תמיסת UW בתוספת נתרן תיוסולפט מגינה על השתלות כליה מפני פציעת איסכמיה-פרפוזיה קרה ממושכת במודל מוריני של השתלת כליה סינגניית

איש קשר: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang וחב'

Cistanche tubulosa מונעכִּליָהמחלה, לחץ כאן כדי לקבל אתמוצרים ו- Cistanche Nz

תַקצִיר

מבוא:פציעת איסכמיה-רפרפוזיה קרה (IRI) היא אירוע בלתי נמנע המגביר את הסיבוכים לאחר ההשתלה. הוכחנו בעבר כי תוספת של תמיסת אוניברסיטת ויסקונסין (UW) עם מולקולות תורמות מימן גופרתי שאינן מאושרות על ידי ה-FDA (H2S) ממזערת IRI קר ומשפרת את תפקוד השתלת הכליה לאחר ההשתלה. המחקר הנוכחי חוקר האם למולקולת תורם H2S שאושרה על ידי ה-FDA, נתרן תיוסולפט (STS), תהיה השפעה זהה או טובה יותר במודל חולדה רלוונטי קלינית של אורתוטופי סינגנייכִּליָההַשׁתָלָה.

שיטה:שלושים חולדות לואיס עברו כריתת כליה דו-צדדית ואחריה השתלה אורתוטופית סינגנטית של שמאלכִּליָהלאחר 24-שעת שימור בפתרון UW או UW פלוס STS ב-4 ◦C. חולדות נוטרו עד יום 14 שלאחר ההשתלה והוקרבו כדי להעריך את תפקוד הכליות (תפוקת שתן, קריאטינין בסרום וחנקן אוריאה בדם).כִּליָהקטעים נצבעו ב-H&E, TUNEL, CD68 ו-myeloperoxidase (MPO) כדי לזהות נמק צינורי חריף (ATN), אפופטוזיס, חדירת מקרופאגים וחדירת נויטרופילים.

תוֹצָאָה:שתלי UW פלוס STS הראו שיפור משמעותי בתפקוד השתל מיד לאחר ההשתלה, עם שיפור בהישרדות הנמען בהשוואה להשתלות UW (p < {0}}.05).="" בדיקה="" היסטופתולוגית="" גילתה="" חדירת="" atn,="" אפופטוזיס,="" מקרופאגים="" ונויטרופילים="" מופחתת="" משמעותית="" והורדה="" של="" גנים="" פרו-דלקתיים="" ופרו-אפופטוטיים="" בהשתלות="" uw="" פלוס="" sts="" בהשוואה="" להשתלות="" uw="" (p=""><>

סיכום:אנו מראים לראשונה ששימור השתלות כליה בתמיסת UW בתוספת STS מגן מפני IRI קר ממושך על ידי דיכוי מסלולים אפופטוטיים ודלקתיים, ובכך משפר את תפקוד השתל ומאריך את הישרדות הנמען. זה יכול לייצג אסטרטגיה טיפולית ישימה קלינית חדשה כדי למזער את התוצאה הקלינית המזיקה של IRI קר ממושך בכִּליָההַשׁתָלָה.

מילות מפתח:נתרן תיוסולפט (STS) פגיעת איסכמיה-רפרפוזיה (IRI) אחסון קר סטטי (SCS)כִּליָההשתלה הישרדות השתל והמקבל

1. הקדמה

כִּליָההשתלה היא הטיפול האופטימלי לשלב הסופיכִּליָהשֶׁל הַכְּלָיוֹתמחלה (ESRD). בהשוואה לדיאליזה,כִּליָהההשתלה עדיפה, מכיוון שהיא מספקת איכות חיים טובה יותר ומעניקה יתרון הישרדותי משמעותי יחד עם עלות-תועלת שלה [1-3]. עם זאת, רכישת כליות של התורם קשורה מטבעה לפציעה של איסכמיה-פרפוזיה (IRI), תוצאה בלתי נמנעת של הפסקה ושיקום זרימת הדם שלאחר מכן במהלך נטיעת ההעברה [4]. האסטרטגיה הנוכחית להפחתת IRI המושרה על ידי השתלה היא אחסון סטטי (SCS) של השתלות כליה בתמיסות שימור סטנדרטיות כגון תמיסת אוניברסיטת ויסקונסין (UW) על הקרח ב-4 מעלות צלזיוס במהלך התקופה שלפני ההשתלה [5]. עם זאת, הוכח כי SCS ממושך קשור למוות תאים מוגבר, דלקת ואירועים מזיקים אחרים בתאים ומולקולרים, אשר בסופו של דבר מביאים לשכיחות מוגברת של תפקוד שתל מושהה (DGF), נמק צינורי חריף (ATN) וירידה בשתל. הישרדות [6-10]. בנוסף, כדי לעמוד בקצב העלייה העולמית של ESRD ומספר גדל והולך של חולים ברשימת המתנה להשתלות, מרכזי השתלות רבים מקבלים השתלות כליה עם תקופות איסכמיות קרות ממושכות, מה שתורם עוד יותר לנזק כללי לרקמות. בעקבות SCS יש רפרפוזיה, כאשר דם מחומצן חם משוחזר לתוך השתל האיסכמי הקר. רפרפוזיה, שהיא השלב המשפיע של פגיעה איסכמית, מאופיין בפגיעה מוגברת ברקמות [11-13].

