Terahertz ספקטרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של תוצרי גז פירוק תרמי של פלזמה דם סוכרתית ולא סוכרתית וכדוריות רקמות כליות
Mar 28, 2022
איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
תַקצִיר
מַשְׁמָעוּת:אחת הטרנדים המודרניים באבחון רפואי מבוסס על מטבולומיקה, גישה המאפשרת קביעת מטבוליטים שיכולים להיות המאפיינים הספציפיים של המחלה. ספקטרוסקופיה גז ברזולוציה גבוהה מאפשרת חקירה של תכולת מטבוליט הגז של דגימות ממקור ביולוגי. אנו מציגים את הפיתוח של שיטה לחקר דגימות ביולוגיות סוכרתיות ולא סוכרתיות, שהוכנו ככדורים, על ידי ספקטרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של terahertz (THz).
מַטָרָה:הרעיון המרכזי של העבודה הוא ללמוד את התוכן של תוצרי גזי פירוק תרמי של מיובשים סוכרתיים ולא סוכרתייםפלזמת דםורקמות כליותלחשיפת סט סמני הגזים שאפיינו סוכרת בשיטת הספקטרוסקופיה ברזולוציה גבוהה THz.
גִישָׁה:אנו מציגים גישה לחקר הסוכרתיים והלא-סוכרתייםפלזמת דם(אדם וחולדות) ורקמות כליות(חולדות), באמצעות ספקטרוסקופיה ברזולוציה גבוהה המבוססת על ההשפעה הלא נייחת של טווח התדרים THz. פותחו שיטות הכנת דגימות הדם והרקמות הכליות ככדורים ולאידוי הדגימות.
תוצאות:המדידות של ספקטרום ספיגה סיבובית של אדים בחימום הכדורים שהוכנו מדם ורקמת כליהבוצעו בטווח התדרים 118 עד 178 GHz. קווי הספיגה המופיעים בספקטרום של אדי הדגימה זוהו וזוהו. התוכן המולקולרי של תוצרי פירוק תרמי היה שונה עבור דגימות לא סוכרתיות וסוכרתיות; למשל, הסמן העיקרי הוא אצטון המופיע בדם הסוכרתי (בני אדם וחולדות) ובסוכרתייםרקמת כליה.
מסקנות: המאמר שלנו ממחיש את היכולת הפוטנציאלית לקביעת תכולת המטבוליטים של דגימות ביולוגיות לאבחון ואת הפרוגנוזה של מחלות לרפואה קלינית. © המחברים. פורסם על ידי SPIE תחת רישיון Creative Commons Attribution 4.0 Unported. הפצה או שכפול של יצירה זו כולה או חלקה מחייבת ייחוס מלא של הפרסום המקורי, כולל DOI שלו. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] מילות מפתח: ספקטרוסקופיה של טרה-הרץ ברזולוציה גבוהה; פירוק תרמי; רִקמָה;פלזמת דם; סוכרת; ליאופיליזציה.
מילות מפתח:ספקטרוסקופיה של טרהרץ ברזולוציה גבוהה; פירוק תרמי; פלזמת דם; סוכרת; ליופיליזציה, רקמת כליות.
1. הקדמה
בימינו, בעיית האבחון של מחלות בעלות חשיבות חברתית (סוכרת, מחלות סרטן וכו'), כולל השלב המוקדם, מושכת את תשומת הלב הרבה של קבוצות מדעיות בעולם.אחת הגישות החדשות הפותחות אפשרויות חדשות באבחון וטיפול במחלות שונות היא מטבולומיקה. מטבולומיקה היא תחום מדע החוקר את התוצרים המטבוליים הסופיים והבינוניים של מערכת ביולוגית (תא, איברים או אורגניזם שלם). המטבולומיקה יכולה לחשוף את המטבוליטים שיכולים להיות המאפיינים הספציפיים של המחלה ויכולים למלא תפקיד גדול באבחון ובפרוגנוזה של מחלה. אמצעי התקשורת, המכילים את התוצרים המטבוליים הסופיים והבינוניים באורגניזם האנושי ושימושיים לחשיפת המטבוליטים הקשורים למחלות ופתולוגיות, הם נשימה בנשיפה, דם, שתן, רוק וכו'.
