Tubuloside B מ-Cistanche Salsa מציל את תאי העצב PC12 מ-1-מתיל-4-פנילפירידיניום יון אפופטוזיס ולחץ חמצוני

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

תַקצִיר:

הנוירו-פרוטקטיביהשפעות של tubuloside B מ-cistanche, אחד הפנילאתנואידים שבודדו מהסיניםרפואת צמחים סיסטאנצ'ה סלסה, על אפופטוזיס המושרה על ידי 1-מתיל-4-פנילפירידיניום (MPP פלוס) ולחץ חמצוני בתאי עצב PC12 נחקרו. תאי PC12 שטופלו ב-MPP ＋עברו מוות אפופטוטי כפי שנקבע על ידי בדיקת MTF, ציטומטריית זרימה ואלקטרופורזה של DNA agarose gel; הצטברות תוך תאית של מיני חמצן תגובתיים (ROS) נמדדה על ידי צביעת DCFH-DA עם מיקרוסקופיה קונפוקלית סריקת לייזר (LSCM). טיפול סימולטני עם tuhuloside B מוחלש במידה ניכרת של MPP＋ ציטוטוקסיות, פיצול DNA והצטברות תוך תאית של ROS. תוצאות אלו מצביעות היטב על כך ש- tubuloside B מונע אפופטוזיס המושרה על ידי MPP ולחץ חמצוני. ניתן ליישם את Tubuloside B בתוראנטי מחלת פרקינסוןסוכנים.

מבוא

מבחינה פתולוגית, מחלת פרקינסון ספוראדית (PD) מאופיינת בדרך כלל באובדן של נוירונים קטכולמינרגיים, במיוחד נוירונים דופמינרגיים של ה-substantia nigra pars compacta (SNc), ובנוכחות של intraneurona אופיינית| תכלילים הנקראים גופי לוי באזורי מוח מושפעים. למרות מגוון גורמים שהיו מעורבים בפתוגנזה של PD, המנגנונים המעורבים בהתחלה והתקדמות של PD נותרו לא ברורים, למרות שהגורם ל-PD נותר תשובה, מספר שורות של ראיות מצביעות בתוקף על מעורבות של עקה חמצונית, ולבסוף מובילה למוות נוירוני או לאפופטוזיס על ידי יצירה מוגזמת של רדיקלים חופשיים [1], [2], [3]. העובדה שהמערכת הדופמינרגית הניגרלית יכולה לייצר רמות גבוהות של רדיקלים חופשיים ויש לה רמות נמוכות יחסית של מערכת הגנה נוגדת חמצון תומכת עוד יותר בהשערה זו. גם מחקרים in vivo וגם מחקרים במבחנה הראו נוירוטוקסיות מתווכת עקה חמצונית של MPP＋, מטבוליט פעיל של l-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) על נוירונים דופמינרגיים [4 ], [5]. מעורבותם של רדיקלים חופשיים המיוצרים באופן מוגזם על ידי מתח חמצוני כגורם הקרוב להפרעות ניווניות כגון PD, מעידה על תפקיד מרכזי עבור נוגדי חמצון. Tubuloside B (איור 1) היה אחת מהתרכובות הפנילאתנואידיות שבודדו מגבעולים שלסלסת סיסטאנצ'ה. מחקרים קודמים גילו כי פנילתנואידים רבים כולל tubuloside B הראו פעילות חזקה של ניקוי רדיקלים חופשיים [6], [7].

בהתחשב בממצאים אלו, חקרנו במחקר הנוכחי את ההשפעה של tubu]nside B על נוירוטוקסיות הנגרמת על ידי MPP פלוס במבחנה, תוך שימוש בקו תאי הפאוכרומוציטומה של העצב הסימפתטי PC12 אשר שימש בהצלחה לאורך השנים לחקר תפקוד עצבי [8], [9].

מחלת אנטי פרקינסון:cistanche

חומרים ושיטות

חומרים

Tubuloside B מסלסת סיסטאנצ'הסופק בחביבות על ידי ד"ר לי ליי (המחלקה למוצרים טבעיים, בית הספר למדעי התרופות, אוניברסיטת פקין, בייג'ינג, סין). טוהר התרכובת היה יותר מ-98 אחוז לפי ניתוח HPLC. ה-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), סרום סוס וסרום עגל עוברי נרכשו מ-GIBCO BRL, 1-methyl~-phenylpyridinium ion (MPP plus ), poly-L-lysine, 3-(4, 5 -dimethylthiazol-2 -yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT), propidium iodide (PI), RNase A, proteinase K ו-2;7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) נרכשו מסיגמא.

