MTHFD2 הוא נקודת ביקורת מטבולית השולטת על גורם ותפקוד תאי T מווסתים

תקציר גרפי

מחברים:

Ayaka Sugiura, Gabriela Andrejeva, Kelsey Voss, ..., Ashutosh K. Mangalam, Joshua D. Rabinowitz, Jeffrey C. Rathmell

הִתכַּתְבוּת:

jeff.rathmell@vumc.org

בקיצור :

סינתזת נוקלאוטידים נדרשת כדי לתמוך בשגשוג מהיר של תאי T. סוגיורה וחב'. מראים שחילוף החומרים של פורין דה נובו מאותת על התמיינות ותפקוד תאי T ומזהים את MTHFD2 כנקודת ביקורת מטבולית ומטרה טיפולית למחלות דלקתיות.

עיקרי הדברים

• MTHFD2 הוא קריטי עבור תאי CD4 T מופעלים כדי לשמור על סינתזת פורין דה נובו

• MTHFD2 לא מספיק מקדם פנוטיפים דמויי תאי Treg ומטבוליזם בתאי Th17 d עיכוב של MTHFD2 מדכא איתות mTORC1 ומשנה מתילציה של היסטון

• MTHFD2 יכול להיות ממוקד כדי להגן מפני דלקת ואוטואימוניות in vivo

MTHFD2 הוא מחסום מטבולי השולט על הגורל והתפקוד של תאי T מווסתים

איאקה סוגיורה,¹גבריאלה אנדרייבה,¹קלסי ווס,¹דארן ר' היינצמן,¹שינצ'נג שו,⁵מתיו ז' מאדן,¹שיאנג יה,¹קתרין ל. בייר,¹נוורין או. צ'ודהורי,²מליסה מ. וולף,²אריסה סי יאנג,¹דלטון ל. גרינווד,¹אליסון אי סוול,¹שיילש ק' שאהי,³סמנתה נ. פרידמן,³אלנה מ. קמרון,⁴פטריק פורך,⁴טים בורן,⁴חואן סי גרסיה-קנבורס,⁵ג'ון קריג'וליץ',¹שחר סי ניוקומב,²אשוטוש ק' מנגלם,³יהושע ד' רבינוביץ,⁵וג'פרי סי רתמל^1,6,*

¹מרכז ונדרבילט לאימונוביולוגיה, המחלקה לפתולוגיה, מיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז רפואי אוניברסיטת ונדרבילט, נאשוויל, TN 37232, ארה"ב

²המחלקה לרפואה, חטיבה להמטולוגיה ואונקולוגיה, המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט, נאשוויל, TN 37232, ארה"ב

³המחלקה לפתולוגיה, אוניברסיטת איווה, איווה סיטי, IA 52242, ארה"ב

⁴Sitryx Therapeutics Limited, Magdalen Centre, Oxford Science Park, Oxford, UK

⁵המחלקה לכימיה, מכון לחקר הסרטן לודוויג סניף פרינסטון, מכון לואיס-סיגלר לגנומיקה אינטגרטיבית, אוניברסיטת פרינסטון, פרינסטון, ניו ג'רזי 08544, ארה"ב6 איש קשר מוביל

*התכתבות: jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

סיכום

גירוי אנטיגני מקדם תכנות מחדש מטבולי של תאי T כדי לעמוד בדרישות מוגברות של ביו-סינטטי, ביו-אנרגטי ואיתות. אנו מראים כי האנזים המטבוליזם בעל פחמן אחד (1C) methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2 (MTHFD2) מסדיר סינתזה דה נובו של פורין ואיתות בתאי T מופעלים כדי לקדם שגשוג וייצור ציטוקינים דלקתיים. בתאי T helper-17 (Th17) פתוגניים, MTHFD2 מנע וויסות עלייה חריג של גורם השעתוק FoxP3 יחד עם רווח לא הולם של יכולת דיכוי. מחסור ב-MTHFD2 גם קידם התמיינות תאי T (Treg) רגולטורית. מבחינה מכאנית, עיכוב MTHFD2 הוביל לדלדול מאגרי הפורין, הצטברות של תוצרי ביניים ביו-סינתטיים של פורין וירידה באיתות mTORC1 של חיישן תזונה. MTHFD2 היה קריטי גם לוויסות מתילציה של DNA והיסטון בתאי Th17. חשוב לציין, מחסור ב-MTHFD2 הפחית את חומרת המחלה במספר מודלים של מחלות דלקתיות in vivo. MTHFD2 הוא אפוא נקודת ביקורת מטבולית לשילוב חילוף החומרים של פורין עם איתות של תאי אפקטור פתוגניים ומהווה יעד טיפולי פוטנציאלי בתוך מסלולי מטבוליזם 1C.

מבוא

גיוס אפקטיבי של התגובה החיסונית האדפטיבית דורש הפעלה חזקה של תאי CD4 פלוס T כדי לעבור צמיחה והתפשטות תאים מהירה. זה כרוך בתכנות מחדש מטבולי, המונע על ידי חיישן התזונה mTORC1, ממצב מנוחה קטבולי למצב צמיחה אנבולי עם דרישות ביוסינתטיות, ביו-אנרגטיות ואותות מוגברות. בהתאם לסביבה של הציטוקינים, תאי CD4 פלוס T מתמיינים לאפקטור וכן תת-קבוצות רגולטוריות שיש להן תוכניות מטבוליות מובחנות המניעות את תפקודי האפקטור שלהם (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). האיזון של תת-קבוצות אלה הוא קריטי לחסינות תקינה תוך מניעת מחלות דלקתיות ואוטואימוניות. לדוגמה, טרשת נפוצה (MS) מאופיינת על ידי עלייה בתאי T helper-17 (Th17) המייצרים אינטרלוקין-17 (IL- 17) וירידה או לא יעילה של תאי T (Treg) מווסתים מדכאים (Dendrou et al., 2015). התמקדות בתוכניות המטבוליות הספציפיות של תת-קבוצות תאי T אלה מציעה גישה חלופית לאימונותרפיה.

טיפול המבוסס על חילוף חומרים בתאים החל בשנת 1948 כאשר תרופות כימותרפיות נוגדות פולאט הוכחו כיעילות בילדים עם לוקמיה לימפובלסטית חריפה (Farber et al., 1948). פולאט תורם למטבוליזם של פחמן אחד (1C) לביוסינתזה של פורין, יצירת תורמי מתיל ושמירה על איזון חיזור תאי (Ducker and Rabinowitz, 2017; Yang and Vousden, 2016). תרופות רבות, כולל methotrexate (MTX), fluorouracil (5-FU), ו-mercaptopurine (6-MP), פותחו מאז כדי למקד את המסלול הזה. תאים המתרבים במהירות, כולל תאים סרטניים ותאי T מופעלים, חולקים תלות במסלולים אלה לסינתזה של DNA ו-RNA. MTX נשאר בשימוש נפוץ לטיפול במחלות אוטואימוניות כמו דלקת מפרקים שגרונית (RA) (Brown et al., 2016). עם זאת, בגלל הביטוי הרחב של האנזימים הממוקדים, סוכנים טיפוליים אלה קשורים לתופעות לוואי שכיחות ועלולות להיות חמורות. זיהוי מטרות לאנזים מטבוליים החשובים באופן סלקטיבי באוכלוסיות תאים מעוררות עניין עשוי להוביל לפיתוח של טיפולים אימונותרפיים בטוחים ויעילים יותר.

מטבוליזם 1C כולל את מחזורי הפולאט והמתיונין עם העברה של יחידות פחמן בודדות. סרין משמש כתורם 1C להפעלת טטרה-הידרופולאט (THF) ל-5,10-מתילן-THF, עם ייצור נלווה של גליצין. לאחר מכן ניתן לחמצן 5,10-methyleneTHF באמצעות NAD(P) כדי ליצור את מבשר הפורין 10- formylTHF. לחלופין, ניתן לסנתז 10-formylTHF מפורמט ו-THF באופן תלוי ATP. במסלול הציטוזולי, ייצור 10-fomylTHF מתווך על ידי methyleneTHF dehydrogenase 1 (MTHFD1). אובדן של MTHFD1 מרעיב את התאים ל-10-formylTHF ציטוזולי, ביטול יכולת ביו-סינתזה של פורין ומוטציות ב-MTHFD1 גורמות לכשל חיסוני משולב חמור (SCID) (Field et al., 2015). המסלול המיטוכונדריאלי מסתמך על מיטוכונדריאלי MTHFD2 ו-MTHFD1-כמו (MTHFD1L).

איור 1. מטבוליזם 1C ו-MTHFD2 מווסתים ב-CD4 משופעל^ועודתאי T ובהקשר של EAE

(א) שינוי במינים של חילוף החומרים הנוקלאוטידים ב-CD4 המובחן במבחנה^ועודתת-קבוצות של תאי T בהשוואה לתאים תמימים שנמדדו באמצעות ספקטרומטריית מסה (n=3 שכפולים ביולוגיים).

(ב) זרימת עבודה להקרנת CRISPR ממוקדת במודל דלקת ריאות in vivo.

(ג) שינוי בשפע ה-gRNA מ-1C ממוקד מטבוליזם in vivo סקר CRISPR ב-CD4 ראשוני^ועודתאי T (ניתוח סטטיסטי שבוצע על ידי MAGeCK, n=3 שכפולים ביולוגיים).

(ד) ביטוי mRNA של גנים שזוהו ב-(C) במהלך פיתוח והפעלה של תאי T (נתונים מדפדפן הנתונים ImmGen RNA-seq).

(E) ביטוי חלבון של גנים שזוהו ב-(C) ב-CD4 נאיבי ומופעל^ועודתאי T (נתונים ממשאב הפרוטאום האימונולוגי [ImmPRes]).

(F) ביטוי mRNA של גנים המזוהים ב-(C) בדם מלא של אנשים עם ההפרעות הדלקתיות המצוינות ביחס ליחידי בקרה בריאים (Aune et al., 2017). RA-MTX, RA בטיפול MTX; SLE, זאבת אדמנתית מערכתית; MS-Tx נאיבי, טרשת נפוצה נאיבית לטיפול בזמן האבחון; טרשת נפוצה מבוססת, טרשת נפוצה בטיפול ובהפוגה במחלה; n=3–8 תורמים.

(G) IHC מציג צביעת CD3 ו-MTHFD2 בקטע cauda equina של חוט השדרה של עכברים עם EAE סימפטומטי בהגדלה של 2003 (עליון; סרגל קנה מידה, 100 מ"מ) ו-4003 (תחתון; סרגל קנה מידה, 50 מ"מ) (הנתונים מייצגים של שני ניסויים עצמאיים).

(H ו-I) ממוצע (H) עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) ו-(I) ביטוי mRNA של MTHFD2 ב-CD4^ועודתאי T מהטחול ומחוט השדרה של עכברים עם EAE סימפטומטיים וטחול של עכברי בקרה (ממוצע ± SD, ANOVA חד כיווני, נתונים מייצגים שני ניסויים עצמאיים עם 6 שכפולים ביולוגיים בסך הכל).

(J) ביטוי mRNA של MTHFD2 ב-CD4 לא מובחן^ועודתאי T 0, 5 ו-24 שעות לאחר הפעלה עם נוגדנים אנטי-CD3 ואנטי-CD28 (ממוצע ± SD, ANOVA חד כיווני, n=3 שכפולים ביולוגיים).

