אתר הפגיעות ב-SARS-CoV-2 ספייק גורם לנוגדן מגן רחב נגד תת-שונות אומיקרון מובחנות באופן אנטיגני

ההתפתחות המהירה של גרסאות Omicron של תסמונת הנשימה החמורה החריפה 2 (SARS-CoV-2) הדגישה את הצורך לזהות נוגדנים בעלי יכולות נטרול נרחבות כדי להודיע ​​על טיפולים חד שבטיים ואסטרטגיות חיסון עתידיות. בזאת, זיהינו את S728-1157, נוגדן מנטרל רחב (bnAb) המכוון לאתר הקולטנים (RBS) שנגזר מאדם שנדבק בעבר ב-WT SARS-CoV-2 לפני התפשטות וריאנטים של דאגה (VOCs). S728-1157 הדגימה נטרול צולב רחב של כל הגרסאות הדומיננטיות, כולל D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu ואומיקרון (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). יתר על כן, S728-1157 הגן על אוגרים מפני אתגרים in vivo עם וירוסי WT, Delta ו-BA.1. ניתוח מבני הראה כי נוגדן זה מכוון לאפיטופ Class 1/RBS-A בתחום הקישור לקולטן באמצעות אינטראקציות הידרופוביות וקוטביות מרובות עם אזור 3 הקובע את השלמות השרשרת הכבדה שלו (CDR-H3), בנוסף למוטיבים הנפוצים ב-CDR-H1/ CDR-H2 של נוגדנים מסוג 1/RBS-A. חשוב לציין, האפיטופ הזה היה נגיש יותר במצב הפתוח והפרפוזיה, או בקונסטרוקציות ספייק מיוצב הקספרולין (6P), בהשוואה למבני דיפרולין (2P). בסך הכל, S728-1157 מפגין פוטנציאל טיפולי רחב ועשוי לספק תכנונים של חיסונים מונעי מטרה כנגד גרסאות עתידיות של SARS-CoV-2.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

מבוא

מאז תחילת המגיפה בדצמבר 2019, וירוס תסמונת נשימתית חריפה נגיף נגיף נגיף 2 (SARS-CoV-2) הוביל ליותר מ-660 מיליון מקרים של מחלת הקורונה 2019 (COVID-19) ולמעלה מ-6.5 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם. למרות שהפיתוח וההפצה המהירה של חיסונים ותרופות ריסנו במידה רבה את ההשפעה של COVID-19, הופעתם של וריאנטים של דאגה במחזור (VOCs) ממשיכה להוות איום גדול בשל הפוטנציאל להתחמקות חיסונית נוספת ופתוגניות מוגברת. גרסת ה-D614G הייתה הגרסה המוקדמת ביותר שהופיעה והפכה לרווחת אוניברסלית לאחר מכן. בהשוואה ל-WT, וריאנט ה-D614G הציג יכולת העברה מוגברת ולא פתוגניות מוגברת ולכן לא היה סביר להפחית את היעילות של חיסונים בניסויים קליניים (1). בין הופעתו של D614G לאוקטובר 2021, 4 VOCs משמעותיים נוספים התפתחו ברחבי העולם, כולל אלפא, בטא, גמא ודלתא. בין הגרסאות הללו, דלתא הפכה לאיום עולמי רציני בגלל יכולת ההעברה שלה, חומרת המחלה המוגברת וההתחמקות החיסונית החלקית, כפי שהוכח ביכולת המופחתת של סרום פוליקונלי ו-mAbs לנטרל זן זה (2-6). זמן קצר לאחר מכן, בנובמבר 2021, זוהתה גרסת Omicron והוכרזה כ-VOC רומן. וריאנט זה היה בעל המספר הגדול ביותר של מוטציות עד כה ונראה שהתפשט מהר יותר מאשר זנים קודמים (7, 8). נכון לעכשיו, יש מגוון רחב של תת-שושלות של Omicron המובילות למקרים חדשים של COVID-19, כאשר BQ.1, BQ.1.1 ו-XBB.1.5 הופכים דומיננטיים על פני BA.5 ומהווים את רוב המקרים החדשים ברחבי העולם באותה תקופה של כתיבה. גרסאות Omicron יכולות להימלט מהכרה על ידי חסינות הקשורה לחיסון COVID-19 בהיקפים שונים, ובכך להפחית משמעותית את עוצמת הנטרול של נוגדנים בסרום מאנשים מחלימים, מחוסנים במלואם ל-mRNA, ואנשים שקיבלו חיזוק עם הדו-ערכי WT/BA.5 החדש. חיסון mRNA (9, 10). באופן דומה, וריאנטים של Omicron הצליחו לחמוק מהקישור של מספר MABs טיפוליים לשימוש חירום (EUA), למרות שאלו הוכחו בעבר כיעילים כנגד VOCs מוקדמים יותר (10-12). בשל הניטרול המופחת נגד Omicron והאיום המתמשך של VOCs עתידיים, יש צורך דחוף לזהות נוגדנים מנטרלים רחבים וחזקים שיכולים להגן מפני שושלות SARS-CoV-2 מגוונות ומתפתחות. במחקר זה, זיהינו תחום מגיב לרצפטורים חזק (RBD-reactive) mAb מהדם ההיקפי של פרט SARS-CoV-2- הבראה, שניטרל למעשה את אלפא, בטא, קאפה, דלתא, מו, וגרסאות Omicron (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 ו-XBB). mAb זה, S728-1157, הפחית באופן משמעותי את העומס הנגיפי של BA.1 Omicron, Delta ו-WT בריאות וברירית האף בעקבות אתגר in vivo באוגרים. S728-1157 קושר את אתר הקישור לקולטן (RBS) שנחשף במלואו כאשר ה-RBD על הספייק נמצא בקונפורמציה למעלה. ה-mAb משתמש במוטיבים המצויים ב-CDR-H1 וב-CDR-H2 המשותפים לנוגדנים מסוג IGHV3-53/3-66 class 1/RBS-A (13, 14), אך גם באמצעות קשרים ייחודיים נרחבים עם CDR -H3 כדי לעקוף מוטציות בקוצים של VOCs. זה מצביע על כך שיש לשנות את התכנון הרציונלי של תוספי חיסון עתידיים המכסים גרסאות של Omicron כדי להציג עלייה יציבה בתצורה בעיקר למעלה כדי לגרום בצורה אופטימלית ל-mAbs מסוג 1/RBS-A בעלי תכונות CDR-H3 דומות.

יתרונות cistanche-מחזק את המערכת החיסונית

תוצאות

בידוד של mAbs מגיבים ל-RBD המציגים דפוסים מגוונים של נטרול ועוצמה. לפני התפשטות שושלת Omicron, איפיינו בעבר 43 mAbs המכוונים לאפיטופים שונים על חלבון הספייק, כולל התחום ה-N-terminal (NTD), RBD ותת-יחידה 2 (S2). אף אחד מהנוגדנים הללו לא הצליח לנטרל את גרסאות ה-SARS-CoV-2 שהסתובבו באותה תקופה (15). במחקר זה, פאנל נוסף של mAbs מגיבים ל-RBD בא לידי ביטוי משלושה אנשים בעלי מגיבים גבוהים אשר הרכיבו תגובות IgG חזקות נגד ספייק, כפי שהוגדר קודם לכן (16) (טבלאות משלימות 1 ו-3; חומר משלים זמין באינטרנט עם מאמר זה; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). למרות שהשיעור של תאי B קושרי ספייק RBD היה דומה במגיבים גבוהים בהשוואה למגיבים בינוניים ונמוכים (איור 1, A-C), שיעורי היפרמוטציה סומטית של שרשרת כבדה היו גדולים יותר באופן משמעותי בקבוצת המגיבים הגבוהים (איור 1). , D ו-E), מה שמצביע על כך שלאנשים אלה עשוי להיות הפוטנציאל הגבוה ביותר ליצור mAbs חזקים בעלי תגובה צולבת (16). נוגדנים אלה נחקרו עוד יותר נגד מוטציות RBD כדי לזהות את סיווגי האפיטופים שלהם (17). בין 14 mAbs מגיבים ל-RBD, זיהינו 4 mAbs בדרגה 2, 2 mAbs בדרגה 3 ו-8 mAbs לא מסווגים שהראו הפחתה מועטה עד ללא הפחתה בקישור כנגד מוטנטים מרכזיים של RBD שנבדקו (איור 1F). יש לציין, נוגדנים מסוג 2, class 3 ו-class 4 תואמים בערך לאפיטופים RBS BD, S309 ו-CR3022 שהוגדרו במחקרים קודמים (13, 18). RBD mAbs Class 2 ו-3 לא זיהו מוטנט RBD רב-שוני המכיל תחליפי K417N/E484K/L452R/N501Y, RBD שתוכנן באופן מלאכותי לכלול מוטציות מפתח לבריחת וירוסים (17, 18), וגם לא הוכיחו תגובתיות צולבת ל- RBD של SARS-CoV-1 ותסמונת הנשימה של המזרח התיכון (MERS)-CoV (איור 1F). מבחינה פונקציונלית, RBD mAbs Class 2 ו-3 נטרלו בצורה חזקה את גרסאות ה-D614G ו-Delta, אך פעילות הנטרול הייתה מוגבלת יותר כנגד Beta, Kappa ו-Mu (איור 1G). אף אחד מהנוגדנים מסוג 2 או 3 שנבדקו לא ניטרל אף וריאנט של Omicron שנבדק.

