אפיון פוטנציאל עיכוב האנזים CYP3A4 של פלבנואידים נבחרים חלק 2

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

2.3. בדיקת עיכוב פסאודו-בלתי הפיך

במבחן העיכוב הפסאודו-בלתי הפיך, דגימות הודגרו עם פלבנואידים וטופלו עם חומר מחמצן, ולאחר מכן עברו דיאליזה. במקרה של עיכוב פסאודו בלתי הפיך, יש להחזיר את פעילות האנזים. בדגירות עם כל הפלבנואידים שנבדקו, היה עיכוב משמעותי של פעילות האנזים לאחר דיאליזה עם ובלי טיפול עם חמצון (איור 4). בכל המקרים, ההבדל בפעילות האנזים השיורית בין דגימת הפלבנואיד לדגימת האשלגן הקסציאנופראט היה חסר משמעות סטטיסטית (p<>

כמו בניסויים הקודמים, ההפחתה הגבוהה ביותר בפעילות האנזים נצפתה כאשר נעשה שימוש בכריסין כמעכב. הפעילות השיורית של האנזים לאחר דגירה ודיאליזה עם כריסין הייתה 0.57 אחוזים, ולאחר דגירה ודיאליזה עם טיפול קודם באשלגן הקסציאנופראט, היא הייתה 1.31 אחוז (איור 4).

Cistanche יכול לשפר חסינות

במקרה של עיכוב ישיר (הפיך), סוג זה של ניסוי יראה התאוששות של פעילות האנזים לאחר דיאליזה. במקרה של עיכוב פסאודו בלתי הפיך, פעילות האנזים תתאושש לאחר טיפול עם חומר חמצון ודיאליזה. מכיוון שאלו לא היו המקרה עם אף אחד מהפלבנואידים המנותחים, ניתן להסיק שכל הפלבנואידים מראים עיכוב בלתי הפיך של ציטוכרום P450 3A4.

3. דיון

הוכח שחלק מהפלבנואידים יכולים לעכב את הפעילות של האנזימים ציטוכרום P450. סריק-מוסטפיק וחב'. [28] וקונדזה וחב'. [29] הראו שאצטין, אפיגנין, כריסין ופינוסמברין מעכבים את האנזים CYP3A4 בבדיקה עם טסטוסטרון כמצע סמן. מכיוון שלאנזים CYP3A4 יש אתר פעיל גדול שיכול להכיל מצעים בצורה שונה, מומלץ לבצע מבחני פעילות עם מצע סמן אחר כגון ניפדיפין ומידאזולם [30]. כתוצאה מכך, השתמשנו בחמצון ניפדיפין כתגובת הסמן של פעילות CYP3A4 וקבענו את הפרמטרים הקינטיים של אי ההפעלה. ערכי יעילות העיכוב המתקבלים באמצעות ניפדיפין כמצע סמן הם באותו סדר גודל בהשוואה למבחן הטסטוסטרון לאפיג'נין, אצטין ופינוסמברין. רק כריסין הראה ערך גבוה פי ארבעה בטסטוסטרון [29] בהשוואה למבחן ניפדיפין, כלומר 0.108 דקות-1 uM-1 לעומת 0.029 דקות-IμM-1. קווי הדמיון שנצפו בקינטיקה של אינאקטיבציה הם בהתאם לנתוני ספרות המאשרים שלניפדיפין ולטסטוסטרון יש אתרי קישור שונים החופפים [31]. לציטוכרום P4503A4 יש את אחד האתרים הפעילים הגדולים ביותר והוא יכול להכיל את המצע ואת המעכב בו זמנית, כאשר אחד משפיע על הקישור של השני, מה שיכול להסביר את ההבדלים שנצפו בין מבחני ניפדיפין וטסטוסטרון.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

