השפעת סימולציית עיכול אנושית חוץ גופית על תכולת הפנולים והפעילויות הביולוגיות של תמציות מימיות ממין ציסטוס טורקי חלק 2

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

3. דיון

רדיקלים חופשיים עשויים לתקוף חלבונים, שומנים או DNA כדי להשיג אלקטרון, וכתוצאה מכך לבעיות בריאותיות שונות. מסיבה זו, חיוני לאזן את מערכת נוגדי החמצון של הגוף ואת הרדיקלים החופשיים הנוצרים בחמצון. במקרה של הידרדרות של איזון זה, נוצר עקה חמצונית [29]. מתח חמצוני הוא אחד הגורמים העיקריים הגורמים להפרעות כרוניות שונות כגון סרטן, סוכרת, מחלות לב וכלי דם, מחלת אלצהיימר וכו'. בעוד שקיימות מערכות נוגדות חמצון עצמיות בגוף האדם כדי להילחם בנזק החמצוני לרקמות ואיברים, אלו מתגוננות מערכות עלולות לאבד את יעילותן עקב מצבים שונים כגון צריכת יתר של אלכוהול, עישון, מתח, שימוש כרוני בסמים והקרנות וכו' [30]. דוחות מדעיים שונים הצביעו על כך שמטבוליטים צמחיים משניים ממלאים תפקיד משמעותי במניעת עקה חמצונית והשפעותיו המזיקות [13,14,31]למרות שהזמינות הביולוגית היא פרמטר חשוב המשפיע על הפעילות הביולוגית של תרכובות אלו, היא לא נלקחה בחשבון ב רוב המחקרים. עם זאת, ידוע היטב שהמטבוליטים המשניים נתונים לטרנספורמציות מבניות עקב תנאי pH שונים, פעילות אנזימטית וטמפרטורת הגוף במערכת העיכול. בנוסף, המאפיינים הכימיים של המטבוליטים המשניים כגון משקל מולקולרי, קוטביות ודרגת קישור למקרומולקולות במטריצת הצמח הם גם גורמים משמעותיים המשפיעים על הזמינות הביולוגית שלהם [13]. בהתאם לכך, ספיגת התרכובות או המטבוליטים שלהן לזרם הדם לאחר הבליעה חיונית על מנת להפעיל את ההשפעות הפיזיולוגיות הסיסטמיות שלהן. מודלים של הדמיית עיכול חוץ גופית עשויים לספק ראיות להערכת מאפייני הזמינות הביולוגית האפשרית של חומרים. בעוד שאישור בניסויים בבני אדם הכרחי כדי לתבוע תכונה פונקציונלית כלשהי, מודלים של סימולציה חוץ גופית משמשים באופן נרחב כחלופות למחקרים in vivo או ניסויים בבני אדם, שלעתים קרובות ניתן להתווכח עליהם מבחינה אתית, עתירי משאבים, יקרים וגוזלים זמן [32].

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

מספר חוקרים חקרו גם את הפוטנציאל נוגד החמצון של תמציות שהוכנו מאיברים שונים של מיני Cistus. על פי סקר הספרות, זהו המחקר הראשון על מיני Cistus לגבי הזמינות הביולוגית של חומרים פנולים והשפעתם על פעילות נוגדת החמצון על ידי שימוש במודל הדמיית עיכול חוץ גופית. קאראס וחב'. [33] הציע כי 10 אחוז מהרכיבים הפוליפנוליים נותרים בלתי מעוכלים במטריקס הצמחי ו-90 אחוז מהם נתונים לעיכול בשלב הקיבה או המעי (כ-48 אחוז ו-52 אחוז, בהתאמה). כפי שהוזכר קודם לכן, כל הכמויות הפנוליות בתמציות מימיות הושפעו לרעה מהליך הדמיית העיכול האנושי במבחנה. לפיכך, זוהו הפסדים משמעותיים בתוכן הפנולי של הדגימות הביולוגיות של כל התמציות. יתר על כן, ריכוזי הפרואנטוציאנידין הכוללים של דגימות IN היו מתחת לגבול הגילוי בכל התמציות המימיות. מחקרים שונים עוררו גם את ההשפעה השלילית של הליך העיכול על תרכובות פנוליות בתמציות הצמחים ובכך הפעילות הביולוגית הקשורה. לדוגמה, דיווחנו על התוכן הפנולי הכולל של Salvia virgata Jacq. הושפע לרעה גם מהליך העיכול במחקר הקודם שלנו בנוסף, כמויות המטבוליטים העיקריים של התמצית, כלומר, רוטין וחומצה רוסמרינית, נטו לרדת [13]. לעומת זאת, מספר מחקרים דיווחו על תוצאות סותרות. במחקר של Celeb et al. [34], הם ראו את הגידול של הכמויות הכוללות של חומצה פנולית, פלבנואידים ופנוליות בדגימות הביולוגיות הזמינות של תמצית מתנולית מ-Hypericum perfoliatum L. למעשה, למטבוליטים העיקריים, קוורציטרין, חומצה כלורוגנית וחומצה גאלית, היו יחסי נגישות ביולוגית מעל 100 אחוזים. מחקרים אלו הראו כי ההשפעות של הליך העיכול עשויות להשתנות בהתאם לחומרי הצמח. על מנת להבהיר הבדלים אלו, חיוני לשקול את מנגנון הפעולה של מערכת העיכול על חומרים פנולים. (יתרונות ביופלבנואידים) סרה ואח' [35] הציע כי תרכובות פנוליות נמצאות בעיקר בגליקוזידים, פולימרים ואסטרים במטריקס הצמחי והן עוברות הידרוליזה במערכת העיכול לפני הספיגה. גורמים שונים עשויים להשפיע על השינויים המבניים של התרכובות הפנוליות במערכת העיכול. לדוגמה, תרכובות בעלות משקל מולקולרי גבוה יותר, כגון פרואנטוציאנידינים או פרוציאנידינים, צריכות לעבור הידרוליזה לפני ספיגה במעי. מבנה המטריצה ​​הצמחית הוא גם גורם בולט בזמינות הביולוגית של פנולים; (לקנות cistancheתרכובות פנוליות יכולות להיקשר למקרומולקולות במטריקס הצמחי, כגון סיבים, חלבונים ומולקולות שומנים. לפיכך, רק הרכיבים הפנוליים המשוחררים מהמטריצה ​​עשויים להיספג ממערכת העיכול. יתר על כן, ערכי pH שונים ופעולות אנזימטיות של המיקרוביוטה של ​​המעי הם בין הגורמים המכריעים האחרים המשפיעים על השינוי במבנה הכימי של תרכובות פנוליות [36]. לאור נתונים אלו, אנו יכולים לשער כי תוצאות שונות המתקבלות מסוגים דומים של מחקרים ניסיוניים עשויות לנבוע ממורכבות מערכת העיכול והרכב המטריצה ​​הצמחית. כפי שמוצג בטבלה 3, הדגימות הביולוגיות הזמינות של תמציות Cistus הפגינו פעילות נוגדת חמצון חלשה יותר מאשר המקבילות הלא מעוכלות והפוסט-קיבה בשל התוכן הפנולי הנמוך שלהן.