אחת המחלות החשובות מבחינה חברתית המאיימת על איכות החיים של אנשים היא סוכרת. סוכרת מסוג 2 הייתה בעבר מחלה בגיל העמידה, אך כיום היא מאובחנת במבוגרים, צעירים וילדים. התוצאות של חקירות מטבולומיות של דגימות דם ושתן של חולי סוכרת מגיל 18 וכן ילדים מגיל 1 עד 13 מוצגות ב-Human Metabolome Database (HMDB).1 בעיקר, דם (21 חומרים כימיים כולל איזומרים), שתן ( נחקרו 30 חומרים כימיים כולל איזומרים), ונוזל מוחי (חומר כימי אחד). לדוגמה, (R)-3-חומצה הידרוקסית-בוטירית זוהתה בכל שלושת סוגי הנוזלים. כמה חומרים (חומצה אצטואצטית, D-פרוקטוז ו-D-גלוקוז) זוהו בשני הנוזלים (דם ושתן). התכונה האופיינית יותר לסוכרת (אצטון, CH3COCH3) הייתה קיימת בשתן בלבד. דגימות הנוזלים, תוצאות החקירות שהוצגו ב-HMDB, נחקרו בשיטות שונות - כרומטוגרפיית גז; 2 כרומטוגרפיית גז עם ספקטרומטריית מסה; 3,4 גז-נוזל כרומטוגרפיה עם ספקטרומטריית מסה; תהודה מגנטית פרוטון;6 ושיטות המשתמשות במכשירים המיוחדים לניטור מצב חולי סוכרת, מערכת ניטור הגלוקוז הרציפה.7
התפתחות מחלת כליות כרונית היא סיבוך עיקרי של סוכרת. למרות שהקביעה של אלבומין מסוכרר היא הגישה הנפוצה להקרנה, נזק לכליות עשוי להתחיל הרבה לפני שמופיעים שינויים משמעותיים קלינית באלבומין בשתן. בהתחשב בפתוגנזה הרב-פקטוריאלית של מחלת כליות כרונית, סמנים שונים נלקחו בחשבון לבדיקתה.
הגישה הספקטרוסקופית יכולה לספק מידע על תוכן הדגימות הביולוגיות שניתן להשתמש בהן לאבחון רפואי. טווח התדרים של terahertz (THz) חשוב מאוד לחקר הגזים, הנוזלים והרקמות של אורגניזמים חיים. ישנן כמה ביקורות המוקדשות ליישומים של שיטות של טווח תדרים THz, כולל ספקטרוסקופיה של תחום זמן THz, רפלקמטריית THz והדמיית THz לביולוגיה ורפואה.10
ספקטרוסקופיה של תחום הזמן של THz מאפשרת לזהות את הספקטרום, כאשר למקדם הספיגה או לאינדקס השבירה יש כמה תכונות ספקטרליות התואמות לנוכחות של כמה ביומולקולות (חלבונים, סוכרים וכו') בדגימות או לריכוזיהן השונים.11
ספקטרוסקופיית ספיגה מולקולרית ובפרט ספקטרוסקופיה גז THz היא גישה מבטיחה מאוד לחקירות של תערובות גזים מרובות רכיבים ממקורות שונים.12 ניתן לחקור את הדגימות במצב נוזלי ומוצק על ידי אידוי או פירוק תרמי. ניתן לחשוף את המטבוליטים-סמנים של מחלות בעלות חשיבות חברתית (סוכרת, סרטן וכו') על ידי הקווים הספקטרליים שלה בספקטרום הספיגה המתבצע בהעברת קרינה דרך דגימות גז.
רמת האצטון בדגימות של נשימה נשיפה ושתן שנלקחו מחולי סוכרת (12 אנשים) נמדדה באמצעות ספקטרומטר טווח terahertz עם מפתוח פאזה של הקרינה הפועלת. הניסויים נעשו בשיתוף עם המרכז הלאומי למחקר רפואי אלמזוב. המדידות בוצעו בקווי ספיגת אצטון בתדרים מרכזיים של 150.537 ו-151.647 גיגה-הרץ. המדידות בוצעו ללא חימום. ניתוח סימולטני של דגימות הנשימה והשתן הנשיפה של חולי סוכרת העלה כי רמת האצטון בשתן הייתה גבוהה בהרבה מאשר בנשימה הנשיפה, במקרים מסוימים בסדר גודל גבוה יותר.13,14
התוצאות של חקירות ספקטרוסקופיה גז ברזולוציה גבוהה של THz שלפלזמת דםשל חולים וחולדות (בריאות על תנאי וסוכרת) וכן של החולדותרקמת כליה(בריא ועם סוכרת) מיובשים ולחוצים לכדורים מוצגים. הרקמות אופלזמת דםשל יצורים חיים, ללא כל הכנה, יש לחקור מיד לאחר הדגימה. הכנה ככדורים מאפשרת חקירה לאחר זמן מספיק ארוך לאחר דגימת דם או ביופסיית כליות.
