המצב הנוכחי של הגנה עצבית במחלות לב מולדות חלק 3

3.2. הערכה חצי כמותית של DNA מיטוכונדריאלי אקטופי

תמונות של צביעת Hsp60 (המטריקס המיטוכונדריאלי) וצביעת היסטון-H2B (הסמן הגרעיני) הופחתו מתמונות של צביעת dsDNA. לאחר מכן, באמצעות הפונקציה "AdjustThreshold" של תוכנת lmage] (המכונים הלאומיים לבריאות), התמונות עברו בינאריות.

המיטוכונדריה הם מפעלי האנרגיה בתאים, האחראים על סינתזה של ATP כדי לספק את האנרגיה הדרושה לתאים. המטריצה ​​המיטוכונדרית היא הנוזל הפנימי של המיטוכונדריה, המכיל מגוון אנזימים ויונים ומהווה אתר מפתח לתגובות ביוכימיות שונות של המיטוכונדריה. זיכרון הוא אחת היכולות הקוגניטיביות החשובות ביותר של בני אדם. למרות שהשניים עשויים להיראות לא קשורים, הם קשורים קשר הדוק.

מחקרים מראים אינטראקציה בין המטריצה ​​המיטוכונדריאלית לזיכרון. אנזימים ויונים במטריקס המיטוכונדריאלי יכולים להשפיע ישירות על ריגושם של נוירונים על ידי ויסות חילוף החומרים האנרגטי ומצב תעלות היונים בתאי עצב, ובכך להשפיע על הזיכרון. בנוסף, קיימות מגוון מולקולות איתות במטריקס המיטוכונדריאלי, אשר יכולות להיות מועברות לנוירונים במורד הזרם דרך האקסונים והסינפסות של נוירונים, ומשפיעות על יעילות העברת האותות של נוירונים, ובכך משפיעות על היווצרות וגיבוש הזיכרון.

במקביל, פעילות הזיכרון משפיעה ישירות גם על מצב המטריצה ​​המיטוכונדריאלית. פעילויות זיכרון יגבירו את צריכת האנרגיה של נוירונים ויקדמו את תגובת החיזור במטריקס המיטוכונדריה, ובכך ישפיעו על הרמה המטבולית של המיטוכונדריה ואיזון היונים התוך תאי, וישפיעו עוד יותר על העוררות ויעילות העברת האותות של נוירונים.

לכן, שמירה על בריאות מיטוכונדריה טובה היא חיונית לשמירה על תפקוד זיכרון טוב. על ידי שמירה על הרגלי חיים טובים, כגון תזונה סדירה, פעילות גופנית מתונה, שינה מספקת וכו', תוכל לסייע בשמירה על בריאות המטריצה ​​המיטוכונדריאלית. בנוסף, ניתן לשפר את תפקוד הזיכרון באמצעות התערבות תרופתית מתאימה לקידום תגובות ביוכימיות ואיתות בתוך המטריצה ​​המיטוכונדריאלית.

בחיי היומיום, אנו יכולים להפעיל את הזיכרון בדרכים רבות, כגון קריאה, לימוד, חשיבה, משחקים וכו'. במקביל, יש לשים לב גם לשמירה על בריאות טובה כדי לשמור טוב יותר על בריאות המטריצה ​​המיטוכונדריאלית. אני מאמין שבאמצעות מאמצים אלו, בוודאי נזכה לזיכרון טוב יותר ונתמודד טוב יותר עם אתגרים שונים בחיים ובעבודה. ניתן לראות שאנו צריכים לשפר את הזיכרון, ו-Cistanche deserticola יכולה לשפר משמעותית את הזיכרון, מכיוון ש-Cistanche deserticola יכולה לווסת גם את איזון הנוירוטרנסמיטורים, כמו הגדלת רמות האצטילכולין וגורמי גדילה. חומרים אלו חשובים מאוד לזיכרון וללמידה. בנוסף, Cistanche deserticola יכולה גם לשפר את זרימת הדם ולקדם מתן חמצן, מה שיכול להבטיח שהמוח יקבל מספיק חומרים מזינים ואנרגיה, ובכך לשפר את חיוניות המוח וסיבולת.