Cistancheפחיתלשפר חסינות

יתרה מכך, שתי התמציות של C.saluifolius הציגו פעילות נוגדת חמצון טובה יותר במבחני DPPH, CUPRAC, FRAP ו-TOAC בהשוואה למינים אחרים. חוץ מזה, שתי התמציות של C.paroifforus הראו פעילות ניקוי רדיקליים של DMPD גבוהה יותר מאשר תמציות של מינים אחרים. כפי שצוין בטבלה 1, תכולת הפנולים, הפלבנואידים והחומצה הפנולית הכוללת של C. salviifolius הייתה גבוהה יותר מאשר בשאר הדגימות. לפיכך, פוטנציאל נוגד החמצון הגבוה יותר של תמציות C. salviifolius עשוי להיות קשור לתכולה הפנולית שלה.

יתרה מכך, הירידה בפוטנציאל נוגדי החמצון, פעילויות מעכבות על אנזימים הקשורים לפחמימות ו-AGEs של הדגימות הביולוגיות עשויות להיות קשורות לירידה בגליקוזידים פלבונואידים. עם זאת, תמציות Cistus הכילו גם חומרים פנולים אחרים, כפי שמצוין באיור 1. לכן, נדרש ניתוח כרומטוגרפי מפורט של התמציות כדי לעקוב אחר השפעת העיכול על הפעילות הביולוגית.