תרבית תאים

תאי PCI2 נשמרו ב-DMEM בתוספת של 10 אחוז סרום סוס, 5 אחוז סרום עגל עוברי, 100U/ml פניצילין ו-100ug/ml סטרפטומיצין. התאים תורבו באינקובטור לחות מאוורר עם 95 אחוז אוויר ו-5 אחוז CO2 ב-37 מעלות. כל הניסויים בוצעו 24-48 שעות לאחר זריעה של תאים. התאים נקצרו באופן שגרתי על ידי טריפסיניזציה של 0.25 אחוז כאשר התאים התקרבו לשלב התת-קונפלוונט וצופו בצלוחיות תרבית של 25 ס"מ מפוצלות ב-1:8.

ניתוח של כדאיות התא

כדאיות התא נקבעה באמצעות בדיקת MTT שונה כמתואר קודם [10], בקצרה, תאי PC12 נזרעו ב96-צלחות באר בצפיפות של I × 104 תקרות לבאר. התרבויות גודלו במשך 48 שעות, ולאחר מכן שונה המדיום לזה המכיל ריכוזים שונים של tubulnside B או MPP＋. לאחר דגירה של עד 48 שעות ו-72 שעות, נוספה תמיסת MTr (5 מ"ג/מ"ל ב-DMEM) לצלחות הבאר 96- והתאים הורשו לדגר במשך 4 שעות ב-37 מעלות. לאחר הסרת המדיום, גבישי התא והצבע הומסו על ידי הוספת 200μL של DMSO, והספיגה נמדדה ב-570 ננומטר (540 ננומטר בתור התייחסות) עם קורא מיקרו-לוחות דגם 550 (Bio-Rad). כדאיות התא נותחה גם בשיטת אי הכללת טריפן כחול. התאים נאספו, גולפו בעדינות, והוצבעו בתמיסה של 0.6 אחוז של טריפן כחול למשך 3 גשמים. אחוז התאים הלא-צבעוניים הוערך לאחר מכן בעשרה שדות מיקרוסקופ שנבחרו באקראי. כתרופה חיובית, נעשה שימוש ב-100 ng／ml גורם גדילה אפידרמיס (EGF).

זיהוי אפופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה

תאים אפופטוטיים זוהו על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות יודיד פרופידיום (PI) [11]. בקצרה, כ-1 × 106 תאים שהודגרו בחומרי בדיקה נקצרו בצנטריפוגה ונשטפו פעם אחת עם PBS. תאים נקבעו עם 70 אחוז אתנול למשך 24 שעות ב-- 20 מעלות ונשטפו פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, התאים הושעו מחדש ב-300μL של PBS המכילים 0.5 מ"ג/מ"ל RNase ו-0.5 מ"ג/מ"ל PI. לאחר דגירה נוספת של 30 דקות בחושך, בוצעה ציטומטריית זרימה עם FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany).

יישמנו את הפרוטוקול של מור [12] שבודד רק DNA מקוטע והניסויים נורמלו על ידי שימוש במספר שווה של תרביות מכל קבוצת בדיקה. בקצרה, 3 × 1 06 נוירונים מכל אחת מהדגימות המטופלות נשטפו בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (1000 גרם למשך 10 דקות), והכדורים שנוצרו בתחתית הצינור הומוגגו עם חיץ תמוגה של 1 מ"ל (10 mM Tris ב-pH 7.4. 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) למשך 20 דקות על קרח. לאחר צנטריפוגה ב-11,000 גרם עבור 20 גשם ב-4 מעלות, הוסרו סופרנטנטים המכילים DNA מקוטע ועוכלו עם 20 מ"ג/מ"ל RNase A ב-37 מעלות למשך שעה אחת, ו-0.1 מ"ג/מ"ל פרוטאינז K ב-56 מעלות למשך שעה נוספת. ה-DNA המפוצל חולץ באמצעות פנול וכלורופורם וצנטריפוגה ב-1O,000g עבור גשם אחד ב-4C. הפאזה המימית הועברה לצינור אפנדורף חדש, מעורבב עם 2 נפחים של אתנול קר כקרח, ולאחר מכן מונח ב--20 מעלות למשך שעה אחת לפחות כדי לזרז DNA. לאחר צנטריפוגה ב-15,000ג' למשך 20 דקות ב-4 מעלות, הוסרו הסופרנטנטים וכדוריות ה-DNA נשטפו עם 80 אחוז אתנול פעם אחת (15,000 גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות), מיובשו באוויר והומס ב-20μL TE חיץ ב-pH 7.6. לאחר מכן, הדגימה כולה עברה אלקטרופורזה על ג'ל 1.5 אחוז אגרוז למשך שעה אחת ב-85 V. הג'ל נבדק וצולם על ידי מערכת תיעוד ג'ל של מוצרי Ultra Violet (GELDOC-2000, Bio-Rad, ארה"ב).