לעומת זאת, רוב ה-mAbs הבלתי מסווגים נקשרו ל-RBD multivariant והגיבו צולבות ל-SARS-CoV-1 RBD (איור 1F). בין אלה, זיהינו 3 mAbs, S451-1140, S626-161 ו-S728-1157, שהראו עוצמת נטרול גבוהה כנגד D614G ובטא, דלתא, קאפה, מו ונטרול צולב. Omicron BA.1 עם ריכוז מעכב של 99% (IC99) בטווח של 20-2,500 ng/mL (איור 1G). בהתחשב בעוצמת הנטרול הרחבה של 3 mAbs אלה, בנוסף לפלטפורמת בדיקת הפלאק, ביצענו גם את פעילות הניטרול נגד BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, אותנטיים, וירוסים BA.5 ו-XBB באמצעות מבחן נטרול הפחתת מיקוד (FRNT) (איור 1G). מתוכם, S728-1157 הציג פעילויות נטרול גבוהות מול הפאנל של גרסאות Omicron כולל BA.1, BA.2, BA.4 ו-BA.5, עם IC99 עד 100 ng/mL כפי שנמדד על ידי בדיקת פלאק. תרחיש דומה נצפה באמצעות FRNT, שבו S728-1157 שמר על פעילות הניטרול הגבוהה שלו כנגד BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 ו-XBB עם IC50 בטווח של 8-300 ng /mL (איור 1G). S451-1140 ניטרל את BA.1, BA.2, BA.2.75 ו-BL.1 בצורה חזקה, אך לא BA.4 ו-BA.5, כפי שנצפה בשתי פלטפורמות בדיקת הנטרול. מצד שני, S626-161 לא הוכיח פעילות מנטרלת כנגד גרסאות Omicron מעבר לגרסה BA.1 (איור 1G). למרות ש-S626-161 הייתה בעלת עוצמת נטרול נמוכה יותר כנגד ה-VOCs שנבדקו מאשר 2 הנוגדנים האחרים, זה היה ה-mAb היחיד שהראה תגובתיות צולבת לא רק ל-SARS CoV-1 RBD אלא גם היה מסוגל לנטרל עטלף וירוסים WIV-1 ו-RsSHC014 (איור 1, F ו-G). נתונים אלה מצביעים על כך ש-S626-161 מזהה אפיטופ שמור המשותף בין שושלות ארבו-וירוס אלו אך נעדר בזנים BA.2 ומאוחר יותר. בנוסף, בהשוואה ל-S728-1157 ו-S451-1140, ל-S626-161 יש CDR-H3 ארוך יותר שיכול לספק יכולת משופרת לזהות תיקון שמור מאוד של שאריות משותף בין ארבו-וירוסים, כמתואר במחקר קודם (19) (איור משלים 1). כאשר משווים בין גנים משתנים של אימונוגלובולינים כבדים (IGHV) ושרשרת קלה (IGLV או IGKV) של 3 mAbs אלה עם מסד הנתונים הזמין של SARS-CoV-2 מנטרל mAbs (13, 15, 20-27), מצאנו ששרשרת כבדה זו לגנים משתנים המשמשים את S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) ו-S626-161 (IGHV4-39) יש דווח בעבר כמקודד למספר נוגדני SARS-CoV-2 מנטרלים בעוצמה המכוונות ל-RBD (21, 22, 28, 29). עם זאת, רק ל-S728-1157 היו צמדי גנים משתנים ייחודיים של שרשרת כבדה וקלה שלא דווחו במסד הנתונים (טבלה משלימה 3), מה שמצביע על כך שהוא אינו קלונוטיפ ציבורי.

איור 1. אפיון של mAbs מגיבים ל-RBD שבודדו מיחידים מחלימים של COVID-19

3 mAbs אלה (S451-1140, S626-161 ו-S728-1157) אופיינו עוד יותר כדי לקבוע את רוחב הקישור שלהם מול SARSCoV-2 VOCs (איור 2, A ו-B) . הספייק המיוצב מראש המכיל 2-תחליפי פרולין ביחידת המשנה S2 (2P; diproline) הוכח כאימונוגן מעולה בהשוואה לספייק WT והוא הבסיס למספר SARS-CoV הנוכחיים-2 חיסונים, כולל חיסונים מבוססי mRNA (30, 31). לאחרונה, דווח כי חלבון ספייק שהתייצב עם 6 פרולינים (6P; hexaproline) מגביר את הביטוי ויציב אפילו יותר ממבנה הדיפרולין המקורי; כתוצאה מכך, הוא הוצע לשימוש בדור הבא של חיסוני COVID-19 (32, 33). כדי לקבוע אם יש הבדלי אנטיגניות בין מבני ספייק דיפרולין והקספרולין, שני האימונוגנים נכללו בפאנל הבדיקות שלנו. כפי שנמדד על ידי ELISA, מצאנו ש-3 mAbs קשרו אנטיגן ספייק 6P-WT במידה רבה יותר בהשוואה ל-WT-2P peak (איור 2, A ו-B). כל 3 ה-mAbs הראו קישור דומה לקוצים של וירוסי אלפא, בטא, גמא ודלתא, ביחס לזה של WT -2P (איור 2, A ו-B). עם זאת, תגובתיות הקישור של 3 mAbs אלה הופחתו באופן משמעותי מול פאנל של אנטיגנים ממשפחת Omicron (איור 2, B ו-C). קישור S451-1140 היה רגיש למוטציות שנמצאו ב-BA.1 וב-BA.2, מה שגרם לירידה גדולה בקישור ולירידה פי 31- בניטרול מול גרסאות אלו בהשוואה ל-WT-2 אנטיגן P ווירוס D614G, בהתאמה (איור 2B). ה-mAb המנטרל את ה-sarbecovirus-crossing, S626-161, הראה גם 1.2- עד 3.5-פי 3.5-קישור מופחת ל-Spike BA.1 אנטיגן, שעשוי להסביר {{45} הפחתה פי כמה בפעילות הנטרול כנגד BA.1 (איור 1G ואיור 2, B ו-C). עבור הנוגדן המנטרל הרחב החזק ביותר (bnAb), S728-1157, הקישור לאנטיגנים של Omicron הופחת במידה פחותה (נע בין פי 1.1- ל-4.4- בהשוואה ל WT-2P עליון ולא הושפע בפעילות מנטרלת (איור 1G ואיור 2, B ו-C). הירידה המשמעותית בקישור ה-mAb המנטרל Omicron לספייק BA.1 עשויה לנבוע משינויים בניידות שלו וקשורה לאריזה הדוקה של מבני ה-Omicron 3-RBD-down והעדפה של 1- למעלה RBD המסייעים בהתחמקות מנוגדנים, כפי שדווח על ידי מחקר קודם (34). למוטציות המייצבות 2P ו-6P יש גם השפעות דיפרנציאליות בווריאציות של Omicron שבהן כל 3 ה-mAbs הראו יותר מ-2.8- קישור מוגבר לספייק BA.1-6P בהשוואה ל-BA.1-2P גרסה, אך גדילה רק באופן שולי את הקישור לגרסאות הספייק BA.2 ו-BA.4/5 6P בהשוואה לגרסאות ה-2P שלהן ב-1.2 × עד 1.4 ×, מה שמרמז על נגישות מעט טובה יותר של mAbs המנטרלים Omicron לגרסאות המשושה, במיוחד עבור מבנה הספייק BA.1. בנוסף ל-ELISA, אינטרפרומטריה ביולוגית (BLI) שימשה כדי לכמת את קצב הקישור וקבועי שיווי המשקל (kon, koff ו-KD) של 3 mAbs אלה לפאנל של אנטיגנים ספייק (איור משלים 2). שיעורי זיהוי קון של קושר אנטיגן מקטע (Fab) לקוצים להקספרולין היו פי 1.5- עד פי 3.3-מהירים יותר בהשוואה לקוצים של דיפרולין (איור משלים 2, B ו-C), מה שמראה כי הנוגדנים נקשרו למבנה 6P מהר יותר מאשר למבנה 2P. אפשר היה לצפות לכך אם האפיטופים היו נגישים יותר על ה-RBD במצב פתוח על ספייק ההקספרולין. מלבד S626- 161, Fabs התנתקו מהספייק ההקספרולין לאט יותר (היה לו קוף נמוך יותר) מאשר ספייק הדיפרולין, כך שה-KD הכולל הראה ש-S728-1157 ו-S451-1140 קשורים ל ספייק ההקספרולין עם זיקה גדולה יותר (איור משלים 2, B ו-C). העלייה בקשירה לספייק ההקספרולין הייתה בולטת אפילו יותר עבור IgG שלם על ידי מודל האינטראקציה 1:2 כפי שמוצג על ידי S728-1157 ו-S451- 1140 mAbs, בהתאם לחשיפה של מספר אפיטופים עם ייצוב 6P המאפשר שיפור התלהבות (איור משלים 2, A ו-C). יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שהאפיטופים הממוקדים עשויים להיות נגישים יותר באופן יחסי על הספייק המיוצב 6P כאשר RBD נמצא במצב פתוח. לאחר מכן בוצעו ניתוחים מבניים כדי לאמת השערה זו.