הפוטנציאל המעכב של תמציות צמחים על אנזימי עיכול משך לאחרונה יותר תשומת לב בשל החשש הבטיחותי של מעכבים סינתטיים. לכן, ההשפעה המעכבת של תמציות צמחים נקבעה במספר מחקרים, והשפעה זו הייתה קשורה בדרך כלל לחומרים פנולים כגון פלבנואידים, חומצות פנוליות, פרואנטוציאנידינים וכו'. Sun et al. [37] הציע שתרכובות פוליפנוליות מציגות את השפעותיהן המעכבות על ידי קשירה לאנזימים שהוזכרו לעיל בעזרת כוחות הידרופוביים וקשרים לא קוולנטיים. לכן, עיכוב פעילות האנזים o-עמילאז ו-a-glucosidase על ידי פוליפנולים קשור למבנים המולקולריים שלהם. בעוד מנגנון אינטראקציה זה נחקר באמצעות טכניקות שונות כגון קינטיקה של עיכוב, עגינה מולקולרית, כיבוי פלואורסצנטי וכו', עדיין לא נרכשה מסקנה ודאית [38]. עם זאת, מחקרים רבים דיווחו שעיכוב אנזימי העיכול של תמציות הצמח קשורות ישירות לתוכן הפנולי שלהם. מחקרים דומים על פעילות מעכבת האנזים של מיני Cistus דווחו גם הם בעבר. Sayah וחב'. [39] חקר את הפעילויות המעכבות -עמילאז ו-glucosidase של 8{{10}}% תמציות מתנוליות ומימיות מ-C. monspeliensis ו-C. saluifolius. התוצאות שלהם היו בהתאם למחקר הנוכחי, וגילו שתמצית מימית של C. salvifolius הדגימה גבוה יותר של o-glucosidase (ICso ug/mL:0.95±0.14)ו-עמילאז(IC5{ {55}} ug/mL:217.1±0.15) פעילות מעכבת מאשר התמצית המימית של C. monspeliensis （IC50 ug/mL∶ 14.58±1.26） ו（IC50 4g/mL:886.10±0.10), בהתאמה. שיעורי המעכבים של שתי התמציות המימיות באנזימים אלו היו גבוהים יותר מאשר תרכובת הייחוס acarbose (ICso ug/mL:18.01±2.00) בדומה למחקר שלנו, הם מצאו מתאם עם שיעורי מעכבי האנזים והסך הכולל כמויות פנוליות ופלבנואידים. גם תכולת הפנולים הכוללת וגם התוכן הפלבנואידי הכולל של התמצית המימית C. saloijfolius (408.43±1.09mg GAE ו-140.00±1.15 RE, בהתאמה) הייתה גבוהה יותר מהתמצית המימית C.monspeliensis (261.76±1.9mg GAE ו- 78.00±1.15 RE בהתאמה). אורהן וחב'. [40] חקר גם את הפוטנציאלים המעכבים של אנזימי העיכול של 80 אחוז תמציות מימיות ואתנוליות מהעלים של C.laurifolius. לפי התוצאות שלהם, תמצית אתנולית 80 אחוז (71.7 אחוז ±0.6) הראתה פעילות מעכבת עמילאז חזקה בהשוואה לתמצית מימית (39.3 אחוז ±2.2 אחוז) בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. הם הציעו שתרכובות פנוליות, במיוחד פלבנואידים, משפיעות ישירות על הפרשת אינסולין על ידי מניעת אפופטוזיס של תאי בטא ותומכות בפעילות אנטי-סוכרתית. השערה זו, בקורלציה עם התוצאות שלנו, מסמנת שדגימת ND של תמציות מימיות של C. salviifolius הפעילה את תכולת הפלבנואידים והפנולים הכוללת הגבוהה ביותר ואת הפעילות המעכבת ביותר של עמילאז ו-o-glucosidase. כפי שניתן בטבלה 4, התמצית המימית של C. salviifolius הראתה פעילות מעכבת טובה יותר על אנזימי עיכול מאשר התמציות האחרות. בנוסף, דגימות IN של התמציות המימיות הכילו כמויות פנוליות ופלבונואידיות נמוכות יותר מדגימות ND ובכך חשפו פעילויות מעכבות אנזימים נמוכות יותר בעבודה הנוכחית. בעוד שהתוכן הפנולי של התמציות הושפע לרעה מהליך העיכול, הם עדיין הפגינו פעילות מעכבת אנזימי עיכול משמעותית. במספר מחקרים, דווח על גליקוזידים פלבנואידים כמטבוליטים העיקריים של תמציות צמחים עם פוטנציאל מעכב חזק של -עמילאז ו-גלוקוזידאז[41-43]בעוד שהמנגנון המעכב של תרכובות פנוליות על אנזימי העיכול עדיין לא נחשף, מבנה- מחקרים על קשרי פעילות בוצעו על כמה מרכיבים פנולים כגון פלבנואידים, חומצות פנוליות, פרואנטוציאנידינים וטאנינים. מחקרי קשרי מבנה-פעילות על פלבנואידים הראו שהקשר הכפול C2=C3 של טבעת ה-C מגביר את פוטנציאל עיכוב אנזימי העיכול של תרכובות כאלה. מכיוון שקשר זה מעלה את צפיפות האלקטרונים, עוצמת האינטראקציה בין הפלבנואיד והאנזים גדלה [44]. בנוסף, קבוצות הידרוקסיל ב-C-5 ו-C-7 מקלות על הפוטנציאל המעכב -עמילאז של פלבנואידים. כמו כן, הוצע כי הידרוקסילציה של שלד הפלבנואידים משפיעה באופן חיובי על הפוטנציאלים המעכבים של א-עמילאז ו-glucosidase שלהם [45]. כפי שצוין קודם לכן, כל הסמנים פלבנואידים במחקר הנוכחי היו גליקוזידים של פלבונול הנושאים דרישות מבניות אלו שתוארו לעיל. עם זאת, לאחר הליך עיכול במבחנה, הפעילות הקשורה אליהם ירדה באופן משמעותי בדגימות ביולוגיות של תמציות מימיות.

באופן כללי, הפוטנציאל המעכב של תמציות הצמחים ב-AGEs קשור למספר גורמים, כלומר, התוכן הפנולי שלהם, פוטנציאל נוגדי חמצון, יכולות קלציית מתכות, אינטראקציות חלבון ופעילויות חסימת קולטן AGE [13]. כפי שמוצג בטבלה 4, דגימות ביולוגיות של התמציות המימיות הציגו פעילויות מעכבות AGE נמוכות יותר בהשוואה לדגימות ND מאחר שהליך העיכול במבחנה השפיע לרעה על תכולת הפנולים של התמציות. על פי תוצאות המחקר הנוכחיות, דגימת ה-ND של תמצית מימית של C. (cistanche and tongkat ali reddit) saluifolius היה בעל הפעילות המעכבת AGE הגבוהה ביותר, כמו גם תכולת פנולים ופלבנואידים. לשם השוואה, דגימת IN של תמצית מימית של C. monspeliensis הראתה את פוטנציאל עיכוב ה-AGE החלש ביותר, אשר עשוי להיות מיוחס לתכולת הפלבנואידים והפנוליים הנמוכים ביותר שלו. מכיוון שלפלבנואידים יש תפוצה רחבה בתמציות צמחים, פירות, ירקות ומשקאות, מספר מחקרים התגברו על פוטנציאל העיכוב של פלבנואידים על תצורות AGE. אותם פלבנואידים שהוקצו כפנולי הסמן במחקר זה דווחו גם כתרכובות הסמן במחקרים אחרים[46-48].