(K) MTHFD2 MFI יחסית במשך 5 ימים לאחר הפעלה בתת-קבוצות של תאי CD4 פלוס T, מנורמל לתאים במנוחה (ממוצע ± SD, n=3 שכפולים ביולוגיים). ראה גם איור S1. תוצאות מובהקות סטטיסטית מסומנות (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0.001,="" ****="" p="" אחוז="">

MTHFD2 הוא אחד הגנים המושרים ביותר ומבוטאים ביותר בכל הגידולים (Nilsson et al., 2014). אף על פי שהוסרו באופן נרחב במהלך העובר, ל-MTHFD2 יש מעט עד אין ביטוי ברוב הרקמות הבוגרות (Nilsson et al., 2014). בטיפול אנטי-סרטני (Zhu ו-Leung, 2020), עיכוב MTHFD2 עלול להוביל לעקה חמצונית מוגברת (Ju et al., 2019; Wan et al., 2020), תלות בגליצין (Koufaris et al., 2016) וחוסר מספיק סינתזה של פורין (Ben-Sahra et al., 2016; Pikman et al., 2016). מחסור ב-MTHFD2 יכול גם לדכא את פעילות mTORC1 באמצעות מנגנונים מרובים, כולל באמצעות דלדול גואנין ועיכוב שלאחר מכן של ה-mTORC 1-מפעיל GTPase Rheb (Emmanuel et al., 2017). מחסור ב-MTHFD2 גורם גם להצטברות של תוצרי ביניים במסלול סינתזה של פורין, כולל האנלוג של אדנוזין מונופוספט (AMP) 5-aminoimidazole carboxamide ribonucleotide (AICAR) (Ducker et al., 2016), שיכול להפעיל חלבון קינאז מופעל על ידי AMP (AMPK) לעכב את mTORC1 (Su et al., 2019).

מכיוון שמטבוליזם 1C משלב מספר כניסות תזונתיות וניתן לפתרון טיפולי, בדקנו את התפקיד של 1Cmetabolism ב-CD4^ועודT effector (Teff) ותתי קבוצות של תאי Treg. באמצעות סקר ממוקד ללא משוא פנים in vivo CRISPR-Cas9- בתאי T עכבריים ראשוניים, זיהינו את MTHFD2 כהיט שגם הוסרה באופן עקבי אצל אנשים עם הפרעות דלקתיות. יש לציין כי מחסור ב-MTHFD2 פגע בשגשוג ובתפקוד תאי Teff. מחסור ב-MTHFD2 גם קידם ביטוי חריג של FoxP3 ופעילות מדכאת בתאי Th17 תוך קידום התמיינות תאי Treg. השפעות אלו היו קשורות להצטברות של AICAR, מופחתת ריכוזי פורין, ויסות מטה של ​​איתות mTORC1, הגברת חילוף החומרים של המיטוכונדריה ושינוי מתילציה של DNA והיסטון. In vivo, מיקוד MTHFD2 מוגן מפני מודלים מרובים של מחלות דלקתיות. נתונים אלה מראים ש-MTHFD2 משמש כנקודת ביקורת מטבולית בתאי Th17 ו-Treg ומדגישים את הפוטנציאל של אנזים זה כמטרה לטיפול אימונותרפי אנטי דלקתי.

תוצאות

מטבוליזם 1C וסינתזה של פורין פעילים באופן דיפרנציאלי ב-CD4^ועודתת-קבוצות של תאי T

שיערנו שסינתזת נוקלאוטידים עשויה להיות שונה בין CD4^ועודתת-קבוצות של תאי T. CD4^ועודתאי T התמיינו במבחנה לתאי Th1, Th17 ו-Treg ונאספו לאחר 72 שעות עבור ספקטרומטריית מסה. כמויות מיני נוקלאוטידים עלו בדרך כלל בכל תת-הקבוצות בהשוואה לתאים תמימים (איור 1A). יש לציין כי תוצרי ביניים של סינתזת פורין היו בשפע באופן דיפרנציאלי, עם ההצטברות הגבוהה ביותר של גליצינאמיד ריבונוקלאוטיד (GAR), 1-(פוספוריבוסיל) אימידאזול קרבוקסמיד (SAICAR), ו-AICAR בתאי Th17 (איור S1A).

כדי לבדוק את התלות של CD4^ועודתאי T על אנזימים במטבוליזם 1C, ביצענו סקר מבוסס CRISPR-Cas9-in vivo ב-CD4 הראשי^ועודתאי T (איור 1B). ספריית RNA מדריך (gRNA) מותאמת אישית נבנתה כדי למקד לאנזימים במטבוליזם של 1C, יחד עם קומפלקס טרשת 2 (TSC2) כביקורת חיובית ובקרות שליליות ללא מיקוד (NTCs). CD4^ועודתאי T מבודדים מקולטן T תאים ספציפי לאובלבומין (TCR) מהונדס OT-II Cas9 עכברים טרנסגניים כפולים הועברו עם ספרייה זו והועברו תוך ורידי לתוך Rag1^{__ /__}מארחים. לאחר מכן חוסנו עכברים עם OVA תוך-אף כדי לגרום לדלקת ריאות. תאי T שהתאוששו מהריאות של עכברים אלה עברו רצף, ונקבעה העשרה או דלדול של gRNAs ביחס לתדרי הקלט. TSC2 gRNA הועשר, ותמך בתפקיד המעכב של חלבון זה בתאי T. לעומת זאת, רכיבי gRNA של PPAT, AHCY, MAT2A ו-MTHFD1 התרוקנו באופן משמעותי, ו-GART, DHFR, DNMT1, MTRR, MTR, SHMT2 ו-MTHFD2 הצטמצמו במידה פחותה, מה שמצביע על כך שגנים אלו תורמים לשגשוג תאי T ולתפקוד דלקתי in vivo (איורים 1C ו-S1B).

לאחר מכן בדקנו את פרופיל הביטוי של הגנים שזוהו מהמסך. למרות שכולם הווסרו בצורה קואורדינטיבית בפיתוח תימוציטים, MTHFD2 mRNA וחלבון הושררו בצורה החזקה ביותר בתאי T היקפיים מגורים (איורים 1D ו-1E). יתרה מכך, במערך נתונים של ריצוף RNA (RNA-seq) שפורסם בנפרד מדם מלא של אנשים עם מגוון מחלות דלקתיות ואוטואימוניות (Aune et al., 2017), MTHFD2 בא לידי ביטוי יתר באופן עקבי על פני מצבים מרובים, כולל קוליטיס כיבית, מחלת קרוהן. , מחלת צליאק, RA, זאבת אדמנתית מערכתית (SLE), פסוריאזיס, דלקת מפרקים פסוריאטית, תסמונת Sjo¨ gren וטרשת נפוצה (איור 1F). יש לציין, לאנשים עם טרשת נפוצה שאובחנה לאחרונה ביטוי MTHFD2 מוגבר באופן משמעותי ביחס לתורמים בריאים או אנשים עם טרשת נפוצה שעברו טיפול עם הפוגה במחלה (איור S1C). לפיכך, CD4^ועודשגשוג והישרדות של תאי T תלויים בגנים מסוימים של מטבוליזם 1C, והביטוי של גנים אלה שונה בשלבי ההתפתחות, ההפעלה וההתמיינות של תאי T, כמו גם במצב של דלקת פתולוגית.

איור 2. מחסור ב-MTHFD2 פוגע ב-CD4^ועודשגשוג ותפקוד תאי T

(א-ד) ריבוי נמדד על ידי (A) דילול CellTrace Violet (CTV), (B) כדאיות, (C) ביטוי CD25 ו-(D) ביטוי TF ב-CD4^ועודתת-קבוצות של תאי T שטופלו ב-MTHFD2i במשך 72 שעות לאחר ההפעלה (ממוצע ± SD, ANOVA חד כיווני, נתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים עם 9 שכפולים ביולוגיים בסך הכל).

MTHFD2 מווסת מאוד ב-CD4 החודר ל-CNS^ועודתאי T באנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) וב-CD4 משופעל^ועודתאי T במבחנה

ויסות MTHFD2 לא תואר היטב בתאי CD4 פלוס T. כדי למדוד את הביטוי של MTHFD2 בנגעים דלקתיים in vivo, CD4^ועודתאי T מעכברי TCR מהונדסים 2D2 ספציפיים למיאלין הופעלו והועברו באופן אימוץ לתוך Rag1^{__ /__}עכברים כדי לעורר EAE. לאחר שהעכברים החלו להפגין שיתוק ברגליים האחוריות, קטע ה-cauda equina של חוט השדרה נותח על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC). עכברים שקיבלו תאי T 2D2 הראו העשרה של MTHFD2 ו-CD3^ועודתאים שנעדרו בבקרה (איור 1G). כדי לקבוע ישירות אם CD4^ועודתאי T העלו ויסות של MTHFD2 בנגעים דלקתיים, תאי T מהטחול ומחוט השדרה של עכברים שהועברו לגליקופרוטאין של מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG) ומודל המושרה על רעלן שעלת (PTX) של EAE נאספו לצורך ניתוח. CD4 חודר למערכת העצבים המרכזית^ועודתאי T ביטאו יתר על המידה MTHFD2 בהשוואה ל-CD4 בטחול תואם^ועודתאי T מעכברי בקרה ו-EAE, כפי שנמדדו על ידי ציטומטריית זרימה (איור 1H) ו-qRT-PCR (איור 1I). הקינטיקה של ביטוי MTHFD2 ב-CD4^ועודבשלב הבא נמדדו תאי T במבחנה. וויסות עלייה חזק של mRNA MTHFD2 זוהה לאחר 5 שעות של גירוי והחל לרדת ב-24 שעות (איור 1J), בעוד CD4 מובחן^ועודתת-קבוצות של תאי T השיגו את הביטוי הגבוה ביותר של חלבון MTHFD2 48 שעות לאחר ההפעלה (איור 1K). נתונים אלה מראים כי MTHFD2 מווסת ב-CD4^ועודתאי T עם הפעלה במבחנה ובאתר הדלקת in vivo.

CD4^ועודתת-קבוצות של תאי T דורשות באופן דיפרנציאלי MTHFD2 להפעלה, התפשטות, הישרדות וייצור ציטוקינים

בשלב הבא בדקנו את התפקיד של MTHFD2 בהפעלה, התמיינות, התפשטות ותפקוד של תאי T-CD4 פלוס. CD4^ועודתאי T הופעלו במבחנה בנוכחות ציטוקינים עבור התמיינות אופטימלית של תאי Th1, Th17 ו-Treg ועורק או מעכב MTHFD2 (MTHFD2i; DS18561882) (Kawai et al., 2019). לאחר 72 שעות, כל תת-הקבוצות הפחיתו את ההתרבות (איור 2A) ומספרם של תאים חיים ברכיבה על אופניים (איורים S2A ו-S2B). הכדאיות הופחתה בתאי Th1 ו-Th17 (איור 2B), וההפעלה, כפי שנמדדה על ידי ביטוי CD25, הופחתה בכל תת-הקבוצות (איור 2C). ביטוי של גורם שעתוק המאפיין שושלת (TF) הופחת בתאי Th1 (T-bet^ועוד) אך ללא שינוי בתאי Th17 (ROR t^ועוד) ושונה באופן מינימלי בתאי Treg (FoxP3^ועוד) (איור 1D). כדי למדוד תפקוד תאי Teff, תאים עוררו מחדש עם 12-myristat 13-אצטט (PMA) ואיונומיצין. פחות מובהק תאי Th1 ביטאו אינטרפרון-g (IFNg), ופחות תאי Th17 ביטאו IL-17 כאשר התמיינו בנוכחות MTHFD2i (איור 2E). זה לא נבע מפגיעה בהפעלה הראשונית מכיוון שפנוטיפים אלו נשמרו כאשר החשיפה לתרופה נדחתה עד 24 שעות לאחר ההפעלה, אם כי ביטוי TF המאפיין את הגיל לא השתנה בהגדרה זו (איורים S2C-S2F). לכן נדרש MTHFD2 עבור CD4 מקסימלי^ועודהפעלת תאי T, שגשוג, הישרדות וייצור ציטוקינים.