אסטרטגיה טיפולית פוטנציאלית להגבלת IRI קר במהלךכִּליָהההשתלה כוללת השלמה של תמיסת שימור סטנדרטית עם מימן גופרתי (H2S), מוליך גזי המיוצר באופן אנדוגני שהוכח כממלא תפקידים פיזיולוגיים חשובים בהרחבת כלי הדם ובאותות הסלולריות [14-16]. הראינו בעבר כי SCS ממושך בתמיסת UW בתוספת H2S מפחית IRI קר המושרה על ידי השתלה ומשפר את הישרדות השתל במודלים של השתלת כליה סינגניית ואלוגניית [17-19,41, 42]. עם זאת, מולקולות תורם H2S המשמשות במחקרים אלה אינן קיימא מבחינה קלינית. זה הוביל לשיקול השימוש ב-sodium thiosulfate (STS), תרופה תורמת H2S המאושרת על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) לטיפול בקלציפילקסיס בחולי ESRD, רעילות הנגרמת על ידי ציספלטין בטיפול בסרטן, וכתרופה נגד. הרעלת ציאניד [20–23]. מחקרים אחרונים הראו כי STS מציג השפעות הגנה במודלים של בעלי חיים של IRI [24-26]. עם זאת, השפעתו על IRI כלייתי קר המושרה על ידי השתלה אינה ידועה. לכן, המחקר הנוכחי חוקר את ההשפעות המגוונות מחדש של STS במודל חוץ-גופני של IRI כליות ומודל חולדה של השתלת כליה אורתוטופית סינגניית.

2. חומרים ושיטות

2.1. פרוטוקול ניסוי במבחנה

מודל חוץ-גופני של היפוקסיה קרה ופציעת חמצון חוזרת חמה המחקה תנאים תאיים במהלך IRI קר in vivo שימש להערכת ההשפעות המגנות של STS במהלך IRI כליות. תאי אפיתל של כליה של חולדה (NRK{{0}}קו תאי E; ATCC, ארה"ב) שימשו בניסויים במבחנה מכיוון שתאים אלה רגישים לפציעה איסכמית [27], והשימוש בהם עולה בקנה אחד עם החולדה מודל ההשתלה המשמש למטרה השנייה של מחקר זה. התאים תורבו ב-Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) המכיל 10 אחוז סרום בקר עוברי (FBS) שהושבת על ידי חום ב-60 ◦C למשך 20 דקות ו-1 אחוז פניצילין/סטרפטומיצין (P/S). תאים הודגרו בתנאי גידול נורמליים של 37◦C, 21 אחוז O2 ו-5 אחוז CO2. תאי הבקרה היו בתנאים זהים לאלה של תאים טרום ניסויים. תאים ניסויים טופלו במדיה נטולת סרום (SF), SF בתוספת 200 ננומטר AP39, או SF עם ריכוזים משתנים (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) של sodium thiosulfate pentahydrate (STS), שהתקבלו מ. תמיסה להזרקה של 250 מ"ג/מ"ל של STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, קנדה]). נעשה שימוש בריכוז של 200 ננומטר AP39 מכיוון שהראינו בעבר ש-AP39 בריכוז זה מגן על הגוף נגד אותה שורת תאים במודל דומה של IRI קר [20]. לאחר מכן הודגרו תאים ב-10 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בתנאים היפוקסיים (5 אחוז CO2, 0.5 אחוז O2, 95 אחוז N2) בתא היפוקסיה HypOxystation H85 (HYPO2YGEN, ארה"ב) כדי לגרום לפציעה איסכמית קרה. נעשה שימוש בטמפרטורה היפותרמית של 10 ◦C מכיוון שזו הייתה הטמפרטורה הנמוכה ביותר שניתן להשיג טכנולוגית תוך שמירה על רמת O2 של 0.5 אחוזים של היפוקסיה. בעקבות היפוקסיה, המדיה המכילה תאים ניסיוניים הוחלפה במדיית בקרה, והתאים עברו חמצן מחדש באמצעות דגירה בתנאי גדילה רגילים (37 ◦C, 21 אחוז O2 ו-5 אחוז CO2) למשך 24 שעות כדי לדמות רפרפוזיה והפגיעה הנלווית לה. לאחר החמצן מחדש של 24 שעות, הכדאיות התאית הוערכה באמצעות צביעה של תאים עם Annexin-V מצומד FITC (FITC-Annexin-V; BioLegend, ארה"ב) ו-7-Aminoactinomycin D (7-AAD; BioLegend, ארה"ב ), המודד אפופטוזיס תאי ונמק בהתאמה. תאים נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות CytoFLEX S (בקמן קולטר, ארה"ב). FlowJo גרסה 11 (FlowJo LLC, ארה"ב) שימשה כדי להגדיר כראוי את הנתונים לניתוח סטטיסטי.