בדומה לעיכוב אנזימי עיכול, פעילויות מעכבות AGE של פלבנואידים עוררו על ידי הקשר הכפול C2=C3 והידרוקסילציה של טבעות A ו-C. עם זאת, התקשרות סוכר לשלד הפלבנואיד מובילה לירידה בפעילות מעכבת [49]. מצד שני, Cervantes-Lauren et al.[50] הציע שלפלבון-3-של גליקוזידים יש פוטנציאל עיכוב AGE גדול יותר מאשר הגליקוזידים הפלבונואידים האחרים. השערה זו עשויה להיות הסבר לירידה בעיכוב ה-AGE בדגימות ביולוגיות. לדוגמה, quercitrin וה-hyperoside לא זוהו בדגימות ביולוגיות של התמצית המימית של C.monspeliensis, וזו הסיבה לפעילות הנמוכה יותר של דגימות IN של C. monspeliensis בהשוואה לתמציות ממינים אחרים. למרות שקוורציטרין לא זוהה בתמצית המימית של C. saloifolius, כמויות גבוהות משמעותית של היפרוזיד וסלידרוזיד עשויות להיות הגורם לפעילות העיכוב הגבוהה של AGE. באופן כללי, נצפה מתאם חיובי בין תכולת הפלבנואידים של הסמן של הדגימות לבין פוטנציאל המעכב שלהם על AGEs.

4. חומר ושיטות

4.1.כימיקלים

כל ההפניות, האנזימים והכימיקלים שהופעלו בניסויים נרכשו מ-Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ארה"ב). בניסויים נעשה שימוש בחומרים בדרגה אנליטית.

4.2.דגימות צמחים

חלקים אוויריים של C.creticus ו-C.saloifolius נאספו מהקמפוס של אוניברסיטת Yeditepe (Kayisdagi, איסטנבול) במהלך השבוע האחרון של אפריל 2018. חלקים אוויריים של C.mon-speliensis ו-C. paroiflorus נאספו מקרבת Alacant Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Ismir בשבוע השני של מאי 2018. חלקים אוויריים של C. laurifolius נאספו מכביש Kemer-Doganhisar, קוניה, בשבוע הראשון של יוני 2018. פרופ' ד"ר ארדם יסילדה אימת חומרים צמחיים. דגימות שובר עבור C. creticus (YEF18013), C. Lauri folium(YEF18017), C.monspeliensis(YEF18015), C.paroiflorus(YEF18016) ו-C.salvifolius (YEF18014) אוחסנו בצמחייה של המחלקה לפארמקוגנוזיה. לרוקחות, אוניברסיטת Yeditepe, איסטנבול, טורקיה. 4.3. נוהל חילוץ

מיצוי מימי נבחר מכיוון שהוא נפוץ כטכניקת הכנה ברפואה המסורתית. החלקים האוויריים מיובשים באוויר ואבקות של מיני Cistus (100 גרם) חולצו במים מזוקקים חמים (80 מעלות, 1.5 ליטר) באמצעות מכשיר ניעור למשך 15 דקות. לאחר מכן, תמציות מימיות סוננו דרך נייר סינון ואדו ליובש בלחץ מופחת. לאחר השלמת הליך הליאופיליזציה, הומסו תמציות במים מזוקקים לעיבוד נוסף (דגימה לא מעוכלת: ND) (תפוקת התמציות: 13.04 אחוז עבור C.creticus, 15.7 אחוז עבור C.laurifolus, 12.8 אחוז עבור C.monspeliensis ,14.94 אחוז עבור C.parviflorus, 14.74 אחוז עבור C.salvifolius). 4.4.שיטת הדמיית עיכול אנושית במבחנה