כדי לאמת גנטית את ההשפעות הפרמקולוגיות הללו, יצרנו Mthfd2^fl/flזן עכבר והצליב אותו עם Cd4- cre עכברים מהונדסים כדי להשיג מחיקה גנטית מותנית. כצפוי, הופעל CD4^ועודתאי T מ-Mthfd2^fl/flCd4-cre plus (CD4^ΔMthfd2עכברים היו בעלי ביטוי נמוך יותר של MTHFD2 בהשוואה לתאים מ-Mthfd2^fl/flתקליטור4-cre^ועוד(איור 2F). בקו הבסיס, לעכברי CD4DMthfd2 היה מעט פחות CD4^ועודתאי T בטחול בהשוואה ל-WT (איור 2G). עם הפעלה והתמיינות במבחנה, מספרי תאים וכדאיות של CD4^ΔMthfd2תאי Th17, ובמידה פחותה, תאי Treg היו נמוכים משמעותית (איור 2H). בנוסף, ביטוי CD25 ירד בתאי Th17 ו-Treg ונטה במגמה נמוכה יותר בתאי Th1 (איור 2I). לבסוף, CD4^ΔMthfd2לתאי Th1 ו-Th17 היה ביטוי נמוך יותר של T-bet ו-ROR t, בהתאמה. FoxP3 בתאי Treg, לעומת זאת, לא השתנה (איור 2J). למרות השינויים בביטוי TF, תאי Teff שאכן התמיינו יצרו כמויות נורמליות של ציטוקינים (איור 2K). ניתן לייחס הבדלים בתוצאות בין הגישות התרופתיות והגנטיות לתזמון ולשלמות של אובדן תפקוד האנזים במהלך הפיתוח ולמנגנוני פיצוי פוטנציאליים.

ה-MTHFD2i גורם לביטוי FoxP3 בתאי Th17 ומשפר את ההתמיינות של תאי Treg

לאור התלות של תאי Teff ב-MTHFD2, בדקנו ויסות MTHFD2i של תאי FoxP3 ו-Treg. יש לציין, טיפול ב-MTHFD2i גרם לוויסות עלייה חריג של FoxP3 ב-Th1 ובולט יותר בתאי Th17 באופן תלוי מינון (איור 3A). זה התרחש גם כאשר הטיפול התעכב עד 24 שעות לאחר ההפעלה (איור 3B). מגמה דומה נצפתה בתאי CD4DMthfd2 Th17 (איור 3C). הרגולציה העליונה של FoxP3 הייתה פונקציונלית מכיוון שתאי Th17 שטופלו ב-MTHFD2i השיגו יכולת דיכוי כאשר תורבו יחד עם CD8^ועודתאי T (איור 3D). ה-MTHFD2i יכול לפיכך לקדם פנוטיפים דמויי תאי FoxP3 ו-Treg בתאי Th17. ה-MTHFD2i גם הגביר את ההתמיינות של תאי Treg המושרים. תאי Treg התמיינו עם מגוון ריכוזי גורם גדילה b (TGF-b) משתנה בנוכחות ה-MTHFD2i. בכל ריכוז שנבדק למעט הגבוה ביותר, ביטוי FoxP3 עלה עם טיפול ב-MTHFD2i (איורים 3E ו-3F). פנוטיפ זה נשמר גם עם טיפול מושהה ב-MTHFD2i (איור 3G).

איור 3. מחסור ב-MTHFD2 גורם לביטוי FoxP3 ומקדם מעבר לעבר זרחון חמצוני

(א) ביטוי FoxP3 בתאי Th1 ו-Th17 שטופלו ב-MTHFD2i 72 שעות לאחר ההפעלה (ממוצע ± SD, ANOVA חד כיווני, הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים עם 9 שכפולים ביולוגיים בסך הכל).

(ב) ביטוי FoxP3 בתאי Th1 ו-Th17 הופעלו למשך 24 שעות ולאחר מכן טופלו עם כלי רכב או 500 ננומטר MTHFD2i למשך 48 שעות (ממוצע ± SD, מבחן t לא מזווג, הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים עם 9 שכפולים ביולוגיים בסך הכל).

(ג) ביטוי FoxP3 בתאי Th1 ו-Th17 מחברי המלטה של ​​WT ו-CD4DMthfd2 72 שעות לאחר ההפעלה (ממוצע ± SD, בדיקת t לא מזווגת, הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים עם 9 שכפולים ביולוגיים בסך הכל).

(ד) בדיקת דיכוי המודדת את יכולת הדיכוי החריגה של תאי Th17 שטופלו ב-MTHFD2i. תאי Th17 שטופלו מראש תורבו יחד עם תאי CD8 פלוס T שנצבעו ב-CTV כדי למדוד שגשוג עם הפעלה עם נוגדנים אנטי-CD3 ואנטי-CD28 (ממוצע ± SD, ANOVA חד כיווני, n=3 שכפולים ביולוגיים) .

(ה) ביטוי FoxP3 בתאי Treg התמיינו עם טווח של ריכוזי TGF-b וטופלו עם MTHFD2i (ממוצע ± SD, מבחן t לא מזווג, הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים עם 9 שכפולים ביולוגיים בסך הכל).

(ו) זרימה ציטומטריית חלקות עבור נתונים בטבלה (E).

(ז) ביטוי FoxP3 בתאי Treg שהופעל והתמיין עם ריכוזים נמוכים של TGF-b למשך 24 שעות ולאחר מכן טופלו עם MTHFD2i למשך 48 שעות (ממוצע ± SD, מבחן t לא מזווג, הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים עם 9 שכפולים ביולוגיים בסך הכל ).

(ח) מבחן מאמץ של Seahorse XF Cell Mito שבוצע על תאי Th17 ו-Treg שטופלו ב-MTHFD2i (ממוצע ± SD, n=3 שכפולים ביולוגיים).(I) Basal ECAR, Basal OCR, max OCR ו-Basal OCR/ECAR יחס נמדד ב-(H) (ממוצע ± SD, בדיקת t לא מזווגת, הנתונים מייצגים שני ניסויים עצמאיים עם 6 שכפולים ביולוגיים בסך הכל). תוצאות מובהקות סטטיסטית מסומנות (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p אחוז 0.001).

לתאי Treg יש מטבוליזם מיטוכונדריאלי גדול יותר מתאי Th17 (Michalek et al., 2011). כדי לקבוע את ההשלכות המטבוליות של טיפול ב-MTHFD2i, תאי Th17 ו-Treg הוערכו על ידי ניתוחי שטף חוץ-תאי. ה-MTHFD2i העלה את קצב צריכת החמצן הבסיסי והמקסימלי (OCR) של תאי Th17 כדי להצביע על שינוי לכיוון נשימה מיטוכונדריאלית (איור 3H). לעומת זאת, לתאי Th17 ו-Treg היה ירידה בשיעור החמצה החוץ-תאית הבסיסית (ECAR) עם טיפול ב-MTHFD2i, מה שמרמז על הגליקוליזה מופחתת (איור 3I). היחס הבסיסי של OCR ל-ECAR גדל באופן משמעותי בתאי Th17 ו-Treg מכיוון שה-MTHFD2i העביר את התוכנית המטבולית מגליקוליזה לכיוון זרחון חמצוני. נתונים אלה מראים שה-MTHFD2i משפר את ביטוי FoxP3 בתאי Th17 ותאי Treg שהתמיינו בתנאי TGF-b נמוך ומעביר את תאי Th17 למטבוליזם דמוי תאי Treg יותר.

מחסור ב-MTHFD2 בתאי CD4 פלוס T אנושיים מקטין את התפשטות תאי Th17 ואת הכדאיות תוך הגברת ביטוי FOXP3 והפחתת פעילות mTORC1

כדי לבדוק את יכולת התרגום של הממצאים לעיל לתאים אנושיים, CD4^ועודתאי T שבודדו מדם היקפי של תורמים בריאים התמיינו במבחנה לתאי Th1, Th17 ו-Treg וטופלו באמצעות כלי או MTHFD2i מרגע ההפעלה. התפשטות ירדה באופן משמעותי בתאי Th17 ו-Treg שטופלו ב-MTHFD2i (איור 4A), וגם תאי Th17 הפגינו אפופטוזיס מוגברת (איור 4B). ירידה בשגשוג בתאי Th17 הוחזרה בגישה גנטית באמצעות RNA מתערב קטן (siRNA) (איורים 4C ו- S2G). בדומה לתאי עכברים, ביטוי FOXP3 היה גבוה יותר בתאי Th17 אנושיים שטופלו ב-MTHFD2i ומגמה גבוהה יותר בתאי Treg אנושיים שטופלו ב-MTHFD2i (איורים 4D ו-S2H). בהתחשב בכך שציר mTORC1-AMPK הוא קריטי להתמיינות תאי Th17 ו-Treg, נמדדה גם זרחון של חלבון היעד הריבוזומי mTORC1 S6 (phospho-S6). זה הראה ירידה בפעילות mTORC1 בתאי Th17 עם MTHFD2i או siMTHFD2 (איור 4E). לפיכך, ניתן לשחזר את אובדן יכולת ההתרבות והשראת ביטוי FOXP3 בתאי Th17 ו-Treg ב-CD4 אנושי ראשוני.^ועודתאי T.

איור 4. מחסור ב-MTHFD2 פוגע בשגשוג וגורם לביטוי FOXP3 בתאי Th17 אנושיים

(א) שגשוג נמדד על ידי דילול CTV בתת-קבוצות של תאי CD4 בתוספת T אנושיים שטופלו עם כלי רכב או 2 mM MTHFD2i במשך 72 שעות לאחר הפעלה עם נוגדנים אנטי-CD3 ואנטי-CD28 (מבחן t מזווג, הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים עם 5 -6 תורמים בריאים).

(ב) אפופטוזיס נמדד על ידי אנקסין V בתאי CD4 בתוספת T אנושיים שטופלו ב-MTHFD2i במשך 72 שעות (מבחן t בצמד, הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים עם 5-6 תורמים בריאים).

(ג) ביטוי Ki-67 בתאי CD4 פלוס T אנושיים שהועברו עם NTC או siMTHFD2 (מבחן t בצמד, הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים עם 4 תורמי חולים בריאים).

(ד) ביטוי FOXP3 בתאי CD4 בתוספת T אנושיים שטופלו ב-MTHFD2i במשך 72 שעות (מבחן t בצמד, הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים עם 6-10 תורמים בריאים).

(ה) שינוי בביטוי phospho-S6 בתאי CD4 בתוספת T אנושיים שטופלו ב-MTHFD2i במשך 72 שעות או שעברו התמרה עם siMTHFD2 (ממוצע ± SD, מבחן t מדגם אחד, נתונים המייצגים שלושה ניסויים עצמאיים עם 4-6 תורמים בריאים). תוצאות מובהקות סטטיסטית מסומנות (* p < 0.{{10}}5,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0.001,="" ****="" p="" אחוז="">

תאי T מסתמכים על תפקוד אנזימטי של MTHFD2, וניתן להציל פנוטיפים על ידי מוצר

MTHFD2 נדרש לתחזוקה של מאגר הפורמט המיטוכונדריאלי עבור סינתזת פורין (Ma et al., 2017) אך עשוי גם למלא תפקידים לא אנזימטיים. תמיכה בפעילות אנזימטית חיונית, טיפול ב-MTHFD2i הוביל לספיגה מפצה של פורמט מהמדיום בתת-קבוצות של תאי CD4 פלוס T (איור 5A). יחידת 1C המשמשת לסינתזת פורמט מסופקת על ידי המרה של סרין לגליצין, וסרין תוך תאי הצטבר בעוד שהגליצין התרוקן בטיפול ב-MTHFD2i בכל תת-הקבוצות (איור 5B). גם ריכוזי המתיונין עלו מעט, דבר המצביע על עיכוב של מחזור המתיונין. כצפוי, בהתחשב בכך ששלב ההמרה של סרין-גליצין הוא במעלה הזרם של MTHFD2, שינויים אלה לא ניצלו על ידי מתן פורמט במדיום.

איור 5. השפעות MTHFD2i על תת-קבוצות של תאי T ניצלות על ידי פורמט אקסוגני

(א) קליטת פורמט נמדדת על ידי ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית 1 H (MRS) בתת-קבוצות של תאי CD4 פלוס T שטופלו ברכב או 500 ננומטר MTHFD2i למשך 72 שעות לאחר ההפעלה (ממוצע ± SD, בדיקת t לא מזווגת, הנתונים מייצגים שני ניסויים עצמאיים עם 6 שכפולים ביולוגיים בסך הכל).

