כיצד חלבוני תיקון קרום התא מווסתים את העברת אותות של גורם שעתוק כדי לשלוט על פיברוזיס כליות

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

הייצ'אנג לי

כִּליָהפיברוזיס קשורה להתקדמות של אקוטיכִּליָהפגיעה במחלת כליות כרונית. MG53, חלבון לתיקון קרום התא, הוכח כמגן מפני פגיעה בתאי אפיתל כליות ופגיעה חריפה בכליות. כאן, הערכנו את התפקיד של MG53 באפנון שלכִּליָהפיברוזיס בעכברים מזדקנים ובעכברים עם חסימת שופכה חד צדדית (UUO) מודל ידוע של פיברוזיס בכליות פרוגרסיבי. עכברים עם אבלציה של MG53 פיתחו יותר פיברוזיס אינטרסטיציאלי עם הגיל מאשר עכברים שלמים MG53- באותו גיל. באופן דומה, בהיעדר MG53,כִּליָהפיברוזיס היה מוגזם בהשוואה לעכברים עם MG53 שלם בכליה החסומה בהשוואה לכליה הבלתי חסימה הנגדית או הכליות של עכברים מופעלים מדמה. השופכה חסםכליותמעכברים חסרי MG53 גם הראו יותר דלקת משמעותית מאשר כליות חסומות בשופכה מעכברים שלמים של MG53. ניסויים במבחנה הוכיחו ש-MG53 יכול להיכנס לגרעין של תאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים ולקיים אינטראקציה ישירה עם הרכיב p65 של גורם השעתוק NF-kB, מה שמספק הסבר אפשרי לדלקת מוגברת בהיעדר MG53. כדי לבדוק זאת, ביטוי משופר של MG53 באמצעות תאים מהונדסים או משלוח חלבון רקומביננטי ישיר ניתן לעכברים הכפופים ל-UUO. זה הפחית את ההפעלה והדלקת של NF-kB ופיברוזיס בכליות מוחלש. לפיכך, ל-MG53 עשוי להיות תפקיד טיפולי בטיפול בדלקת כרונית בכליות ובכך לספק הגנה מפנילַיֶפֶתמה שמוביל לפנוטיפ של מחלת כליות כרונית.

Cistanche tubulosa מונע מחלת כליות, לחץ כאן כדי לקבל את הדגימה

הצהרה תרגום דלקת כרונית מובילה לשיפוץ פיברוטי שעשוי גם לעמוד בבסיס המעבר מפגיעה כלייתית חריפה למחלת כליות כרונית. הפעלת גורם התעתוק הדלקתי של חלבון גרעיני גורם-kB (NF-kB) מעורב בפתוגנזה של דלקת בכליות. כאן אנו מספקים ראיות לכך ש-MG53, חלבון לתיקון קרום התא שזוהה בעבר, מקיים אינטראקציה ישירה עם NF-kB ומפחית את פעילות התעתיק שלו. במקביל, MG53 במתן אקסוגני יכול להפחית את העיצוב הפיברוטי של הכליה הדלקתית. ממצאים אלה מצביעים על משחק גומלין מגן בין MG53 ו-NF-kB כדי להחליש את ההתפתחות של פיברוזיס בכליות בתיווך דלקת. מתן פרמקולוגי של MG53 עשוי להיות גישה מבטיחה לטיפול בפיברוזיס מתקדם בכליות.

תפקוד לקוי של הכליות, שניתן לסווג כפגיעה כלייתית חריפה (AKI) או מחלת כליות כרונית (CKD), הפכה למגיפה באוכלוסיות מבוגרות. בשנת 2017, השכיחות של CKD הגיעה ל-14.5 אחוזים מבני 65 ומעלה, מה שהוביל להוצאות רפואיות של למעלה מ-84 מיליארד דולר לטיפול.^1,2AKI ו- CKD שכיחים יותר אצל אנשים מבוגרים, בעיקר בשל רגישות מוגברת לפציעה בתוספת יכולת מופחתת לתקן את הכליה המזדקנת. מחקרים קליניים הראו ש-CKD הוא גורם סיכון עיקרי ל-AKI, ולהפך, אפיזודות של AKI יכולות להאיץ את התקדמות CKD לקראת מחלת כליות סופנית. נכון לעכשיו, הטיפול ב-AKI תומך בעיקר, והטיפול ב-CKD מבוסס מתמקד בהאטת ההתקדמות באמצעות עיכוב של מערכת רנין-אנגיוטנסין-אלדוסטרון וכעת אולי באמצעות עיכוב קוטרנספורטר-2 של נתרן-גלוקוז.^3,4

בהתאם לחומרת הפציעה, תאים צינוריים פרוקסימליים, היעד העיקרי לפציעה חריפה, עשויים לעבור שינויים בהתקדמות מחזור התא, 5,6 מטבוליזם, 7 הפרשת ציטוקינים חלבוניים-דלקתיים ופרופיברוטיים, או מעבר אפיתל-מזנכימלי חלקי,8 אשר יקבע אם שיפוץ/תיקון יצליח או לא יסתגל ויביא לפיברוזיס בכליות, סימן היכר של CKD.9,10 שיפוץ זה מתרחש בדרך כלל על רקע של דלקת בכליות,

אספקת כלי דם מופחתת, וייצור חלבוני מטריקס חוץ-תאי (ECM) וכולל אובדן של תאי אפיתל והצטברות של קולגנים, אקטין שריר חלק ופיברונקטין; יש לו גם מתאם גבוה עם הידרדרות בתפקוד הכליות.