מודל הדמיית העיכול האנושי יושם על דגימות Cistus במבחנה, בעקבות השיטה שפורטה קודם לכן על ידי Celeb et al.[34]. ראשית, 1 גרם NaCl ו-1.6 גרם פפסין הומסו ב-500 מ"ל מים מזוקקים כדי לקבל תמיסה מדומה של נוזל קיבה (SGF) מאוחר יותר, ה-pH של תמיסת SGF הוסדר ל-2 עם HCl (5 M); 17.5 מ"ל של תמיסה זו היה מעורבב עם 2.5 מ"ל של דגימות צמחים, ותערובת זו הייתה ממוקמת באמבט המים הרועד ב-37 מעלות למשך שעתיים כדי לחקות את התנועות הפריסטלטיות של מערכת העיכול. לאחר שעתיים, הדגימות הוכנסו לאמבט קרח כדי להשבית את התגובות האנזימטיות; 2 מ"ל מהדגימות הוחזקו כדגימה "פוסט קיבה" (PG) לניסויים נוספים. קרום דיאליזה תאית עמוסה בכמות נאותה של NaHCO3 (1 M, pH7) נמצאה בתמיסות הדגימה הקרה; לפיכך, ספיגה במערכת העיכול נחקה. לאחר מכן, 4.5 מ"ל של תמיסת חומצות מרה/פנקריאטין שולבו עם התמיסות, והתערובת הודגרה למשך שעתיים נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות. לבסוף, הנוזל בתוך קרום הדיאליזה נרכש כדגימה "זמינה ביולוגית" (IN). לאחר סיום ההליך, כל הדגימות נשמרו ב--20 מעלות לניסויים נוספים. 4.5. אומדן במבחנה של פרופיל פנולי 4.5.1. Assay Total Phenolic Content קביעה ספקטרופוטומטרית של התוכן הפנולי הכולל של הדגימות בוצעה בתבנית של לוחית באר לפי השיטה שפורטה קודם לכן על ידי ברק וחב'.【32】;75 uL של NagCO3 (20 אחוז ב-H2O ） נוספה ל-20 μL של דגימות ופתרונות ייחוס טריים שהוכנו. לאחר מכן, 100 μL של ריאגנט Folin-Ciocalteu שולבו עם התערובת. לאחר תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, הספיגה נמדדה ב-690 ננומטר. חומצה גאלית שימשה כתמיסת ייחוס בריכוזים שונים כדי ליצור עקומת כיול ותכולת הפנולית הכוללת הובעה כשווי חומצה גאלית (GAE). 4.5.2. Assay Total Flavonoid קביעה ספקטרופוטומטרית של תכולת הפלבנואידים הכוללת של הדגימות נוהלה בתבנית של 96-צלחת באר בהתאם לשיטה שהוסברה קודם לכן על ידי Bardakci et al. 【51】; 150 μL של 75 אחוז אתנול, 10 μL של אלומיניום כלוריד ו-10 μL של 1M נתרן אצטט טריהידראט שולבו עם 50 μL של דגימה ופתרונות ייחוס, בנפרד. לאחר מכן, תערובות אלה הודגרו בטמפרטורת חדר החושך למשך 30 דקות. לאחר תקופת הדגירה, ספיגה חושבה ב-405 ננומטר. קוורצטין שימש כתמיסת ייחוס בריכוזים שונים כדי ליצור עקומת כיול ותכולת הפלבנואידים הכוללת הוצגה כמקבילות קוורצטין (QE).

4.5.3. בדיקת תכולת חומצה פנולית כוללת

תכולת החומצה הפנולית הכוללת של הדגימות נמדדה בספקטרופוטומטריה בעקבות ההליך שדווח בעבר על ידי ברק וחב'. [52]. ראשית, כמויות מתאימות של נתרן ניטריט ונתרן מוליבדאט הומסו במים מזוקקים כדי להשיג את הריאגנט של Arnow. לאחר מכן, 1 מ"ל מהדגימות שולבו עם 1 מ"ל של ריאגנט Arnow, 1 מ"ל של 0.1 M HCl, ו-1 מ"ל של 1 M NaOH, בנפרד. לאחר מכן, נפח התערובת הותאם ל-10 מ"ל עם מים מזוקקים, והספיגה נקראה מיד ב-490 ננומטר. חומצה קפאית שימשה כתמיסת ייחוס בריכוזים שונים כדי לקבל עקומת כיול, ותכולת החומצה הפנולית הכוללת ניתנה כשווי חומצה קפאית (CAE).

4.5.4. בדיקת תכולת פרואנטוציאנידין כוללת

קביעה ספקטרופוטומטרית של תכולת הפרואנטוציאנידין הכוללת של הדגימות בוצעה בתבנית של 96-צלחת באר על ידי ביצוע השיטה של ​​Barak et al. [11]. בקצרה, 25 ul מתמיסות הדגימה עורבבו עם 150 ul של 4 אחוז ונילין ו-75 ul של פתרונות HCl (32 אחוזים), בהתאמה. לאחר זמן דגירה של 15 דקות בטמפרטורת חדר החושך, הספיגה הותאמה ל-492 ננומטר. קטצ'ין הידרט שימש כפתרון ייחוס בריכוזים שונים כדי לקבל עקומת כיול. מתנול שימש כתמיסת בקרה. תכולת הפרואנטוציאנידין הכוללת של הדגימות צוינה כמקבילות קטצ'ין (CE).

4.6. מבחני פעילות ניקוי רדיקליים חופשיים 4.6.1. מבחני פעילות ניקוי רדיקליים DPPH

פעילות סילוק רדיקלי DPPH של הדגימות נקבעה בתבנית של 96-לוחית באר לפי השיטה ששונתה על ידי Celeb et al.[53]. בהתחלה, 150 uM של תמיסת DPPH הוכנה טריה. לאחר מכן, 200 μL של תמיסת DPPH עורבבו עם 25 ul של תמיסות מדגם. לאחר מכן, תערובת זו הודגרה בטמפרטורת חדר החושך למשך 50 דקות. הספיגה חושבה ב-540 ננומטר. בוטיליד הידרוקסיטולואן (BHT) שימש כפתרון ייחוס בריכוזים שונים. מתנול שימש כתמיסת בקרה. פעילות הדגימות הוצגה כ-EC50, המתאים לריכוז המראה 50 אחוזי פעילות.