ניתן להימנע מההשלכות הקליניות של מעכבים הפיכים (כלומר, אינטראקציות בין מזון לתרופות) אם מפסיקים את הטיפול במעכב. אינטראקציות חשובות יותר הן אלו שהן בלתי הפיכות, בעוד שפשוט הפסקת השימוש במעכב לא תפתור את בעיות האינטראקציה. במחקר זה, כריסין הראה את פוטנציאל העיכוב הגבוה ביותר, עם ה-IC50 וה-K הנמוכים ביותר; ערכים. מחקר העגינה המולקולרית של פלבנואידים הקשורים לציטוכרום P450 3A4 הראה זיקת קשירה גבוהה יותר של כריסין על ידי חשיפת טבעת B לברזל במרכז הפעיל של האנזים [28]. מחקר יחסי מבנה-עכבה הראה זאתהידרוקסילקבוצות בטבעת A תורמות להשפעה המעכבת כנראה בגלל אינטראקציות יון-יון, בעוד שטבעת B יכולה להיות לא-מוחלפת (פינוסמברין, כריסין) או מוחלפת (acacetin, apigenin) כדי לראות את ההשפעה המעכבת (איור 1) [28]. פלבנואידים לא מוחלפים (פינוסמברין, כריסין) רגישים יותר לאפוקסידציה וליצירת תוצרי ביניים תגובתיים המשביתים את CYP3A4. ההשפעה המעכבת החזקה יותר שנצפתה עם כריסין נובעת כנראה מהקשיחות של המבנה ומהנוכחות של הקשר הכפול C2=C3 בהשוואה לפינוסמברין.

ניתן לראות את החשיבות של קינטיקה של האנזים המתוארת בהקשר של אינטראקציות בין מזון לתרופות, שבהן מתן כריסין (20-100 μM) העלה משמעותית את ה-AUC ואת ריכוז השיא בסרום (Cmax) של ניטרופורנטואין בחולדות [32] .cistanche deserticola ma,לדוגמה, המעכב החלש יחסית מבוסס המנגנון של האנזים CYP3A4/5, אריתרומיצין [33], דווח כגורם לאינטראקציה מתונה עם cerivastatin אצל מתנדבים בריאים (עלייה של 21 אחוז ב-AUC של cerivastatin) [34]. לקריסין יש גם פוטנציאל עיכוב גדול יותר מ-mibefradil, תרופה להורדת לחץ דם שהופסקה עקב אינטראקציות משמעותיות עם תרופות אחרות. התוצאות של מחקר זה מצביעות על כך שכריסין יכול להיות מעכב חזק ואולי לקיים אינטראקציה עם תרופות אחרות בשימוש,cistanche deserticolaשינוי ה-AUC וה-Cmax של תרופות אלו. כריסין מצוי בשפע בפרופוליס (28 גרם/ליטר), והוא הפלבנואיד השלישי העיקרי בדבש 5.3 מ"ג/ק"ג [35]; לכן, לתזונה עשירה במזונות אלו יש פוטנציאל לקיים אינטראקציה עם תרופות שהן מצעים של CYP3A4.

Pinocembrin, מעכב בלתי הפיך מוכח של האנזים CYP3A4, הראה את ה-k הנמוך ביותר; ערך mg של 0.04 ± 0.01 דקות-1. יעילות האינאקטיבציה שלו הייתה דומה לזו של אקאצטין ואפיג'נין (0.01 דקות-1 מיקרומטר-1). Pinocembrin נמצא בעיקר במזונות כגון דבש ומשקאות (תה ויין אדום), המהווה מקור עשיר של פלבנואיד זה [29]. על פי פרמטרים קינטיים אלו, יש לנקוט משנה זהירות בצריכת מקורות פינוסמברין אלו יחד עם תרופות הפועלות כמצעים של CYP3A4.