דלקת כרונית מובילה לשיפוץ פיברוטי שעשוי גם לעמוד בבסיס המעבר מ-AKI ל-CKD.11-13 מחקר מצטבר מצביע על מעורבותו של גורם התעתוק של גורם גרעיני-kB (NF-kB) בפתוגנזה של דלקת בכליות הנגרמת מזיהום, פציעה, או השתלה.11,12,14 הפעלת מסלול NF-kB הקנוני מתחילה בהפעלה של מעכב קינאז NF-kB (IkB), מה שמוביל לזרחון ופירוק של IkBa ולטרנסלוקציה גרעינית של הטרודימרים NF-kB.15 הפעלה של איתות NF-kB בתאי אפיתל כליות ותאי חיסון חודרים יכולה להיות מעוררת על ידי טריגרים פתופיזיולוגיים כגון חשיפה לליפופוליסכרידים (LPSs) או פגיעה באיסכמיה-ריפרפוזיה.16 מחקרי פרופיל מולקולרי מגלים את nfkb1 כמניע עיקרי של פיברוזיס בכליות.¹⁷בנוסף לתאי צינורי כליה, תאי חיסון מולדים כגון מקרופאגים ותאים דנדריטים תורמים גם הם לפציעה בכליות, דלקת ועיצוב פיברוטי.^13,18–20

cistanche יעיל בטיפול בתפקוד לקוי של הכליות

העדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שגורמי הפרשה שמקורם בשריר (כלומר, מיוקינים) מווסתים את הפיזיולוגיה המערכתית באמצעות הצלבת רקמות כדי להשפיע על התקדמות מחלות כליה.²¹MG53 (נקרא גם TRIM72) הוא חלבון מועשר בשריר משולש (TRIM) בעל תפקיד קריטי בתיקון קרום התא. 22,23 לחלבונים ממשפחת TRIM יש תפקודים מגוונים החל מוויסות האיתות החיסוני ועד לתיקון רקמות.²⁴תיקון MG53-באמצעות קרום מעורב בהפחתת פגיעה חריפה בשרירי השלד,²⁵כליות,²⁶לֵב,²⁷ ריאות, 28 מוחות,^29,30ועור.³¹המחקרים הקודמים שלנו זיהו רמה נמוכה של ביטוי MG53 בכליה, המהווה מרכיב מרכזי בהגנה על AKI, ועכברים החסרים ב-MG53 (mg53 / ) היו רגישים יותר ל-AKI המושרה על ידי מתח.²⁶לאחרונה הדגמנו גם כי עלייה מתמשכת של MG53 במחזור הדם משפרת תיקון והתחדשות של פציעות רקמות.32 התפקידים היחסיים של MG53 במחזור הדם הספציפי לכליות והחיצוני בוויסות פיברוזיס בכליות במהלך CKD מתקדם עדיין אינם ידועים.

לאחרונה, התפתח תפקיד מתפתח של MG53 בוויסות הגנה על רקמות באמצעות עיכוב דלקת, במיוחד באמצעות אפנון של איתות NF-kB. לדוגמה, MG53 מחליש נוירוטוקסיות הנגרמת על ידי LPS ודלקת עצבית על ידי עיכוב מסלול TLR4/NF-kB,33 ו-MG53 הלבבי מווסת את ביטוי KChIP2 כדי לשלוט בשיפוץ אלקטרופיזיולוגי במהלך היפרטרופיה קרדיו-טרופית.34 בנוסף, הדגמנו תפקוד כפול של MG53 ב מניעת תגובה היפר-דלקתית בלתי מסתגלת במהלך זיהום בנגיף שפעת A sub-lethal, המאופיינת בייצור יתר של אינטרפרון-b, באמצעות דיכוי של הפעלת IRF3/NF-kB ועיכוב של איתות תוך תאי חריג של Ca2þ במקרופאגים.35 יתר על כן, עם מינון קטלני של שפעת A זיהום בנגיף, הוכח כי MG53 מונע תמותה ונזק לריאות, לא על ידי השפעה ישירה על טיטר נגיפי כשלעצמו אלא על ידי הפחתת סערת ציטוקינים (אינטרפרון-b, אינטרלוקין-6 ואינטרלויקין-1ב) באמצעות ויסות שלילי של ה-NLRP3 inflammasome ומניעת פירופטוזיס של הריאה.36 יתרה מכך, טיפול כרוני במינון גבוה של MG53 אקסוגני נקשר לדיכוי NF-kB - דלקת מתווכת בלב המבוגר.37 מחקרים אלו מראים ש-MG53 יכול לווסת איתות חריג של NF-kB במהלך דלקת, אך לא נחקר האם זה מתרחש בהקשר של דלקת בכליות.