(ב) שינוי בריכוזי סרין, גליצין ומתיונין בתאי CD4 פלוס T שטופלו ב-500 nM MTHFD2i או 500 nM MTHFD2i בתוספת 1 mM פורמט במשך 4-6 שעות בהשוואה לרכב, שנמדד על ידי ספקטרומטריית מסה (ממוצע ± SD, n { {8}} שכפולים ביולוגיים).

(ג) ספירת תאים חיים, קיימות וביטוי CD25 בתאי CD4 פלוס T שטופלו ב-MTHFD2i שניצלו עם 1 מ"מ פורמט או 60 מ"מ תמיסת אדנין וגואנין פורין למשך 72 שעות לאחר ההפעלה (ממוצע ± SD, ANOVA חד כיווני, הנתונים הם נציג של שלושה ניסויים עצמאיים עם 9 שכפולים ביולוגיים בסך הכל).

(ד) ספירת תאים חיים, קיימות וביטוי CD25 בתאי CD4 פלוס T מחברי המלטה של ​​WT או CD4DMthfd2 שניצלו עם פורמט או פורינים למשך 72 שעות לאחר ההפעלה (ממוצע ± SD, ANOVA חד כיווני, n=3 שכפולים ביולוגיים ).

בשלב הבא בדקנו האם תוספת של פורמט או תמיסה של אדנין וגואנין פורין יכולה להציל תפקוד אנזימטי לקוי ולהפוך את ההשפעות במורד הזרם של מחסור ב-MTHFD2. ואכן, 1 מ"מ פורמט החזיר את השגשוג, הכדאיות וההפעלה בתאים שטופלו ב-MTHFD2i (איור 5C). תוספי פורין הצילו שגשוג בכל תת-הקבוצות והפעלה בתאי Th1 ו-Th17 אך לא את הכדאיות בכל תת-הקבוצות והפעלה בתאי Treg. פורמט גם הציל התפשטות, כדאיות והפעלה ב-CD4^ΔMthfd2תאי T (איור 5D). ייצור ציטוקינים פגום בתאי Th1 ו-Th17 שטופלו ב-MTHFD2i הפך לכמויות הרכב עם תוספת פורמט או פורין (איור 5E). יש לציין, שיפור ויסות חריג של FoxP3 בתאי Th17 ניצל על ידי תוספת פורין אך לא פורמאט, בעוד שתוספת פורמט ופורין הפחיתו את ביטוי FoxP3 לקו הבסיס בתאי Treg שהתמיינו עם ריכוזים נמוכים של TGF-b (איור 5F). נראה כי פנוטיפים של MTHFD2i תלויים בתחזוקת MTHFD2 של בריכות הפורמט המיטוכונדריאלי או הפורין.

MTHFD2 מווסת את פעילות mTORC1 ומתילציה של DNA והיסטון ב-CD4^ועודתאי T

בתאי סרטן שהונצחו, מחסור ב-MTHFD2 יכול להוביל להצטברות של תוצרי הביניים GAR, SAICAR ו-AICAR, הנמצאים במעלה הזרם של 10-שלבי פורמילציה בתיווך formylTHF (Ducker et al., 2016). CD4^ועודתת-קבוצות של תאי T תורבו במשך 72 שעות לפני החשיפה ל-MTHFD2i למשך 4-6 שעות. מסגרת זמן קצרה זו נבחרה כדי למנוע השפעות משניות, כולל שינויים מפצים. טיפול חולף ב-MTHFD2i הביא להצטברות של GAR, SAICAR ו-AICAR בכל תת-הקבוצות (איור 6A). השפעה זו ניצלה במלואה על ידי הוספת 1 מ"מ פורמט, התומך בתפקיד אנזימטי של MTHFD2. נוקלאוטידים ונוקלאובסים, כולל גואנין, התרוקנו גם הם על ידי ה-MTHFD2i וחולצו על ידי פורמט בתאי Th17 ו-Treg (איור 6B).

איור 6. MTHFD2i גורם להצטברות של תוצרי ביניים לסינתזת פורין המעכבת את פעילות mTORC1 ושינתה מתילציה של DNA והיסטון

(א) שינוי בריכוזי GAR, SAICAR ו-AICAR בתאי CD4 פלוס T שטופלו ב-500 nM MTHFD2i או 500 nM MTHFD2i בתוספת 1 mM פורמט למשך 4-6 שעות ביחס לרכב, נמדד באמצעות ספקטרומטריית מסה (ממוצע ± SD, אחד- דרך ANOVA, n=3 שכפולים ביולוגיים).

(ב) שינוי במין חילוף החומרים של נוקלאוטידים בתאי Th17 ו-Treg שטופלו ב-MTHFD2i עם או בלי פורמט במשך 4-6 שעות ביחס לרכב, נמדד על ידי ספקטרומטריית מסה (n=3 שכפולים ביולוגיים).

(ג) אימונובלוט של phospho-S6, S6, Rheb, phospho-ACC, ACC, HIF-1a ו-b-actin בתאי CD4 פלוס T שטופלו ב-MTHFD2i עם או בלי פורמט במשך 72 שעות לאחר ההפעלה (נתונים נציג של שלושה ניסויים עצמאיים עם n=3 שכפולים ביולוגיים).

(ד) שינוי במטבוליטים של מחזור TCA בתאי Th17 שטופלו ב-MTHFD2i עם או בלי פורמט במשך 6 שעות ביחס לרכב, נמדד על ידי ספקטרומטריית מסה (ממוצע ± SD, ANOVA חד כיווני, n=3 שכפולים ביולוגיים).

(ה) מפות חום של יחס בקרת H3K27me3 ל-IgG באזורים של ±10-kb מסביב למקדמים של גנים ידועים ב-UCSC בתאי Th17 ו-Treg שטופלו ב-MTHFD2i, נמדד על ידי CUT&RUN (נתונים שנאספו מ-3 שכפולים ביולוגיים).

(ו) מפת חום של תדירות מתילציה חציונית של ה-DNA של לוקוס Foxp3 לפי אתר CpG בתאי Th1 ו-Th17 שטופלו עם כלי רכב או 500 ננומטר MTHFD2i ובתאי nTreg מחברי המלטה של ​​WT או CD4DMthfd2 (בדיקת Mood, n=3 שכפולים ביולוגיים).

(ז) טבלציה של (F) לפי מקדם פרוקסימלי, מקדם דיסטלי ו-TSDR (מבחן t מזווג). ראה גם איורים S3 ו-S4. תוצאות מובהקות סטטיסטית מסומנות (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0.001,="" ****="" p="" אחוז="">

AICAR ונוקלאוטידים הם מווסתים מבוססים של ציר mTORC1-AMPK (Emmanuel et al., 2017; Kim et al., 2016). ואכן, ביטוי פוספו-S6 ירד עם טיפול ב-MTHFD2i בכל תת-הקבוצות ושוחזר במלואו על ידי הוספת פורמט (איורים 6C ו-S3A). החלבון הקושר ל-GTP Rheb, מפעיל חובה של mTORC1, יכול להיות רגיש לזמינות גואנין תוך-תאי (Emmanuel et al., 2017), וביטוי Rheb נדכך בטיפול ב-MTHFD2i (איורים 6C ו-S3B). AICAR הוא אנלוגי אדנוזין ומפעיל AMPK (Rae and Mairs, 2019; Su et al., 2019). עם זאת, 72 שעות לאחר ההפעלה, זרחון של AMPK או המטרות שלו, אצטיל-קואנזים A(CoA) carboxylase (phospho-ACC) ו-Unc-51-כמו אוטופאגיה משפעל קינאז (phospho-ULK1), לא השתנו עם הטיפול ב-MTHFD2i (איורים 6C, S3C ו-S3D). פעילות mTORC1 מקדמת Th17 ומחלישה את ההתמיינות של תאי Treg בין השאר באמצעות אינדוקציה של מטבוליזם גליקוליטי תלוי HIF-1a (Shi et al., 2011). בהתאם לכך, ביטוי HIF-1 ירד בתאים שטופלו ב-MTHFD2i ו-CD4DMthfd2 Th17 (איורים 6C, S3E ו-S3F). שינויים אלה בפעילות mTORC1 לא היו קשורים לחסרים כלשהם באיתות TCR, כפי שנמדד על ידי ביטוי Nur77 עם ובלי גירוי מחדש (איור S3G). מתמר האותות והמפעיל של פעילות שעתוק 3 (STAT3), שהוא קריטי לפיתוח תאי Th17, לא השתנה או גדל באופן מתון עם טיפול ב-MTHFD2i (איור S3H). ירידה בפעילות mTORC1 ומעבר מגליקוליזה לכיוון זרחון חמצוני עם טיפול ב-MTHFD2i הצביעו על שינויים בשפע היחסי של מטבוליטים במחזור החומצה הטרי-קרבוקסילית (TCA). ריכוזי הסוקסינאט והפומראט הופחתו באופן משמעותי על ידי MTHFD2i אך ניצלו על ידי פורמט (איור 6D).

מטבוליטים של TCA הם מעכבים ידועים של DNA והיסטון דמתילאזות (Su et al., 2016), ודלדול של בריכות succinate ו-fumarate עשוי לתמוך במצב hypomethylated. טרי-מתילציה של H3K27 (H3K27me3) על פני הגנום נמדדה על ידי רצף CUT&RUN (ביקוע מתחת למטרות ושחרור באמצעות נוקלאז) (Skene and Henikoff, 2017). ואכן, תאי Th17 שטופלו ב-MTHFD2i הפחיתו את H3K27me3 בהשוואה לרכב (איורים 6E ו-S4A). מתילציה של DNA בלוקוס Foxp3 נמדדה גם על ידי ריצוף ביסולפט כדי לקבוע אם מתילציה דיפרנציאלית תרמה ל- MTHFD2i שגרם ל-Upregulation FoxP3. למרות שמספר לוקוסים של CpG נבדלו בתדירות המתילציה בין תנאי הרכב ו-MTHFD2i, לא היה דפוס ניתן להבחין באזור ה-Treg-cell-specific demethylated (TSDR). לא היו גם הבדלים בין תאי nTreg (CD4 פלוס CD25 פלוס) שבודדו מעכברי WT ו-CD4DMthfd2 (איור 6F), אם כי הטוהר של כל אוכלוסייה מועשרת היה נמוך (איור S4B). עם זאת, חלה ירידה משמעותית בתדירות המתילציה של DNA על פני אזור הפרוקסימלי של Foxp3 בתאי Th17 שטופלו ב-MTHFD2i בהשוואה לכלייל (איור 6G), מה שמצביע על שיפור אפשרי של שעתוק עם MTHFD2i.

בנוסף לשמירה על מאגר הפורמטים התוך תאי, פעילות MTHFD2 תורמת לאיזון החיזור הסלולרי באמצעות המרה של NAD^ועודל-NADH ול-NADP^ועודל-NADPH (Shin et al., 2017) ותמיכה במסלול הטרנססולפורציה וסינתזת גלוטתיון לאחר מכן. לתאי Th17 שטופלו ב-MTHFD2i היה ירידה בריכוזים של NAD^ועוד, NADH, NADP^ועוד, ו-NADPH, שניצל עם פורמט (איור S4C). עם זאת, NAD^ועוד/NADH ו-NADP^ועודיחסי /NADPH לא השתנו בתנאים. זה, בשילוב עם היעדר שינוי במיני חמצן תגובתי תגובתי (ROS) וסופראוקסיד מיטוכונדריאלי (איור S4D), מצביעים על כך ששינויים במצב החיזור לא צפויים להיות תורם מרכזי לפנוטיפ MTHFD2i.

מחסור ב-MTHFD2 in vivo מפחית את חומרתן של מחלות דלקתיות מרובות

היעילות של MTHFD2 כמטרה טיפולית נבדקה לאחר מכן במודל של רגישות יתר מסוג מושהה (DTH) תלוי בתאי T in vivo. עכברים חוסנו ואוגרו על האוזן עם ה-Keyhole limpet hemocyanin (KLH) כדי לגרום לדלקת מקומית וטופלו באמצעות כלי פומי או MTHFD2i. הטיפול לא הראה רעילות גלויה מכיוון שבעלי חיים שמרו על משקלם (איור S5A). חשוב לציין, עובי ומשקל האוזניים עלו בעכברי DTH בקרה אך לא בבעלי חיים שטופלו במעכבים, מה שמצביע על הגנה מפני דלקת בטיפול ב-MTHFD2i (איורים 7A, 7B ו-S5B). אימונוגלובולין G (IgG) הספציפי ל-KLH הופחת גם במינון הגבוה ביותר של מעכב, מה שמצביע על השפעות פוטנציאליות המתרחבות לתפקוד תאי B (איור 7C).