2.2. חיות ניסוי

30 חולדות לואיס זכרים במשקל 275-300 גרם שנרכשו מ-Charles River (St. Constant, QC, קנדה) שוכנו במתקן לטיפול בבעלי חיים ושירותים וטרינריים ב-Western University (לונדון, ON) בתנאים סטנדרטיים. מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי מועצת האוניברסיטה המערבית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים עם מזהה פרוטוקול 2018–155.

2.3. מודל השתלת כליה

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >ירידה של 20 אחוז במשקל) או מוות. נקודות קצה אנושיות נבדקו פעמיים ביום וכל החולדות הומתמו על ידי חשיפה ל-CO2 בתא בקצב זרימה של 40 אחוז. בזמן המתת חסד, לא היו סיבוכים ניתוחיים שיכולים היו לגרום לשונות בתוצאות.

2.4. ניתוח של תפקוד הכליות

לאחר השתלת כליה, חולדות נוטרו בכלובים מטבוליים במשך 14 ימים ולאחר מכן הוקרבו. דגימות דם ושתן נאספו ב-POD 3, 5, 7, 10 ו-14 כדי לקבוע פרמטרים של תפקוד כליות (קריאטינין בסרום, חנקן אוריאה בדם [BUN], אוסמולאליות שתן ותפוקת שתן). BUN וקריאטינין בסרום הגיעו ממושתלי כליה וחולדות המופעלות בדמה נמדדו באמצעות מכונת IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer (Markham, ON). רמות אוסמולאליות השתן נקבעו על ידי אוסמומטריה של נקודת הקפאה באמצעות מכונת אוסמומטר 3320 (Advanced Instruments, Norwood, MA) והשוו לתקנים שסופקו על ידי החברה.

2.5. ניתוח היסטופתולוגי ומורפומטרי

רקמות כליה משובצות בפרפין נחתכו לקטעים בעובי של 4 מיקרון והותקנו על שקופיות מיקרוסקופיות להיסטולוגיה. המקטעים נצבעו בהמטוקסילין ו-Eosin (H&E), Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end tagging (TUNEL) כדי לקבוע את מידת ה-ATN והאפופטוזיס בהתאמה. קטעי H&E קיבלו ציון עבור ATN על ידי פתולוג כליות עיוור לפי השיטה הבאה: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 אחוז השתלת ATN. קטעי כליה נצבעו גם בנוגדנים הראשוניים הבאים: סמן פגיעה בכליות (KIM-1), סמן משטח מקרופאג CD68, ואנזים מיילופרוקסידאז ספציפי לנויטרופילים (MPO; Abcam®, טורונטו, קנדה) והוצגו עם נוגדנים משניים ו כרומוגן מצע DAB באמצעות Dako Envision System (Dako, Glostrup, דנמרק) לפי פרוטוקול היצרן ואחריו ניתוח תחת מיקרוסקופ אור דיגיטלי Eclipse 90i (Nikon® Instruments, ניו יורק) בהגדלה של פי 10 ומכומת על ידי תוכנת ImageJ v. 1.8 (National מכונים לבריאות, בת'סדה, MD).

2.6. ניתוח PCR כמותי

RNA הכולל בודד מרקמות השתלת כליה שהושגו ב-POD 3 באמצעות RNeasy® Mini Kit (Qiagen, טורונטו, קנדה) ותעתיק לאחור ל-cDNA באמצעות OneScript® Plus cDNA סינתזה ערכת (ABM, קנדה) בשילוב עם oligo(dT)12– 18 פריימרים לפי פרוטוקול היצרן. RNA ו-cDNA מבודדים נותחו באמצעות ננו-דרופ (DeNovix DS-11 Spectrophotometer, קנדה) לפני השימוש, עם דירוג A260/280 באופן עקבי > 1.95 ו-> 1.8 בהתאמה. לתערובת התגובה של כל דגימת qPCR הייתה נפח של 20 μL והיא נוצרה לפי פרוטוקול Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, קנדה) ונותחה באמצעות מכונת CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, קנדה) . רצפי פריימר תוכננו באמצעות תוכנת Primer-BLAST (NCBI) נגד בטא-אקטין, פולי (ADP-ribose) פולימראז (PARP), אינטרפרון-גמא (IFN-), גורם נמק-אלפא של הגידול (TNF-), אינטרלוקין 6 (IL) -6), לימפומה 2 של תאי B (Bcl-2), חלבון X משויך ל-Bcl-2- (BAX), קספאז 3, אגוניסט מוות באינטראקציה של BH3 (BID), c-Jun קינאז N-טרמינלי 1/2 (JNK1/2), Pparg coactivator 1 alpha (PGC-1), קומפלקס מיטוכונדריה I (NDUFB8), קומפלקס מיטוכונדריה II (SDHB), חלבון קינאז מופעל מיטוגן 1/2 (ERK1 /2), נויטרופילים ג'לטינאז ליפוקלין (NGAL) וגנים של מולקולת פגיעה בכליות-1 (KIM-1). כל הגנים המעניינים נורמלו כנגד בטא-אקטין. שינויים קיפולים של ביטוי גנים הושוו לחולדות המופעלות בדמה וחושבו בשיטת ΔΔCt.