2 ניסויים ומתודולוגיה
2.1 שיטה להכנת כדורי פלזמה דם וכדורי כליות
דם ורידי מחולים עם סוכרת מסוג 2 ומשתתפים בריאים על תנאי נאסף במחלקה האנדוקרינולוגית של המרכז הלאומי למחקר רפואי אלמזוב; המרכז מספק טיפול רפואי לחולי סוכרת. שלושה מטופלים ושני משתתפים היו גברים, תואמים לגיל (39 עד 43 שנים). כל הפרוטוקולים הניסויים ששימשו בחקירה זו נבדקו ואושרו על ידי המטופלים והמשתתפים וועדת השימוש של המרכז הרפואי. דם ורידי נאסף בבוקר לאחר 8 עד 12 שעות של צום בצינור עם נוגד הקרישה K3EDTA (Vacutest Kima, איטליה). פלזמה התקבלה לניתוח פרמטרים ביוכימיים על ידי צנטריפוגה של דם מלא ב-3000 סל"ד למשך 15 דקות בצנטריפוגה מעבדה (Eppendorf 5702R, גרמניה) בטמפרטורה של þ4 מעלות. ערכים של פרמטרים ביוכימיים שלפלזמת דםדגימות ומרווחי התייחסות מוצגים בטבלה 1 (רמת ההמוגלובין המסוכרר התקבלה בדם המלא). טבלה 1 מראה שריכוז הגלוקוז, הטריגליצרידים וההמוגלובין המסוכרר בדגימות של חולה סוכרת עולה פי 1.5, 2 ו-2.3 בהתאמה.
המחקר בוצע גם עם חולדות Wistar זכרים בגיל 8 שבועות ומשקלם 180 עד 200 גרם, על פי פרוטוקול מחקרים ניסיוניים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון לרפואה ניסויית אלמזוב המרכז הלאומי למחקר רפואי. רמת הגלוקוז בבעלי חיים מקבוצת הניסוי הייתה 21 mmol ∕ ליטר לאחר 120 דקות לאחר העמסת גלוקוז. חולדות שלמות שימשו כקבוצת ביקורת. דם ורידי נאסף מהווריד הנבוב התחתון לפני שהמתת בעלי חיים. כמו כן, הכליה נקצרה. דגימות דם נאספו לתוך צינורות המכילים נוגד קרישה.
דגימות הבדיקה הוקפאו בטמפרטורה של -80 מעלות (מקרר בטמפרטורה נמוכה DW-86L388A, Haier, סין). לאחר מכן הוא עבר ליופיליזציה על ידי ייבוש בהקפאה של Vaco 2 (ZirBus, גרמניה) בטמפרטורה של -50 מעלות ולחץ של 3 Pa. ההקפאה מתבצעת לפני ליאופיליזציה שכן, במהלך ליאופיליזציה בהשפעת לחץ פנימי גבוה, רכיבים ביולוגיים יכולים לְהֵהָרֵס. דגימות מיובשות היו ספוג המורכב מגבישים ביולוגיים. הספוג נהרס על ידי מרית מתכת ונמחץ לגבישים בגודל של כמה עשרות מיקרומטרים. השימוש במכתש ועלי היה בלתי אפשרי, שכן טחינת החלבונים בהרכב הדגימות תוביל להידבקותם הלא רצויה ולהיווצרות גרגירים עגולים.
אבקת הדגימות הליופיליות נשקללה (מאזן אנליטי OHAUS Discovery, שוויץ) ולאחר מכן הונחה בתבנית לחיצת פלדה. שימוש במכבשי מעבדה (אנגקור, רוסיה ו-Specac, בריטניה) בלחץ יציקה מסוים, הפלזמת דםהתקבלו כדורים וכדורי כליות. כל גביש של כדורים מכיל אחוז מסוים של שומנים (טריגליצרידים), חלבונים (אלבומין) ופיברינוגן - כולם נורמליים או מסוכררים (במקרה הסוכרתי). הכדורים של דגימות מקבוצת הביקורת מכונות להלן "גלולה לא סוכרתית" והכדורים של דגימות מה-קבוצת סוכרת מכונה להלן "גלולה סוכרתית".