איור 7. מיקוד MTHFD2 in vivo מפחית את חומרת המחלה במודלים של DTH, EAE ו-IBD

(A ו-B) האוזן (A) עובי יחסי ומשקל הביופסיה (B) 10 ימים לאחר KLH עם חיסון CFA ו-3 ימים לאחר אתגר KLH לגרימת DTH (ANOVA חד כיווני). עכברים טופלו פעמיים ביום עם אוראלי 0, 100 או 300 מ"ג/ק"ג MTHFD2i (ממוצע ± SEM, n=8 שכפולים ביולוגיים).

(ג) ריכוזי IgG ספציפיים ל-KLH ביום 10 של DTH המושרה על ידי KLH (ממוצע ± SEM, מבחן Kruskal-Wallis, n=8 שכפולים ביולוגיים).

(ד) ציון קליני ממוצע לאורך זמן בבני חולי WT ו-CD4DMthfd2 שחוסנו עם MOG עם CFA ו-PTX כדי לגרום ל-EAE (ממוצע ± SEM, מספר בדיקות Mann-Whitney, הנתונים מייצגים שני ניסויים עצמאיים, כל אחד עם 5 שכפולים ביולוגיים).

(ה) ספירת תאים ותדירות של תאי CD4 פלוס T בחוט השדרה של עכברי EAE בשיא חומרת המחלה (ממוצע ± SEM, בדיקת t לא מזווגת, הנתונים מייצגים שני ניסויים עצמאיים עם 9 שכפולים ביולוגיים בסך הכל).

(ו) ביטוי CD25 ו-CD44 בתאי CD4 פלוס T מחוט השדרה של עכברי EAE (ממוצע ± SEM, בדיקת t לא מזווגת, n=4 שכפולים ביולוגיים).

(G ו-H) ספירת תאים של (G) T-bet plus , RORgt plus , FoxP3 plus , FoxP3 plus /T-bet plus ratio, FoxP3 plus /RORgt plus ratio ו-(H) IL-17 plus , IFNg פלוס, ו-IL-17 פלוס IFNg פלוס CD4 פלוס תאי T מחוט השדרה של עכברי EAE (ממוצע ± SEM, מבחן t לא מזווג, נתונים מייצגים שני ניסויים עצמאיים עם 9 שכפולים ביולוגיים בסך הכל).

(I) צביעת H&E, anti-CD3 IHC ו-Luxol Fast Blue (LFB) עבור מיאלין בחוט השדרה של עכבר WT ללא חיסון ושותפים ל-WT ו-CD4DMthfd2 עם EAE בשיא המחלה (הגדלה של 2003, נציג של 5 שכפולים ביולוגיים ).

(י) שינוי במשקל הגוף לאורך זמן של Rag1^__/__עכברים שהוזרקו ל-ip עם תאי CD4 תמימים של WT או CD4DMthfd2 פלוס T כדי לגרום לקוליטיס IBD (ממוצע ± SEM, בדיקות t מרובות, n=8 שכפולים ביולוגיים).

(K ו-L) ספירת תאים של (K) סך תאי CD4 פלוס T ו-(L) T-bet plus , RORgt plus ו-FoxP3 פלוס CD4 פלוס תאי T מ-MLNs של עכברי IBD (ממוצע ± SEM, מבחן t לא מזווג n { {4}} שכפולים ביולוגיים). ראה גם איורים S5 ו-S6. תוצאות מובהקות סטטיסטית מסומנות (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0.001,="" ****="" p="" אחוז="">

באופן דומה, מעכב MTHFD1/2 הכפול LY345899 (Gustafsson et al., 2017) היה יעיל בטיפול במחלה במודל EAE. EAE הושרה עם MOG ו- PTX, ועכברים טופלו מדי יום בהזרקה תוך צפקית (ip) של DMSO או LY345899. טיפול במעכבים הוביל להפחתה משמעותית בחומרת המחלה וציון קליני מצטבר בהשוואה לרכב (איורים S5C ו-S5D). עכברים הוקרבו ביום 26, ותאים חודרים לחוט השדרה נאספו לצורך יצירת פרופיל חיסוני. יש לציין, פחות CD45 באופן משמעותי^ועוד, CD4^ועוד, ו-CD8^ועודתאים חדרו לחוט השדרה של עכברים שטופלו ב-LY345899- (איורים S5E-S5G). לא היו שינויים בתדירות של ROR t^ועודאו FoxP3^ועודתאים בין CD4 המסתננים^ועודתאי T (איור S5H). עם זאת, הייתה ירידה בתדירות של תאי IFNg פלוס IL-17 פלוס ועלייה בתאי IL-17 פלוס (איור S5I), מה שמצביע על מעבר אפשרי לפנוטיפ פחות פתוגני.

כדי לבדוק ישירות את התלות הפנימית של תאי T ב-MTHFD2 in vivo, חברי המלטה של ​​WT ו-CD4DMthfd2 הועברו לשלושה מודלים שונים: EAE, מחלת מעי דלקתית (IBD) ומחלת דרכי אוויר אלרגית. EAE הושרה שוב עם MOG ו- PTX, ובדומה לניסוי המעכבים, עכברי CD4DMthfd2 הפחיתו באופן משמעותי את חומרת המחלה במשך 26 ימים (איור 7D). קבוצה נפרדת הורדמה בשיא המחלה ביום 15 לאחר אינדוקציה לפנוטייפ של תאי T (איורים S6A ו-S6B). למרות CD4^ועודאו CD8^ועודספירת תאי T לא השתנתה בטחול (איור S6C), חדירת תאי CD4 פלוס T לתוך חוט השדרה ירדה באופן משמעותי (איור 7E). לתאי CD4 פלוס T שחדרו לחוט השדרה בעכברי CD4DMthfd2 היה ביטוי CD25 דומה לזה של WT אך ביטוי מופחת של CD44, מה שמצביע על פגיעה חלקית בהפעלה (איור 7F). המספרים של הימור T^ועודתאי , ROR t plus ו- FoxP3 plus (איור 7G), וכן תאי IL-17 plus ו-IFNg plus (איור 7H), הופחתו גם הם בחוט השדרה של עכברי CD4DMthfd2 ביחס ל-WT. יש לציין כי היחסים של תאי FoxP3 plus ל-T-bet plus ו- RORgt plus עלו בעכברי CD4DMthfd2 בהשוואה למחלת WT בשיא, תוך שיקוף של הממצאים במבחנה של ביטוי מוגבר של FoxP3 עם מחסור ב-MTHFD2 (איור 7G). למרות שהתדירות של תאים המבטאים TF בקרב תאים מסתננים עלתה במגמה גבוהה יותר, תדירות ביטוי הציטוקינים לא השתנתה (איורים S6D ו-S6E). היסטולוגיה של חוט השדרה של עכברי בקרה ללא EAE ו-WT ו-CD4^ΔMthfd2עכברים עם EAE הראו תאי מוגברת וחיוביות CD3 בחוט השדרה בעכברי WT שהייתה קשורה לדמיילינציה, כפי שהוצג על ידי צביעת Luxol Fast Blue (איור 7I). שינויים אלה נעדרו בבקרה ללא EAE וב-CD4^ΔMthfd2עכברים.

תפקידו של MTHFD2 נבדק בשלב הבא במודלים של IBD ומחלות אלרגיות בדרכי הנשימה. תאי CD4 פלוס T נאיביים מסוג WT ו-CD4DMthfd2 הועברו למקבלי Rag1/להתחיל IBD. למרות שעכברים שקיבלו תאי WT החלו לרדת במשקל עם התקדמות IBD, מקבלי תאי CD4DMthfd2 T המשיכו לעלות במשקל (איור 7J). נמצאו פחות מספרים ותדרים משמעותיים של תאי T CD4DMthfd2 בטחול (איור S6F) ובלוטות לימפה מזנטריות (MLNs) המנקזים את המעי הגס (איורים 7K ו-S6G). מספר תאי T-bet plus , ROR t plus ו-FoxP3 פלוס CD4DMthfd2 T ירדו גם הם ב-MLNs, אך התדירות של תאי FoxP3 plus גדלה (איורים 7L ו-S6H). עם זאת, לא היו הבדלים ביחסי ספירת תאי FoxP3/T ו-FoxP3/RORgt ב-MLN בנקודת זמן זו בשלב מאוחר (איור S6I). בדומה לממצאים של MTHFD2 כפגיעה צנועה במסך CRISPR דלקת בדרכי הנשימה in vivo (איור 1C), לעכברי CD4DMthfd2 שהיו נתונים למחלת דרכי אוויר אלרגית הנגרמת על ידי אלטרנריה הייתה מגמה של ירידה בשפע נויטרופילים בנוזל השטיפה הסימפונות-אלוואולרי (BALF), אם כי לא נצפו שינויים בספירת לימפוציטים BALF, אאוזינופילים ומקרופאגים (איור S7A).

לבסוף, השפעת ה-MTHFD2i נבדקה על פעילות חיסונית כללית. OT-II CD45.2 ספציפי ל-OVA^ועודCD4^ועודתאי T הועברו באופן אימוץ לתוך CD45.1^ועודעכברים, שחוסנו לאחר מכן תת עורית עם אמולסיה של OVA עם אדג'ובנט מלא של פרוינד (CFA) וטופלו מדי יום עם כלי פומי או MTHFD2i. משקל הגוף לא השתנה בכל התנאים (איור S7B). הרחבת ה- OT-II CD45.2 המועבר^ועודתאים עוכבו מעט בעכברים שעברו חיסון ב-MTHFD2i, אך הגיעו למספרי כלי רכב ביום 7 (איורים S7C-S7E). עם זאת, התדירות של תאים IFNg פלוס הופחתה ב-LNs מנקזים (איור S7F). נתונים אלו מראים שטיפול ב-MTHFD2i in vivo מאפשר הרחבת תאי T ספציפיים לאנטיגן בעקבות גירוי חריף, אם כי עם ייצור ציטוקינים דלקתי מופחת.

דִיוּן

הפעלה, התמיינות ותפקוד של תאי T דורשים תכנות מחדש מטבולי מתאים כדי לענות על הדרישות המוגברות של התאים לאנרגיה, אבני בניין ביו-סינתטיות ומולקולות איתות. במחקר זה, חקרנו את התפקוד של מטבוליזם 1C בתאי CD4 ראשוניים פלוס T. באמצעות שילוב של בדיקות סקר מבוססות תא T ראשוני in vivo ונתוני ביטוי גנים, MTHFD2 זוהה כיעד פוטנציאלי לטיפולים אנטי דלקתיים. עיכוב או מחסור ב-MTHFD2 הובילו בדרך כלל לירידה בשגשוג תאי CD4 פלוס T. יש לציין, זה היה קשור בהשראת ביטוי FoxP3 ותפקוד מדכא בתאי Th17, כמו גם התמיינות מוגברת של תאי Treg. נתונים אלו מצביעים על כך ש-MTHFD2 עשוי לתפקד כנקודת ביקורת מטבולית בציר תאי Th17-Treg, כאשר טיפול ב-MTHFD2i תופר את האיזון מפנוטיפ פתוגני לפנוטיפ אנטי-דלקתי יותר. אכן, עיכוב MTHFD2 או מחסור גנטי שיפרו את חומרת המחלה במספר מודלים in vivo של אוטואימוניות ורגישות יתר.