איור 2. רוחב מחייב של mAbs המנטרלים Omicron

ניתוח מבני של mAbs מנטרלים באופן נרחב. כקירוב ראשון של אפיטופים קשורים, נעשה שימוש במבחן תחרותי ELISA כדי לקבוע אם שלושת ה-mAbs המנטרלים באופן נרחב חולקו חפיפה כלשהי עם פאנל ה-mAbs הנוכחי שלנו, אוסף של mAbs עם סגוליות אפיתופיות ידועות ממחקרים קודמים (15, 25, 35) , ו-2 mAbs נוספים שנמצאים כיום בשימוש קליני, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) ו- REGN10933 (Regeneron) (37). אתרי הקישור של S451-1140 ו-S728-1157 חופפו חלקית עם CC12.3 (23, 25), נוגדן מנטרל סוג 1, ורוב הנוגדנים Class 2, כולל LY-CoV555 ו-REGN10933, אך לא עם נוגדנים מסוג 3 ו-class 4 (איור 3A). S626-161 חלקה חפיפה בולטת באזור הקישור עם סוג 1 CC12.3, מספר נוגדנים מסוג 4, כולל CR3022, ונוגדנים לא מסווגים אחרים, בעוד שיש להם חפיפה חלקית עם מספר נוגדנים מסוג 2 ונוגדנים מסוג 3 (איור 3א). באופן אנלוגי, מבחן BLI תחרותי גילה ש-S451-1140 ו-S728-1157 התחרו מאוד זה בזה על קשירה לספייק WT-6P, בעוד ש-S626-161 לא (איור משלים 3). בסך הכל, נתונים אלה מצביעים על כך ש-S451-1140 ו-S728-1157 מזהים אפיטופים דומים הנבדלים מ-S626-161.

איור 3. מנגנון של נטרול רחב של S728-1157

נוגדן S728-1157 קודד על ידי IGHV3-66 והיה בעל אזור 3 הקובע השלמה קצר (CDR-H3). יש לציין, mAbs הקושרים את ה-RBS במצב כריכה 1 (כלומר RBS-A או אתר class 1), מאופיינים על ידי CC12.1, CC12.3, B38 ו-C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), נוטים להשתמש ב-IGHV3-53 או 3-66 ורגישים למוטציות VOC (40). עם זאת, אזור ה-CDR-H3 של S728-1157 נבדל מאוד מנוגדנים אחרים מהסוג הזה, מה שעשוי להסביר את הפעילות הרחבה יותר שלו. כדי להבין את הבסיס המבני של נטרול רחב על ידי S728-1157 באפיטופ זה, פתרנו מבנה קריו-אלקטרוני (Cryo-EM) (איור 3B) של IgG S728-1157 במתחם עם ספייק WT{ {31}}P-Mut7, גרסה של ספייק WT-6P בעל קשר בין פרוטומר דיסולפיד ב-C705 ו-C883, ברזולוציה גלובלית של כ-3.3 Å (איור משלים 4E). באמצעות הרחבת סימטריה, סיווג ממוקד ושיטות חידוד, השגנו רזולוציה מקומית בממשק RBD-Fv לכ-4 Å (איור משלים 4E וטבלה משלימה 8). מבנה גבישי של S728-1157 Fab נקבע ברזולוציה של 3.1 Å ושימש לבניית המודל האטומי בממשק RBD-Fv. המבנים שלנו מאשרים ש-S728-1157 קושר את האפיטופ RBS-A (או class 1) בקונפורמציה RBD-up (איור 3B ואיור משלים 4E), בדומה ל-IGHV אחרים3-53/{{55} } נוגדנים (איור 3C). חסימה סטרית של אתר הקישור לאנזים 2 (ACE2) הממיר אנגיוטנסין על ידי S728-1157 מסבירה את עוצמת הנטרול הגבוהה שלו נגד SARS-CoV-2. מוטיב 32NY33 ומוטיב 53SGGS56 (23) ב-S728-1157 CDR-H1 ו-H2 מקיימים אינטראקציה עם ה-RBD כמעט באותו אופן כמו CC12.3 (איור משלים 4, B ו-C). עם זאת, בהשוואה ל-VH 98DF99 ב-CC12.3, VH 98DY99 ב-S728-1157 CDR-H3 יוצר אינטראקציות נרחבות יותר, כולל אינטראקציות הידרופוביות וקוטביות כאחד, עם RBD, מה שעשוי להסביר את הנטרול הרחב כנגד VOCs (איור 3D וטבלאות משלימות 6 ו-7). הדיגליצין VH 100GG101 ב-S728- 1157 CDR-H3 עשוי גם להקל על קישור נרחב יותר בהשוואה ל-VH Y100 ב-CC12.3, ככל הנראה בשל הגמישות בשאריות הגליצין שמובילות לקונפורמציה שונה של קצה ה-CDR -H3 לולאה ושינוי יחסי של שאריות ב-98DY99.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

למרות של-Omicron VOCs יש מוטציות נרחבות ב-RBD, רוב השאריות הללו אינן מקיימות אינטראקציה עם S728-1157, מכיוון שעדיין נצפה קישור (איור משלים 4A). מדגם הספייק WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157 שלנו, Y505 עד VL Q31, ו-E484 עד VH Y99 צפויים ליצור קשרי מימן (איור משלים 4D וטבלה משלימה 6 ), שיש להם פוטנציאל להפרעות על ידי מוטציות Omicron Y505H ו-E484A. עם זאת, מוטציה של Y505H עדיין תאפשר קשר מימן עם VL Q31, ומוטציה של E484A תוסיף עוד שרשרת צד הידרופובי ליד שאריות הידרופוביות VL Y99, F456 ו-Y489. אנשי קשר אלה עשויים להסביר, בין השאר, את המנגנון המאפשר ל-S728-1157 לשמור על פעילות מנטרלת, אם כי מופחתת, כנגד אנטיגן הספייק BA.1 (איור 1G ואיור 2B). האנטיגן BA.1, בתורו, קשור אולי למוטציות של Omicron שמשנות את הנוף הקונפורמטיבי של חלבון הספייק (34). עם זאת, כמה שיירים שעברו מוטציה סומטית, כלומר, VH L27, L28, R31, F58, ו-VL V28 ו-Q31, ב-S728-1157 מעורבים באינטראקציה עם SARS-CoV-2 RBD (איור משלים 1 ו- טבלה משלימה 7), אשר עשויה גם לתרום לתגובתיות הרחבה שלו בהשוואה ל-CC12.3. בסך הכל, המחקרים המבניים שלנו חשפו את הבסיס לנטרול רחב של S728-1157 שיכול להכיל את רוב המוטציות ב-SARS-CoV-2 VOCs.