הנחנו כי MG53 מווסת דלקת בכליות על ידי אפנון פעילות התעתיק של NF-kB ובכך יכול להחליש את הפיברוזיס בכליות המתרחש כתוצאה מדלקת כרונית. מחקר זה נערך כדי להתייחס להשערה זו.

cistanche יעיל בטיפול במחלות כליה

שיטות

מחקרים בבעלי חיים

כל הניסויים עם בעלי חיים דבקו במדריך המכון הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ופעלו לפי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אוהיו. סוג בר תואם גיל (WT) או mg53^-/-בני זוג שאינם חולים מזן 129S1/SvImJ שימשו22 כדי לבסס את תפקידו של MG53 באפנון של פיברוזיס כליות תלוי-גיל וחד צדדי (UUO). עכברי C57B6/J (9-10 שבועות) נרכשו ממעבדות ג'קסון.

עבור מחקרים על פגיעה בכליות, עכברים (9-12 שבועות) הועברו ל-UUO כדי לגרום לפיברוזיס בכליות. עכברים הורדמו באמצעות איזופלורן (1.5 אחוז -2.0 אחוזים) כדי להבטיח מישור הרדמה עמוק. הליך UUO בוצע על ידי קשירת השופכן השמאלי עם 5-0 משי כירורגי פעמיים לפי פרוטוקולים שפורסמו. 38 לעכברי דמה היה רק ​​חתך בעור הבטן. כדי להעריך את ההשפעה של rhMG53 על פגיעה בכליות חסימתית, קבוצה אחת של עכברי UUO קיבלה rhMG53 (2 מ"ג/ק"ג) באמצעות הזרקת וריד הזנב החל מיד לאחר ניתוח UUO (יום 0) ולאחר מכן מדי יום במשך 7 ימים, עם 2 מנות נוספות בימים 9 ו-11. קבוצת ביקורת של עכברי UUO קיבלה זריקות מלוחים לפי אותו לוח זמנים. עכברים נהרגו ביום ה-12 לאחר ניתוח UUO, הכליות חולפו במקום עם תמיסת מלח מוגברת בפוספט, ודגימות רקמה מהכליה UUO והכליה הנגדית נאספו לצורך היסטולוגיה וניתוח Western blot.

במחקרים נפרדים, WT ו- mg53^-/-עכברים עברו UUO או ניתוח דמה ונהרגו ביום 7 לאחר הניתוח. MG53 ניתן לעכברים תוך שימוש בגישת טיפול מבוסס תאים.39 מקרופאגים RAW 264.7 הודבקו בחלקיקי נגיפי דובדבן תלויי דוקסיציקלין (DOX) Ad tPA-MG53- למשך 24 שעות. התאים הנגועים (בריכוז של {{10}} /100 מ"ל תמיסת מלח לעכבר) הוזרקו לווריד זנב לעכברים מיד לאחר הניתוח (הזרקת יום 0). עכברים קיבלו 4 זריקות של תאי RAW שעברו מתמר של Ad-tPA-MG53 בימים 0, 1, 3 ו-6. מיד לאחר הזרקת התאים ביום 0, חולקו עכברים אקראית לקבוצה שקיבלה ולקבוצה שלא קיבלה DOX (2 מ"ג/מ"ל בתמיסת סוכרוז של 5 אחוזים) במי השתייה שלהם למשך 7 ימים ולאחר מכן נהרג. דגימות רקמה מהכליה UUO ומהכליה הנגדית נאספו לצורך ניתוח היסטולוגיה, RNA וחלבונים.

ניתוחים סטטיסטיים הנתונים מבוטאים כאמצעי -SD. השוואה בין קבוצות בוצעה באמצעות מבחן t של הסטודנט בהשוואה בין 2 מחקרים בסיסיים ניסיוניים H Li et al.: MG53 מווסת NF-kB in kidney fibrosis 2 Kidney International (2021) -, ---groups ו1-ניתוח השונות עבור יותר מ-2 קבוצות (Graphpad Prism 8.2; GraphPad) ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של Bonferroni או Holm-Sidak אד-הוק. ערך של P < 0.05="" נחשב="" מובהק="">

שיטות משלימות שיטות מלאות כולל הערכה היסטולוגית, מדידות קריאטינין בסרום, מבני פלסמיד, תרבית תאים ובידוד תאי אפיתל צינוריים ראשוניים, הכנת אדנוווירוס וזיהום בתאים, בדיקת טרנסלוקציה גרעינית של NF kB p65, אימונוהיסטוכימיה ותמונות קונפוקאליות, דיווחי NF-kB luciferaskin ניסוי אימונוסורבנט מקושר אנזימים, חלוקה של רקמות, אימונובלוטינג, קו-אימוניות, תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (טבלה משלימה S1), וייצור rhMG53 נמצאים בשיטות המשלימות.

תמצית cistanche tubulosa: טיפול במחלת כליות

תוצאות

עכברים עם אבלציה של MG53 מפתחים פיברוזיס בכליות תלוי-גיל

השוו את השפעת ההזדקנות על תפקוד הכליות ופיברוזיס ב- mg53^-/-ועכברי WT. אישרנו את התצפית הקודמת שלנו שלמרות שרמות הקריאטינין בסרום של עכברים צעירים (חודשיים) עם ובלי MG53 לא היו שונות באופן משמעותי, מבוגרים יותר (16-20 חודשים) mg53-/-עכברים הפגינו קריאטינין בסרום גבוה משמעותית מבקרות WT תואמות גיל (איור 1a). בהתבסס על צביעת trichrome, מצאנו כי mg53-/-לעכברים היו יותר פיברוזיס בכליות בהשוואה לעכברי WT, החל מגיל 5 חודשים והמשיכו עד גיל 20 חודשים (איור 1b ו-c). נעשה שימוש בצביעה אימונוהיסטוכימית כדי להעריך את ההשפעה של אבלציה של MG53 על חדירת לויקוציטים, מונוציטים ומקרופאגים בכליות עכברים בנות 2-חודש ו5-חודש (איור 1ד וה'). לכליות לעכברי WT ו- mg53-/- צעירים היו רמות דומות של לויקוציטים תוך-כליים, אך נמצאו יותר תאים דלקתיים ב- mg53/כליות מאשר בכליות WT בעכברים בני 5-חודש.

