השפעת הורדת חומצות השתן והמנגנון של אקטוזיד ואכינאקוזיד המופק מ- Cistanche Tubulosa

תַקצִיר:שואפים לחקור את השפעות הורדת חומצות השתן והמנגנונים של אקטוזיד (AS) ו- Echinacoside (ECH) שחולצו מCistanche Tubulosa.

שיטותמודל העכברוש Hyperuricemia (Hua) הוקם באמצעות אשלגן אוקונאט (1.5 גרם · ק"ג -1 · d -1) בשילוב עם אדנין (100 מ"ג · ק"ג {}}} · d {}}}). The HUA model rats were randomly divided into a model control group, an allopurinol group (30 mg·kg-1·d-1 ), AS low and high (50, 100 mg·kg-1·d-1 ) dose groups, and ECH low and high (50, 100 mg · kg -1 · d -1) קבוצות מינון. בעבר הוקמה קבוצת ביקורת רגילה. לאחר ארבעה שבועות של מתן, מנתח הביוכימיה בדם שימש לאיתור SUA אוריאה, CREA, אדנוזין דימינאז (ADA) ורמות חומצת שתן (UUA) בשתן. ניסוי חיסוני מקושר לאנזים שימש לאיתור רמות קסנטין אוקסידאז (XOD) בסרום. רקמת כליות נאספה, ומקדם הכליות נשקל וחושב. מכתים של המטוקסילין אאוזין (HE) שימשו לצפייה בשינויים פתולוגיים כלייתיים. אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו- PCR בזמן אמת שימשו לאיתור רמות הביטוי של החלבון וה- mRNA של טרנספורטר uratate 1 (URAT1), טרנספורטר גלוקוז 9 (GLUT9), טרנספורטר אניון אורגני 1 (OAT1), וטרנספורטר אניון אורגני 3 (OAT3) ברקמת הכליה. תוצאות AS ו- ECH יכולות לשפר את תפקוד הכליות אצל חולדות מודל HUA, להפחית את רמות חומצת השתן בדם, לקדם הפרשת חומצות שתן, לסקור את רמות הסרום של ADA ו- XOD, ולווסת את הביטוי של חלבון ו- mRNA של urat1 ו- glut9 ברקמת כליות, תוך כדי ביטוי חלבון upreculating חלבון וביטוי mRNA של תוצאות OAT1 ו- OAT3.

מסקנות הגליקוזידים הפנילטנואידים AS ו- ECH מ- Cistanche Tubulosa עלולים להפעיל את השפעות הורדת חומצות השתן על ידי שיפור תפקוד הכליות בחולדות מודל HUA, הפחתת רמות ADA ו- XOD, ווויסות הביטוי של urat1, gult9, OAT1 ו- OAT3.

מילות מפתח: cistanche tubulosa; Acteoside; Echinacoside; היפרוריצמיה; הפחתת חומצת שתן; מַנגָנוֹן

 

 

 

תמצית Cistanta

צור איתנו קשר עכשיו

 

 

 

Hyperuricemia (HUA) היא מחלה מטבולית הנגרמת כתוצאה מטבוליזם של פורין מופרע בגוף האדם, מה שמוביל לרמות חומצות השתן בדם מוגברות [1]. בדרך כלל הוא מאובחן כאשר רמות חומצת השתן בדם עולות על 7. 0 mg · dl⁻ (416. 0 μmol·l⁻) בגברים ו -6. 0 mg · dl⁻ (357. התפתחות של היפרוריקמיה קשורה בעיקר לגורמים כמו תזונה עשירה בפיורין, צריכת אלכוהול כרונית, שימוש בתרופות והפרעה של בלוטת התריס. זה לא רק מגדיל את הסיכון למחלות לב וכלי דם, סוכרת ויתר לחץ דם [3-4] אלא גם משפיע באופן משמעותי על בריאותם של החולים.