התקנה ניסיוני של ספקטרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של 2.2 THz
ספקטרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של THz המבוססת על השפעות לא נייחות מאפשרת לנתח את הרכב הרכיבים של תערובות גז מרובי רכיבים אדים. ספקטרומטרים מספקים רגישות קרובה לגבול התיאורטי עם רזולוציה מוגבלת רק על ידי אפקט הדופלר ויכולים להקליט תהליכים מהירים. הרגישות נשמרת גם עם ירידה משמעותית בלחץ הגז והיא כ-0.2 ppb במצב הסריקה עבור גזים מסוימים (למשל, אמוניה במדידות של קו ספיגה ליד התדר של 572 GHz). בנוסף, היא מאפשרת לקבוע את הרכב הרכיבים של תערובת גז באמינות גבוהה.12 מחקר של תוצרי הפירוק התרמי של כדורים בוצע בשיטת THz ספקטרוסקופיה גז לא נייח של טווח 118 עד 178 GHz. הספקטרומטר משתמש בלולאה נעילת פאזה לשליטה אוטומטית בתדר של מנורת הגל לאחור והסטת הפאזה, רישום בתחום הזמן, מיצוע ועיבוד אות המעבר הספקטרוסקופי. המכשיר רושם אות בתחום הזמן. אדי הדגימות נותחו באמצעות ההליך הבא. כדורים הוכנסו למבחנה, באמצעות שאוב ואקום, חיממו מבחנה בהדרגה (עד 240 מעלות) והתערובת שנוצרה של תוצרי הפירוק התרמי של הדגימה הוכנסה לתא המדידה. קובץ נתונים כולל בדרך כלל הקלטות של טווח פעולה נבחר או של טווח הפעולה הכולל של הספקטרומטר. לכן, ניתן לזהות חומרים על ידי קווי ספיגה המופיעים בספקטרום הכולל של הדגימה וניתן לאתר את הדינמיקה של ריכוזים בתערובת על ידי השוואה של מספר קבצי נתונים. חומרים זוהו על ידי חיפוש בהם במסדי נתונים MW, mmw ו-THz בקוד פתוח.15,16
3 אדי פלזמה ואדי כליות בדם בעזרת שימוש בספקטרומטר Terahertz ברזולוציה גבוהה
עם מערכות ה-THz-TDS שלנו, מדדנו העברת כדורים בטווח הספקטרלי של 0.2 עד 1.4 THz,17 אך אנו יודעים שלביומולקולות ובפרט לתוצרי הפירוק שלה במצב גז יש תגובה אינפורמטיבית (ספיגה סיבובית ספקטרום) בתדרים אלה ומטה, ולכן ביצענו מחקר נוסף על ספקטרומטר גז ברזולוציה גבוהה של THz. קווי ספיגה שזוהו של חומרים באדם סוכרתיפלזמת דםחופפים לחומרים של אדם ללא סוכרתפלזמת דם, למעט אצטון. ישנם קווי ספיגה רבים של אצטון השוכנים בטווח תדרי העבודה של הספקטרומטר (118 עד 178 GHz). בדרך כלל, די בזיהוי קו ספיגה כלשהו של חומר אחד לקביעה חד משמעית של נוכחות החומר בתערובת הגז המרובת רכיבים. דוגמה לרישום חלקים של ספקטרום הספיגה עם קו הספיגה של אצטון מוצגת באיור 1. אצטון יכול להופיע בדם כאשר הפרעה במטבוליזם של פחמימות. כפי שצוין בספרות, הדם של חולי סוכרת הכיל -OH-butyrate ואצטואצטט, אך מאוחר יותר חומרים אלו התפרקו לאציטון ופחמן דו-חמצני.18 לפחמן דו-חמצני אין מומנט דיפול; לכן, אין לו מעברים סיבוביים. ניתן לזהות את התוכן המוגבר שלו רק על ידי לימוד ספקטרום הרטט של המדגם בטווח ה-IR.