מדידה להיווצרות ROS תוך תאית

היווצרות של פרוקסידים תוך תאיים זוהתה במיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקאלי באמצעות תרכובת לא פלואורסצנטית, 2"7"-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) [13], אשר אסתר בתוך תאים על ידי אסטראזים אנדוגניים לחומצה החופשית המיונן, 2 ;7"-dichlorofluorescein. 2",7-Dichlorofiuorescin מסוגל להתחמצן ל-2"7"-dichlorofluorescein ניאון (DCF) על ידי הידרו-נוגדי חמצון. תאים הודגרו עם 10 מיקרומטר DCFH-DA למשך 30 דקות ב-37 מעלות. התרבויות נשטפו פעמיים בתמיסת המלח המאוזנת של האנק והצטלמו באותו מדיום. ההדמיה נעשתה באמצעות מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקאלי, DCF נרגש ב-488 ננומטר ומסנן הפליטה היה מסנן מחסום של 510 ננומטר. כדי לספק השוואה תקפה, נעשה שימוש באותם פרמטרי רכישה עבור כל התצפיות. המיקום האנכי האופטימלי באמצע התאים נקבע, ולאחר מכן השדה נסרק במהירות. מכיוון שהארה באורך גל עירור של 488 ננומטר גרמה לקרינה מוגברת בגלל חמצון של צבע זה, כל שדה נחשף לאור בדיוק באותו זמן. ערכי בסיס של תאים לא מגורים שימשו כערכי בקרה להשוואה עם תאים שטופלו ב-MPP בנוכחות או היעדר טובולוזיד B. לאחר הסריקה, עוצמת הקרינה היחסית הממוצעת בגופי תאים עצביים 15-20 לכל שדה מיקרוסקופ כמתה בארבעה תרבויות נפרדות לכל מצב טיפול.

cistanche

ניתוח סטטיסטי

כל הערכים שהתקבלו הובאו כממוצע ±SD. מובהקות סטטיסטית של הבדלים בין קבוצות נקבעה על ידי מבחן t של Student; ערכי p מחושבים של פחות מ-0.05 נחשבו כמובהקים סטטיסטית.