נכון לעכשיו, טיפולים קליניים להיפרוריקמיה כוללים בעיקר תרופות המעכבות את ייצור חומצות השתן ומקדמות הפרשת חומצות שתן. עם זאת, לטיפולים אלה יש מגבלות מסוימות לחולים עם תפקוד כבד או כליה לקוי [5-6]. לפיכך, בחינת תרופות יעילות עם תופעות לוואי נמוכות היא בעלת משמעות רבה למניעה וטיפול בהיפרוריצמיה.

Cistanche Tubulosa (Schenk) R. Wightמשמש בדרך כלל ברפואה הסינית המסורתית כעשב ניניון בכליות, משמש לטיפול בתנאים כמו אימפוטנציה, עקרות, מחסור במהות ודם, חולשה בגב התחתון ובברכיים, חולשת שרירים ועצירות עקב יובש מעיים [7]. מחקרים הראו זאתCistanche Tubulosaבעל נוירו-הגנה נוירו-הגנה [8], אנטי דלקתית [9], חילוף החומרים העצם המווסת [10] והשפעות משפרות יעילות בכימותרפיה לחולי סרטן [11]. בין מרכיביו הפעילים השונים, גליקוזידים פנילנואידים הם השופעים ביותר.

Acteoside (As) ו- Echinacoside (ECH), שני גליקוזידים פנילנואידים עם תוכן גבוה בCistanche Tubulosa, מציגים פעילות ביולוגית חזקה ומחזיקים פוטנציאל משמעותי להתפתחות ויישום. כתוצאה מכך, קבוצת המחקר שלנו בחרה כ- ECH להמשך המחקר. באמצעות תחזיות פרמקולוגיות ברשת וחששות מקדימות בעכברים, גילינו שתמציות גליקוזיד פנילנואידיות מןCistanche Tubulosaיכול להיות בעל השפעה מסוימת בהורדת חומצות שתן. עם זאת, המסלולים והמנגנונים של השפעות אלה נותרו לא ברורים.

לפיכך, בעזרת המנגנונים של ייצור חומצות שתן ומסלולי ההפרשה העיקריים שלו כמיקוד המחקר, חקרנו את ההשפעות המורדות חומצות השתן של תמציות הגליקוזיד הפנילטנואידי AS ו- ECH. מחקר זה נועד להבהיר את המסלולים והמנגנונים שדרכם AS ו- ECH מפעילים את השפעותיהם להורדת חומצות השתן.

1 חומרים

1.1 בעלי חיים ניסויים

שבעים שבעים חולדות Sprague-Dawley (SD) של SPF, במשקל 150–180 גרם, נרכשו ממרכז החיות הניסוי של האוניברסיטה הרפואית שינג'יאנג. מספר רישיון ייצור בעלי חיים: SCXK (XIN) 2023-0001. ניסוי זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של המכון לחקר הרפואה האוטונומית של שינג'יאנג, עם מספר אישור האתיקה של בעלי החיים: IACUC- (ZHUN) {}}}.

1.2 סמים וריאגנטים

תמציות גליקוזיד פנילנואידיות (AS ו- ECH)מִןCistanche Tubulosa (purity >98%, מאומתים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים) חולצו, טוהרו והוכנו על ידי מעבדת המפתח של מדעי הניסוח של Uygur, המכון לחקר הרפואה האוטונומית של Xinjiang. מספרי אצווה: 20220617 (AS) ו- 20220526 (ECH).

טבליות Allopurinol, מספר אצווה: 62208726, מיוצר על ידי Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Group Co., Ltd.

אשלגן אוקסונטוכןאדנין, מספרי אצווה: I2130050 ו- C2202255, שנרכשו משנגחאי אלדין ביוכימי טכנולוגיה ושות 'בע"מ.

CREA (קריאטינין), UA (חומצת שתן), אוריאה ו- ADA (Adenosine Deaminase) ערכות assay, מספרי אצווה: 141123010, 141223004, 141323008 ו- 043624005, נרכשו מ- Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.

ערכת בדיקת פעילות XOD (Xanthine oxidase), מספר אצווה: Y10001219, נרכש משנגחאי מקלין ביוכימי טכנולוגיה ושות 'בע"מ.

נוגדנים (urat1, utl9, oat1, oat3), מספרי אצווה: 3i5723 0, 92f0296/4, 0f33081/2i44618, נרכש מ- Affinity Biosciences.