4.6.2. בדיקת פעילות ניקוי רדיקלית של DMPD

פעילות סילוק רדיקלים של DMPD* (N,N-dimethyl-p-phenylenediamine) של הדגימות בוצעה בתבנית 96-צלחת באר לפי השיטה שתוארה קודם לכן על ידי Inan et al. [13]. ראשית, 10{{10}} mM DMPD פלוס פתרון,0.05 M FeCl; תמיסת 6H2O ומאגר אצטט של 0.01 M הוכנו טרי. לאחר מכן ערבבו 1 מ"ל תמיסת DMPD, 100 מ"ל חיץ אצטט ו-0.2 מ"ל תמיסת FeCl3-6 H2O, ומאוחר יותר שולבו 15 uLof תמיסות דגימה עם 210 μL של תערובת זו. לאחר תקופת הדגירה בטמפרטורת חדר חשוך למשך 50 דקות, הספיגה נמדדה ב-492 ננומטר. Trolox שימש כתמיסת ייחוס בריכוזים שונים כדי לקבל עקומת כיול. הריכוזים של תמיסות הדגימה היו 1 מ"ג/מ"ל. פעילויות ניקוי רדיקליות של DMPD של הדגימות צוינו כמקבילות ל-Trolox (TE). 4.7. מבחני פעילות הפחתת מתכות

4.7.1. מבחן כוח נוגד חמצון מפחית פרז (FRAP)

קביעת פעילות FRAP של הדגימות הושגה בתבנית של 96 בארות בעקבות ההליך שדווח קודם לכן על ידי Bardakci et al.[54]. בתחילת הניסוי, מגיב ה-FRAP נוצר על ידי ערבוב של חיץ אצטט, תמיסות ברזל-טריפירידילטריאזין ו-FeCl;6H2O. לאחר מכן, מגיב ה-FRAP הוכנס לתנור של 37 מעלות למשך 30 דקות. לאחר מכן, 10 ul מתמיסות המדגם שולבו עם 30 μL של מים מזוקקים ו-260 ul של מגיב FRAP, בהתאמה. לאחר זמן הדגירה ב-37 מעלות למשך 30 דקות, הספיגה הותאמה ל-593 ננומטר. עקומה סטנדרטית נבנתה על ידי שימוש במולריות שונות של תמיסת ברזל סולפט (0.25-2 mM) כדי להעריך את התוצאות. BHT שימש כתמיסת ייחוס בריכוזים שונים. פעילויות FRAP של הדגימות הוצגו כ-mM FeSO4 בתמצית יבשה של 1 גרם.

4.7.2.Cupric Reducing Capacity Capacity (CUPRAC)

פעילות ה-CUPRAC של הדגימות נקבעה בתבנית של 96-צלחת באר לפי השיטה ששונתה על ידי Celeb et al. 【31】; 85 μL של CuSO4 （10 mM）, תמיסות ניאוקופרין ואמוניום אצטט ו- 51 μL של מים מזוקקים נוספו ל-43 μL של תמיסות מדגם, בנפרד. לאחר תקופת דגירה (20 דקות) ב-50 מעלות באמבט מים, הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר. חומצה אסקורבית שימשה כתמיסת ייחוס בריכוזים שונים כדי לרכוש עקומת כיול. פעילויות CUPRAC של הדגימות הוצגו כשווי חומצה אסקורבית (AAE). 4.8. מבחן פעילות נוגד חמצון כולל (TOAC)

קביעת פעילות נוגדת החמצון הכוללת של הדגימות בוצעה בתבנית של 96-צלחת באר בעקבות ההליך של Celeb וחב'. [55]. בתחילה, ערבבו כמות מסוימת של נתרן פוספט מונו-בסיסי, אמוניום מוליבדאט טטרהידרט וחומצה גופרתית כדי להשיג את תמיסת ה-TOAC. לאחר מכן, נוספו 300 μL של תמיסת TOAC ל-30 ul של תמיסות מדגם. לאחר תקופת הדגירה ב-95 מעלות באמבט מים למשך 90 דקות, הספיגה נקבעה ב-690 ננומטר. חומצה אסקורבית שימשה כתמיסת ייחוס בריכוזים שונים כדי לרכוש עקומת כיול. פעילויות TOAC של הדגימות הוצגו כשווי חומצה אסקורבית (AAE). 4.9. אומדן מדד הזמינות הביולוגית

מדד הזמינות הביולוגית (BAvI) חושב על פי המשוואה התיאורטית שתוארה על ידי Inan וחב' [13]:

BAVI=CIN/CND "מדד הזמינות הביולוגית" (BAvI) תואר כיחס בין מספר הפנולים בדגימה הביולוגית (IN) לזה שבדגימה הלא מעוכלת (ND). 4.10. כימות של מרקר פלבנואידים על ידי HPTLC