2.7. ניתוח סטטיסטי

כל הניתוחים הסטטיסטיים נערכו באמצעות GraphPad (La Jolla, קליפורניה) חבילת התוכנה הסטטיסטית Prism, גרסה 9.0. נתוני הישרדות נותחו באמצעות ניתוח הישרדות של Kaplan-Meier ובדיקת דירוג לוג, בעוד שנתוני ביטוי גנים של qPCR נותחו באמצעות מבחן t חד כיווני לא מזווג. כל שאר הנתונים נותחו באמצעות ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו המבחן הפוסט-הוק של Tukey כדי לקבוע הבדלים סטטיסטיים בין קבוצות. מובהקות סטטיסטית התקבלה בעמוד<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. תוצאות

3.1. מדיה ללא סרום בתוספת STS משפרת את הישרדות תאי אפיתל צינורי כליה במהלך היפוקסיה קרה/חמצן מחדש

ניתוח ציטומטריית זרימה לאחר צביעה לאפופטוזיס ונמק הראה שתאי NRK{{0}}E שטופלו ב-SF במהלך IRI קר במבחנה הפגינו ירידה משמעותית בכדאיות התא בהשוואה לתאי בקרה (נורמוקסיים) (איור 1A; p < 0.05).="" בעוד="" שכל="" דגימות="" הניסוי="" הראו="" יכולת="" נמוכה="" משמעותית="" של="" תאי="" אפיתל="" צינורי="" כליה="" מאשר="" תאים="" שגדלו="" בתנאים="" נורמוקסיים="" (p="">< 0.05),="" תאים="" שטופלו="" ב-sf="" בתוספת="" של="" 150="" µm="" ו-500="" µm="" sts="" הפגינו="" כדאיות="" גבוהה="" משמעותית="" מאלה="" שטופלו.="" עם="" מדיה="" sf="" בלבד="" (איור="" 1a;="" p="">< 0.05),="" אשר="" תואמה="" עם="" אפופטוזיס="" מופחת="" באופן="" ניכר="" בהשוואה="" לתאים="" שטופלו="" במדיה="" sf="" בלבד="" (איור="" 1b;="" p="">< 0.05).="" בנוסף,="" נראה="" שהעלייה="" בכדאיות="" התא="" והירידה="" באפופטוזיס="" מגיעים="" לרמות="" אופטימליות="" עם="" 150="" µm="" ו-500="" µm="" sts,="" שכן="" מינון="" גבוה="" יותר="" הפך="" את="" המגמות="" הללו="" (איור="" 1a="">

3.2. תוספת של תמיסת UW עם STS משפרת את ההישרדות והתפקוד המוקדמים של השתלת כליה

שימור השתלות כליה בתמיסת UW בתוספת STS שיפרה משמעותית את הישרדות הנמען עם 83 אחוז הישרדות עד POD 14 (יום ההקרבה) בהשוואה לקבוצת הביקורת ללא תוספת STS, שהראתה 12.5 אחוז הישרדות, במיוחד ב-3 הימים הראשונים (איור. 2A; p < 0.05).="" בנוסף,="" תוספת="" sts="" שיפרה="" באופן="" ניכר="" את="" תפקוד="" השתל="" במהלך="" התקופה="" המוקדמת="" שלאחר="" ההשתלה="" בהשוואה="" לטיפול="" ב-uw="" בלבד.="" רמות="" קריאטינין="" ו-bun="" בסרום="" עלו="" באופן="" מובהק="" הן="" בקבוצות="" uw="" והן="" בקבוצות="" uw="" פלוס="" sts="" ב-pod="" 3,="" אשר="" נמצאה="" בקורלציה="" עם="" ירידה="" באוסמולליות="" השתן="" בהשוואה="" ל-sham="" (איורים="" 2b,="" c="" ו-3a;="" p="">< 0.{{25="" }}5).="" עם="" זאת,="" רמות="" הקראטינין="" וה-bun="" בסרום="" בקבוצת="" uw="" פלוס="" sts="" ירדו="" באופן="" מובהק="" ב-pod="" 3="" עם="" עלייה="" מקבילה="" באוסמולאליות="" השתן="" בהשוואה="" לקבוצת="" uw="" (איור="" 2b,="" c="" ו-3a;="" p=""><0.05). מעניין="" לציין="" שרמות="" הקריאטינין="" וה-bun="" בסרום="" בקבוצת="" uw="" פלוס="" sts="" ירדו="" בהתמדה="" מ-pod="" 3="" ל-pod="" 14="" עם="" עלייה="" באוסמולאליות="" בשתן="" והיו="" דומות="" לאלו="" של="" sham="" (איורים="" 2b,="" c="" ו-3a).="" כמו="" כן,="" תפוקת="" השתן="" בקבוצת="" uw="" פלוס="" sts="" הייתה="" גבוהה="" משמעותית="" במהלך="" ארבעת="" הימים="" הראשונים="" שלאחר="" הניתוח="" בהשוואה="" לקבוצות="" uw="" ו-sham="" (איור="" 3b;="" p="">< 0.05).="" עם="" זאת,="" הוא="" ירד="" בהתמדה="" לקראת="" ערך="" הבסיס="" (sham)="" והיה="" דומה="" לזה="" של="" sham="" ב-pod="" 14="" בעוד="" שתפוקת="" השתן="" בחולדה="" השורדת="" בקבוצת="" uw="" נותרה="" גבוהה="" מערך="" הבסיס="" ב-pod="" 14="" (איור="">