עזים עם תווית HRP אנטי-ארנב IgG, מספר אצווה: 245440113, נרכש מ- ZSGB-BIO.

תמיסת מכתים של המטוקסילין, מספר אצווה: 24135741H, שנרכש מ- Beijing Lanjieke Technology Co., Ltd.

ערכת מגיב כרומוגנית מטלטלת, מספר אצווה: 240010512, נרכש מ- ZSGB-BIO.

DEPC (דיאתיל פירוקבונט), מספר קטלוג: d 60029-500 מ"ל, נרכש מ- Amresco (ארה"ב).

M5 Hiclear DL2000 סמן DNA, מספר קטלוג: MF025, נרכש מ- Beijing Genomics Biotechnology Co., Ltd.

מגיב ™ Trizol, מספר קטלוג: 15596026, שנרכש מ- Thermo Fisher Scientific (ארה"ב).

5x All-in-One RT MasterMixוכןEvagreen Express 2 × QPCR MasterMix-Low ROX, מספרי קטלוג: G492 ו- G891, שניהם נרכשו מ- Applied Biology Materials Inc. (ABM).

2 שיטות

2.1 הקמת מודלים וקיבוץ

שבעים חולדות שבעים ספראג-דוולי (SD) זכרו התאקלמו וחולקו לשתי קבוצות: קבוצת ביקורת רגילה (1 0 חולדות) וקבוצת ביקורת מודל (60 חולדות). קבוצת הביקורת הרגילה ניתנה 0.5% CMC-NA באמצעות Gavage. קבוצת הביקורת על הדגם ניתנה אשלגן אוקונט (1.5 גרם · kg⁻) בשילוב אדנין (100 מ"ג · קג"ג) במינון של 10 מ"ל · קג"ג, פעם ביום במשך 14 ימים ברציפות. המודל נחשב להוקמה בהצלחה כאשר רמות אוריאה, CREA ו- SUA עלו באופן משמעותי, כפי שנמדד על ידי מנתח ביוכימי.

חולדות מודל ההיפרוריצמיה חולקו עוד יותר לקבוצות הבאות המבוססות על רמות SUA, אוריאה ו- CREA: קבוצת ביקורת מודלים, קבוצת Allopurinol (3 0 mg · kg⁻), מינון נמוך כקבוצה (50 מ"ג · ק"ג), מינון גבוה כקבוצה (100 מ"ג · ק"ג) (ק"ג, ק"ג. קבוצת ECH (100 מ"ג · קג"ג), עם 10 חולדות בכל קבוצה. כדי לשמור על היפרוריצמיה יציבה, כל הקבוצות פרט לקבוצת הביקורת הרגילה ניתנו אשלגן אוקסונט (500 מ"ג · קג"ג) בשילוב עם אדנין (100 מ"ג · ק"ג) באמצעות חילוף בבוקר, ואחריו מתן התרופות בהתאמה בכל קבוצת טיפול בשעות אחר הצהריים. קבוצת הביקורת הרגילה קיבלה תמיסת 0.5% CMC-NA בבוקר ושתיית מים בשעות אחר הצהריים במינון של 10 מ"ל · קג"ג, פעם ביום במשך 14 ימים ברציפות. לאחר מכן הופסק מתן סוכני דוגמנות, והתרופות המתאימות הועברו ברציפות מדי יום למשך 14 יום נוספים.

 

2.2 אוסף לדוגמא

לאחר המינון הסופי, החולדות צמו למשך הלילה (מים לא הוגבלו). שתן מכל קבוצה נאסף לבדיקת חומצות שתן. משקל הגוף נמדד לאחר צום, ודגימות דם נאספו בהרדמה. הסרום הופרד על ידי צנטריפוגה ואוחסן לשימוש עתידי. רקמות כליות נאספו ונשקלו. כליה אחת תוקנה בתמיסה של 4% paraformaldehyde, ואילו השנייה הוקפאה בחנקן נוזלי לצורך ניתוח נוסף.