הקביעה הכמותית של ריכוזי סלידרוסיד, היפרוזיד וקוורציטרין בכל דגימות הסימולציה (ND, PG, IN) של התמציות המימיות ממיני Cistus בוצעה על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה בעלת ביצועים גבוהים (HPILC) (CAMAG, Muttenz, שוויץ) בעקבות השיטה שאושרה על ידי Guzelmeric וחב'. [16]. Hyperoside, Salidroside ו- quercitrin הוכנו בריכוזים של 25,50 ו-10{{30}} ug/mL, והריכוזים של תמיסות דגימה טריות הותאמו ל- 10 מ"ג/מ"ל. פתרונות אלו יושמו על לוחות סיליקה ג'ל מגב זכוכית רגילים (20 ס"מ × 10 ס"מ, Merck, Darmstadt, גרמניה) עם נפחים מסוימים （1-5 פתרונות סטנדרטיים μL ופתרונות דגימה של 5 μL) באמצעות מזרקים של 100 μL （ Hamilton, Bonaduz, שוויץ）. הליך היישום בוצע עם מוליך מדגם Linomat 5. תהליך הפיתוח בוצע בתא פיתוח אוטומטי (ADC 2) ואתיל אצטט: דיכלורומתאן. חומצה אצטית. חומצה פורמית: מים (10:25:10) :10:10:10me) נבחרה כפאזה ניידת. לאחר מכן, הלוחות הופקו עם Natural Product Reagent (NPR) (1 גרם חומצה דיפנילבורית 2-אמינואתיל אסטר ב-200 מ"ל אתיל אצטט) במכשיר הטבילה (CAMAG) בעוד היפרוזיד וקוורציטרין נותחו ספקטרופוטומטרית ב-260 ננומטר, כמות הסלידרוזיד נמדדה ב-330 ננומטר על ידי סורק UV. ערכי Rf של הסטנדרטים נקבעו כהיפרוזיד （≈0.35）, quercitrin≈iro5（c）,til45））. 0.65）. מקדמי המתאם (r²) נמצאו להיות ×0.98 לכימות של הסמן פלבנואידים.

4.11. פעילות מעכבת על אנזימים הקשורים לסוכרת 4.11.1. -פעילות מעכבת גלוקוזידאז

פעילויות מעכבות גלוקוזידאז של הדגימות הלא מעוכלות והזמינות ביולוגיות שהתקבלו מהתמציות המימיות של מיני Cistus נבדקו בעקבות השיטה שהוסברה קודם לכן על ידי Balan et al. [56]. ראשית, כמויות מתאימות של מונוסודיום פוספט ודיסודיום פוספט עורבבו עם רכישת חיץ פוספט של 100 mM (pH7). האנזים ac glucosidase הומס במאגר פוספט כדי להשיג את תמיסת -glucosidase (0.2U/mL). לאחר מכן 17 0 ul של חוצץ פוספט, 20 μL מתמיסת -glucosidase ו-20 μL של תמיסות דגימה שולבו והודגרו בתנור של 37 מעלות למשך 15 דקות. לאחר מכן, נוספו לתערובת 20 ul של תמיסה של 2.5 מ"מ p-nitrophenyl- -D-glucopyranoside ב-100 מ"מ אשלגן פוספט חיץ (pH7.0), ותקופת דגירה נוספת בוצעה ב-37 מעלות למשך 15 דקות. לאחר מכן, 80 μL של תמיסה של 0.2 M נתרן קרבונט צורפה לתערובת כדי לסיים את התגובה. הספיגה נמדדה ב-405 ננומטר. תמיסת קוורצטין בריכוזים שונים שימשה כהתייחסות. התוצאות נאמדו כאחוז הפעילות המעכבת בריכוזים של 1 מ"ג/מ"ל ו-0.5 מ"ג/מ"ל של דגימות ND ו-IN של תמציות מימיות של מיני Cistus.

4.11.2. -פעילות מעכבת עמילאז

פעילות מעכבת עמילאז של דגימות לא מעוכלות וזמינות ביולוגית שהתקבלו מתמציות מימיות של מיני Cistus נקבעה על ידי ביצוע ההליך שפורט קודם לכן על ידי Balan et al.[56]. קביעה ספקטרופוטומטרית של פעילויות מעכבות a-עמילאז של הדגימות בוצעה על ידי שימוש ב-DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) מגיב. כאמור בשיטה, מלטוז נוצר מהמרה של העמילן, והצבע הצהוב של DNS אלקליין הופך לצבע כתום-אדום עקב מלטוז המופק מעמילן. לפיכך, הוכנה תמיסת DNS 96 מ"מ מתערובת של תמיסת נתרן אשלגן טרטרט (מומס ב-2 M NaOH) וכמות מסוימת של DNS (מומסת במים מזוקקים). לאחר מכן הוכן 20mM חיץ נתרן פוספט עם 6.7 mM NaCl (קו-פקטור של אנזים a-עמילאז) ב-20 מעלות (pH:6.9). האנזים a-עמילאז (1U/mL) ועמילן (10 mg/mL) הומסו במאגר זה. לאחר מכן, 50 μL של חיץ נתרן פוספט ו-10 μL של תמיסת האנזים a-עמילאז היו מעורבבים עם 20 μL של פתרונות המדגם. תערובת זו הודגרה ב-37 מעלות למשך 45 דקות. לאחר תקופת הדגירה, נוספו לתערובת 20 μL מתמיסת העמילן. תקופת דגירה נוספת החלה ב-37 מעלות למשך 45 דקות. אותו הליך הוחל על הדגימות ללא תוספת של תמיסת אנזים o-עמילאז הנקראת "רקע לדגימה". קבוצת הביקורת נחקרה באותו הליך בהיעדר תמיסות דגימות. הספיגה נמדדה ב-540 ננומטר. אקרבוז שימש כתמיסת ייחוס בריכוזים שונים התוצאות הוצגו כאחוז של פעילות מעכבת בריכוזים של 1 מ"ג/מ"ל ו-0.5 מ"ג/מ"ל של דגימות ND ו-IN מתמציות מימיות של מיני Cistus. 4.11.3. פעילות מעכבת של AGE