לחץ על יודע תוספי מזון כדי להגביר את הזיכרון

בחרנו dsDNA puncta בגודל שבין 2 ל-20 um' (מעגליות 0.1-1.0) באמצעות הפונקציה "ניתוח-נתח חלקיקים". במידת הצורך, התמונות המקוריות נבדקו לספירה הסופית. אם האות של היסטון H2B היה קטן. לאחר מכן התמונות שהופחתו הראו מבנים דמויי סופגניה.

אלה מייצגים dsDNA ציטוסוליים ממקור גרעיני ויש להסירם מכמות ה-dsDNA הציטוסוליים ממקור מיטוכונדריאלי. ניתן לשנות את טווח הגודל בהתאם לסוג התא או למקור של דגימות היסטולוגיות. איור lE מציג דוגמה לספירה של DNA מיטוכונדריאלי חוץ רחמי

נקודות באמצעות 1B D.

לחלופין, תמונות של צביעת Hsp60 הופחתו מתמונות של צביעת dsDNA. לאחר מכן, מספר ה-dsDNA puncta נספר באמצעות פונקציות "Adjust-Threshold "Analyze-Analyze Particles". לאחר מכן, dsDNA puncta ללא אות ההיסטון-H2B נספרו על ידי תצפית ישירה. השיטה האחרונה מתאימה כאשר תמונות היסטון-H2B להראות יחס אות לרעש נמוך.

בסך הכל, שיטה זו יכולה להראות בבירור DNA מיטוכונדריאלי חוץ רחמי דולף לתוך הציטופלזמה ומאפשרת הערכה אובייקטיבית וסטטיסטית של DNA מיטוכונדריאלי חוץ רחמי כזה בתאים.

4. דיון

במחקר שלנו פיתחנו שיטה המאפשרת ספירה של DNA מיטוכונדריאלי ציטופלזמי. גילוי של DNA מיטוכונדריאלי ציטופלזמי דווח באמצעות טכניקות אימונופלואורסצנטיות, אך השיטות לא היו כמותיות להערכת DNA מיטוכונדריאלי ציטופלזמי ברוב המקרים [15,25]. במחקר אחר, טיפות PCR נערך כדי לכמת את ה-DNA המיטוכונדריאלי במחזור [9].

לאחרונה, Sato et al. [26,27] פרסם פרוטוקול מצוין להערכת DNA ציטופלזמי על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדני Lamin B1 (LMNB1) כסמן מבנה גרעיני ותת-יחידת ציטוכרום c אוקסידאז 4 (COX4) כסמן מבנה מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה נראה שימושי מאוד לכימות dsDNA ציטופלזמי ממקור גרעיני.

עם זאת, כשניסינו COX4 או סמני ממברנה מיטוכונדריה אחרים, כולל סמנים פנימיים וחיצוניים כאחד, היה קשה מאוד להבחין במדויק בין הציטופלזמה למיטוכונדריה.

לדוגמה, אם צפינו באותות מעגליים באמצעות סמן ממברנה מיטוכונדריאלי וצפינו באותות dsDNA בתוכו, אזי ה-dsDNA הזה יכול לייצג או מיטוכונדריאלי-DNA בתוך המיטוכונדריה המעגלית (רגיל) או DNA מיטוכונדריאלי ציטופלזמי מחוץ למיטוכונדריה דמוית הסופגניה (אקטופית). לכן השתמשנו ב-Hsp60 כסמן המסמן את המטריצה ​​המיטוכונדריאלית כדי להעריך את ה-DNA המיטוכונדריאלי החוץ רחמי בציטופלזמה.

