מחקר על תפקוד נוירואנדוקריני-אימוני של Cistanche Deserticola ומוצרי אידוי יין האורז שלה בדגם חולדה המושרה על ידי גלוקוקורטיקואידים-Ⅱ

3.2.4. אימונוהיסטוכימיה

אפופטוזיס נוירוני נשלט על ידי גנים אפופטוטיים ואנטי-אפופטוטיים רבים, בעיקר הגן מקדם אפופטוזיס Bax והגנים האנטי-אפופטוטיים של משפחת הגנים Bcl-2. Bcl-2 ממוקם באברונים המייצרים חמצן תגובתיים כגון המיטוכונדריה, הרשת האנדופלזמית וממברנות גרעיניות. ל-Bcl-2 יש השפעה מועטה על רדיקלים חופשיים של חמצן, אבל יכוללמנוע נזק חמצוני בתאים. Bax מעביר מהציטופלזמה אל הממברנה המיטוכונדריאלית, משנה את מבנה הממברנה המיטוכונדריאלית ומקדם את שחרור הציטוכרום c והשראת אפופטוזיס.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%

היה ביטוי בציטופלזמה של יותרת הכליה של חלבון Bax ו-Bcl-2. הצביעה הראתה את כל החלקיקים הצהובים. בהשוואה לזו של קבוצת BC, הצפיפות האופטית הממוצעת של חלבון Bax בקבוצת MC עלתה באופן משמעותי (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

איור 5(ב) מראה שבהשוואה לזו של קבוצת BC, הצפיפות האופטית הממוצעת של חלבון Bcl-2 בקבוצת MC ירדה באופן משמעותי (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

חלבון הקספאז-3 ממוקם בעיקר בציטופלזמה בצורתו המקורית ברקמות נורמליות ובעל ביטוי נמוך. האותות החיוביים הם צהוב חיוור או צהוב חום. בהשוואה לזה של קבוצת BC, הביטוי של caspase-3 בקבוצת MC עלה באופן משמעותי (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

ברקמות נורמליות, הביטוי של הגן Fas הצטמצם, והאות החיובי להכלאה באתרו היה צהוב חום. כפי שמוצג באיור 5(ד), בהשוואה לזו של קבוצת BC, הצפיפות האופטית הממוצעת של חלבון Fas בקבוצת MC עלתה (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

חלבון FasL ממוקם בעיקר בממברנת התא או בציטופלזמה, והאותות החיוביים שלו חומים. בהשוואה לזו של קבוצת BC, הצפיפות האופטית הממוצעת של הגן FasL בקבוצת MC עלתה באופן משמעותי (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

התוצאות הוכיחו ש-CD ו-WCD יכוליםלגרום לאפופטוזיס בתאים דלקתייםולהפחית את הנזק לאדרנל על ידי קידום הביטוי של חלבון FasL וקשירה לחלבון Fas, הפעלת חלבון קספאז-3 והפעלת מפל קספאז. ההשפעה של קבוצת WCD-HD הייתה הטובה ביותר.

3.3. קביעת התפקוד החיסוני

3.3.1. אינדקס איברים חיסוניים

בהשוואה לאלה של קבוצת BC, מקדם התימוס ואינדקס הטחול של קבוצת MC ירדו באופן משמעותי (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3.2. זיהוי של תת-קבוצות לימפוציטים מסוג T בדם היקפי

אחוז תאי ה-CD4+ ברביע השמאלי העליון ותאי ה-CD8+ ברביע התחתון הימני ב-BC ובכל קבוצת תרופות היה גבוה יותר מזה שבקבוצת ה-MC. בהשוואה לזה של קבוצת ה-BC, היחס של CD4+ThCD8+ ירד משמעותית בקבוצת MC (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3. קביעת הרמה של IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α ו-IFN-C בסרום

איור 8 מראה שבהשוואה לזו של קבוצת ה-BC, רמת ה-IL-6, TNF- ו-IFN-c עלתה באופן משמעותי (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4. תוצאות של ניסוי תצפית במיקרוסקופ של רקמות לימוס

איור 9 מראה כי בקבוצת BC, מספר רב של לימפוציטים היו נוכחים. לימפוציטים ורטיקולוציטים היו מסודרים באופן רופף במרכז עם תימוציטים עגולים או סגלגלים מפוזרים. לא היה נמק, לא הסתננו תאי דלקת, ולא היו שינויים חריגים.

קבוצת MC הראתה כמות גדולה של רקמת נמק לימפואידית, עם סידור לא מסודר של לימפוציטים ורטיקולוציטים במרכז. תימוציטים עגולים או סגלגלים נעלמו, ניוון תאים מסיבי או נמק ניכר, והייתה חדירת תאים דלקתיים עם שינויים פתולוגיים חריגים.

בקבוצות ה-CD, המאפיינים המורפולוגיים של לימפוציטים חזרו לקדמותם, וסידור הלימפוציטים המרכזיים והרטיקולוציטים היה כמעט תקין. תימוציטים עגולים או סגלגלים התאוששו, אך נותרו מספר קטן של לימפוציטים ניווניים או נמקיים ותאי דלקת חודרים.