Acacetin הראה ערך IC50 גבוה פי שלושה מאשר כריסין ופי חמישה K גבוה יותר; ערך, תוך שמירה על ערכי השפעה דומים לאלו של פלבנואידים אחרים, מה שמצביע על יעילות מעכבת נמוכה יותר. ניתן למצוא אצטין בעיקר במיני צמחים כמו Turnera diffusa, Robinia pseudoacacia ו- Betula pendula [36], אך מזונות מסוימים מציגים גם מקור לפלבונואיד זה. לדוגמה, מיץ קומקוואט הוא מקור עשיר לאקצין, וניתן למצוא אצטין בריכוזים של 0.1 מ"ג/100 גרם של מיץ טרי [37]. תרכובת האב של אצטין, apigenin הראתה את ערך ה-IC50 הגבוה ביותר ואת ה-K הגבוה ביותר; ערך בין ארבעת הפלבנואידים שנבדקו. הפוטנציאל המעכב של אפגנין אושש in vivo כאשר הטיפול המשולב באפיגנין ופקליטקסל הוביל לעלייה בזמינות הביולוגית דרך הפה של paclitaxel, אשר יוחסה בעיקר לספיגה מוגברת במערכת העיכול באמצעות עיכוב P-glycoprotein והפחתת מעבר ראשון. מטבוליזם של paclitaxel באמצעות עיכוב של תת-משפחת CYP3A במעי הדק ו/או בכבד על ידי אפיגנין [38]. Apigenin הוא פלבנואיד דומיננטי בסלרי, פטרוזיליה וקמומיל. דווח כי פטרוזיליה מיובשת מכילה את הכמות המקסימלית של אפגנין, 45035 ug/g. מקורות נוספים לאפיג'נין נמצאים בצמחי מרפא כגון פרח קמומיל מיובש, המכילים 3000 עד 5000 אג'/ג, וזרעי סלרי, המכילים 786.5 אג'/ג [39].

העיכוב הפיך של ציטוכרומים P450 3A4 קשור לשלב הראשון של המחזור הקטליטי של ציטוכרום P450 (איור 5). לרוב, נצפית התחרות בין המצע לבין המעכב בקשירה לאתר הפעיל (ברזל ברזל). במקרה כזה, רצוי לערוך ניסויי קשירה (טיטרציות אנזים) ולבדוק אותו עם יותר ממצע אחד, שכן ל-CYP3A4 יש אתר פעיל גדול שיכול להכיל יותר ממולקולה אחת של סובסטרט/מעכב [26,30. במחקר זה, השתמשנו בניפדיפין כמצע, ותוצאות יעילות העיכוב היו בסדר גודל דומה למבחנים שדווחו בעבר שנערכו עם טסטוסטרון כמצע סמן (טבלה 1).

איור 5. מחזור קטליטי של Cytochrome P450 מורכב מתשעה שלבים. השלב הראשון מייצג את הקישור של הסובסטרט ואת נקודת האינטראקציה עם מעכבים הפיכים. בשלב השני, ברזל heme מופחת לצורה ברזלית שאליה נקשרים מעכבים פסאודו-בלתי הפיכים.השפעות ציסטאנצ'יאם נצפה עיכוב בלתי הפיך, זה בדרך כלל קשור לצורה הרדיקלית של המצע (שנוצר בשלב 7) ו/או המוצר (שנוצר בשלב 8). מיני חמצן תגובתיים הנוצרים במחזור ציטוכרום P450 חסר תועלת (שלבים 3a ו-5a) יכולים לגרום להרס של אנזים, שניתן למנוע על ידי הוספת SOD ו-CAT. תיאור השלבים שאינם קשורים לעיכוב מושמט. הוכן לפי הפניה [26].

עם זאת, כפי שהראינו בעבר [28,29] ואישרנו כאן בניסויים שערכנו, כל הפלבנואידים שנחקרו מראים עיכוב בלתי הפיך. ללא קשר לסוג העיכוב הבלתי הפיך (קישור פסאודו-בלתי הפיך או קוולנטי של חומר ביניים ל-heme או apoprotein), העיכוב יהיה הבולט ביותר אם יתבצע קדם-אינקובציה, לפני הוספת מצע סמן [26]. בקדם-אינקובציה, מחזור קטליטי מופעל על ידי הוספת מערכת הייצור לייצור הקואנזים (NADPH), ומתאפשר זמן מספיק כדי לצפות בהשבתת האנזים. לפיכך, כל סוגי העיכוב הבלתי הפיכים דורשים הפחתת האנזים לצורת הברזל (איור 5).