כפי שתואר בסקירה שנערכה לאחרונה [23], ישנם סוגים רבים ושונים של cytoplasmicdsDNA ממקור גרעיני, ורובם חיוביים עבור סמני היסטון. בשל ההגבלה של שילוב הנוגדנים המשמשים לצביעה משולשת, השתמשנו בהיסטון H2Bas סמן היסטון.

עם זאת, אם מגבלה זו תיפתר, H2AX עשוי להיות סמן טוב יותר ל-dsDNA ציטופלזמי ממקור גרעיני. DsDNA ציטופלזמי שלילי של היסטון-H2B נצפה לעתים רחוקות בתאי ה-HeLa הבקרה בהם נעשה שימוש במחקר זה, אך עשוי להיות קיים dsDNA כזה ממקור גרעיני אם נעשה שימוש בשורות תאים או תנאים אחרים.

ההכלאה במקום של DNA מיטוכונדריאלי בשימוש במאמר האחרון שלנו מתאימה להערכה איכותית, אך ייתכן שיהיה קשה להשתמש בהכלאה באתרו להערכה כמותית [8].

הכלאה באתרו חושפת את הדגימה לטמפרטורות גבוהות, מה שעלול לגרום לעיוות או לרעש של חלקים מסוימים של הדגימה. מצד שני, השיטה האימונוציטוכימית המוצגת במאמר זה יכולה להשיג אותות עם רעש רקע נמוך. במאמר האחרון שלנו, בתאי האדם ובדג הזברה המשמשים כמודלים של מחלת פרקינסון, הראינו ש-DNA מיטוכונדריאלי דלף החוצה אל הציטופלזמה, שהיא רעילה ל- תאים. כמו כן, ראינו שכמות ה-DNA המיטוכונדריאלי הציטוזולי גדלה ברקמות המוח שלאחר המוות של חולים עם מחלת פרקינסון [8].

קווי ראיות אלו מצביעים על כך שכמות מוגברת של DNA מיטוכונדריאלי חוץ רחמי שדלפת החוצה מהמיטוכונדריה יכולה לגרום לדלקת חריפה וכרונית הגורמת למחלות שונות, כולל מחלת פרקינסון ואי ספיקת לב; לפיכך, הרגולציה של פירוק ציטוזולי-DNA או עיכוב של החיישנים שלו עשויה להיות יעד טיפולי פוטנציאלי למחלות אלו [8,28].

השיטה שהוצגה במאמר זה להערכה כמותית של DNA מיטוכונדריאלי חוץ רחמי משמשת ככלי חשוב למחקר נוסף בתחום זה.

תרומות מחבר: HM ו-MTH ניסחו את ההשערות, תכננו את רוב הניסויים, ביצעו את הניסויים, ניתחו את הנתונים וכתבו את כתב היד. NM ביצע את הניסויים הקשורים לתאים מתורבתים. כל המחברים קראו והסכימו לגרסה שפורסמה של כתב היד.

מימון: עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-AMED (מספרי מענק JP21gm6110028 ו-JP19dm0107154 (HM)), קרן Takeda Science (HM), JSPS KAKENHI (מספרי מענק JP14516799 (HM), JP 16690735 (7HMP) (7HMP) (7HMP) (7HMP) (7HMP) (7HM) ), JST (Moonshot R&D; מענק מספרJPMJMS2024 (HM)), ו- Grants-in-Aid מ-TBRF (מספר מענק TBRF-RF 21-135 (HM)).

הצהרת זמינות נתונים: הנתונים והכלים המתוארים בכתב יד זה זמינים לפי בקשה.

תודות: אנו מודים ל-Shinano Kobayashi על ההשתתפות בדיונים מועילים ומתן תמיכה מתמשכת. אנו מכירים ב-Tokyo Biochemical Research Foundation (TBRF) על מתן מלגת TBRF לפוסט-דוקטורט לחוקרים זרים ל-MH (TBRF-RF 21-135).

ניגודי עניינים: המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים.