חילוף החומרים של 1C מורכב מחילוף החומרים של סרין-גליצין, מחזור הפולאט ומחזור המתיונין והוא מרכזי במספר תהליכים, כולל סינתזת פורין דה נובו, יצירת תורם מתיל וויסות חיזור (Yang and Vousden, 2016). חילוף החומרים של 1C מעורב בחוזקה עם גירוי TCR (Tan et al., 2017) ונדרש כדי לתמוך בהרחבת תאי T (Ma et al., 2017). מחזור הפולאט מחולק לרכיבים ציטוסוליים ומיטוכונדריים. בציטוזול, MTHFD1 ממיר 5,10-מתילן-THF, 10-formylTHF ופורמט. במיטוכונדריה, אותן תגובות מושגות על ידי MTHFD2 ו- MTHFD1L. תוצרי הביניים המתקבלים משמשים לתמיכה בשלבי פורמילציה בסינתזת פורין דה נובו. MTHFD1 ו-MTHFD2 יכולים גם לווסת את מצב החיזור באמצעות יצירת NAD(H) ו-NADP(H) (Ducker and Rabinowitz, 2017). למרות שסוגי תאים מסוימים מציגים גמישות במעבר למקור הציטוזולי בהגדרות של חוסר תפקוד של מסלול המיטוכונדריאלי (Ducker et al., 2016), תאי T הוצעו בעבר להיות תלויים בעיקר במסלול המיטוכונדריאלי כדי לספק יחידות 1C ומינים רדוקטיביים (Ron- הראל וחב', 2016). כמו כן, הוכח כי תאי T מסתמכים על ספיגת סרין, וניתן לווסת תגובות חיסוניות in vivo על ידי כמויות סרין בתזונה. ההשפעות של הרעבה בסרין מתווכות על ידי הגבלת ביו-סינתזה של פורין אפילו בנוכחות מסלולי הצלה שלמים וניתן לעקוף אותן על ידי מתן גליצין ופורמט (Ma et al., 2017). הנתונים שלנו מוסיפים לממצאים אלו ומצביעים על MTHFD2 כרגולטור קריטי המשפיע על CD4^ועודשגשוג והתמיינות של תאי T.

Echanicoside

למרות שחילוף החומרים של 1C ממלא תפקיד רחב במטבוליזם של התא, מצאנו שחלק מהפונקציות היו נבדלות מקבוצות משנה של תאי T. כל תאי ה-T האנושיים והעכברים התרבו במידה פחותה עם מחסור ב-MTHFD2, מה שמצביע על פונקציה משותפת של MTHFD2 לתמיכה בצמיחה וחלוקה של תאי T. עם זאת, ההשפעות של מחסור ב-MTHFD2 על התמיינות תאי T ותפקוד האפקטורים היו שונות בכל תת-קבוצה שנבדקה. תאי Th1 הראו התמיינות לקויה עם אינדוקציה מופחתת של T-bet וירידה בייצור ציטוקינים. גם לתאי Th17 השתנתה התמיינות והפחתה בייצור ציטוקינים. למרות ש-ROR t לא השתנה, תאי Th17 חסרי MTHFD2- העלו ויסות של תא Treg TF FoxP3 וקיבלו יכולת לדכא שגשוג של תאי CD8 פלוס T פעילים. תאי Treg הפגינו התמיינות מוגברת בתנאי TGF-b נמוכים. כעת ידוע היטב שלכל אחת מתת-קבוצות אלה יכולות להיות דרישות מטבוליות שונות (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). הנתונים שלנו מראים ש-MTHFD2 נדרש באופן סלקטיבי עבור תאי Teff תוך קידום גורל ותפקוד תאי Treg. ראוי לציין שתוצאות אלו שונות מחסרים של GLUT1, GLS או ASCT2 הפוגעים או משנים את ההתמיינות של תאי Teff תוך השפעות צנועות לקידום ישיר של התמיינות תאי Treg או טרנסדיפרנציאציה של תאי Th17 לתאי Treg (Johnson et al., 2018; Macintyre et al. ., 2014; Nakaya et al., 2014).

נראה כי גורלות שונים של תאי T תלויים בפעילות האנזימטית של MTHFD2 מכיוון שההשפעות של מחסור ב-MTHFD2 ניצלו עם פורמט או נוקלאובאס של פורין. למרות שלא מצאנו השפעה משמעותית של שינוי באיזון חיזור עם מחסור ב-MTHFD2, נראה כי סינתזה של פורין דה נובו היא קריטית. טיפול ב-MTHFD2i הוביל לירידה בריכוזי פורין, במיוחד גואנין תוך גרימת הצטברות של תוצרי הביניים GAR, SAICAR ו-AICAR. תוצרי ביניים אלו דורשים פורמילציה לביו-סינתזה נוספת, וההשפעות ניצלו כאשר פורמט המטבוליט שמקורו ב-MTHFD2- נוסף למדיום, ותמך במנגנון ביוכימי של ה-MTHFD2i. סינתזת נוקלאוטידים דה נובו לתמיכה בסינתזת DNA ו-RNA חיונית לשגשוג תאי T (Que´me´neur et al., 2003, 2004). לפיכך, נראה שמרכיב במנגנון שבאמצעותו ה-MTHFD2i פוגע בהתרחבות תאי T הוא יצירה לא מספקת של נוקלאוטידים.

פלבנואיד

כישלון בסינתזה של נוקלאוטידים נאותים עלול לדכא תאי אפקטור T באמצעות מנגנונים מרובים. AMPK ו-mTORC1 הם המניעים העיקריים של תכנות מחדש מטבולי עם תפקידים מנוגדים בדרך כלל בתאי Teff ו-Treg (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). אנו מראים שטיפול ב-MTHFD2i בתאי T הוביל להצטברות חריפה של AICAR, מטבוליט הבולט כאנלוגי אדנוזין ומפעיל AMPK (Rae and Mairs, 2019; Su et al., 2019). עם זאת, לא הייתה עדות לפעילות AMPK מוגברת בנקודות הזמן שנבחרו. זה עשוי לשקף רגולציה נוספת של AMPK, אך ל-AICAR יכולות להיות גם השפעות בלתי תלויות AMPK (Dembitz et al., 2019). mTORC1 רגיש גם לריכוזי פורין מכיוון שירידה בזמינות הגואנין מדכאת את פעילותו של המפעיל mTORC1 Rheb (Emmanuel et al., 2017; Hoxhaj et al., 2017). הצטברות AICAR והפחתה בפעילות mTORC1 עשויות, אם כן, לתרום לפגיעה ביצירת תאי Th1 ו-Th17 שטופלו ב-MTHFD2i ויצירת תאי Treg משופרת. דיכוי איתות mTORC1 עשוי גם לתרום לשינוי בתוכנית המטבולית מגליקוליזה לנשימה מיטוכונדריה ולשינוי בשפע המטבוליטים של TCA בתאי Th17 שטופלו ב-MTHFD2i. מסלול mTORC1 ממלא תפקיד מרכזי בקידום מטבוליזם אנבולי ויכול להניע הצטברות של TF ATF4, אשר, בתורו, יכול לגרום לביטוי MTHFD2 (Ben-Sahra et al., 2016).

השטף המטבולי קשור לוויסות אפיגנטי מכיוון שמטבוליטים תורמים לשינויים אפיגנטיים רבים (Sharma and Rando, 2017), כולל מטבוליזם 1C ליצירת תורם המתיל האוניברסלי S-adenosyl methionine (SAM) עבור מתילציה של חלבון ו-DNA. עם זאת, ניסויי מעקב אחר פחמן בתאי T משופעלים מצביעים על כך שיחידות 1C המופקות מסרין שמקורו בגלוקוז ואקסוגנית אינן תורמות באופן משמעותי למחזור המתיונין ולמתילציה (Ma et al., 2017). השטף המטבולי עשוי להשפיע גם על דפוסי המתילציה באמצעות שינויים בשפע של מטבוליטים של TCA, כולל אלפא-קטוגלוטרט, פומראט וסוקסינאט. באופן ספציפי, fumarate ו-succinate מעכבים DNA והיסטון demethylases (Su et al., 2016). בהתאם לדלדול של מטבוליטים אלה בתאי Th17 שטופלו ב-MTHFD2i, H3K27me3 הופחת בצורה נרחבת על פני הגנום, ומתילציה של DNA הופחתה במיוחד במקדם Foxp3 הפרוקסימלי, שעשוי לתרום לפנוטיפ הטרנסדיפרנציאציה. פנוטיפ ההתמיינות של תאי Th17 לא ניצל על ידי תוספת פורמט, מה שמצביע על כך שסביר להניח שמסלולים נוספים תורמים לוויסות FoxP3, כגון באמצעות פעילות של מנגנוני חישה אחרים של ריכוז נוקלאוטידים

אקטאוזיד (ורבסקוסיד)

MTHFD2 דווח גם כממלא תפקידים לא אנזימטיים שעשויים לתרום לפעולות הפרו-דלקתיות של אנזים זה. בתאי סרטן, ל-MTHFD2 יכולים להיות פונקציות גרעיניות, הממוקמות יחד עם אתרי שכפול DNA כדי לקדם התקדמות מחזור התא (Gustafsson Sheppard et al., 2015). בתאי גזע של עכברים, הוכח כי MTHFD2 מווסת תיקון DNA כדי לשמור על יציבות גנומית (Yue et al., 2020). בקרצינומה של תאי כליה, נמצא כי MTHFD2 חיוני לתכנות מחדש מטבולי באמצעות מתילציה של mRNA (Green et al., 2019). למרות שהתפקידים הללו עבור MTHFD2 אינם סותרים זה את זה עם הממצאים שלנו, היכולת של פורמט להציל רבים מהפנוטיפים של מחסור ב-MTHFD2 בתאי T מעידה על כך שפעילות אנזימטית של MTHFD2 היא המניע העיקרי של התפשטות תאי T וגורל.

MTHFD2 נחשב במידה רבה למטרה תרופתית במסגרות אנטי-סרטניות. זה עשוי גם להיות יעד אנטי דלקתי מבטיח ולהציע פחות השפעות שליליות בהשוואה לאנטי-פולאטים הזמינים כיום, בהינתן ביטוי נמוך ברוב הרקמות הבוגרות. לדוגמה, יעד אחד של MTX, DHFR, מתבטא באופן נרחב ברקמות בוגרות (Nilsson et al., 2014). לכן, MTX יכול להיות קשור למגוון תופעות לוואי, כולל רעילות במערכת העיכול. יתרה מכך, מנגנון הפעולה של MTX נותר לא מובן למרות ההיסטוריה הענפה שלו (Cronstein and Aune, 2020). הביטוי המווסת מאוד של MTHFD2 ופוטנציאל יתירות עם מסלול ה-MTHFD1 הציטוזולי עלול לגרום לתלות סלקטיבית של אוכלוסיות תאים ספציפיות ב-MTHFD2. הממצאים שלנו מזהים את MTHFD2 כנקודת ביקורת מטבולית קריטית ב-CD4^ועודתאי T. למרות שקיימת חפיפה רחבה בין ביולוגיה של תאים סרטניים לביולוגיה של תאי T המתרבים במהירות, אנו מוצאים שתת-קבוצות של תאי CD4 פלוס T מציגות רגישות נוספת באמצעות אפנון של התמיינות ותפקוד תאים. סביר להניח שהתמקדות ב-MTHFD2 בטיפולים בסרטן עשויה לרסן חסינות נגד גידולים. עם זאת, הגדרות כגון קרצינומה של המעי הגס, שבהן דלקת מתווכת תאי Th17 תורמת למחלה, עשויות להתאים היטב ל-MTHFD2is. רגישות תאי T ל-MTHFD2is עשויה להיות צורה יעילה של אימונותרפיה בהגדרות של CD4^ועודדלקת המונעת על ידי תאי T מעבר לסרטן ומובילה לפחות תופעות לוואי מהתרופות הטיפוליות הזמינות כיום.