איור 4. יעילות הגנה של bnAbs נגד זיהום SARS-CoV-2 באוגרים.

S728-1157 מפחית שכפול של SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta ו-WT SARS-CoV-2 באוגרים סוריים. כדי להעריך את יעילות ההגנה של ה-mAbs המנטרלים באופן נרחב, השתמשנו במודל זהוב של זיהום אוגר סורי שהיה בשימוש נרחב עבור SARS-CoV-2. אוגרים קיבלו 5 מ"ג/ק"ג של mAbs הניסויים שלנו או בקרת איזוטיפ המכוונת לאנטיגן לא רלוונטי (גליקופרוטאין של ebolavirus) באמצעות הזרקה תוך צפקית יום אחד לאחר ההדבקה בנגיפים של SARS CoV{10}}. רקמות הריאות והאף נאספו 4 ימים לאחר ההדבקה (איור 4A). מתן טיפולי של S728-1157 הביא להפחתת טיטרים של גרסאות WT, BA.1 Omicron ו-Delta הן בטורבינות האף והן בריאות של אוגרים נגועים (איור 4, B-D). מעניין לציין שההשפעה של S728-1157 בריאות הייתה דרמטית, והפחיתה את העומס הנגיפי של WT ו-BA.1 Omicron בכ-104PFU, כשהטיטרים הוויראליים של וריאנט BA.1 Omicron בוטלו לחלוטין (איור 4C). בניגוד לניטרול חוץ גופית (איור 1G), S451-1140 לא הפחית את השכפול הנגיפי של BA.1 Omicron בטורבינות ריאות ואף, מה שמעיד על ניתוק בין נטרול חוץ גופית והגנה in vivo עבור שיבוט זה (איור 4E) . לשם השוואה, מתן S626-161 הביא להפחתות מובהקות באופן שולי בטיטרי נגיפי הריאות בעקבות אתגר WT ו-BA.1 (איור 4, F ו-G). נתונים אלה מדגישים שכדי להגדיר במדויק mAbs מגינים באופן רחב, נדרשת הערכת יעילות ההגנה במקביל לפעילות הנטרול. בהמשך, יהיה מעניין לבדוק באיזו מידה יכולת ההגנה של S728-1157 תלויה ב-Fc. בסך הכל, S728-1157 מייצג mAb מבטיח עם יעילות נטרול רחבה כנגד גרסאות SARS CoV-2 שמסוגלות להפחית באופן דרמטי את שכפול WT, Delta ו-BA.1 in vivo.

זיהום ב-SARS-CoV-2 מעורר רק לעתים נדירות S728-1157 עוצמתיים של mAbs מנטרלים צולבים. בהתחשב בפוטנציאל הנטרול ההצולב והמניעתי של S728-1157, ביקשנו להעריך אם נוגדנים דמויי S728-1157 נגרמות בדרך כלל בקרב תגובות פוליקונליות בחולי SARS-CoV-2. כדי להעריך זאת, ביצענו ELISA תחרותי באמצעות סרום הבראה כדי לזהות טיטר נוגדנים נגד RBD שיכולים להתחרות על הקישור עם S728-1157 (איור 5A). הנבדקים חולקו ל-3 קבוצות בהתבסס על גודל תגובות הנוגדנים, כפי שהוגדר קודם לכן (15, 16). למרות שלמגיבים גבוהים ומתונים היו רמות גבוהות יותר של נוגדני סרום תחרותיים S728-1157 בהשוואה למגיבים נמוכים (איור 5B), הטיטרים היו נמוכים למדי בכל הקבוצות, מה שמצביע על כך שלא שכיח להשיג רמות גבוהות של S{{ נוגדנים דמויי 18}} בסרום פוליקונלי בעקבות זיהום ב-WT SARS-CoV-2. בנוסף ל-S728-1157, בדקנו את התחרות של סרום הבראה עם mAbs אחרים, כולל S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 ו-CC12.3. בדומה ל-S728-1157, ראינו טיטרים נמוכים יחסית של נוגדנים מתחרים עם S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 ו-CC12.3 בנסיוב פוליקלונאלי מרוב ההחלמה פרטים (איור 5, C–F ו-H). אף על פי כן, מגיבים גבוהים נטו להיות בעלי טיטר גבוה משמעותית מול אלה מנטרלים mAbs מאשר מגיבים נמוכים (איור 5, B-F ו-H). לעומת זאת, נוגדנים המכוונים לאתר האפיטופ CR3022 היו בולטים יותר אצל אנשים בהחלמה, דבר המצביע על העשרה של נוגדני RBD מסוג 4 בסרום פוליקונלי (איור 5G). יש לציין שלא היה הבדל משמעותי בטיטרים של CR3022 בין 3 קבוצות המגיבים, מה שמצביע על כך שנוגדנים לאתר CR3022- נגרו באופן עקבי במהלך זיהום WT SARS-CoV-2 ברוב האנשים. מעניין, בהשוואה ל-CC12.3, S728-1157 זוהה ברמות 4-פי כמה נמוכות יותר בסרום של מגיבים גבוהים. לפיכך, למרות נוגדנים מסוג 1 המושרים לעתים קרובות על ידי זיהום וחיסונים טבעיים (14, 20, 28, 29, 41-43), הנתונים שלנו מראים כי נוגדנים דמויי S728-1157 המייצגים תת-קבוצה של מחלקה זו הם נדירים יחסית.

בנוסף, בדקנו את ההבדל בתגובתיות ל-2P לעומת ספייק מיוצב ב-6P בסרת קבוצת ההבראה שלנו (איור 5, I-K). מצאנו שכל 3 קבוצות המגיבים הרכיבו נוגדנים תגובתיים נגד ספייק נגד ספייק WT מיוצב 6P במידה רבה יותר מאשר ספייק WT מיוצב 2P, בפקטור של פי 6 עד 11 (איור 5J), מה שמצביע על כך שה אפיטופים אנטיגנים מרכזיים הוצגו טוב יותר או התייצבו על אנטיגן מיוצב 6P. באמצעות אותן דגימות, למגיבים גבוהים ומתונים היו גם טיטרים נמוכים יותר של נוגדנים נגד ספייק נגד BA.1-2P מאשר BA.1-6P, פי 4-עד-5 (איור 5K). יש לציין, למגיבים נמוכים היה שינוי קטן יותר בתגובתיות הקישור כנגד ספייק BA.1 Omicron-2P ו-6P (הפחתה של פי2-) בהשוואה ל-WT-2P ו-6P ספייק ({ {28}}הפחתה של פיפול) (איור 5, J ו-K), מה שמצביע על כך שנוגדנים בסרום נגד אפיטופים מגיבים ל-BA.1 Omicron עשויים להיות מוגבלים יותר בנבדקים בעלי תגובה נמוכה. בסך הכל, נתונים אלו מצביעים על כך שיש שיפור בקישור הפוליקלונלי המושרה על ידי זיהום טבעי לספייק מיוצב 6P, הן עבור וירוסי WT והן של Omicron.