מכיוון שציטוכרומים P450 הם המופרוטאינים, חקרנו את הקישור של פלבנואידים לצורת הברזל של האתר הפעיל ואת הקישור של תוצר ביניים תגובתי אפשרי ל-heme [26]. כדי להעריך את היווצרות האדוקט האפשרי של heme, בוצע בדיקת hemochromopyridine. כל הנבדקיםפלבנואידיםהפחית משמעותית את ריכוז ההם בשני המבחנים, ביותר מ-50 אחוזים. Chrysin היה, שוב, המעכב החזק ביותר, תואם את ערכי העיכוב הקינטיים שנצפו במחקר זה. ריכוז Heme עם Pinocembrin היה גבוה פי חמישה, ועם Apigenin הוא היה גבוה כמעט פי עשרה מזה עם כריסין (25.3±0.4 ו-45.1±1.7 אחוזים, בהתאמה). הפחתה זו בריכוזי ההם מצביעה על כך שניתן לייחס את העיכוב הבלתי הפיך של CYP3A4 על ידי הפלבנואידים שנחקרו לקשירה קוולנטית של תוצר ביניים תגובתי ל-heme. יש לציין כי ניתן להרוס hemes על ידי מיני חמצן תגובתיים, ולהוריד את התוצאות של בדיקת hemochromopyridine. כדי לבטל אפשרות זו, נערכו דגירות בנוכחות SOD ו-CAT (טבלה 2), המאשר את המסקנה האמורה.

השלב הראשון במחזור הקטליטי של האנזים ציטוכרום P450 הוא התקשרות של סובסטרט ליון ברזל. אם המעכב מראה עיכוב תחרותי למצע, ניתן לאחזר את פעילות האנזים בדיאליזה, שכן סילוק המעכב מאפשר התאוששות מלאה של פעילות האנזים [26]. עם זאת, אם המעכב נקשר לברזל הברזל, יש צורך בשימוש בחומצן, כגון PCF, לפני דיאליזה על מנת לשחזר את פעילות האנזים. אם פעילות האנזים מתאוששת, העיכוב מתאפיין כפסאודו-בלתי הפיך [26]. מכיוון שלא ניתן היה לשחזר את פעילות האנזים לאחר דיאליזה עם או בלי PCF, אף אחד מהפלבנואידים שנבדקו (בריכוז של 25 uM) לא פועל כמעכבים הפיכים או פסאודו-בלתי הפיכים של האנזים CYP3A4. זה גם מאשר שעיכוב בלתי הפיך על ידי קשירה קוולנטית להם או לאפופרוטאין הוא הגורם הסביר להשבתת האנזים.

יש לציין כי כריסין גרם להפחתה כמעט מוחלטת של heme בדגירה: 97.1 אחוזים ללא ו-94.5 אחוזים עם SOD ו-CAT(טבלה 2); בעוד שתוצאות פעילות האנזים שיורית בתנאים דומים הראו הפחתה של פעילות האנזים בכ-99 אחוז (איור 4). בדיקת ההמוכרומופירידין רושמת hemes מכל המקורות בדגירה, כלומר ציטוכרום P450, כמו גם ציטוכרום b;. התוצאות עבור כריסין מצביעות על כך שחומר ביניים תגובתי שנוצר על ידי ציטוכרום P450 הגיב עם heme מציטוכרום P450 וכן ציטוכרום b5.

ניתוח נוסף של LC-MS בוצע כדי לקבוע תוצרי ביניים תגובתיים אפשריים של פלבנואידים בצורה של אדדוקט Heme או לכוד באמצעות גלוטתיון כסורק רדיקלי (נתונים לא מוצגים). עם זאת, לא הצלחנו לבודד אף אחת מהאדוקטים החזויים, ככל הנראה בגלל חוסר היציבות של תוסף הפלבנואיד התגובתי ו/או ה-heme/glutathione adduct. התנהגות דומה נצפתה עם mibefradil, תרופה נגד יתר לחץ דם, שהוצאה מהשוק עקב אינטראקציות בין תרופתיות. למרות שמיבפרדיל גרם להפחתה של heme, תוצר ביניים תגובתי לא הוקם [40].

4. חומרים ושיטות

4.1.חומרים

במחקר זה נעשה שימוש בארבעה פלבנואידים (אקאצטין, אפיגנין, כריסין ופינוסמברין) (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ארה"ב). ציטוכרומים רקומביננטיים P450 3A4 שבא לידי ביטוי יחד עם nicotinamide-adenine-dinucleotide phosphate (NADPH)reductase וציטוכרום bs באוטוסומים נרכשו מ-Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, ארה"ב).