פעילות מעכבת AGE של דגימות לא מעוכלות וזמינות ביולוגית מתמציות מימיות של מיני Cistus נקבעה בעקבות השיטה שתוארה על ידי Starow-icz וחב'. [57]. לפני כל תהליך, 1 מ"ג/מ"ל ו-0.5 מ"ג/מ"ל של דגימות ND ו-IN הוכנו טריים. לאחר מכן, 1 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל תמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) נוספה ל-1 מ"ל של תמיסות ND ו-IN לדוגמה. דגימות בקרה הוכנו ללא הוספת תמיסות דגימות ND ו-IN, והדגימות הריקות הוכנו ללא הוספת 0.5 M גלוקוז. לאחר מכן, כל הדגימות המוכנות הודגרו במשך 40 שעות באמבט מים רועד ב-55 מעלות. לאחר סיום תקופת הדגירה, נעשה שימוש בקורא המיקרו-צלחות Thermo ScientificTM VarioskanTMLUXmultimode בטווח עירור של 370 ננומטר/440 ננומטר כדי לחשב את עוצמת הקרינה. קוורצטין שימש כתמיסת ייחוס בריכוזים שונים.

5. מסקנות

במחקר הנוכחי, התמציות המימיות של כל מיני ה-Cistus שתועדו בפלורה הטורקית נחקרו עבור הפרופילים הפנוליים שלהם ופוטנציאלים נוגדי חמצון וסוכרת במבחנה. מכיוון שמרתח או חליטה הם הצורה הנפוצה בתרופות מסורתיות, שימוש בתמציות מימיות להערכת הפעילות במחקרים ניסיוניים חשוב במיוחד. מצד שני, מרכיבים הידרופיליים בתמצית המימית נתונים לסדרה של טרנספורמציות מטבוליות במערכת העיכול לאחר בליעה. לכן להערכת פעילות נכונה של פורמולציות מסורתיות, יש לחקור גם את הפעילויות של המטבוליטים הזמינים הביולוגית.

זהו המחקר הראשון שבוחן את ההשלכות של שיטת הדמיית העיכול האנושי במבחנה על מיני ציסטוס טורקי. בנוסף, פוטנציאל העיכוב של מיני Cistus טורקי על AGEs נחקר במחקר זה בפעם הראשונה. יתרה מזאת, לסאלידרוזיד, היפרוזיד וקוורציטרין נקבעו סמן פלבנואידים, ושינויים בריכוזיהם נוטרו בהליך העיכול במבחנה. בעוד שתכולת פנולים ופעילות נוגדת סוכרת ונוגדי חמצון של התמציות הושפעו לרעה מהליכי עיכול במערכת העיכול, הם עדיין הפגינו פעילות ביולוגית משמעותית. על פי התוצאות, תמצית C. salviifolius זוהתה כצמח החזק ביותר מבחינת תכולת פנולים ופעילות נוגדת חמצון ואנטי סוכרת. לסיכום, לחלקי אוויר ממינים טורקיים יש תוכן פנולי עשיר ופעילות נוגדת חמצון ואנטי סוכרת פוטנציאלית. בעוד ששיטת הדמיית העיכול במבחנה הופעלה כדי להעריך את הזמינות הביולוגית, ייתכן שהיא לא מחקה באופן מלא את המסלולים המטבוליים המתרחשים באורגניזם. לכן, נדרשים מחקרים נוספים in vivo וקליניים כדי להעריך את הזמינות הביולוגית של התרכובות הפנוליות ותרומתם להשפעות הפרמקולוגיות המדווחות בפירוט.

תרומות מחבר:המשגה, YI, EC, EY; מתודולוגיה, YI, SA, IK, ניתוח פורמלי של EC, YI, IK.-C., SA; חקירה, י"י, יק.-ג, ס"א; משאבים, YI, IK.SA, EC ו-EY; אוצרות נתונים, YI, IK-C., SA; כתיבה--YI, כתיבה-סקירה ועריכה, YI, EC, EY; הדמיה, YI; פיקוח, EC ו-EY כל המחברים קראו והסכימו לגרסה שפורסמה של כתב היד.

מימון:מחקר זה לא קיבל מימון חיצוני. הצהרת ועדת הביקורת המוסדית: לא רלוונטי. הצהרת הסכמה מדעת: לא רלוונטי.

הצהרת זמינות נתונים:הנתונים המוצגים במחקר זה זמינים לפי בקשה מהמחבר המקביל.

ניגוד עניינים:המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים.

זמינות לדוגמה:דוגמאות של התרכובות אינן זמינות מהמחברים.

מאמר זה מופק מ-Molecules 2021, 26, 5322. https://doi.org/10.3390/molecules26175322 https://www.mdpi.com/journal/molecules