תוצאות

כפי שמוצג באיור 2, MPP plus יצר ירידה תלוית מינון בכדאיות של תאי PCI2. לעומת זאת, EGF, גורם נוירוטרופי ידוע, יצר הגנה משמעותית על כדאיות התא ב-100ng/mL MPP＋ השפעות ציטוטוקסיות המושרות הוחלשו גם בנוכחות טובולוזיד B (5, 10, 50 או 100ug-ml-1 ), אם כי עם פחות עוצמה מאשר תרופת הייחוס (איור 3). Tubuloside B בריכוזים אלה הפגין השפעות ציטו-פרוטקטיביות באופן תלוי מינון והתרכובת לבדה לא גרמה לציטוטוקסיות לכאורה (לא מוצגים נתונים). אלקטרופורזה ג'ל של תמצית ה-DNA מתאי PCI 2 שטופלו ב-200 µM MPP פלוס במשך 48 שעות הראתה סולם DNA. סימן היכר קלאסי של אפופטוזיס, טובולוזיד B, במינונים של 10 ו-100 מיקרוגרם גרם·מ"ל-1היווצרות מושכלת של סולם ה-DNA(איור.4)．איור.5 מציג היסטוגרמות טיפוסיות של ניתוח ציטומטרי זרימה של מוות תאים אפופטוטי המושרה על ידי תאי MP12＋ בנוכחות או היעדר טובולוזיד B. כימות של פרופיל מחזור התא עם PI חשף את מספר התקרות עם מאפיינים תת-דיפלואידיים (אזור M1) המעידים על פיצול DNA אפופטוטי. בתאים לא מטופלים, החלק התת-דיפלואידי האפופטוטי היה מינימלי עד 5.94% מסך 10,000 תאים (איור 5 א'). לאחר חשיפה של 48 שעות ל-MPP＋, אחוז האפופטוזיס עלה ל-43．02;j;(איור．5 ב)． כאשר הוסיפו לתרבית התא, טובולוזיד B עיכב MPP או אפופטוזיס המושרה באופן תלוי מינון. בריכוז של 10 ug·ml-1ההגנה על ידי tubuloside B לא הייתה מובהקת סטטיסטית, אבל ב-50 ו-1 00ug·ml-1, ירידה של 45％ו-63％ בהתאמה, נצפתה וכתוצאה מכך לעלייה באחוז תאי ההישרדות (איור 5D, E).

ניתן לזהות הצטברות של ROS תוך תאי על ידי שימוש בתאי DCFH-DA．PC12 שטופלו ב-200 uM MPP＋ במשך 48 שעות הציגו קרינה אינטנסיבית בתוך התא לאחר צביעה עם צבע DCFH-DA (איור 6)． טיפול בו-זמני עם tubuloside B (במינונים של 10 ו- 100ug·ml.) עיכב ייצור ROS המושרה על ידי MPP＋一 (האחוז המופחת היה 24．52％ו-55．63％, בהתאמה).

דִיוּן

הפתוגנזה של PD כרוכה בלחץ חמצוני חזק, מופחתת רמות נוגדי החמצון ופגמים במיטוכונדריה. כולם ידועים כמעוררים אפופטוזיס במספר מערכות תאיות. בפרט, הוכח כי רדיקלים חופשיים מעוררים מוות תאים פעיל בנוירונים[14]. MPTP מייצר תסמונת דמוית פרקינסון בלתי הפיכה וחמורה הגורמת לניוון סלקטיבי של הנוירונים הדופמינרגיים הניגרוסטריאטליים בבני אדם. נוירוטוקסין זה שימש ליצירת מודלים של בעלי חיים של PD[15]．MPTP הופך על ידי מונואמין אוקסידאז B ל-MPP＋, אשר מצטבר במיטוכונדריה. שבו הוא מעכב את קומפלקס המיטוכונדריאלי I ואת אותם ימים מיטוכונדריאליים. תפקוד גורם לאפופטוזיס[16]. לפיכך, נוירוטוקסיות הנגרמת על ידי MPP בתוספת 一 בנוירונים דופמינרגיים הופעלה באופן נרחב כמודל אטיולוגי של PD להקרנה של חומרים נוירו-פרוטקטיביים.

במחקר הנוכחי, הוכחנו שמוות תאי המושרה על ידי MPP פלוס באמצעות עקה חמצונית בתאי PC12 הופחת על ידי tubuloside B. יתרה מכך, הדגמנו כי tubuloside B גם הגן באופן תלוי מינון מפני סולם DNA המושרה על ידי MPP plus ואפופטוזיס, כפי שנמדד באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל DNA וניתוח ציטומטרי זרימה. יתר על כן, טיפול בו-זמני עם ריכוזים גבוהים יותר של tubuloside B עיכב ייצור ROS המושרה על ידי MPP. לפיכך, tubuloside B הראה השפעות נוירו-הגנה רב תפקודיות. מספר מנגנונים, בנפרד או בשיתוף, עשויים להיות מעורבים בפעולות של tubuloside B. ההשפעה נוגדת החמצון היא מנגנון אפשרי להגנה עצבית בתיווך tubuloside B. Xiong Q מצא כי tubuloside B הראה פעילות חזקה של ניקוי רדיקלים חופשיים על רדיקל 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ו-xanthine]xanthine oxidase שנוצר רדיקל אניון סופראוקסיד [6].