חומרי אדי פלזמה, כגון קרבוניל גופרתי (OCS), דו תחמוצת הגופרית (SO2), חומצה פורמית (HCOOH), חומצה איזוציאנית (HNCO) ואמוניה (NH3), זוהו בדגימות חולי סוכרת אנושיות וגם בדגימות שאינן חולות סוכרת. במקרים מסוימים, יש קו ניסוי אחד שזוהה בספקטרום של הדגימה המקביל ליותר קווים מאחד עבור חומר אחד (למשל, חומצה איזוציאנית) בנתוני הקטלוג (ראה טבלה 2).15,16
זה מוסבר על ידי העובדה שהקטלוגים מכילים נתונים על מבנים היפר-עדינים של חומרים שאינם נפתרים בניסוי זה, שכן לקווים יש רוחב סופי בסדר גודל של כמה מאות קילו-הרץ. קווי הספיגה המתקבלים של החומרים הנחקרים עולים בקנה אחד עם ספקטרום הספיגה של אדי דם נימי ופלזמת דםשל מטופלים עם סוכרת ומשתתפים בריאים על תנאי שפורסמו בעבודה הקודמת שלנו.19 החומרים הגזים שהתגלו יכלו להיווצר במהלך הכנת הדגימה כתוצרים של הטרנספורמציה כימית של חומצות אמינו. השאלה אם תרכובות אלו הן בעלות ערך אבחנתי מחייבת בדיקה. בפרקטיקה הקלינית בסוכרת, ניתוח התוכן של חומרים אלה אינו משמש עדיין.
האדים של הפלזמת דםשל חולדות בריאות הכילו קרבוניל גופרתי (OCS), מתאניול (CH3SH), בוטירוניטריל (C3H7CN), אצטלדהיד (CH3CHO) וחומצה פורמית (HCOOH). המדגם שלפלזמת דםשל חולדות סוכרתיות היה שונה על ידי נוכחות אצטון. בנוסף לקווי הספיגה של פרופיוניטריל (C2H5CN), זוהה מתיל פורמט (CH3OCHO).
דגימות האדים של כדורים מיובשים של חולדות בריאות וחולות סוכרת'רקמות כליותנלמדו. האדים שלרקמת כליהשל חולדות בריאות מכילות קרבוניל גופרתי (OCS), דו תחמוצת הגופרית (SO2), חומצה פורמית (HCOOH), חומצה איזוציאנית (HNCO), אתיל פורמט (C2H5OCHO) ופרופילן גליקול (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3). תכולת האדים של חולדה סוכרתיתרקמת כליההיה שונה מהחולדה הבריאה בנוכחות לא רק קרבוניל גופרתי (OCS) אלא גם האיזוטפולוג שלו OCS-34. האצטלדהיד (CH3CHO), מתנתיול (CH3SH), אתילן גופרתי (C2H4S), מתנול (CH3OH) וגליקולאלדהיד (CH2ðOHÞCHO) זוהו גם באדים של גלולה של חולדה סוכרתית.רקמת כליה(ראה איור 2 ואיור 3).
נוכחותן של תרכובות גופרית, כגון מתאניול, עשויה להיות מוגדרת על ידי פירוק תרמי של חומצות אמינו גופרית (מתיונין, ציסטאין וציסטין) בהרכב חלבון הדם. מתיונין היא חומצת אמינו חיונית שאינה מסונתזת באורגניזמים אנושיים. הוא מתקבל ממזון ומהווה מקור לגופרית לביוסינתזה של ציסטאין. כאשר חומצות אמינו גופרית חוממו לטמפרטורות של כ-240 מעלות, זוהו מתאניול ואתילן גופרתי (פירוק מתיונין) בספקטרום המסה של חומרים אלה.20
4. מסקנה
התוכן המולקולרי של אדם וחולדהפלזמת דםוחולדהרקמת כליהבמהלך פירוק תרמי של הדגימות נחקר באמצעות ספקטרומטר THz ברזולוציה גבוהה. הוצגה שיטת הכנת הדגימות הביולוגיות ככדורים. שיטה זו נותנת אפשרות לאחסון והובלה של דגימות. ספקטרוסקופיה של גז ברזולוציה גבוהה מאפשרת לקבוע את התוכן של תערובות גז מרובות רכיבים מכל מקור, כולל ביולוגי עם ריכוזי עקבות של רכיבי גז. אצטון זוהה בחולי סוכרתפלזמת דםדגימות. מידע על ההבדל בתוכן של סוכרתי ובריאפלזמת דםשל גברים וחולדות וחולדה סוכרתית ובריאהרקמות כליותהתקבל מספקטרום סיבובי ספיגה של אדים. השימוש בספקטרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של THz מספק ניתוח איכותי של תכולת הרכיבים של דגימות של אדי דם ורקמות כליותכדורים. האפשרות לבצע הערכה כמותית של ריכוזים של סמני גזי סוכרת חשובים בהתאם למצב החוליםיש ללמוד בחקירות נוספות.