3.3. הוספה של STS לתמיסת UW מפחיתה מוות תאים כתוצאה מהשתלה לאחר השתלת כליה

קטעי כליות שהושגו ב-POD 3 ו-14 נצבעו ב-TUNEL כמדד למוות של תאים אפופטוטיים וצוינו על ידי פתולוג כליות עיוור (איור 4A). השתלות כליה מקבוצת UW הראו מוות תאי אפופטוטי גבוה יותר באופן משמעותי ב-POD 3, כפי שצוין על ידי ציון TUNNEL גבוה יותר בהשוואה לכליות מקבוצות UW פלוס STS ו-Sham (איור 5A ו-b; p < 0.{{11}="" }5).="" השתלים="" מקבוצת="" uw="" פלוס="" sts="" לא="" היו="" שונים="" באופן="" משמעותי="" בהשוואה="" לאלו="" של="" sham="" באותה="" נקודת="" זמן="" וב-pod="" 14="" (איור="" 4b).="" בנוסף,="" בעוד="" שתלים="" מקבוצות="" uw="" ו-uw="" פלוס="" sts="" הראו="" ציוני="" atn="" מוגברים="" באופן="" משמעותי="" ב-pod="" 3="" בהשוואה="" לקבוצת="" הדמה="" (איור="" 5;="" p="">< 0.05),="" השתלי="" uw="" פלוס="" sts="" הראה="" ירידה="" בציוני="" atn="" ב-pod="" 3="" בהשוואה="" ל-uw="" (איור="" 5;="" p=""><0.05). כמו="" כן,="" בעוד="" שמקבלי="" השתלות="" uw="" לא="" שרדו="" עד="" pod="" 14,="" ומכאן="" שלא="" ניתן="" היה="" לקבוע="" את="" ציוני="" ה-atn="" שלהם="" ב-pod="" 14,="" אלו="" של="" השתלי="" uw="" פלוס="" sts="" שרדו="" עד="" pod="" 14="" אך="" הראו="" ציוני="" atn="" מוגברים="" משמעותית="" בהשוואה="" לקבוצת="" הדמה="" (איור="" 5;="" p=""><>

3.4. השתלות כליה שנשמרו בתמיסת UW בתוספת STS הראו ירידה בסמני פציעה ובהסתננות דלקתית לאחר השתלת כליה

קטעי כליה שהתקבלו ב-POD 3 ו-14 נצבעו ב-KIM-1 כדי לזהות פגיעה בצינורית פרוקסימלית וכן CD68 (סמן מקרופאג) ו-MPO (סמן נויטרופילים) וצוינו על ידי פתולוג כליות עיוור (איורים 6A, 7A, ו-ג). ביטוי רקמת הכליה של KIM-1, CD68 ו-MPO היו גבוהים יותר באופן משמעותי בקבוצת ה-UW ב-POD 3 בהשוואה לאלו של UW פלוס STS וקבוצות Sham (איורים 6B, 7B ו-D; p < {{11}="" }.05)="" בעוד="" שהביטוי="" של="" סמנים="" אלה="" בשתלים="" של="" uw="" פלוס="" sts="" לא="" היה="" שונה="" באופן="" משמעותי="" בהשוואה="" ל-sham="" על="" pod="" 14="" (איורים="" 6b,="" 7b="" ו-d;="" p=""> 0.05).

3.5. תוספת STS לתמיסת UW דיכאה ביטוי כלייתי של גנים פרו-דלקתיים, פרו-אפופטוטיים ומיטוכונדריה

ביטוי גנים של סמנים פרו-דלקתיים, פרו-אפופטוטיים, ממוקדי מיטוכונדריה ופגיעה בכליות נקבע באמצעות qRT-PCR בכליות מושתלות שהתקבלו ב-POD 3. ביטוי של הגנים הפרו-דלקתיים IFN-, TNF- ו-IL{{8 }} עלו באופן ניכר בהשתלות UW ביחס להשתלות UW פלוס STS ב-POD 3 (איור 8A; p < 0.05)="" ופעלו="" לפי="" אותו="" דפוס="" עם="" גנים="" פרו-אפופטוטיים="" parp,="" bax="" ,="" caspases-3,="" bid,="" jnk1="" ו-jnk2="" (איור="" 8a;="" p="">< 0.05)="" בעוד="" שהביטוי="" של="" bcl="" אנטי-אפופטוטי-2="" גדל="" מעט="" ב-uw="" פלוס="" קבוצת="" sts="" בהשוואה="" לקבוצת="" uw,="" אם="" כי="" עלייה="" זו="" לא="" הגיעה="" למובהקות="" סטטיסטית="" (איור="" 8a).="" בנוסף,="" ביטוי="" של="" גנים="" מיטוכונדריאליים="" pgc-1,="" ndufb8="" (קומפלקס="" i)="" ו-sdhb="" (קומפלקס="" ii)="" בשתלים="" uw="" ירד="" באופן="" משמעותי="" בהשוואה="" להשתלי="" uw="" פלוס="" sts="" (איור="" 8b;="" p="">< 0="" .05)="" בעוד="" שההיפך="" נצפה="" עם="" ביטויי="" erk1="" ו-erk2="" (איור="" 8b;="" p=""><0.05). יתר="" על="" כן,="" ביטוי="" הגנים="" kim-1="" בהשתלות="" uw="" גדל="" באופן="" משמעותי="" בהשוואה="" להשתלות="" uw="" פלוס="" sts="" (איור="" 8c;="" p="">< 0.05)="" בעוד="" שירידה="" בביטוי="" ngal="" בשתלי="" uw="" פלוס="" sts="" לא="" הגיעה="" למובהקות="" סטטיסטית="" בהשוואה="" לזה="" ב="" שתלי="" uw="" (איור="" 8c;="" p=""> 0.05).