הפניות

1. לי, XD; וו, ג'; גאו, ד.; וואנג, ה.; שמש, ל. Chen, ZJ תפקידים מרכזיים של איתות cGAS-cGAMP בהגנה אנטי-ויראלית והשפעות אדג'ובנטיות חיסוניות. מדע 2013, 341, 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]

2. אנסארי, מ.א.; דותא, ש; Veettil, MV; דותא, ד; איקבל, י. קומאר, ב.; רועי, א.; צ'יקוטי, ל. סינג, VV; Chandran, B. Herpesvirusgenome זיהוי מושרה של אצטילציה של IFI16 גרעיני חיונית לטרנסלוקציה הציטופלזמית שלו, לדלקת ולתגובות IFN-. PLoS Pathog. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]

3. אורזאלי, MH; Broekema, NM; דינר, BA; הנקס, DC; אלדה, NC; Cristea, IM; Knipe, ייצוב בתיווך cGAS של IFI16 מקדם איתות מולד במהלך זיהום בנגיף הרפס סימפלקס. פרוק. נאטל. אקד. Sci. ארה"ב 2015, 112, E1773–E1781. [CrossRef] [PubMed]

4. וודוורד, ג'יי ג'יי; Iavarone, AT; Portnoy, DA c-di-AMP המופרש על ידי Listeria monocytogenes תוך תאי מפעיל תגובת Iinterferon מסוג מארח. מדע 2010, 328, 1703–1705. [CrossRef] [PubMed]

5. דו, ז.; גוש, ק.; Vizioli, MG; ז'ו, ג'; סן, פ.; Wangensteen, KJ; סימתי, ג'; לאן, י.; לין, י.; ג'ואו, ז'; et al. Cytoplasmicchromatin מעורר דלקת בהזדקנות ובסרטן. טבע 2017, 550, 402–406. [CrossRef]

6. טקאהאשי, א.; לו, ט.; אוקאדה, ר.; קמאצ'י, פ.; Watanabe, Y.; וואקיטה, מ.; Watanabe, S.; Kawamoto, S.; מיאטה, ק.; ברבר, ג.נ.; וחב'. ויסות מטה של ​​DNases ציטופלזמי מעורב בהצטברות DNA ציטופלזמי ו-SASP בתאים מזדקנים. Nat.Commun. 2018, 9, 1249. [CrossRef]

7. מקארתור, ק.; Whitehead, LW; Huddleston, JM; לי, ל.; פדמן, ב"ש; Oorschot, V.; Geoghegan, ND; צ'פז, ש; דוידסון, ש.; סנטר, HS; et al. מקרופורי BAK/BAX מקלים על פריצת מיטוכונדריה וזרימת mtDNA במהלך אפופטוזיס. מדע 2018,359, eaao6047. [CrossRef]

8. Matsui, H.; איטו, ג'; Matsui, N.; אואצ'י, ט.; Onodera, O.; Kakita, A. Cytosolic dsDNA ממקור מיטוכונדריאלי משרה ציטוטוקסיות וניוון עצבי במודלים תאיים ודגי זברה של מחלת פרקינסון. נאט. Commun. 2021, 12, 3101. [CrossRef]

9. סלייטר, ד"א; מרטינז, ג'; האו, ל.; חן, X.; שמש, נ.; טרה, ד.; פישר, TD; בורמן, JL; לי, י.; ג'אנג, ז'; et al. פרקין ו-PINK1 מקלים על דלקת הנגרמת על ידי STING. טבע 2018, 561, 258–262. [CrossRef]

10. הו, י.; ווי, י.; לאוטרופ, ש.; יאנג, ב.; וואנג, י.; קורדונייר, ש.; Mattson, MP; Croteau, DL; Bohr, VA NAD(+) תוסף מפחית דלקת עצבית והזדקנות תאים במודל עכבר טרנסגני של מחלת אלצהיימר באמצעות cGAS-STING. פרוק. Natl.Acad. Sci. ארה"ב 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com