לאחרונה דווח על מספר פנילתנואידים כבעלי תכונות של ניקוי רדיקלים חופשיים ומגנים על פציעות רעילות הנגרמות כתוצאה מלחץ חמצוני. ROS המיוצר על ידי MPP plus כגון מי חמצן, אניון סופרוקסיד ורדיקל הידרוקסיל פוגעים בקלות במולקולות ביולוגיות, מה שעלול להוביל בסופו של דבר למוות של תאים אפופטוטי או נמק. לפיכך, ל- tubuloside B עשויות להיות השפעות ניקוי ישירות נגד ROS. בעוד שהנתונים שלנו אינם קובעים את האתר המדויק שבו טובולוזיד B פועל לדיכוי הצטברות ROS, הם כן מצביעים על כך שמנגנון ההגנה העצבי כרוך בגירוי של מסלולי נוגדי חמצון. מחקר של המבנה המולקולרי של tubuloside B גם מצביע על כך שהוא בעל יכולת חזקה לניקוי רדיקלים חופשיים (תקשורת אישית).

גם מנגנונים אחרים יכולים להיות רלוונטיים. לדוגמה, ל- tubuloside B עשויה להיות היכולת לסתור את הרעילות של MPP＋ על ידי עיכוב הפתיחה של נקבוביות המעבר של חדירות המיטוכונדריה ותפקוד לקוי. בנוסף, יש לשקול גם האם ל- tubuloside B יש השפעה מקדמת צמיחה ישירה על תאי עצב. המנגנון המדויק של הפעולה הנוירו-פרוטקטיבית של tubuloside B נותר לא ברור. נדרשים מחקרים נוספים כדי להבהיר את התמונה המלאה של ההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית שלו.

לסיכום, ל- tubuloside B מתמצית סלסה Cistanche יש השפעות הגנה ברורות על אפופטוזיס המושרה על MPP פלוס ועל עקה חמצונית. ההשפעות הנוירו-פרוטקטיביות שלו נגד MPP ＋ רעילות עשויות להיות חשובות ומצביעות על כך שיש לה פוטנציאל טיפולי במניעה וטיפול ב-PD.

טיפול ב-PD: cistanche

הפניות

7. Xiong Q, Tezuka Y, Kaneko 1", Li H, Tran LQ Hase K, Namba T, Kadota S. Inhibition of nitric oxide by phenylethanoids in activated macrophages. Eur J Pharmaco12000; 400:137 –44

8. Greene LA, טישלר AS. הקמת קו משובט נוראדרנרגי של תאי פיאוכרומוציטומה של יותרת הכליה המגיבים לגורם גדילה עצבי. Proc Nat Acad Sci 1976; 73:2424-8

9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. רדיקלים חופשיים וחמצן שומנים אינם מתווכים מוות תאי עצב המושרה על ידי עמילואיד. Brain Res 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. אפיון קינטי של רעילות תחמוצת החנקן עבור תאי PC12: השפעה של זמן מחצית החיים של שחרור NO. Eur J Pharmacol 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. שיטה מהירה ופשוטה למדידת אפופטוזיס של תימוציטים על ידי צביעת יודיד פרופידיום וציטומטריית זרימה. J Immunol Methods 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ, Matlashewski C. זיהום תוך תאי על ידי Leishmania do nova מעכב אפופטוזיס מקרופאגים. J Immunol 1994; 152: 2930- 7

13. מארק RJ, Keller JN, Kruman I, Mattson MP. FGF בסיסי מחליש מתח חמצוני המושרה על ידי עמילואיד פפטיד, חוסר תפקוד מיטוכונדריאלי ופגיעה בפעילות Na ＋-K ＋-ATPase בנוירונים בהיפוקמפוס. חקר המוח 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L ליקוי מיטוכונדריאלי כאירוע מוקדם בתהליך של אפופטוזיס המושרה על ידי דלדול גלוטתיון בתאי עצב: רלוונטיות למחלת פרקינסון. Biochem Pharmaco11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. פרקינסוניזם כרוני בבני אדם עקב תוצר של סינתזה של meperidine-analog. מדע 1983; 219:979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. מחקרים על הרעילות של 1-me ethyl-4-phenylpyridinium ion (MPP ＋) נגד המיטוכונדריה של מוח העכבר.J Neurol Sci 1988; 86: 97-110