מגבלות הלימוד

ל-MTHFD2i המשמש במחקר זה יש ערך IC50 של 0.0063 mM עבור MTHFD2 ו-0.57 mM עבור MTHFD1; לכן, לא ניתן לשלול השפעות קלות מחוץ למטרה של עיכוב כפול של MTHFD2 ו-MTHFD1. בהתחשב בכך שהוויסות העלייה החריגים של FoxP3 בתאיTh17 לא ניצלה על ידי מתן פורמט אבל פעילות mTORC1 כן, המנגנון העומד בבסיס הפנוטיפ הזה דורש חקירה נוספת. בנוסף, כל המודלים in vivo בוצעו עם טיפול MTHFD2i או אבלציה גנטית מרגע השראת המחלה, ופנוטייפ תאי T בוצע בנקודת זמן אחת. כדי לאפיין טוב יותר את ההשפעה של מחסור ב-MTHFD2 על פתוגנזה של המחלה, מחקרים נוספים צריכים לכלול ניסויים של משך זמן עם אפיון סדרתי של אוכלוסיות תאי T כדי לקבוע באופן סופי יותר אם תת-קבוצות של תאי CD4 פלוס T מושפעות באופן דיפרנציאלי in vivo. לבסוף, כדי לשפר את הרלוונטיות של מחקר זה ליישומים קליניים, יש לבדוק את היעילות של טיפול ב-MTHFD2i שהתחיל לאחר הופעת המחלה.

שיטות כוכבים

שיטות מפורטות מסופקות בגרסה המקוונת של מאמר זה וכוללות את הדברים הבאים:

• טבלת משאבי מפתח

• זמינות משאבים

• ב קשר מוביל

• ב זמינות חומרים

• ב זמינות נתונים וקוד

  
  

• מודל ניסוי ופרטי נושא

• B עכברים B תאי T אנושיים

• B קווי תאים

  
  

• פרטי השיטה

• B עכבר במבחנה CD4^ועודהפעלה והתמיינות של תאי T

• בדיקת דיכוי תאי B Th17

• B CD4 אנושי במבחנה^ועודתנאי תרבות תאי T

• B סקר CRISPR B מטבולומיה של ספקטרומטריית מסה

• B ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית של פרוטון (1H-MRS)

• B Immunoblotting

• B CUT&RUN B EpigenDx ממוקד NextGen Bisulfifite Sequencing

• B מודלים של EAE In vivo עבור IHC וציטומטריית זרימה

• טיפול B In vivo LY345899 במודל EAE

• טיפול B In vivo DS18561882 בדגם DTH B דגם In vivo IBD עם WT ו-CD4^ΔMthfd2חברי המלטה

• B מודל של מחלת דרכי אוויר אלרגית In vivo עם WT ו-CD4^ΔMthfd2חברי המלטה

• טיפול B In vivo DS18561882 במודל חיסון OVA

  
  

• כימות וניתוח סטטיסטי

מידע משלים

מידע משלים ניתן למצוא באינטרנט בכתובת https://doi.org/10.1016/j. immuni.2021.10.011.

תודות

אנו מודים לחברי מעבדת Rathmell על התרומה לפרויקט זה. אנו מודים לתומס אונה על סיפוק נתוני RNA-seq ול-J. Cools (VIB) על סיפוק המבנה pMx-U6-gRNA-GFP. אנו מודים למקס ר. ואן בלקום על עיצוב הפריימרים של MTHFD2 qPCR. אנו מודים ל-Nello Mainolfifi, Vipin Suri, Adam Friedman ומארק Manfredi מ-Raze Therapeutics, Inc. (בוסטון, MA) על סיפוק התרכובת Raze 1459, אשר שימשה לאישוש ממצאים (לא מוצגים נתונים). דיאגרמות נוצרו עם BioRender. אנו מכירים במשאב המשותף לפתולוגיה תרגום, נתמך על ידי מענק התמיכה של NCI/NIH Cancer Center 5P30 CA68485-19 ומענק מכשור משותף S10 OD023475-01A1, עבור Leica Bond RX. עבודה זו נתמכה על ידי פרס ה-William E. Paul Distinguished Innovator for the Lupus Research Alliance (ל-JCR), R01s DK105550 (ל-JCR), HL136664 (ל-JCR ו-DCN), CA217987 (ל-JCR), AI153167 (ל-JCR), AI137075 (ל-AKM), T32 DK101003 (KV), ו-T32 GM007347 (ל-AS).

תרומות מחבר

AS, GA ו-JCR עיצבו את המחקר. AS, GA, KV, DRH, XX, MZM, XY, KLB, NC, MMW, ACY, DLG, AES, SKS, SNF, AMC, PF, TB ו-JCG-C. ביצע את המחקר. AS, GA, XY, JK, DCN, AKM, JDR ו-JCR ניתחו נתונים. AS ו-JCR כתבו את המאמר עם תרומות של המחברים האחרים.

הצהרת אינטרסים

JCR הוא מייסד, חבר מועצת ייעוץ מדעי, ובעל מניות של Sitryx Therapeutics; חבר מועצת ייעוץ מדעי ובעל מניות של Caribou Biosciences; חבר במועצה המייעצת המדעית של NirogyTherapeutics; התייעץ עם Merck, Pfizer ו- Mitobridge ב-3 השנים האחרונות; וקיבל תמיכת מחקר מ-Incyte Corp., CalitheraBiosciences ו-Tempest Therapeutics. JDR הוא מייסד שותף ובעל מניות ב-Raze Therapeutics, Toran, Serien Therapeutics ו-Farber Partners ויועץ ובעל מניות ב-Agios Pharmaceuticals, Kadmon Pharmaceuticals, Bantam Pharmaceuticals, Colorado Research Partners, RafaelHoldings, Barer Institute ו-LEAF Pharmaceuticals; הוא קיבל דמי ייעוץ ומימון מחקר מפייזר ורפאל והוא ממציא הפטנטים שבידי אוניברסיטת פרינסטון. AMC, PF ו-TB הם עובדים של Sitryx Therapeutics.

הכלה וגיוון

פעלנו להבטחת איזון מיני בבחירה של נושאים לא אנושיים. אחד או יותר מהמחברים של מאמר זה מזהים את עצמם כמיעוט אתני לא מיוצג במדע. תוך ציטוט של הפניות רלוונטיות מבחינה מדעית לעבודה זו, פעלנו באופן פעיל לקידום איזון מגדרי ברשימת ההתייחסויות שלנו. רשימת הכותבים של מאמר זה כוללת תורמים מהמקום בו נערך המחקר שהשתתפו באיסוף הנתונים, העיצוב, הניתוח ו/או הפרשנות של העבודה.

הפניות

אנדרסון, GR, Winter, PS, Lin, KH, Nussbaum, DP, Cakir, M., Stein, EM, Soderquist, RS, Crawford, L., Leeds, JC, Newcomb, R., et al. (2017). נוף של שיתוף פעולה טיפולי בסרטן מוטנטי KRAS חושף עקרונות לשליטה בהתפתחות הגידול. נציג תא 20, 999–1015.

Aune, TM, Crooke, PS, 3rd, Patrick, AE, Tossberg, JT, Olsen, NJ, and Spurlock, CF, 3rd (2017). ביטוי של RNA ארוכים שאינם מקודדים באוטואימוניות וקישור לתפקוד משפר וגרסאות גנטיות בסיכון למחלות אוטואימוניות. ג'יי אוטואימונית. 81, 99–109.

Bantug, GR, Galluzzi, L., Kroemer, G., and Hess, C. (2018). הספקטרום של חילוף החומרים של תאי T בבריאות ובמחלות. נאט. כומר אימונול. 18, 19–34. בן-סהרה, I., Hoxhaj, G., Ricoult, SJH, Asara, JM, and Manning, BD (2016). mTORC1 משרה סינתזה של פורין באמצעות שליטה במחזור הטטרה-הידרופולאט המיטוכונדריאלי. מדע 351, 728–733.

בראון, PM, Pratt, AG, ואייזקס, JD (2016). מנגנון הפעולה של מתוטרקסט בדלקת מפרקים שגרונית, והחיפוש אחר סמנים ביולוגיים. נאט. ר' ראומטול. 12, 731–742.

Buck, MD, O'Sullivan, D., and Pearce, EL (2015). חילוף החומרים של תאי T מניע את החסינות. J. Exp. Med. 212, 1345–1360.

Cantor, JR, Abu-Remaileh, M., Kanarek, N., Freinkman, E., Gao, X., Louisaint, A., Jr., Lewis, CA, and Sabatini, DM (2017). מדיום פיזיולוגי חוט מחדש את חילוף החומרים התאי וחושף חומצת שתן כמעכבת אנדוגנית של UMP Synthase. תא 169, 258–272.e17.

Cronstein, BN, and Aune, TM (2020). מתוטרקסט ומנגנוני הפעולה שלו בדלקת מפרקים דלקתית. נאט. ר' ראומטול. 16, 145–154.

Dembitz, V., Tomic, B., Kodvanj, I., Simon, JA, Bedalov, A., and Visnjic, D. (2019). ה-ribonucleoside AICar משרה התמיינות של לוקמיה מיאלואידית על ידי הפעלת ה-ATR/Chk1 באמצעות דלדול פירמידין. ג'יי ביול. Chem. 294, 15257–15270.

Dendrou, CA, Fugger, L., ו-Friese, MA (2015). אימונופתולוגיה של טרשת נפוצה. נאט. כומר אימונול. 15, 545–558.

Ducker, GS, and Rabinowitz, JD (2017). מטבוליזם אחד של פחמן בבריאות ובמחלות. Cell Metab. 25, 27–42.

Ducker, GS, Chen, L., Morscher, RJ, Ghergurovich, JM, Esposito, M., Teng, X., Kang, Y., and Rabinowitz, JD (2016). היפוך של שטף פחמן ציטוזולי אחד מפצה על אובדן מסלול הפולאט המיטוכונדריאלי. Cell Metab. 23, 1140–1153.

Emmanuel, N., Ragunathan, S., Shan, Q., Wang, F., Giannakou, A., Huser, N., Jin, G., Myers, J., Abraham, RT, and Unsal-Kcmaz, K. (2017). זמינות נוקלאוטיד Purine מווסתת את פעילות mTORC1 באמצעות Rheb GTPase. נציג תא 19, 2665–2680.

Farber, S., Diamond, LK, Mercer, RD, Sylvester, RF, וולף, JA (1948). הפוגות זמניות בלוקמיה חריפה בילדים המיוצרים על ידי אנטגוניסט חומצה פולית, 4-aminopteroyl-glutamic acid. N. Engl. J. Med. 238, 787–793.

Field, MS, Kamynina, E., Watkins, D., Rosenblatt, DS, and Stover, PJ (2015). תובנות חדשות לגבי הגורמים המטבוליים והתזונתיים של כשל חיסוני משולב חמור. Dis. 3, e1112479.

Fuseini, H., Yung, JA, Cephus, JY, Zhang, J., Goleniewska, K., Polosukhin, VV, Peebles, RS, Jr., and Newcomb, DC (2018). טסטוסטרון מפחית את דלקת הנגרמת על ידי קרדית אבק הבית וסוג 2 ו-IL-17A-Mediated Airway. J. Immunol. 201, 1843–1854.

Govindaraju, V., Young, K., and Maudsley, AA (2000). שינויים כימיים של פרוטון NMR וקבועי צימוד עבור מטבוליטים במוח. NMR Biomed. 13, 129–153.

גרין, NH, Galvan, DL, Badal, SS, Chang, BH, LeBleu, VS, Long, J., Jonasch, E., and Danesh, FR (2019). MTHFD2 קושר מתילציה של RNA לתכנות מחדש מטבולי בקרצינומה של תאי כליה. Oncogene 38, 6211–6225.

Gustafsson, R., Jemth, A.-S., Gustafsson, NMS, F€ arnega˚rdh, K., Loseva, O., Wiita, E., Bonagas, N., Dahllund, L., Llona-Minguez, S., H€ aggblad, M., et al. (2017). מבנה קריסטל של מטרת הסרטן המתהווה MTHFD2 במתחם עם מעכב מבוסס מצע. Cancer Res. 77, 937–948.

Gustafsson Sheppard, N., Jarl, L., Mahadessian, D., Strittmatter, L., Schmidt, A., Madhusudan, N., Tegne´r, J., Lundberg, EK, Asplund, A., Jain, M. ., and Nilsson, R. (2015). האנזים MTHFD2 הצמוד לפולאט הוא חלבון גרעיני ומעודד שגשוג תאים. Sci. נציג 5, 15029.