יתר על כן, אימונוהיסטוכימיה של אקטין שריר חלק ופיברונקטין, 2 חלבוני מטריקס חוץ-תאיים הנמצאים בדרך כלל באזורים של פיברוזיס בכליות, הראתה צביעה משופרת (3- עד פי 8-) בגלומרולי וב-tubulointerstitium של הכליות מ-{ {4}}מ"ג בני חודש53-/- עכברים בהשוואה לעכברי WT 10-בני חודש (איור משלים S1).

UUO גורם לדלקת כליות מחמירה ופיברוזיס בעכברים מ"ג53-/- רמות MG53 בכליות שזוהו על ידי אימונובלוטינג עלו באופן משמעותי 7 ימים לאחר UUO (איור 2א). הכליות mg53- /- UUO הראו פיברוזיס מוגזם, עם שטח נוסף של 30 אחוזים מוכתמים בטריכרום, מאשר כליות WT UUO (איור 2ב).

MG53 מווסת את הפעלת NF-kB ולוקליזציה גרעינית p65

הפעילות של NF-kB (p65) הוערכה במודל UUO. מספר ה-p65 הכולל (t-p65) גדל באופן משמעותי בכליות UUO מ-WT ו-mg53/עכברים, אך הפעלת NF-kB, שהוערכה כזרחון של p65, הייתה גדולה יותר (פי16-) ​​ב-mg53/UUO הכליה מאשר הכליה WT UUO (2-פיפול) בהשוואה לבעלי חיים המופעלים מדמה (איור 3א). ניתחנו את רמות ה-RNA היחסיות של גורם גדילה מתמיר b1 (TGF-b1), מעכב מפעיל פלסמינוגן-1 (PAI-1), וקולגן מסוג I alpha 1 (Col1a1) בכליה החסומה.40 זיהה רמות נמוכות של ביטוי גנים בחיות דמה ואינדוקציה דומה (TGF-b1, w10 fold; PAI -1, w40 fold; Col1a1, w40 fold) בכליה UUO מ-WT ו-mg53 / (איור 3b). כדי לבחון את ההתפלגות המרחבית של MG53 בקליפת הכליה בתנאים רגילים, נותחו חלקי רקמת הכליה. השגנו בקביעות פי 10- יותר חלבון ציטוזול מכלל החלבון הגרעיני המופק. רמות t-p65 היו דומות בשבר הציטוסולי בין WT ו- mg53-/- עכברים, אך היו גבוהות יותר בחלק הגרעיני של mg53-/- עכברים (איור 3c). MG53 זוהה בקטע הציטוזול (עם טובולין כסמן ציטוזול). באופן בלתי צפוי, כמות משמעותית של MG53 זוהתה בשבר הגרעיני (עם היסטון H3 כסמן שבר גרעיני).

כדי לאשר ממצא זה, בדקנו גם לוקליזציה של MG53 בשברי שרירי השלד (איור משלים S2). שחזרנו את המחקרים הקודמים שלנו שבהם MG53 התמקם לציטוזול ולממברנה הסרקולמלית (נתרן-אשלגן אדנוזין טריפוספטאז כסמן של שבריר ממברנה)22,23,25 אך גם זיהה MG53 גרעיני מועשר משריר השלד.

MG53 מקיים אינטראקציה עם p65 כדי לשלוט בפעילות תעתיק הנגרמת על ידי גורם נמק גידול כדי לאשר את תוצאות חלוקת הרקמה שלנו, ערכנו את המחקרים האימונוהיסטוכימיים הבאים. בתאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים של WT מתורבתים, p65 נמצא בעיקר בציטוזול אך התמקם לגרעינים בהיעדר MG53 (איור 4a). כאשר תאים אלו טופלו ב-LPS (5 מ"ג) במשך 8 שעות, הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים הייתה גדולה משמעותית ב- mg53/תאים מאשר בתאי WT (איור 4ב).

מכיוון שהנתונים הללו הציעו ש-MG53 עשוי לקיים אינטראקציה עם p65 כדי לווסת ביטוי ציטוקינים דלקתי, אינטראקציה ישירה בין p65 ו-MG53 הוערכה על ידי מבחני coimmunoprecipitation באמצעות תאי HEK293 שהועברו יחד עם Flag-p65 ו-HA-MG53. הדגמנו אינטראקציה חלשה (איור 4ג). קוטרנספקציה של פלסמידים GFP-p65 ו-RFP-MG53 וניתוח קונפוקאלי אישרו קולקליזציה של p65 ו-MG53 (איור 4ד). לאחר מכן כימתנו האם MG53 משפיע על פעילות שעתוק NF-kB (p65) לאחר גירוי TNF על ידי מדידת פעילות הלוציפראז מקו תאי תעתיק יציב NF-kB/293-GFP-Luc שעבר טרנספקציה זמנית עם כל אחד מהווקטורים של pHM6 או HA-MG53. תאי הכתב מכילים מכתב לוציפראז של ביטוי lentivirus transduced המונע על ידי מקדם ציטומגלווירוס מינימלי בשילוב עם 4 עותקים של אלמנטים של תגובה תמלולית קונצנזוס NF-kB (אתר kB) במעלה הזרם. בהיעדר TNF-a, זוהתה פעילות luciferase פנימית נמוכה מאוד בתאי הכתב המבטאים חלבוני MG53. MG53 דיכא את פעילות התעתוק של NF-kB (p65) של TNF-a-elicited בכ-40 אחוזים (איור 4ה).