נוגדנים דמויי S728-1157 מושרים בצורה מיטבית בהקשר של חסינות היברידית. זיהום ראשוני של SARS-CoV-2 ללא חיסון הפך לנדיר בסביבה העולמית הנוכחית, וכמה מחקרים דיווחו שחסינות SARS-CoV-2 שונה בין אנשים עם היסטוריית חיסונים/זיהומים ספציפיים. כתוצאה מכך, ביקשנו לחקור אילו חשיפות נפוצות, מלבד זיהום WT עם SARS-CoV-2 קדמון בלבד, יגרמו ביעילות נוגדנים דמויי S728-1157 בפלזמה מחיסונים מבוססי mRNA חד ערכיים עם וללא קודם הַדבָּקָה. השגנו את הדגימה הביולוגית הדרושה מקבוצת המחקר של Protection Associated with Rapid Immunity to SARS-CoV-2 (PARIS), שעקבה אחרי עובדי שירותי הבריאות לאורך זמן מאז תחילת המגיפה (44). בחרנו דגימות פלזמה ממשתתפי מחקר מחוסנים במלואם (2 × מחוסנים) עם ובלי זיהום וכן ממשתתפים בעלי חיזוק (3 × מחוסנים) עם ובלי זיהום. בנוסף, כללנו גם דגימות ממשתתפי המחקר שקיבלו את חיסון ה-mRNA הדו ערכי (אבותי WA1/2020 בתוספת Omicron BA.5) (איור 6A וטבלה משלימה 2). הזיהומים פורצי הדרך במשתתפים שקיבלו חיסוני מאיץ התרחשו בתקופה שבה שושלות Omicron עזבו את כל שושלת ה-SARS-CoV-2 האחרות באזור המטרופולין של ניו יורק. מצאנו שלאנשים שחוסנו כפול היה הטיטר הנמוך ביותר של נוגדנים תחרותיים בסרום S728-1157 מבין 5 קבוצות הדגימות שנבדקו (איור 6B). יש לציין שרמות אלו היו דומות לרמות שנצפו עבור קבוצת ההבראה שלנו ללא חיסון (כל המגיבים; איור 5B). לשם השוואה, אנשים עם היסטוריה של זיהום טבעי, כולל אנשים בהחלמה עם 2 מתוך 3 מנות חיסון, ואנשים שחוו זיהום פורץ דרך וקיבלו מאיץ דו ערכי, הראו רמות גבוהות יותר משמעותית של העלאת S728-1157 בהשוואה לבלתי נגועים אלא אנשים מחוסנים (איור 6B). למרות שקבוצת המינון הבלתי נגועה הציגה רק עלייה לא מובהקת בהשוואה לקבוצת המינון 2-, פירוק זוגי לפי סוג חיסון הצביע על כך שמינונים שלישיים הומולוגיים של BNT162b2 ו-mRNA-1273 העלו משמעותית את S{{ 38}}כמו נטרול טיטר נוגדנים ב-2.72 × ו-2.85 ×, בהתאמה (איור 6, C ו-D). שימו לב, בקרב המשתתפים עם 3 מגע בסך הכל עם ספייק בכל אמצעי, טיטרי S728-1157-כמו נוגדנים היו גבוהים פי 3 במחסנים כפולים בהבראה בהשוואה לחיסונים משולשים תמימים בזיהום, מה שמצביע על כך ש-SARS-CoV{{ 51}} זיהום גורם בצורה אופטימלית יותר לקלונוטיפ זה. מבין קבוצות החסינות ההיברידית, ציינו שלרוב מהאנשים שקיבלו חיזוק עם פריצת דרך שקיבלו את מינון החיסון הדו ערכי היה טיפר נוגדני S728-1157 גבוה רק באופן שולי בהשוואה לקבוצות מחוסנות טרום אומיקרון, מה שמצביע על כך שה-S{{53 סביר להניח שהטיטר של }} התקרב לרמה לאחר 3 חשיפות. חקרנו גם את הטיטרים של נוגדנים פוליקונליים שהתחרו עם CC12.3 ו-CR3022 בנוסף ל-S728-1157. כל הפרטים הראו טיטר גבוה יחסית של CC12.3- ו-CR3022-כמו נוגדנים, ללא תלות במספר וסוג החשיפות (איור משלים 5), בניגוד למה שצפינו עבור S728-1157- כמו נוגדנים. בסך הכל, נתונים אלה מצביעים על כך שזיהום SARS-CoV-2 וחיסון mRNA תורמים שניהם להשראת נוגדנים מסוג S728-1157-, כאשר זיהום משחק תפקיד דומיננטי יותר אצל אנשים מחוסנים.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

לבסוף, בהשוואה בין תגובות נגד 2P- לעומת 6P-מיוצב ספייק בקבוצת חיסוני mRNA, מצאנו שרוב הקבוצות עוררו רמות דומות של נוגדנים כנגד שני המבנים. היוצא מן הכלל זה היה הקבוצה הבלתי נגועה מחוסנת משולשת, שהדגימה סטטיסטית תגובתיות גבוהה יותר, אם כי רק מעט מוגברת, ל-2P בהשוואה לספייק המיוצב ב-6P (איור 6E). נתונים אלו מצביעים על כך שבניגוד לזיהום טבעי (איור 5, J ו-K), חיסון לבדו מייצר תגובה פוליקונלית המוגבלת יותר לאפיטופים במבנה הספייק-2P, בהתאם לספייק{{12 }}ניסוח P של חיסונים נוכחיים. בסופו של דבר, ממצאים אלה תומכים ברעיון שייצוב 6P של חיסוני SARS-CoV-2 עתידיים עשוי להועיל בגרימת קלונוטיפים של נוגדנים מגינים באופן נרחב כמו S728-1157.

איור 5. תחרות נוגדני סרום הבראה עם נטרול נרחב של mAbs מגיבים ל-RBD והשוואה של תגובת נוגדנים בסרום נגד קוצים מיוצב 6P לעומת 2P.

איור 6. תחרות נוגדנים בסרום מחוסנים ל-mRNA עם S728-1157 מנטרל mAbs תגובתי ל-RBD והשוואה של תגובת נוגדנים בסרום נגד קוצים מיוצבים ב-6P לעומת 2P.

דִיוּן

במחקר זה, אנו מזהים bnAb חזק שבודד מתא זיכרון B של אדם שהחלים מזיהום SARS-CoV-2 במהלך הגל הראשוני של מגיפת COVID-19. bnAb זה, S728- 1157, שמר על תגובתיות כרוכה משמעותית והיה לו פעילות מנטרלת עקבית כנגד כל SARS-CoV-2 VOC שנבדקו, כולל Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 ו-XBB, והצליחו להפחית באופן משמעותי כיתרים ויראליים זיהומיות בעקבות זיהום Delta ו-BA.1 באוגרים.

מצאנו שנסיוב הבראה מהקבוצה שלנו הכיל ריכוזים נמוכים של נוגדנים שמתחרים עם S728-1157 (נוגדן מסוג 1/RBS-A) ו-mAbs של epitope Class 2. זה מצביע על כך ש-S728-1157 הוא ייחודי במקצת מנוגדנים אחרים שמכוונים לאפיטופים מסוג 1, והוא מושרה לעיתים רחוקות במאגר תאי B של זיכרון RBD הספציפי. במקום זאת, נראה כי קבוצת הזיהום הטבעית שלנו גרמה לנוגדנים המכוונים לאפיטופ CR3022 (מחלקה 4); נוגדנים בעלי סגוליות זו הם לעתים קרובות תגובתית צולבת אך מנטרלים בעוצמה פחותה מנוגדנים מכווני RBS (14, 17). נתונים אלה משלימים את הממצאים הקודמים שלנו, המוכיחים כי שפע של נוגדנים מסוג 3/S309 בסרי הבראה עשוי לתרום לנטרול פעילות נגד גרסאות אלפא וגמא, בעוד שמחסור בנוגדנים מסוג 2 עשוי להסביר יכולת נטרול מופחתת נגד דלתא (15) . עם זאת, רוחב הפעילות של רוב הנוגדנים המכוונים ל-RBS הללו (RBS-A/class 1, RBS-B, C/class 2, ו-RBS-D, S309/class 3) נגד גרסאות Omicron מדווחים כמוגבל מאוד (11, 40, 45).