4. דיון

מחקר זה קובע השלמה של תמיסת שימור סטנדרטית עם STS, תורם H2S בר-קיימא מאושר על ידי ה-FDA, כדי להפחית את IRI הכלייתי הקרה שנגרם על ידי השתלה, לשפר את איכות השתל ולהאריך את הישרדות הנמען. באמצעות מודל חוץ-גופני של IRI כלייתי וחולדות של השתלת כליה אורתוטופית סינגניית, אנו מדגימים לראשונה כי תוספת של תמיסת UW עם STS במהלך SCS ממושך מגן על איברים ואיברים.

הממצא העיקרי במודל החוץ-גופני שלנו הוא שתוסף STS למדיה נטולת סרום מגן על תאי אפיתל כליות מפני היפוקסיה קרה ואפופטוזיס חם הנגרמת על ידי חמצון חוזר ומגביר את הכדאיות, מה שעולה בקנה אחד עם המחקר הקודם שלנו שבו הראינו את ההשפעות המגן של המיטוכונדריה. תרופת תורמת H2S מכוונת, AP39, במודל חוץ גופי של IRI כליות קר [20]. מעניין לציין שריכוז STS גבוה יותר של 1 mM הפך את ההשפעות המועילות, מה שמרמז ש-STS מציג תופעת מינון-תגובה דו-פאזית המכונה הורמזיס, שבה ריכוז נמוך יותר הוא ציטוטוקסי בעוד ריכוז גבוה יותר הוא ציטוטוקסי. נזק מיטוכונדריאלי הוא תוצאה מרכזית של IRI כלייתי, שכן חדירות מיטוכונדריאלית יכולה לעכב ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) ולהגביר את היווצרות מיני חמצן תגובתיים (ROS), מתווך הרסני של פגיעה ברקמות [13]. לאחרונה הוצע שהמיטוכונדריה הן האתר העיקרי של פעילות STS. לא רק ש-STS ידוע כמייצר H2S במיטוכונדריה באמצעות הפחתה תלוית גלוטתיון ולהיפך דרך מסלול חמצון סולפיד, אלא גם משמר את סינתזת ה-ATP המיטוכונדריאלי, מפחית את ייצור ROS ומשפר את פעילות האנזים המורכבת בשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC) [24] ,28–30]. בנוסף, מחקרים עדכניים הראו ש-STS הגביר באופן משמעותי את הביטוי של PGC-1, מווסת חיובי של ביוגנזה מיטוכונדריאלית וייצור ATP [26], מה שמתאים לתצפית שלנו in vivo. מנגנונים מולקולריים אלו יכולים להסביר את הביטוי המוגבר באופן משמעותי של קומפלקסים ETC מיטוכונדריאליים I ו-II (NDUFB8 ו-SDHB בהתאמה) במודל השתלת הכליה שלנו עם הישרדות ותפקוד מוגברים כפי שנצפו בהשתלות כליה שנשמרו בתמיסת UW בתוספת STS.

בהתבסס על התוצאות במבחנה שלנו, החלטנו לחקור אם ההשפעה המגנה של STS ישימה in vivo באמצעות מודל השתלה שבו IRI קר תורם עיקרי לתפקוד לקוי של השתל ולהגברת הסיבוכים לאחר ההשתלה. הממצאים שלנו מראים ש-SCS ממושך (24 שעות) של השתלות כליה בתמיסת UW בתוספת STS משפר באופן משמעותי את איכות ההשתלה ותפקוד המאופיין בירידה ברמות קריאטינין ו-BUN בסרום, תפוקת שתן גבוהה יותר והישרדות ממושכת של הנמען בהשוואה להשתלים שנשמרו בתמיסת UW בלבד. . חשוב לציין שהמיידיות של תפוקת השתן גם לאחר השתלת כליה קלינית היא תוצאה קריטית הקובעת האם נדרשת דיאליזה כדי לטפל בתפקוד השתל מושהה (DGF). לכן, התצפית שלנו ש-STS מגבירה את תפוקת השתן מיד לאחר ההשתלה וניתנת להשוואה לקבוצת Sham על POD 14 היא ממצא מבטיח. השיפור שנצפה בתפקוד הכלייתי לאחר השתלת שתלים שנשמרו בתמיסת UW בתוספת STS העניק גם יתרון הישרדותי משמעותי. מבחינה כמותית, תוספת STS האריכה את חיי השתל כך ש-83 אחוז (5/6) מהחולדות שקיבלו UW ועוד שתלי STS שרדו עד POD 14 (יום ההקרבה) בהשוואה ל-12.5 אחוז בלבד (1/8) מהחולדות שקיבלו שתלים שנשמרו בתמיסת UW ללא תוספת STS. ממצא זה מהמחקר הנוכחי מתיישב גם עם המחקר הקודם שלנו, שבו רק 14 אחוז (1 מתוך 7) מהחולדות שקיבלו השתלים נשמרו בתמיסת UW למשך 24 שעות ללא תוספת H2S (GYY4137), שרדו עד POD 14 [20] .