 

2.3 מדידת חומצת שתן בשתן חולדה

דגימות שתן מכל קבוצה צנטריפוגות (3, 000 r · min⁻, 10 דקות, רדיוס צנטריפוגה 14 ס"מ), והסופר -נפט נאסף. דגימות שתן מדוללות 1: 9 עם מלוחים ונותחו לתכולת חומצת שתן באמצעות מנתח ביוכימי.

2.4 מדידת ADA, אוריאה, CREA ו- SUA בסרום חולדה

דגימות דם מכל קבוצה צנטריפוגות (3, 000 r · min⁻, 10 דקות, רדיוס צנטריפוגה 14 ס"מ), וסרום נאסף. רמות ADA, אוריאה, CREA ו- SUA בסרום נמדדו באמצעות מנתח ביוכימי.

 

2.5 מדידת XOD בסרום חולדה

שינויים ברמות ה- XOD בסרום עכברוש נמדדו באמצעות בדיקה אנזימטית על פי הוראות היצרן. נרשמו הספיגה הראשונית (A₁) והספיגה הסופית (A₂) במהירות של 290 ננומטר, וחושבה ΔA (ΔA=A₂ - A₁). ΔA הוחלף בנוסחה:
Xod (nmol⁻ · min⁻ · ml⁻)=[ΔA × מערכת תגובה נפח כולל ÷ (מקדם הכחדה טוחנית של חומצת שתן × אורך נתיב אופטי) × 10⁹] ÷ נפח מדגם ÷ זמן {2}} × ΔA),
כדי לחשב את כמות חומצת השתן המנותזת לדקה למיליליטר של סרום.

 

2.6 מדידת מקדם כליה

רקמות כליות נאספו, נשטפו במי מלח והוסרו עודפי מים. משקל האיברים נמדד במדויק, ומקדם הכליה חושב כדלקמן:
מקדם כליה=משקל כליה (מ"ג) / משקל גוף (G).

 

2.7 התבוננות היסטופתולוגית ברקמת הכליות על ידי מכתים

רקמות כליות קבועות בתמיסה של 4% paraformaldehyde התייבשו בריכוזי אתנול מדורגים, פונו עם קסילן, הוטבעו בפרפין וחתכו לפרוסות {}}} מיקרומטר. החלקים הועברו לאופראפניזציה עם קסילן, התייבשו באתנול מדורגת, מוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין (HE), ואטמו עם מסטיק ניטרלי. השינויים המורפולוגיים ברקמת הכליות נצפו תחת מיקרוסקופ אור, ותמונות נלכדו בהגדלה של 400 ×.

 

2.8 איתור ביטוי חלבון urat1, ut9, oat1 ו- oat3 ברקמת הכליות על ידי IHC

רקמות כליות קבועות בתמיסת פראפורמאלדהיד 4% התייבשו בריכוזי אתנול מדורגים, פונו עם קסילן, הוטבעו בפרפין וחתכו. בוצעו אחזור אנטיגן וחסימת סרום עיזים. נוגדנים ראשוניים (Urat1, Glut9, OAT1, OAT3) נוספו בדילול 1: 200 ודגרו במשך הלילה ב -4 מעלות. למחרת, החלקים נשטפו עם PBS, מיובשים באוויר ודגרו עם IgG אנטי-ארנב עם תווית ביוטין עם 37 מעלות למשך 30 דקות. החלקים נשטפו ב- PBS ודגרו עם מגיב כרומוגני מטורף למשך 10 דקות, ואחריו שטיפת PBS, הכתמת המטוקסילין למשך 3 דקות, התמיינות עם תמיסת אתנול חומצה הידרוכלורית, כחול ליתיום פחמתי, התייבשות עם אתנול שיפוע, פינוי עם קסילן, ופיטיל עם סיגום.

עבור כל חולדה נבחרו שני שדות אקראיים 4 0 0 × שדות של קטעי כליות. מכתים חיוביים (צהוב-צהוב) נותחו, והצפיפות האופטית המשולבת (IOD) של כל שדה נמדדה באמצעות Image-Pro Plus 6.0 לניתוח סטטיסטי.