ביטוי יתר של MG53 מנע טרנסלוקציה גרעינית של NF-kB p65 בטיפול ב-TNF-a NF-kB p65 הועבר לגרעין בטיפול ב-TNF-a באפיתל הצינורית הפרוקסימלית של הכליה.41 כדי לחקור אם טיפול ב-MG53 יכול להחליש את הטרנסלוקציה הגרעינית של NF-kB p65 בגירוי TNF-a, הבענו יתר על המידה MG53 בתאי HKC-8 או באמצעות התמרה ויראלית Ad-tPA-MG53 תלויה ב-DOX או באמצעות טיפול ב-MG53 אנושי רקומביננטי (rhMG53). שימוש בנוגדן חד שבטי ספציפי ל-MG53-, לאחר אינדוקציה תלוית DOX זוהה MG53 על ידי אימונובלוטינג. MG53 היה קיים ברמה גבוהה מאוד בתאי HKC-8 שהועברו ל-Ad-tPA-MG53,

שווה ערך ל-1 ng rhMG53/mg lysate סלולרי. לעומת זאת, HKC-8 תפס וביטא כמות פחותה בהרבה של rhMG53 (איור 5a). הספיגה של rhMG53 שכותרתו פלורסנט FL על ידי HKC -8 אושרה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור משלים S3). לאחר טיפול TNF-a, הזמן עד לשיא הפעלת p65 היה 15 עד 30 דקות (איור 5b). בתנאים בסיסיים, NF-kB p65 שוכן בעיקר בציטוזול, וביטוי יתר של MG53 לא שינה זאת (איור 5c ו-d). עם זאת, לאחר גירוי TNF-a, p65 עבר לגרעין בתאי HKC-8 שאינם מביעים יתר על המידה MG53. לשם השוואה, טרנסלוקציה גרעינית של p65 ירדה ב-33 אחוז (תאים שקיבלו rhMG53) ל-50 אחוז (תאים שעברו התמרה שקיבלו DOX) בתאים המבטאים יתר על המידה MG53 (איור 5c ו-d).

העברה מאמצת של תאי RAW מהונדסים למודל UUOmouse בוצעה עם תאים 1 - 106 שניתנו באמצעות הזרקת וריד הזנב מיד לאחר ניתוח UUO. עכברים חולקו באופן אקראי לקבוצה שקיבלה מי שתייה רגילים (-DOX) וקבוצה שקיבלה DOX (2 מ"ג/מ"ל) במי שתייה. עכברי UUO קיבלו RAW כל יום אחר בסך הכל 4 זריקות. כליות נקצרו 7 ימים לאחר הניתוח.

עכברים שקיבלו עירוי RAW מהונדס ואחריו אינדוקציה של DOX הפגינו פיפיברוזיס בכליות מופחתת באופן משמעותי (ב-30 אחוזים) בהשוואה לאלה שלא קיבלו תאים או לאלה שקיבלו תאי RAW מהונדסים אך ללא אינדוקציה של Dox (אזור פיברוטי של 66 אחוזים; איור 6a ו-b).

רק אוכלוסיית RAW/Ad-tPA-MG53 קטנה שרדה את המעקב אחר מערכת הרטיקולואנדותל עד סוף הניסויים. צביעת אימונוהיסטוכימיה אישרה שטיפול ב-DOX גרם לביטוי MG53 בתיווך RAW בכליה (איור 6c). מעניין לציין שכליות UUO מעכברים המושרים על ידי RAW ו-MG53 המושרה על ידי DOX הפגינו יחס p-65/t-p65 נמוך יותר (בערך 40 אחוזים) מאלו שלא קיבלו RAW או אלו שניתנו RAW ללא DOX (איור 6ד ו-ה). הרמה המופחתת של p-p65 אושרה עם צביעה אימונוהיסטוכימיה של p-p65 (S536) של כליות UUO (איור 6f). אנו חושבים ש-MG53 במחזור הנמסר על ידי Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX וספיגה על ידי תאי אבובת פרוקסימליים בכליות יכולים להשתתף בהפחתת p-p65 (S536) ולהפחית את דלקת הכליות UUO. בהשוואה לכליות UUO בלבד, ביטוי TGF-b1, PAI- 1 ו-Col1a1 גדל באופן משמעותי בכליות UUO מעכברים שקיבלו עירוי RAW ללא DOX (ללא אינדוקציה של MG53). ניתן לייחס עלייה בגנים הפרופיברוטיים הללו להשראה של תגובה שתל חזקה מתאי עירוי לעכברים בעלי יכולת חיסונית. עם זאת, כליות UUO מעכברים שקיבלו עירוי RAW וקיבלו DOX (אינדוקציה של MG53) הביעו PAI נמוך משמעותית (הפחתה של 60 אחוזים -72 אחוזים)-1 ורמות נמוכות יחסית של TGF-b1 ו-Col1a1 מאשר עכברים ללא טיפול ב-DOX (איור 6 גרם).