האתגר המרכזי שמתקדם יהיה לקבוע כיצד לשפר את העלאת נוגדנים צולבים תגובתיים רחבים לאפיטופים RBS שמורים. בהקשר זה, ראינו כאן שאנשים עם חסינות היברידית העלו טיטר גבוה משמעותית של נוגדנים דמויי S728-1157- מאשר אנשים מחוסנים ללא זיהום קודם. חשוב לציין, תופעה זו צוינה גם כאשר מספר החשיפות היה מבוקר (כלומר, אצל מחוסנים כפולים בהחלמה לעומת מחוסנים משולשים לא נגועים), מה שמרמז על אלמנט כלשהו של חסינות הקשורה לזיהום (או ניסוח חיסון שיכול לחקות סוג זה של חסינות) חשוב להעלאת הקלונוטיפ הזה. זה עולה בקנה אחד עם עדויות ניסיוניות המתעדות שלאנשים עם חסינות היברידית יש פרופילי תגובתיות נוגדנים רחבים יותר בהשוואה לאלה שיש להם רק תגובות חיסוניות הנגרמות על ידי חיסון או זיהום ראשוני (9).

המבנים כאן המחישו ש-S728-1157 קושר את האפיטופ RBS-A/class 1 ב-RBD בקונפורמציה למעלה. נראה שהאפיטופ הזה נגיש יותר על קוצים מיוצבים ב-6P, אשר דווחו שהם מציגים 2 RBDs במדינה העליונה, בהשוואה לקוצים של 2P, המציגים רק 1 (30, 33, 46, 47), ושאליו נוגדנים שלנו ספייק ספציפי עבור ספייק קונפורמציה גבוה מציג כריכה משופרת. S728-1157 בודד לאחר זיהום טבעי; בהקשרים כאלה, הסיכויים לגרום לשבטים דמויי S728-1157 ככל הנראה גבוהים יותר בהתחשב בכך שה-RBD חייב להיות מסוגל לאמץ קונפורמציה למעלה, אפילו זמנית, כדי להיקשר ל-ACE2, ובכך לחשוף את האפיטופ הזה. בניגוד לרוב נוגדני IGHV3-53/3-66 RBS-A/class 1, S728-1157 יכול להכיל מוטציות מפתח בקוצים של VOC באמצעות אינטראקציות נרחבות בין CDR-H3 ל-RBD (29, 48–50). S728-1157 משתמש גם בשרשרת קלה שונה (IGLV3-9) בהשוואה לנוגדנים פחות רחבים אחרים כגון CC12.3 (IGKV3-20), מה שעשוי להשפיע על אינטראקציות הקישור הכוללות; עם זאת, הניתוח שלנו מצביע על כך שיש פחות קשרי מימן בין השרשרת הקלה S728-1157 ל-RBD בהשוואה ל-CC12.3 (טבלה משלימה 7). למרות שרוב שיירי המגע של CDR-H3 הקריטיים לתגובתיות צולבת של VOC באינטראקציה זו מקודדים בקו נבט ואינם מוכנסים על ידי מוטציות סומטיות, מספר שיירים שעברו מוטציה סומטית באזורי מסגרת או CDR-H1, CDR-H2 ו-CDR-L1 הם מעורב באינטראקציה עם SARS-CoV-2 RBD. מצד אחד, זה מצביע על כך שתאי זיכרון B המקודדים לנוגדנים מסוג IGHV3-53/66 יכולים לרכוש מידה דומה של תגובתיות צולבת על ידי הבשלה נוספת של זיקה. מצד שני, זה גם מצביע על האפשרות לתכנן אימונוגנים ממוקדי קו נבט שמכוונים ל-S728-1157-כמו תאי B תמימים. למרות שזה עשוי להיות מאתגר לתכנן חיסונים שיכולים לעורר ספציפית נוגדנים דמויי S728-1157 עם CDR-H3s נבחרים המסוגלים להתגבר על מוטציות ה-VOC, זה מעודד שהגבלת גן IGHV נצפית ב-SARS-CoV חזקים אחרים{ {58}} מחקרים מנטרלים mAbs (13, 15, 20-27). לחלופין, זה עשוי להיות אפשרי גם באמצעות חיסון איטרטיבי עם אימונוגנים RBD אופטימליים, כפי שדווח בעבר עבור פתוגנים אחרים (51-55).

למרות שמוטציות רבות נצפו באתר האנטיגני RBS-A/ class 1 (18), בהתייחס לאפיטופ S728-1157, 13 מתוך 15 שאריות מגע RBD הכוללות ו-2 מתוך 3 CDR-H{{9} }שאריות מגע RBD נשמרות בתוך Omicron וכל שאר ה-VOCs. זה מצביע על כך שאזור ה-RBD שבו נמצא האפיטופ S728-1157 עשוי לכלול שאריות קריטיות לתפקוד הדינמי ולכושר הוויראלי שלו, ולכן יהיה פחות סובלני למוטציות ולסחף אנטיגני מאשר שיירי אתר RBS-A/class 1 שמסביב. אם זה המקרה, יש להפחית את הנטייה לאיבוד הספציפי הזה עם התפתחות וריאנטים ויראליים, מה שהופך את האפיון של S728-1157 ונוגדנים ואפיטופים דומים לחשוב עבור חיסונים עמידים לווריאציות או לפיתוח טיפולי mAb. לסיכום, המחקר שלנו מזהה bnAbs שעשויים לתת מענה לתכנון אימונוגן עבור חיסוני נגיף הדור הבא העמידים בפני וריאנטים או לשמש כתרופת mAb שעמידים לאבולוציה של SARS CoV-2. בפרט, במונחים של עוצמה ורוחב משולבים, נראה ש-S728-1157 הוא הנוגדן הטוב ביותר בקבוצה שבודד עד כה. בהתחשב בכך שהנוגדן הזה נקשר ביתר קלות עם ייצוב 6P, צפוי שהוא מושרה מועדף על ידי חלבוני ספייק רקומביננטיים מיוצבים ב-6P או וירוס שלם, מה שמרמז ששינוי הקספרולין יכול להועיל למבני חיסונים עתידיים על מנת להגן בצורה מיטבית מפני SARS-CoV עתידי -2 גרסאות וארבו-וירוסים אחרים.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

שיטות

בידוד נוגדנים חד-שבטיים. PBMCs בודדו ממסנני לויקורידוקציה והוקפאו כפי שתואר קודם (24). תאי B הועשרו מ-PBMCs באמצעות FACS. תאים נצבעו בבדיקות CD19, CD3 ואנטיגן מצומדות לאוליגו-פלואורופור; תאים מעניינים זוהו כ-CD3– CD19+ Antigen+. כל ה-mAbs נוצרו מתאי אוליגו מתויגים, ממוינים בפיתיון אנטיגן שזוהו באמצעות RNA-Seq חד-תא, כפי שתואר קודם לכן (15, 24). הנתונים של תאי B בודדים שנוצרו במחקר זה הופקדו ל- Gene Expression Omnibus: GSE171703 ו-GSM5231088–GSM5231123.