בהתבסס על בדיקת ציטוכרום P450 פחמן חד חמצני [41], התוכן של האנזים CYP3A4 שהוכרז על ידי היצרן אושרה כ-1 μuM. גלוקוז-6-פוספט (G6P), גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז (G6PDH), ו-nicotinamide-dinucleotide phosphate disodium salt (NADP plus ) נרכשו מ-Sigma-Aldrich. אשלגן פוספט (pa) ודיכלורומתאן (pa) נרכשו מ-Kemika dd (זאגרב, קרואטיה), חומצה פורמית (85 אחוז, pa) מ-Semikem doo (סרייבו, בוסניה והרצגובינה), ומתנול המשמש לפירוק ריאגנטים וכרומטוגרפיה מ Merck KGaA (Darmstadt, גרמניה). נעשה שימוש במים טהורים במיוחד בתערובות הדגירה ובכרומטוגרפיה. אשלגן דימימן פוספט (Kemika dd) שימש להכנת חיץ אשלגן פוספט pH 7.85; ה-pH הותאם באמצעות נתרן הידרוקסיד שנרכש מ-Semikem doo Nifedipine (Sigma-Aldrich) וניפדיפין מחומצן (הדירקטוריון האירופאי לאיכות תרופות, פרמקופיה, מהדורה 10, שטרסבורג, צרפת) שימשו במחקר של פעילות אנזימים שיורית, כמו גם ב קינטיקה של אינאקטיבציה. טסטוסטרון (Sigma-Aldrich) ו-6 -hydroxytestosterone (קיימן אירופה, טאלין, אסטוניה) שימשו עבור מבחני עיכוב פסאודו-בלתי הפיך. Troleandomycin ודiltiazem התקבלו מהסוכנות למוצרים רפואיים ומכשור רפואי (זאגרב, קרואטיה). בבדיקת ההמוכרומופירידין נעשה שימוש בפירידין(פא)(Semikem doo), המין בקר (Sigma-Aldrich) ודימתילסולפוקסיד (Semikem doo). אשלגן הקסציאנופראט (Siegfried AG, Zofingen, שוויץ) שימש במחקר של עיכוב הפיך ופסאודו-הפיך. Superoxide Dismutase (SOD) (Sigma-Aldrich), Catalase (CAT) (Sigma-Aldrich) וחומצה הידרוכלורית (36 אחוזים, pa) (Semikem doo) שימשו במבחן סגוליות הקישור. דגירות אנזימים בוצעו באמבט מים (אינקולב, זאגרב, קרואטיה). בדיקה של פעילות האנזים שיורית וקינטיקה של אי-אקטיבציה של פלבנואידים בוצעו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשילוב עם זיהוי UV-Vis (HPLC UV-Vis, Agi-lent 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ארה"ב). חישובי פעילות שארית ופרמטרי קינטיקה של עיכוב נעשו באמצעות התוכנית R (The R Project for Statistical Computing, Vienna, Austria) ו-Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, ארה"ב).