מתן מערכתי של rhMG53 מפחית את הפעלת NF-kB והתפתחות פיברוזיס בעכברים הנתונים ל-UUO

בדקנו האם rhMG53 הציג אפקט אנטי-פיברוטי דומה לזה של הטיפול המהונדס בתאי RAW שתואר קודם לכן. הנתונים הפרמקוקינטיים הקודמים שלנו הצביעו על מחצית החיים הקצרה במחזור הדם (כ-90 דקות במכרסמים) של rhMG53.42 עכברים סבלו מתן כרוני של 2 עד 6 מ"ג/ק"ג.

rhMG5326,37 טוב, אז נעשה שימוש באסטרטגיית הניהול המוצגת באיור 7a. לעכברי UUO ניתנו באקראי חומרי שיניים (מי מלח) או rhMG53 (2 מ"ג/ק"ג) מדי יום במשך 7 הימים הראשונים שלאחר הניתוח ולאחר מכן כל יומיים עד שהם נהרגו ביום 12. כליות דמה וכליות נגדיות הציגו t-p65 שווה ערך בערך ורמות ביטוי פיברונקטין, כאשר רמות p-p65 עלו מעט בכליות קונטרלטרליות בהשוואה לכליות דמה. לאחר UUO, t-p65 של הכליות גדל. בהשוואה לחיות שטופלו בתמיסת מלח, יחס ה-p-65/t-p65 בכליות UUO של בעלי חיים שטופלו ב-rhMG53- הופחת בכ-37 אחוז, בעוד ש-IkBa עלה בכ-27 אחוז (איור 7ב ו- ג). בנוסף, פיברונקטין ירד בכ-33 אחוזים (איור 7b ו-c). אימונוהיסטוכימיה אישרה ש-rhMG53 היה קיים בכליות UUO לאחר הטיפול (איור 7ד). הפיברוזיס הכולל הופחת בכליות UUO שטופלו ב-rhMG53- (איור 7ה). עם זאת, ביטוי RNA של TGF-b1, PAI-1 ו-Col1a1 היה דומה בעכברים שטופלו במי מלח או rhMG53 (איור 7f).

cistanche יעיל בטיפול בתפקוד לקוי של הכליות

דִיוּן

MG53 הוא חלבון TRIM מועשר בשרירים שזוהה בתחילה כמרכיב בולט במכונות לתיקון קרום פלזמה. 22,26,42,43 עם זאת, הפעולות של MG53 אינן מוגבלות לשריר השלד, ו-MG53 יכול להשתחרר למחזור הדם. myokine.32 הראינו בעבר ש-MG53 יכול לשלוט בדלקת במהלך נזק לרקמות באיברים מרוחקים.27,29,33,35–37 החקירה הנוכחית מרחיבה את היקף ההגנה על איברים בתיווך MG53- לכליה. אנו מסיקים ש-MG53 יכול להחליש דלקת תוך-כליתית ופיברוזיס בכליות על ידי חסימת הפעלה הנגרמת על ידי ציטוקינים של גורם התעתוק הפרו-דלקתי והפרופיברוטי NF-kB. מסקנה זו מבוססת על התצפיות הבאות: (i) מחיקה גנטית של MG53 בעכברים רגילים.

הביאה לירידה בתפקוד הכליות כשהעכברים מזדקנים אשר לוותה בעלייה בפיברוזיס בכליות ובחדירת הכליה על ידי לויקוציטים ומקרופאגים; (ii) במודל של פגיעה בכליות UUO של עכברים, הכליות החסומות של עכברים חסרי MG53- הפגינו יותר פיברוזיס ודלקת מאשר עכברים מלאי MG53-; (iii) ייצור TNF-a ואינטרלוקין-6 על ידי תאי אפיתל פרוקסימליים צינוריים שטופלו ב-LPS הוחלשו בנוכחות MG53; (iv) טיפול עם או ביטוי יתר של MG53 בקו תאי אפיתל פרוקסימלי צינורי הפחית את הפעלת ה-NF-kB המושרה על ידי TNFa על ידי חסימת הטרנסלוקציה הגרעינית של רכיב p65 של-kB (נמצא כי MG53 נקשר ישירות ל-p65, אם כי חלש); ו-(v) זרחון של p65, שלב הכרחי בהפעלת NF-kB, ירד בכליות החסומות של עכברי UUO שטופלו ב-MG53 רקומביננטי שהושרה לבטא יתר של MG53 במקרופאגים. יתר על כן, המעכב של הפעלת NF-kB, IkBa, גדל בכליות החסומות של עכברי UUO שהוזרקו עם רקומביננטי MG53.