תאי B ספציפיים לאנטיגן נבחרו ליצור mAbs בהתבסס על עוצמת אנטיגן-probe שניתחה על ידי JMP Pro 15. גנים של נוגדנים כבדים וקלות של נוגדנים סונתזו על ידי Integrated DNA Technologies (IDT) ושובוטו לתוך IgG1 אנושי ו- κ או λ קל-שרשרת אנושית וקטורי ביטוי על ידי הרכבה של גיבסון, כפי שתואר בעבר (56). השרשראות הכבדות והקלות של ה-mAb המקביל הועברו במקביל לתאי HEK293T (ATCC). לאחר טרנספקציה במשך 18 שעות, התאים שעברו הוספו עם סופרנטנט היברידומה בינוני ללא חלבון (PFHM-II, Gibco). הסופרנטנט המכיל mAb מופרש נקצר ביום 4 וטיהרו באמצעות חרוזי חלבון A-agarose (Thermo Fisher Scientific) כפי שפורט קודם לכן (56). רצפים של שרשראות כבדות וקלות של הנוגדנים המאופיינים היטב נגזרו מ-Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR3022 (PDB ID: 6W7Y) ו-REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) וסונתזו כמתואר לעיל. ה-mAb CC12.3 (PDB ID: 6XC4) סופק על ידי מנג יואן במכון המחקר Scripps (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב). ביטוי חלבון ספייק רקומביננטי. ספייק D614G SARS-CoV-2 רקומביננטי באורך מלא (FL), BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, מוטציות RBD בודדות (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493Y, Q493Y, N Y505A, ו-Y505F), מוטציה RBD משולבת (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD ו-MERS-CoV RBD נוצרו בבית. בקצרה, האנטיגנים הרקומביננטיים באו לידי ביטוי באמצעות תאי Expi293F (Thermo Fisher Scientific). הגן המעניין שובט לתוך וקטור ביטוי יונקים (AbVec שונה בבית) והועבר באמצעות ערכת ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) לפי פרוטוקול היצרן. הסופרנטנט נקצר ביום 4 לאחר ההעברה והודגרה עם Ni-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) agarose (Qiagen). הטיהור בוצע באמצעות עמודת זרימת כוח הכבידה ונשלף עם חיץ המכיל imidazole כפי שתואר קודם לכן (57, 58). ה-eluate הוחלף והוחלף עם PBS באמצעות יחידה צנטריפוגלית של Amicon (Millipore). קוצים רקומביננטיים FL התייצבו על ידי מוטציות 2P של הווריאציות B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 ו-BA.4 Omicron והיו הופק במעבדת סאתר במכון המחקר לילדים בסיאטל. ה-K417V, N439K ו-E484K RBDs ו-FL spike WT-2P ו-6P רקומביננטיים יוצרו במעבדת Krammer בבית הספר לרפואה של Icahn בהר סיני. SARS-CoV-2-6P-Mut7 וספייק BA.1-6P תוכננו ויוצרו כמתואר במחקר קודם (59). רצפי החלבון והמשאבים עבור כל אנטיגן מפורטים בטבלה משלימה 4. ELISA. חלבונים רקומביננטיים של SARS-CoV-2 ספייק/RBD צופו על גבי לוחות מיקרוטיטר גבוהים הקשורים לחלבון (Costar) ב-2 ug/mL ב-PBS ב-50 μL/well ונשמרו למשך הלילה ב-4 מעלות. צלחות נשטפו עם PBS המכיל 0.05% Tween 20 (PBS-T) ונחסמו עם 150 μL של PBS המכילה 20% FBS למשך שעה אחת ב-37 מעלות. נוגדנים חד-שבטיים הודללו באופן סדרתי 3-כפול החל מ-10 ug/mL ב-PBS והודגרו בבארות למשך שעה אחת ב-37 מעלות. לאחר מכן נשטפו הצלחות והודגרו עם נוגדן IgG של עיזים מצומדות ב-HRP (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1,000) למשך שעה אחת ב-37 מעלות. לאחר הכביסה, נוספו 100 μL של מצע Super AquaBlue ELISA (eBioscience) לכל באר. הספיגה נמדדה ב-405nm בספקטרופוטומטר של מיקרו-פלט (Bio-Rad). המבחנים היו סטנדרטיים באמצעות נוגדן בקרה S144-509 (15), עם מאפייני קישור ידועים בכל צלחת, והצלחות פותחו עד שהספיגה של הביקורת הגיעה ל-OD של 3.0. כל ה-mAbs נבדקו בעותק, וכל ניסוי בוצע פעמיים.

סרום ELISA. צלחות מיקרוטיטר קושרות חלבון גבוהות צפו באנטיגנים רקומביננטיים של SARS-CoV-2 בקצב של 2 ug/mL ב-PBS למשך הלילה ב-4 מעלות. הצלחות נשטפו עם PBS 0.05% Tween ונחסמו עם 200 μL PBS 0.1% Tween + 3% אבקת חלב רזה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT). דגימות פלזמה הושבתו בחום למשך שעה אחת ב-56 מעלות לפני ביצוע הניסוי הסרולוגי. הפלזמה דוללה באופן סדרתי 2-פיפול ב-PBS 0.1% Tween + 1% אבקת חלב רזה. צלחות הודגרו עם דילולים בסרום למשך שעתיים ב-RT. נוגדן Ig משני של עיזים מצומד HRP, מדולל ב-1:3,000 עם PBS 0.1% Tween + 1% אבקת חלב דל שומן שימש כדי לזהות את הקישור של נוגדנים. לאחר 1 שעה של דגירה, לוחות פותחו עם 100 μL SigmaFast OPD פתרון (Sigma-Aldrich) במשך 10 דקות. לאחר מכן, נעשה שימוש ב-50 μL 3M HCl כדי לעצור את תגובת הפיתוח. הספיגה נמדדה ב-490 ננומטר בספקטרופוטומטר של מיקרו-לוח (Bio-Rad). טיטר נקודת הקצה הוחלף מהעקומה הסטנדרטית של 4PL הסיגמואידית (כאשר x הוא ריכוז לוג) עבור כל דגימה. מגבלת הגילוי (LOD) מוגדרת כממוצע ה-+ 3 SD של אות ה-OD שנרשם באמצעות פלזמה מאנשים לפני SARS-CoV-2. כל החישובים בוצעו בתוכנת GraphPad Prism (גרסה 9.0).

תחרות ELISA. כדי לקבוע את סיווג האפיטופי היעד של mAbs תגובתיים ל-RBD, בוצעו ELISAs תחרותי תוך שימוש ב-mAbs אחרים עם מאפיינים ידועים של קשירת אפיטופים כ-mAbs מתחרים. mAbs מתחרים עברו ביוטיניל באמצעות EZ-Link sulfo-NHS-biotin (Thermo Fisher Scientific) למשך שעתיים ב-RT. עודף הביוטין של mAbs עם biotinylated הוסר עם עמודות התפלת ספין של Zeba של 7k משקל מולקולרי (MWCO) (Thermo Fisher Scientific). צלחות כוסו באנטיגן של 2 ug/mL RBD למשך הלילה ב-4 מעלות. הצלחות נחסמו ב-PBS–20% FBS למשך שעתיים ב-RT, והדילול 2-הפיפול של ה-mAbs של מחלקה או סרום לא מוגדרת, נוסף, החל מ-20 ug/mL של mAbs ודילול 1:10 של סרום. לאחר דגירת נוגדנים במשך שעתיים ב-RT, ה-mAb המתחרה ביו-טיניל נוסף בריכוז פי שניים מקובוע הדיסוציאציה שלו (KD) והודגרה למשך שעתיים נוספות ב-RT יחד עם ה-mAb או הסרום שנוספו קודם לכן. הצלחות נשטפו והודגרו עם 100 μL streptavidin מצומד HRP (Southern Biotech) בדילול של 1:1,000 למשך שעה אחת ב-37 מעלות. הלוחות פותחו עם מצע Super AquaBlue ELISA (eBioscience). כדי לנרמל את המבחנים, ה-mAb המתחרה ביו-טיניל נוסף לבאר ללא כל mAbs או סרום מתחרים כביקורת. הנתונים נרשמו כאשר הספיגה של באר הבקרה הגיעה ל-OD של 1.0-1.5. לאחר מכן חושבה אחוז התחרות בין mAbs על ידי חלוקת ה-OD שנצפה של מדגם ב-OD שהגיע אליו הבקרה החיובית, הפחתת ערך זה מ-1, והכפלה ב-100. עבור סרום, ODs הועברו log10 ונותחו על ידי רגרסיה לא לינארית כדי לקבוע את ה-50 ערכי % ריכוז עיכוב (IC50) באמצעות תוכנת GraphPad Prism (גרסה 9.0). הנתונים הומרו ל-Log1P ושורטטו לגרף המייצג דילול סרום הדדי של IC50 של דילול סרום שיכול להשיג תחרות של 50% עם ה-mAb המתחרה המעניין. כל ה-mAbs נבדקו בשני עותקים, כל ניסוי בוצע 2 פעמים באופן עצמאי, וממוצע הערכים מ-2 ניסויים עצמאיים.