בנוסף להראות שיפור בפרמטרים של תפקוד הכליות, תוספת STS גם עיכבה אפופטוזיס ודלקת של השתלת כליה על ידי הורדת ביטוי הרקמה של גנים פרו-אפופטוטיים ופרו-דלקתיים, תוך העלאת ויסות גנים אנטי-אפופטוטיים והפחתת מקרופאגים חיוביים של CD68- נויטרופילים חיוביים ל-MPO, שהביאו בסך הכל להפחתת ביטוי KIM-1 ו-ATN ובסופו של דבר שימרו את המורפולוגיה הכלייתית. ציטוקינים דלקתיים אלו ידועים כמתווכים של מוות תאי במהלך IRI קר [31], והפחתה שלהם בהשתלות UW פלוס STS נובעת ככל הנראה מהמאפיינים הידועים של STS להפחתת חדירות האנדותל בשכבת האנדותל החד-שכבתית של כלי הדם, מחלישה את ייצור הציטוקינים , ומעורר ייצור של ציטוקינים אנטי דלקתיים [32]. כמו כן, הממצא שלנו שתוספת STS לתמיסת UW מווסתת את הביטוי של גנים פרו-דלקתיים תואמת את זה של מחקר קודם על הפעילות האנטי דלקתית של STS על ידי הפחתת רמות TNF ו-IL-6 במחלות נוירולוגיות [33 ,34]. מבחינה מכאנית, STS משבית את הקספאז-3 על ידי הצמדות לאתר הפעיל שלו באמצעות קשרי מימן חזקים ובכך מונעת גישה של מצע טבעי לאתר הפעיל, ובסופו של דבר עוצר את האפופטוזיס [35]. STS גם חוסם את ההפעלה של JNK, חלבון הממלא תפקיד קריטי באיתות אפופטוטי [35], מה שתומך בממצא שלנו על ההשפעה המווסתת של STS על caspase3 ו-JNK. עם זאת, איננו מסוגלים לקבוע אם מנגנונים כאלה פועלים במחקר הנוכחי מכיוון שלא ביצענו ניסויים נוספים כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים הללו.

מגבלה עיקרית של הניסוי במבחנה שלנו היא האתגר הטכני שלנו להשתמש בטמפרטורת השימור הסטנדרטית הנוכחית 4 ◦C [36], שכן ה-10 ◦C שבה השתמשנו היו הטמפרטורה הנמוכה ביותר שניתן להשיג טכנולוגית מבלי לסכן את הסביבה ההיפוקסית. זהו הבדל אמיתי בכל הנוגע לתהליכים פיזיולוגיים תאיים וגם בטכניקות שימור. פתרון אפשרי הוא להשתמש בהיפוקסיה הנגרמת כימית בשקית ניילון ולהכניס אותה למקרר של 4 מעלות צלזיוס על מנת לשקף את ההגדרות הקליניות של SCS. עם זאת, שקיות לייצור אווירה אנאירובית אלו תוכננו לשימוש בטמפרטורות חמות (21-37 ◦C) מאחר שהתרכובות הכימיות המעוררות את הסביבה ההיפוקסית פועלות במצב זה. מחקרים עתידיים צריכים לכוון לייעול הטמפרטורה בתא ההיפוקסיה כדי לחקות הגדרות SCS קליניות. השגת טמפרטורה עקבית של 4 ◦C מבלי להתפשר על סביבה היפוקסית תאפשר לנו לקבוע אם הפנוטיפים שנצפו במודל ה-IRI הקר במבחנה באים לידי ביטוי באופן עקבי. מלבד הניסוי במבחנה, גם מודל השתלת החולדות שלנו אינו חף מחסרון. ביצענו השתלת כליה סינגנטית (תורמים ומקבלים זהים מבחינה גנטית עם תאימות אימונולוגית), אשר חלה רק על תאומים זהים בהשתלת כליה קלינית, בעוד שרוב השתלות הכליה הקליניות הן אלוגניות (תורמים ומקבלים שונים מבחינה גנטית). ההשתלה האלוגנית מאלצת את המושתלים לעבור בדיקות אימונולוגיות לפני ההשתלה כדי לזהות את האנטיגנים של התורם לויקוציטים אנושיים (HLA; מולקולות המעוררות ומווסתות תגובה חיסונית), לקבוע תאימות אימונולוגית בין התורמים והמקבלים, ולהימנע מדחיית איברים [37,38]. מחקרים עתידיים המשתמשים ב-STS צריכים לשקול השתלה אלוגניית. מודל השתלת כליה מגבלה נוסף הוא העובדה שהתמקדנו בתורמים חיים, שתלים לא אופטימליים מתרומת מוות לבבי (DCD) הופכים נפוצים יותר ויותר כמקור לכליות של התורם במרכזי השתלות רבים בעולם [39]. DCD חושף את איברי התורם לתקופות שונות של איסכמיה חמה בנוסף לזמנים איסכמיים קרים במהלך SCS, וקשור לשיעורים מוגברים של DGF וירידה בהישרדות השתל בהשוואה לתורמים חיים [40]. לכן, מחקרים עתידיים צריכים לשקול את מודל השתלת הכליה DCD כדי להעריך את ההשפעה של STS נגד IRI במודל זה.