מחיקה גנטית של MG53 בעכברים רגילים הייתה מתירנית להשפעות השליליות של ההזדקנות על הכליות. זה מצביע על כך שהנוכחות של MG53 אנדוגני מספקת רמה בסיסית של הגנה במהלך ההזדקנות. באופן דומה, אובדן MG53 אנדוגני החמיר את AKI עקב חסימה. כליית ה-UUO צברה MG53, אולי משקפת פעילות מיוקינית מרוחקת משרירי השלד. עדיין לא ברור כיצד ניתן לגייס שריר MG53 לכליה במהלך פציעה; עם זאת, כליה פגומה מפתחת לעיתים קרובות היפוקסיה ועוברת לחץ חמצוני,^44,45אותות שיכולים לשמש לגיוס MG53. אם כן, ניתן למנף את ציר "שריר-כליה-תא חיסון" זה כדי להחליש את הנזק לכליות.46 לחלופין, תאי כליה אכן מבטאים רמות נמוכות של MG53 בקו הבסיס,²⁶ובמהלך פציעה חריפה או כרונית, ייצור MG53 יכול להיות מווסת.

NF-kB הוא מניע תעתיק בולט של דלקת ופיברוזיס בפגיעה בכליות והזדקנות.^14,17,47,48התבקשנו לחקור אם ניתן לתווך את ההשפעות של MG53 באמצעות NF-kB מכיוון שהנוכחות של MG53 בתא הגרעיני של הומוגנטים של הכליות הצביעה על פוטנציאל להפרעות שעתוק. לוקליזציה גרעינית של MG53 אינה חסרת תקדים. במודל טרנסגני המבטא יתר על המידה MG53 שריר הלב, MG53 גרעיני מווסת את הביטוי של קולטן-אלפא המופעל על ידי פרוקסיזום פרוליפרטור ברמת התעתיק והשפיע על חילוף החומרים של שומנים בלב.49 יתרה מכך, לאחרונה הדגמנו rhMG53 דיכא NF-kB הפעלה הקשורה לגיל אי ספיקת לב. באמצעות הפחתת ציטוקינים פרו-דלקתיים, אפופטוזיס ולחץ חמצוני בקרדיומיוציטים מבוגרים.³⁷

המנגנון המולקולרי של האופן שבו MG53 מווסת את הגיוס הגרעיני/ציטופלזמי של p65 נותר לא ברור. MG53 אינו מכיל אות לוקליזציה גרעיני, אך הוא מכיל 3 אותות יצוא גרעיניים עתירי N-טרמינל משוערים, מוטיב המוכר על ידי יצוא חלבון יצוא גרעיני.⁵⁰האינטראקציה הישירה בין MG53 ל-p65 הייתה חלשה למדי בתור ההשפעה המשבשת היחידה או העיקרית של MG53 על הפעלת NF-kB. למרות שנראה ש-MG53 משפיע על ההסעה הדינמית הנוקלוציטופלסמית של רכיבים קריטיים של NF-kB, המנגנונים המדויקים נותרו לקבוע.

נראה כי התוצאה הקריטית של MG53-מתווכת renoprotection היא הפחתת שיפוץ פיברוטי באמצעות הפחתה של דלקת בתיווך NF-kB. פיברוזיס בכליות הוא תהליך מורכב הכולל שקיעה פתולוגית של חלבוני ECM שונים. 51 MG53 נראה היה בעל השפעות ברורות על חלבון ECM fibronectin. פיברונקטין עלה בכליות UUO החסרות ב-MG53 וירד בעכברי UUO שטופלו ב-MG53. קשה יותר להבין את הביטוי של חלבוני ECM אחרים בנוכחות והיעדר MG53. הדגמנו בעבר ש-rhMG53 מווסת לרעה את איתות TGF-b1/Smad ומדכא את הסינתזה של חלבוני ECM במחקר חוץ גופי.31 תעתיקי In vivo, TGF b1, PAI-1 ו-Col1a1 לא עלו בכליות UUO מ mg53 / בעלי חיים חסרים. התמלילים הללו אכן ירדו בחיות UUO שנגרמו לבטא יתר של MG53 באמצעות מתן עכברים המושרים על ידי ויראלית

מקרופאגים, אך כאשר ניתן MG53 רקומביננטי, לא נראתה השפעה. זה עשוי להיות פשוט מקרה של מינון מספק מכיוון שרמות ה-MG53 התוך-כליות שהושגו היו גבוהות בהרבה בבעלי חיים שקיבלו את וקטור המקרופאג', בניגוד ל-MG53 רקומביננטי. בנוסף, רמות החלבון לא נמדדו, ואירועים שלאחר שעתוק יכולים לשנות את ה-ECM ב-UUO. דרוש מחקר נוסף כדי להבהיר את התפקיד המתהווה של MG53 באפנון חלבוני ECM ספציפיים. לסיכום, מחקר זה הוכיח כי מיוקין עשוי לסייע בוויסות הדלקת הבסיסית באיבר מרוחק כמו הכליה, ובמסגרת של פגיעה בכליות, עשוי לעזור להחליש ולשלוט בדלקת. איור 8 מציג מודל עבודה של תפקידו של MG53 בהגנה מפני רינו. במהלך גירוי של דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק (DAMP, כגון TNF-a) ודפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן (PAMP, כגון LPS) ולחץ איסכמי, הסיגנלוזום NF-kB מופעל בכליה. MG53 מגן על הכליה על ידי עיכוב זרחון והפעלה של איתות NF-kB, ייצוב IkBa והפחתת גיוס גרעיני p65, חסימת ההפעלה של תוכניות פרו-דלקתיות. למרות ש-MG53 אנדוגני עשוי לתווך את ההשפעות הללו, אנו מציעים שניתן להעניק הגנה חזקה יותר באמצעות MG53 מבחינה טיפולית, דבר אפשרי בהתבסס על היכולת של MG53 אקסוגני להפחית פגיעה ב-UUO. יש צורך בחקירה נוספת כדי להבין כיצד ניתן לנצל את המיוקין הזה מבחינה קלינית.