4.2.שיטות

4.2.1. קביעת קינטיקה של האנזים ופעילות שארית

דגירות אנזימים בוצעו בשלושה עותקים, תוך ערבוב מכני באמבט מים ב-37 מעלות. מנות של פלבנואידים בריכוז סופי של 1 מיקרומטר הומסו במתנול, הועברו לצינורות זכוכית, ואדו עד ליובש, למעט בדגימות ביקורת ללא המעכב (פלבנואיד). לאחר אידוי הממס, הוכנה תערובת דגירה לנפח של 100 μL, המורכבת מאנזים CYP3A4 5pmol, 50 mM אשלגן פוספט חיץ (pH7.4) ומים טהורים במיוחד. מערכת הפקת NADPH המורכבת מ-0.1 M G6P:10 mg/mL NADP בתוספת :1000 IU/mL G6PDH=50:25:1(v/v/v) הוכנה מיד לפני השימוש. מערכת ייצור זו מכילה גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז שמחדש את NADP ל-NADPH, שומר על ריכוז קו-אנזים ציטוכרום P450 (NADPH) קבוע בדגירה. הוספת מערכת הייצור (15 אחוז מהנפח בדגירה הסופית, v/v) התחילה את התגובה. ניפדיפין שימש לבדיקת פעילות האנזים השיורית בריכוז סופי של 200 מיקרומטר. התגובה הופסקה באמצעות 1 מ"ל של תמיסת 1 אחוז קרה כקרח של חומצה פורמית בדיכורומתאן. הדגימות היו מעורבות, ואז עברו צנטריפוגה למשך 10 דקות על 1900g (Rotofix32, Westfalia, גרמניה). לאחר הצנטריפוגה נוצרו שתי שכבות (מים ושכבה אורגנית) 850 μL מהשכבה האורגנית הועברו לקובטות ואידוי. לאחר מכן האנליט הומס ב-30 μL מתנול. עמודה Agilent Zorbax SB C18 （4.6×250 מ"מ, 3 מיקרומטר, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ארה"ב) שימש לניתוח הדגימות ע"י HPLC. השלב הנייד הורכב מתנול ומים ביחס של 64:36. הניתוח היה איזוקרטי. הזרימה נקבעה על 1.0 mL min-. נפח ההזרקה נקבע על 10 μL. ניפדיפין שימש כמצע סמן. התגובה שנצפה הייתה חמצון של ניפדיפין. כרומטוגרמות נרשמו ב-254 ננומטר. משך הניתוח נקבע ל-25 דקות. השמירה הזמן של ניפדיפין הוא 7.1 דקות וזה של ניפדיפין מחומצן הוא 10.8 דקות [42]. בשני המקרים, כמות התוצר שהתקבלה נצפתה ככמות השטח מתחת לעקומה (AUC) ביחס לדגימת הביקורת. עבור כל הפלבנואידים , ריכוז מעכב חצי מרבי (ICs0), קבוע של נקבעו עיכוב (K;), קבוע של מהירות אינאקטיבציה (Kinect), ויעילות אי-אקטיבציה (השפעה /K;). Troleandomycin שימש כביקורת חיובית--מעכב בלתי הפיך של ציטוכרום P450 3ריכוז A4.25 uM של troleandomycin הפחית את פעילות האנזים ל-35±5 אחוזים.

4.2.2. בדיקת המוכרומופירידין

בדיקת ההמוכרומופירידין שימשה להערכת הרס אפשרי של heme על ידי צורת הביניים התגובתית במחזור הציטוכרום P450 ובוצעה על פי השיטה שתוארה על ידי Flink and Watson [43] ו-Paul et al.[44], עם כמה שינויים. נוצרה עקומת כיול באמצעות המין מומס ב-dimethylsulfoxide(0.6 עד 0.1 מיקרומטר). ספקטרות תועדו באורך גל של 500 עד 600 ננומטר. תערובות דגירה עם 25 uM מעכבי (פלבנואידים) הוכנו לנפח של 200 μL. התגובה התחילה על ידי הוספת מערכת יוצרת NADPH (להרכב, ראה סעיף 4.2.1), והדגירות נמשכו 30 דקות. התגובה הופסקה לאחר חצי שעה על ידי הוספת פירידין (ריכוז סופי 0.83 M) ונתרן הידרוקסיד (ריכוז סופי 0.06 M). הדגימות תועדו בספקטרופוטומטר (UV-1280, Shimadzu Corporation, קיוטו, יפן) תוך דקה אחת מ- הוספת תמיסה אלקלית, עקב חוסר היציבות של פירידין המוכרומוגן בתנאים בסיסיים [44]. ריכוז ההם בדגימות חושב על סמך עקומת הכיול שהוכנה. בדיקה זו בוצעה בשלושה עותקים. הדגירות חזרו על עצמם באמצעות קטלאז וסופראוקסיד dismutase (5 IU כל אחד) ב תערובת דגירה למניעת יצירת מי חמצן דרך המחזור הקטליטי חסר התועלת.