Hoxhaj, G., Hughes-Hallett, J., Timson, RC, Ilagan, E., Yuan, M., Asara, JM, Ben-Sahra, I., and Manning, BD (2017). רשת האותות mTORC1 חשה שינויים ברמות הנוקלאוטידים הפורין הסלולריים. נציג תא 21, 1331–1346.

Johnson, MO, Wolf, MM, Madden, MZ, Andrejeva, G., Sugiura, A., Contreras, DC, Maseda, D., Liberti, MV, Paz, K., Kishton, RJ, et al. (2018). ויסות מובהק של בידול תאי Th17 ו-Th1 על ידי מטבוליזם תלוי גלוטמינאז. תא 175, 1780–1795.e19.

Ju, H.-Q., Lu, Y.-X., Chen, D.-L., Zuo, Z.-X., Liu, Z.-X., Wu, Q.-N., Mo, H.-Y., Wang, Z.-X., Wang, D.-S., Pu, H.-Y., et al. (2019). מודולציה של הומאוסטזיס חיזור על ידי עיכוב של MTHFD2 בסרטן המעי הגס: מנגנונים והשלכות טיפוליות. J. Natl. סרטן אינסט. 111, 584–596.

Kawai, J., Toki, T., Ota, M., Inoue, H., Takata, Y., Asahi, T., Suzuki, M., Shimada, T., Ono, K., Suzuki, K., et al. (2019). גילוי של מעכב MTHFD2 חזק, סלקטיבי וזמין דרך הפה (DS18561882) עם פעילות אנטי-גידולית ב-Vivo. J. Med. Chem. 62, 10204–10220.

Kim, J., Yang, G., Kim, Y., Kim, J., and Ha, J. (2016). מפעילי AMPK: מנגנוני פעולה ופעילויות פיזיולוגיות. Exp. מול. Med. 48, e224.

Koufaris, C., Gallage, S., Yang, T., Lau, C.-H., Valbuena, GN, and Keun, HC (2016). דיכוי MTHFD2 בתאי סרטן שד MCF-7 מגביר את הגליקוליזה, התלות בגליצין אקסוגני ורגישות לדלדול חומצה פולית. J. Proteome Res. 15, 2618–2625.

Li, W., Xu, H., Xiao, T., Cong, L., Love, MI, Zhang, F., Irizarry, RA, Liu, JS, Brown, M., and Liu, XS (2014). MAGeCK מאפשר זיהוי חזק של גנים חיוניים ממסכי נוקאאוט של CRISPR/Cas9 בקנה מידה גנום. גנום ביול. 15, 554.

Ma, EH, Bantug, G., Griss, T., Condotta, S., Johnson, RM, Samborska, B., Mainolfifi, N., Suri, V., Guak, H., Balmer, ML, et al. (2017). סרין הוא מטבוליט חיוני להרחבת תאי אפקטור T. Cell Metab. 25, 345–357.

Macintyre, AN, Gerriets, VA, Nichols, AG, Michalek, RD, Rudolph, MC, Deoliveira, D., Anderson, SM, Abel, DE, Chen, BJ, Hale, LP, et al. (2014). Glucose Transporter Glut1 חיוני באופן סלקטיבי עבור הפעלת תאי CD4 T ותפקוד אפקטור. Cell Metab. 20, 61–72.

Michalek, RD, Gerriets, VA, Jacobs, SR, Macintyre, AN, MacIver, NJ, Mason, EF, Sullivan, SA, Nichols, AG, and Rathmell, JC (2011). חוד החנית: תכניות חילוף חומרים גליקוליטיים וחומצן שומנים חיוניים עבור תת-קבוצות של תאי CD4 ו-T רגולטוריות. J. Immunol. 186, 3299–3303.

Nakaya, M., Xiao, Y., Zhou, X., Chang, J.-H., Chang, M., Cheng, X., Blonska, M., Lin, X., and Sun, S.-C. . (2014). תגובות דלקתיות של תאי T מסתמכות על טרנספורטר חומצות אמינו ASCT2 הקלה של ספיגת גלוטמין והפעלת mTORC1 קינאז. חסינות 40, 692–705.

Nilsson, R., Jain, M., Madhusudhan, N., Sheppard, NG, Strittmatter, L., Kampf, C., Huang, J., Asplund, A., and Mootha, VK (2014). ביטוי אנזים מטבולי מדגיש תפקיד מפתח ל-MTHFD2 ולמסלול הפולאט המיטוכונדריאלי בסרטן. נאט. Commun. 5, 3128.

Palmer, LD, Maloney, KN, Boyd, KL, Goleniewska, AK, Toki, S., Maxwell, CN, Chazin, WJ, Peebles, RS, Jr., Newcomb, DC, and Skaar, EP (2019). החלבון החיסוני המולד S100A9 מגן מפני דלקת אלרגית בדרכי הנשימה המתווכות מסוג T-Helper Cell 2-. אמ. J. Respir. Cell Mol. ביול. 61, 459–468.

Pikman, Y., Puissant, A., Alexe, G., Furman, A., Chen, LM, Frumm, SM, Ross, L., Fenouille, N., Bassil, CF, Lewis, CA, et al. (2016). מיקוד MTHFD2 בלוקמיה מיאלואידית חריפה. J. Exp. Med. 213, 1285–1306.

Que´me´neur, L., Gerland, L.-M., Flacher, M., Ffrench, M., Revillard, J.-P., and Genestier, L. (2003). בקרה דיפרנציאלית של מחזור התא, התפשטות והישרדות של לימפוציטים T ראשוניים על ידי נוקלאוטידים פורין ופירימידין. J. Immunol. 170, 4986–4995.

Que´me´neur, L., Beloeil, L., Michallet, M.-C., Angelov, G., Tomkowiak, M., Revillard, J.-P., and Marvel, J. (2004). הגבלה של ביוסינתזה של נוקלאוטידים דה נובו מפריעה להתרחבות ובהתמיינות המשובטים לתאי CD8 T effektor וזיכרון. J. Immunol. 173, 4945–4952.

Rae, C., and Mairs, RJ (2019). הפעלת AMPK על ידי AICAR גורם לרגישות לתאי סרטן הערמונית לטיפול בהקרנות. Oncotarget 10, 749–759.

רון-הראל נ', סנטוס ד', גרגורוביץ' JM, Sage PT, Reddy, A., Lovitch, SB, Dephoure, N., Satterstrom, FK, Sheffer, M., Spinelli, JB, et al. (2016). ביוגנזה מיטוכונדריאלית ושיפוץ פרוטאומים מקדמים חילוף חומרים של פחמן אחד להפעלת תאי T. Cell Metab. 24, 104–117.

Shahi, SK, Freedman, SN, Murra, AC, Zarei, K., Sompallae, R., Gibson Corley, KN, Karandikar, NJ, Murray, JA, and Mangalam, AK (2019). Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, חזק כמו COPAXONE במודל בעלי חיים של טרשת נפוצה. חֲזִית. אימונול. 10, 462.

Shalem, O., Sanjana, NE, Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA, Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL, Root, DE, Doench, JG, and Zhang, F. (2014). בדיקת נוקאאוט של CRISPR-Cas9 בקנה מידה גנום בתאים אנושיים. מדע 343, 84–87.

שארמה, U., and Rando, OJ (2017). כניסות מטבוליות לאפיגנום. Cell Metab. 25, 544–558.

Shi, LZ, Wang, R., Huang, G., Vogel, P., Neale, G., Green, DR, and Chi, H. (2011). מסלול גליקוליטי תלוי HIF1alpha מתכנן נקודת ביקורת מטבולית להתמיינות של תאי T H17 ו-Treg. J. Exp. Med. 208, 1367–1376.

Shin, M., Momb, J., ו-Appling, DR (2017). מיטוכונדריאלי אנושי MTHFD2 הוא דו-פקטור חיזור ספציפי ספציפי ל-methylenetetrahydrofolate dehydrogenase/methyltetrahydrofolate cyclohydrolase. סרטן Metab. 5, 11.

Skene, PJ, and Henikoff, S. (2017). אסטרטגיית נוקלאז ממוקדת יעילה למיפוי ברזולוציה גבוהה של אתרי קישור ל-DNA. eLife 6, e21856.

Su, C.-C., Hsieh, K.-L., Liu, P.-L., Yeh, H.-C., Huang, S.-P., Fang, S.-H., Cheng, W.-C., Huang, K.-H., Chiu, F.-Y., Lin, I.-L., et al. (2019). AICAR מעורר אפופטוזיס ומעכב הגירה ופלישה בתאי סרטן הערמונית באמצעות נתיב תלוי AMPK/mTOR. Int. י.מול. Sci. 20, 1647.

Su, X., Wellen, KE, and Rabinowitz, JD (2016). בקרה מטבולית של מתילציה ואצטילציה. Curr. דעה. Chem. ביול. 30, 52–60.

Tan, H., Yang, K., Li, Y., Shaw, TI, Wang, Y., Blanco, DB, Wang, X., Cho, J.-H., Wang, H., Rankin, S. , ועוד. (2017). פרוטאומיקה אינטגרטיבית ופוספופרוטאומיקה חושף רשתות איתות דינמיות ומסלולי ביו-אנרגטיים העומדים בבסיס הפעלת תאי T. חסינות 46, 488–503.

Toffalini, F., Kallin, A., Vandenberghe, P., Pierre, P., Michaux, L., Cools, J., and Demoulin, J.-B. (2009). חלבוני ההיתוך TEL-PDGFR ו-FIP1L1-PDGFR בורחים מ-ubiquitination ופירוק. Haematologica 94, 1085–1093.

וואן, X., Wang, C., Huang, Z., Zhou, D., Xiang, S., Qi, Q., Chen, X., Arbely, E., Liu, C.-Y., Du, P., and Yu, W. (2020). Cisplatin מעכב SIRT3-deacetylation MTHFD2 כדי להפריע לאיזון החיזור הסלולרי בתא סרטן המעי הגס. Cell Death Dis. 11, 649.

Wang, L., Xing, X., Chen, L., Yang, L., Su, X., Rabitz, H., Lu, W., and Rabinowitz, JD (2019). מנוע הערות ואימות שיא עבור מטבולומי LC-MS לא ממוקדים. אנאלי. Chem. 91, 1838–1846.

Yang, M., and Vousden, KH (2016). מטבוליזם של סרין ופחמן אחד בסרטן. נאט. כומר סרטן 16, 650–662.

Yue, L., Pei, Y., Zhong, L., Yang, H., Wang, Y., Zhang, W., Chen, N., Zhu, Q., Gao, J., Zhi, M., et al. (2020). Mthfd2 מווסת תפקוד מיטוכונדריאלי ותיקון DNA כדי לשמור על הפלוריפוטנציה של תאי גזע עכברים. דוחות תאי גזע 15, 529–545.

Zhu, Z., and Leung, GKK (2020). יותר מאנזים מטבולי: MTHFD2 כיעד חדש לטיפול נגד סרטן? חֲזִית. אונקול. 10, 658.

שיטות כוכבים

טבלת משאבי מפתח

זמינות משאבים

קשר מוביל

יש להפנות מידע ובקשות נוספות למשאבים וריאגנטים ותימלאו עם השלמת ה-MTA המתאים על ידי איש הקשר הראשי, ד"ר ג'פרי רתמל (jeff.rathmell@vumc.org).

זמינות חומרים

פלסמידים וקווי עכבר שנוצרו במחקר זה יהיו זמינים עם השלמת MTA מתאים לפי בקשה.

זמינות נתונים וקוד

נתוני רצף CUT&RUN הופקדו ב-GEO וזמינים לציבור החל מתאריך הפרסום (GSE180356). נתוני מיקרוסקופיה ותמונות מקוריות של כתם מערבי המדווחים במאמר זה ישותפו על ידי איש הקשר הראשי לפי בקשה. כל מידע נוסף הנדרש לניתוח מחדש של הנתונים המדווחים במאמר זה זמין מאיש הקשר המוביל לפי בקשה.

לחץ אל Cistanches לחסינות