היתרון של cistanche: הגנה על הכבד ואנטי פיברוזיס

חשיפה

ל-JM יש מניות ב-TRIM-edicine, Inc., המפתחת rhMG53 לטיפול במחלות אנושיות. פטנטים על השימוש ב-MG53 מוחזקים על ידי אוניברסיטת רוטגרס ואוניברסיטת אוהיו סטייט. כל שאר המחברים הצהירו שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR ו-P-HL) ו-NIH R01-AG062896 (P-HL ו-BHR). פרויקט זה נתמך בחלקו גם על ידי קרן לוקווד תוך-קירית מאוניברסיטת אוהיו סטייט (P-HL) ופרס מהמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום (NCATS; P-HL, מספר פרס UL1TR002733). התוכן הוא באחריות הכותבים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של ה-NCATS או ה-NIH.

תרומות המחבר,

PD, P-HL, JM ו-BHR הגו ו/או תכננו את הלימודים; HL, PD, P-HL, ZL ו-XZ ערכו את הניסויים, רכשו נתונים וביצעו ניתוח נתונים; PD, P-HL ו-BHR פירשו את התוצאות; ו-P-HL ו-BHR ניסחו, תיקנו ואישרו את כתב היד. כל המחברים קראו ואישרו את הגרסה הסופית.

חומר משלים

קובץ משלים (PDF) שיטות משלימות.

טבלה S1.רצפי פריימר. איור S1. עכברים מ"ג53-/- מציגים שקיעת חלבון ECM משופרת. רקמות כליה תואמות גיל (10 חודשים) מסוג פרא (WT) ומ"ג53- /- נצבעו ב-40 6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI; כחול, לוחות שמאל), אקטין שריר חלק (SMA; ירוק, לוחות שניים), פיברונקטין (אדום, לוחות שלישיים), ומשולב (לוחות ימין). בר ¼ 25 מ"מ. כימות של אזור פיברוזיס בכליות (n ¼ 3 לקבוצה). הנתונים מוצגים כאמצעי -SD. מבחן t של תלמיד. ***P <>

איור S2.התפלגות של שריר השלד MG53 בין הגרעין לציטופלזמה. שרירי השלד שמקורם בעכברים מסוג wild-type (WT) ormg53-/- חולקו וחולקו אימונו עם נוגדן אנטי-MG53 בהתאמה אישית (3 מ"ג ליזטים) וסמני תא (20 מ"ג ליזטים). נתרן-אשלגן אדנוזין טריפוספטאזות משמשות כסמן ממברנת התא, היסטון H3 כסמן גרעיני, וטובולין כסמן ציטוזול.

איור S3.HKC-8 תאי אבובות פרוקסימליות בכליות קולטים באופן ספציפי את AlexaFluor 647-מסומן rhMG53. rhMG53 (Trimedicine) ואלבומין בסרום בקר (BSA; ThermoFisher Scientific) סומנו עם ערכות תיוג נוגדנים של Alexa Fluor(AF) (Life Technologies) לפי פרוטוקול היצרן. תאי HKC-8 תורבו על צלחת Delta TPG בעלת תחתית זכוכית (Bioptechs Inc.) במדיום (DMEM) של Dulbecco עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) בנוכחות חלבונים מסומנים, BSA-AF647 (משמאל ) ו-rhMG53-AF647 (מימין), למשך 24 שעות. תמונות מחסנית Z נלקחו ממיקרוסקופ קונפוקאלי LSM780 (Zeiss). תמונות מציגות תאים בתחתית הכלים. בר ¼ 25 מ"מ.

איור S4.הנדסת תאי RAW לתווך הפרשת MG53 הניתנת להשראה. (א) תאי RAW הודבקו ב-Ad-tPA-MG53 למשך 24 שעות וטופלו ללא (דוקסיצילין [Dox]) או עם Dox (þDox, 1 מ"ג/מ"ל) למשך 24 שעות נוספות כדי לגרום לביטוי tPA-MG53. תמונות קונפוקאליות הראו אינדוקציה של ביטוי MG53 (נוגדן אנטי-MG53 בהתאמה אישית, לוחות אדומים, תחתונים) מתאי RAW דמויי מקרופאגים (צבע F4/80, ירוק, לוחות עליונים). מוטות ¼ 25 מ"מ. (ב, ג) ניתוח כתם מערבי של ליזטים של תאים (בכמות של 0.6, 3 ו-6 מ"ג) לביטוי המושרה של tPA-MG53 ו-MG53 מתאי RAW נגועים (B) והתרבית המתאימה תרכיזי מדיה (בנפחים של 2, 5 ו-10 מ"ל) (C). כמויות שונות של rhMG53 (בכמות של 0.2, 1, 0.05 ו-0.025 ng) הועמסו כסטנדרטים. Mw, סמני משקל מולקולרי.