בקבוצות WCD ובקבוצת PC, המאפיינים המורפולוגיים של לימפוציטים תוקנו טוב יותר. הלימפוציטים והרטיקולוציטים במרכז היו מיושרים היטב, התימוציטים העגולים או הסגלגלים היו כמעט תקינים, אך נותר מספר קטן של לימפוציטים חודרים וניונים.

3.4. ביטוי גן חלבון CaM

ערך RQ (CaM mRNA -actin mRNA) נחשב לבחינת הביטוי של CaM mRNA. ה-RQ של קבוצת BC היה 1. הביטוי של CaM mRNA בהיפותלמוס בקבוצת MC עלה באופן משמעותי (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. דיון

הפרמקופיה הסינית [2] מתעדת כי ניתן להשתמש בתקליטור ו-WCD במרפאה כסוגים העיקריים של פריטי בישול. לאחר מאודה עם יין אורז, ההשפעות נוגדות הזדקנות וחיטוב כליות-יאנגהיו משופרים. באמצעות UPLC-QqQ-MS, זיהינו את השינויים הכמותיים בבסיס החומר הכימי במהלך תהליך אידוי יין האורז. הגליקוזידים האירידואידים היו לא יציבים ותכולת הגליקוזידים הללו ירדה, אפילו לא ניתנת לזיהוי. תכולת הגליקוזידים של פנילטנול השתנתה גם היא, מה שעלול לגרום לשינויים בפרמקודינמיקה ובהשפעה הקלינית.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%

המודל הקלאסי של מחסור בכליות-יאנג שוכפל על ידי הזרקה תת עורית של קורטיקוסטרון [19]. מינון יתר של קורטיקוסטרון עלול לעכב את סוד ה-CRH בהיפותלמוס. בינתיים, הסוד של ACTH גם עוכב. רמת הורמון קליפת יותרת הכליה ירדה, וכך, התפקוד של ציר HPA ירד. תת-תפקוד של ציר HPA הוא מאפיין שכיח של מחסור בכליות-יאנג [20]. לאחר מכן החולדות מראות תופעות של "דלדול" והתסמינים תואמים את אלה של מחסור בכליות-יאנג במרפאה.

בקבוצת MC, רמת CRH, ACTH, T ו-CORT בסרום חולדות ירדה באופן משמעותי (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

מווסת השיעור של בני משפחה Bcl-2 הוא אחד ממנגנוני הליבה שבאמצעותם FasThFasL מתווך את מסלול קולטני המוות, ומשפחת Bcl-2 מווסתת את המסלול המיטוכונדריאלי [21]. גורם מעכב אפופטוזיס Bcl-2 וגורמים מעוררי אפופטוזיס, כגון Bax, כולם שייכים למשפחת Bcl-2 [22]. אפופטוזיס תאי עשוי להיקבע על ידי היחס היחסי בין גורמים מעכבי אפופטוזיס וגורמים מעוררי אפופטוזיס [23]. למיטוכונדריה יש תפקיד של מחסומים מרכזיים לצורות רבות של אפופטוזיס [24]. המחקר הנוכחי הראה ש-CD-MD ו-WCD יכולים להסיק את הביטוי של Bax ולהגדיל את Bcl-2 ללשפר את המחסור בכליות-יאנג. Fas הוא קולטן המוות העיקרי הגורם לאפופטוזיס על ידי קשירה עם ליגנד Fas (FasL) [25]. הביטוי של Fas ו-FasL בקבוצת MC עלה, בעוד שביטוי זה גדל באופן משמעותי בקבוצת WCD-MD (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

מחסור בתפקוד חיסוני הוא אחד הביטויים החשובים של מחסור בכליות-יאנג [28]. במחקר זה, מצאנו שהמדד של הטחול והתימוס של קבוצת WCD-MD התאושש באופן משמעותי (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

ציר HPA הוא מערכת הוויסות החשובה ביותר מכיוון שהוא מווסת את הפרשת הגלוקוקורטיקואידים ואת המערכת האנדוקרינית כדי לשמור על תפקוד ההפרשה של קליפת האדרנל [32]. ביטוי יתר של CaM mRNA ברקמת ההיפותלמוס היה קשור לחסר של יאנג כליות. CD ו-WCD יכולים לחסום את תעלות הסידן, לעכב את ביטוי CaM mRNA בהיפותלמוס ולהפחית את זרימת הסידן, ובכך להפחית את פעילות קומפלקס Ca2+·CaM.

היווצרות מחסור בכליות-יאנג הוא תהליך התפתחות מחלה כרונית. כליות אינן עוד מושג אנטומי גרידא, והיא כינוי כללי למערכות נוירואנדוקריניות-אימוניות וגניטורינאריות. רשת נוירואנדוקרינית-אימונית (NEI) היא מערכת רגולטורית משולבת חשובה [33]. CD ו-WCD יכולים לווסת את תפקוד ציר HPAT ולשפר את ההתאוששות של מחסור בכליות-יאנג. תוצאה זו מספקת את הבסיס הניסיוני למניעה וטיפול קליני של מחסור בכליות-יאנג.