לסיכום, המחקר שלנו מדגים כי תוספת של תמיסת שימור סטנדרטית עם תרופה תורמת H2S קיימא מבחינה קלינית במהלך SCS ממושך של השתלות כליה מגן מפני IRI כלייתי קר המושרה על ידי השתלה, משפר את איכות ההשתלה הכללית ואת תפקוד ההשתלים ומאריך את הישרדות המושתלים. בהתחשב בכך שהסיכון ל-DGF עולה עם זמן איסכמי קר ממושך בהשתלת כליה קלינית, מה שמעורר דאגה קלינית מרכזית, התצפית ש-STS מגינה על השתלות כליה במהלך SCS ממושכת ומונעת DGF לאחר ההשתלה מספקת הבטחה קלינית גדולה שיכולה להפחית או למנוע את שכיחות של DGF בהשתלת כליה קלינית בעתיד הקרוב. לפיכך, היתרון העתידי של הוספת STS לפתרונות השימור עשוי להוות פתרון פוטנציאלי לבעיה מתמשכת זו. בסך הכל, מחקר זה מוסיף לגוף הספרות ההולך וגדל התומך בהשפעות הציטו-פרוטקטיביות של STS ותורמי H2S אחרים נגד IRI של איברים, במיוחד משפר את תוצאות ההשתלות ב-IRI כליות קר המושרה על ידי השתלה. אסטרטגיות אלו עשויות להקל על השימוש בעוד שתלים החשופים לזמנים איסכמיים קרים ממושכים, מה שעלול להגדיל את מאגר האיברים הניתנים לשתילה.

הצהרת תרומת הכותבים של CrediT

כל המחברים הסכימו להגשת כתב היד הזה. אין ניגוד עניינים.

הפניות

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford, et al., Comparison of mortality בכל החולים בדיאליזה, חולים בדיאליזה הממתינים להשתלה, ומקבלי השתלת גופות ראשונה, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll, et al., סקירה שיטתית: השתלת כליה בהשוואה לדיאליזה בתוצאות רלוונטיות קלינית, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte, et al., Cost-effectiveness of kidney transplantation from DCD in Italy, Transplant. פרוק. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Ischemia- reperfusion injury, Eur. J. Trauma Emerg. Surg. 33 (6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, שימור איברים: מושגים עדכניים ואסטרטגיות חדשות לעשור הבא, Transfus. Med. המותר. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Cold ischemia and the reduction long-term survival of cadaveric renal allografts, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo, et al., Major effects of delayed function graft and ischemia cold on survival allograft renal, Nephrol. חוּגָה. לְהַשְׁתִיל. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold. J. השתלה. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Recipient risk factors הקשורים לתפקוד שתל מושהה: ניתוח כליות מזווג, Transplantation 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay, et al., כל שעה נוספת של זמן איסכמיה קרה מגבירה באופן משמעותי את הסיכון לאי ספיקת שתל ותמותה בעקבות השתלת כליה, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, נוגדי חמצון ממוקדי מיטוכונדריה: פרספקטיבות עתידיות בפציעת איסכמיה-פרפוזיה בכליות, אוקסיד. Med. תא לונגב. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, מתח חמצוני הנגרם על ידי עומס יתר של סידן מיטוכונדריאלי, Ann. NY Acad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, The role of mitochondria in asschemia/reperfusion injury, Transplantation 73 (4) (2002) 493-499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Emerging role of gasotransmitters in renal transplantation, Am. J. השתלה. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, מימן גופרתי ואיתות תאים: שחקן צוות או שופט? צמח פיזיול. Biochem. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, The vasorelaxant effect of H(2)S as a andogous gaseous K(ATP) opener channel, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter, et al., טיפול במימן גופרתי מקל על פגיעת איסכמיה-רפרפוזיה של הכלייתי כליות במהלך אחסון קר ומשפר את תפקוד הכליות וההישרדות המוקדם לאחר השתלת כליה אלוגנית, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb. ודלקת, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian, et al., Hydrogen Sulfide מגן על השתלי כליה מפני פגיעה ממושכת באיסכמיה קרה באמצעות פעולות מיטוכונדריאליות ספציפיות, Am. J. השתלה. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Sodium thiosulfate עבור הרעלת ציאניד חריפה: מחקר במודל של חולדה, Ann. פארם. Fr. 63 (2) (2005) 154–161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri, et al., Sodium thiosulfate מגן מפני ליקוי כליות בעקבות כימותרפיה תוך פריטונאלית היפרתרמית (HIPEC) עם Cisplatin, Int. J. Hyperth. 37 (1) (2020) 897–902.