4.2.3. בדיקת עיכוב פסאודו-בלתי הפיך

מטרת מאמר זה היא לבדוק את היווצרותם של קומפלקסים קוולנטיים עם ברזל ברזל (Fe-), על ידי הערכת התאוששות פעילות האנזים לאחר דיאליזה עם או בלי תוספת של חומר חמצון. בוצעו שלושה סוגי ניסויים לכל פלבונואיד: תערובת דגירה ללא פלבנואידים (בקרה), תערובת דגירה עם פלבנואיד ותערובת דגירה עם פלבנואיד שאליה הוסיפו חמצון לאחר הדגירה. כל דגירה עם המעכב בוצעה למשך 30 דקות תוך שימוש באותן הגדרות ניסוי כמתואר לעיל (סעיף 4.2.1). לאחר הדגירה, הדגימות הועברו למחסניות דיאליזה. Aa oxidant - תמיסה של 20 mM של אשלגן הקסציאנופראט נוספה לאחת הדגירות לפני הדיאליזה [45]. הקלטות (Slide-A-Lvzer Dialysis Cassettes, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) הוטבלו בתמיסת חיץ של 50 מ"מ אשלגן פוספט (pH7.4) למשך 30 דקות (תמיסת דיאליזה הוחלפה שלוש פעמים). לאחר דיאליזה, הדגימות הועברו מהקסטה בחזרה לצינור הזכוכית, ופעילות האנזים השיורית הוערכה באמצעות טסטוסטרון כמצע סמן (ריכוז סופי של 200 מיקרומטר). מכיוון שמערכת ייצור NADPH עברה דיאליזה, היא נוספה שוב לדגירות כדי ליזום תגובות אנזימים. הדגימות הודגרו במשך 30 דקות באותן הגדרות (מתוארות בסעיף 4.2.1). התגובה הופסקה על ידי הוספת תמיסה קרה כקרח של חומצה פורמית בדיכורומתאן. הדגימות נותחו על ידי HPLC. Diltiazem, מעכב פסאודו-בלתי הפיך ידוע של ציטוכרום P450 3A4, שימש כבקרה חיובית להערכת חמצון לצורת ברזל (נצפתה התאוששות מלאה של פעילות האנזים).

4.2.4.עיבוד תוצאות

מבחן t חד צדדי ישמש להערכת המובהקות הסטטיסטית של ההבדלים בין דגימות ובקרות, בהתבסס על מדידות של פעילות שיורית. נעשה שימוש במשוואה לא ליניארית לחישוב ערך IC50. משוואת Michaelis-Menten שימשה לקביעת קבוע האינאקטיבציה וקצב האינאקטיבציה של המעכב. עיבוד סטטיסטי והכנת גרפים נעשו באמצעות Program R (The R Project for Statistical Computing, Vienna, Austria) ו-Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, ארה"ב).

5. מסקנות

Acacetin, apigenin, chrysin ו-pinocembrin מעכבים את פעילות האנזים CYP3A4 במבחנה. כריסין הוא מעכב האנזים החזק ביותר, עם ה-IC50 הנמוך ביותר, K; ערכי קינקט ויעילות האינאקטיבציה הגבוהה ביותר. כל הפלבנואידים הפחיתו את ריכוז ההמה של האנזים, מה שמאשר כי מדובר בעיכוב בלתי הפיך על ידי חומר ביניים תגובתי שלא ניתן למנוע על ידי הוספת SOD ו-CAT. אף אחד מהפלבנואידים שנבדקו לא פועל כמעכבים הפיכים או פסאודו-בלתי הפיכים של האנזים CYP3A4 בריכוז של 25 מיקרומטר, מכיוון שלא ניתן היה לשחזר את פעילות האנזים בדיאליזה עם ובלי תוספת אשלגן הקסציאנופראט. כיוון שפלבונואידים אלה יכולים להימצא בשפע במזונות שונים כגון פירות, ירקות, תבלינים, תה ויין אדום, ישנה אפשרות שהם יכולים להפריע לשנאות זרים שונים שהם מצעי CYP3A4. דרושים מחקרים נוספים in vivo כדי לחקור לחלוטין את האפשרויות של אינטראקציות מסוג מזון-תרופתי, כמו גם את התרומה האפשרית של אנזימים וטרנספורטרים אחרים באינטראקציות.

מאמר זה מופק ממולקולות 2021, 26, 3018