מבחני פלאק. מבחני פלאק בוצעו עם וירוסים מסוג SARS-CoV-2 בתאי Vero E6/TMPRSS2 (אוסף יפני של משאבי מחקר ביולוגיים (JCRB)) (טבלה משלימה 5). תאים תורבו כדי להגיע ל-90% ריכוז לפני שעברו טריפסין וזרעו בצפיפות של 3 × 104 תאים לבאר ב96-צלחות באר. ביום שלאחר מכן, 102 PFUs של וריאנט SARS-CoV-2 הודגרו עם mAbs בדילול 2-פיפול למשך שעה. תערובת הנוגדנים-וירוס הודגרה עם תאי Vero E6/TMPRSS2 למשך 3 ימים ב-37 מעלות. לוחות היו קבועים עם 20% מתנול ולאחר מכן מוכתמים בתמיסת סגול קריסטל. הריכוזים המעכבים המלאים (IC99) חושבו באמצעות הלוג(מעכב) לעומת תגובה מנורמלת (שיפוע משתנה), שבוצעה ב-GraphPad Prism (גרסה 9.0). כל ה-mAbs נבדקו בעותק, וכל ניסוי בוצע פעמיים. מבחן נטרול הפחתת מיקוד. בדיקות נטרול הפחתת מיקוד (FRNTs) שימשו לקביעת פעילויות נטרול כפלטפורמה נוספת מלבד מבחן הפלאק. דילולים סדרתיים של נסיוב החל מריכוז סופי של 1:20 עורבבו עם 103 יחידות וירוס יוצרות פוקוס לבאר והודגרו למשך שעה אחת ב-37 מעלות. דגימת סרום טרום-פנדמית מאוחדת שימשה כביקורת. תערובת הנוגדנים-וירוס חוסן על גבי תאי Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) בצלחות של 96-בארות והודגרה למשך שעה אחת ב-37 מעלות. נפח שווה של תמיסת מתילצלולוזה הוסף לכל באר. התאים הודגרו במשך 16 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות ולאחר מכן קבועים עם פורמלין. לאחר הסרת הפורמלין, התאים הוצבעו ב-mAb של עכבר נגד SARS-CoV-1/2 נוקלאופרוטאין [clone 1C7C7 (Sigma-Aldrich)], ואחריו אימונוגלובולין עז נגד עכברים שסומן HRP (Sigma- Aldrich; A8924). התאים הנגועים נצבעו במצע TrueBlue (SeraCare Life Sciences) ולאחר מכן נשטפו במים מזוקקים. לאחר הייבוש, מספרי המיקוד כומתו באמצעות מנתח ImmunoSpot S6, תוכנת ImmunoCapture ותוכנת BioSpot (טכנולוגיה סלולרית). ה-IC50 חושב מהערך המעורב מהלוג(מעכב) לעומת תגובה מנורמלת, תוך שימוש בשיפוע משתנה (4 פרמטרים) רגרסיה לא לינארית שבוצעה ב-GraphPad Prism (גרסה 9.0).

הפניות

1. Hou YJ, et al. גרסת SARS-CoV-2 D614G מציגה שכפול יעיל ex vivo ושידור in vivo. מַדָע. 2020;370(6523):1464–1468.

2. Garcia-Beltran WF, et al. גרסאות מרובות של SARS CoV-2 בורחות מנטרול על ידי חסינות הומורלית הנגרמת על ידי חיסון. תָא. 2021;184(9):2523.

3. Wall EC, et al. נטרול פעילות נוגדנים נגד SARS-CoV-2 VOCs B.1.617.2 ו-B.1.351 על ידי חיסון BNT162b2. אִזְמֵל. 2021;397(10292):2331–2333.

4. Edara VV, et al. זיהום ותגובות נוגדנים מנטרלים הנגרמות על ידי חיסון לגרסאות SARS-CoV-2 B.1.617. N Engl J Med. 2021;385(7):664–666.

5. Zhou D, et al. עדות לבריחה של וריאנט SARS-CoV-2 B.1.351 מסרום טבעי וחיסונים. תָא. 2021;184(9):2348–2361.

6. ויסבלום י, ואח'. בריחה מנוגדנים מנטרלים על ידי גרסאות חלבון ספייק של SARS-CoV-2. אלייף. 2020;9:e61312.

7. Graham F. תדרוך יומי: גרסה של Omicron coronavirus מכניסה מדענים לכוננות. טֶבַע. 2021;.

8. קארים SSA, קארים QA. גרסה של Omicron SARS-CoV-2: פרק חדש במגיפת COVID-19. אִזְמֵל. 2021;398(10317):2126–2128.

9. Carreño JM, et al. פעילות של סרום הבראה וחיסון נגד SARS-CoV-2 Omicron. טֶבַע. 2021;602(7898):682–688.

10. Wang Q, et al. תכונות חמקנות נוגדנים מדאיגות של תת-וריאנטים של SARS-CoV-2 BQ ו-XBB עולות. תָא. 2022;186(2):279–286.

11. VanBlargan LA, et al. וירוס SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron בורח מנטרול על ידי נוגדנים חד שבטיים טיפוליים. נאט מד. 2022;28(3):490–495.

12. Takashita E, et al. יעילות של נוגדנים ותרופות אנטי-ויראליות נגד Covid-19 Variant Omicron. N Engl J Med. 2022;386(10):995–998.

13. Yuan M, et al. זיהוי של תחום הקישור לקולטן SARS-CoV-2 על ידי נטרול נוגדנים. Biochem Biophys Res Commun. 2021;538:192–203.

14. Barnes CO, et al. מבני נוגדנים מנטרלים של SARS-CoV-2 מסייעים לאסטרטגיות טיפוליות. טֶבַע. 2020;588(7839):682–687.

15. Changrob S, et al. ניטרול צולב של וריאנטים מתעוררים של SARS-CoV-2 של דאגה על ידי נוגדנים המכוונים לאפיטופים שונים על ספייק. Mbio. 2021;12(6):e0297521.

16. גוטמילר JJ, et al. חומרת הזיהום ב-SARS-CoV-2 קשורה לחסינות הומורלית מעולה נגד הספייק. Mbio. 2021;12(1):e02940–20.

17. Greiney AJ, et al. מיפוי מוטציות ל-SARS-CoV-2 RBD שבורחות מקישור על ידי מחלקות שונות של נוגדנים. נאט קומון. 2021;12(1):4196.

18. Liu H, Wilson IA. אפיטופים מנטרלים מגנים ב-SARS-CoV-2. Immunol Rev. 2022;310(1):76–92.

19. Jette CA, et al. תגובתיות צולבת רחבה על פני ארבו-וירוסים המוצגים על ידי תת-קבוצה של נוגדנים מנטרלים שמקורם ב-COVID-19. נציג תא 2021;36(13):109760.

20. Brouwer PJM, et al. נוגדנים מנטרלים חזקים מחולי COVID-19 מגדירים מטרות מרובות של פגיעות. מַדָע. 2020;369(6504):643–650.

21. פינטו D, et al. ניטרול צולב של SARS CoV-2 על ידי נוגדן SARS-CoV חד שבטי אנושי. טֶבַע. 2020;583(7815):290–295.

22. Robbiani DF, et al. תגובות נוגדנים מתכנסות ל-SARS-CoV-2 אצל אנשים בהחלמה. טֶבַע. 2020;584(7821):437–442.

23. Yuan M, et al. בסיס מבני של תגובת נוגדנים משותפת ל-SARS-CoV-2. מַדָע. 2020;369(6507):1119–1123.

24. Dugan HL, et al. פרופיל דומיננטיות חיסונית של תאי B לאחר זיהום ב-SARS-CoV-2 חושף התפתחות נוגדנים למטרות ויראליות שאינן מנטרלות. חֲסִינוּת. 2021;54(6):1290–1303.

25. Rogers TF, et al. בידוד של נוגדנים חזקים של SARS CoV-2 והגנה מפני מחלות במודל של בעלי חיים קטנים. מַדָע. 2020;369(6506):956–963.

26. שמיץ AJ, et al. נוגדן ציבורי המושרה על ידי חיסון מגן מפני SARS-CoV-2 וגרסאות מתפתחות. חֲסִינוּת. 2021;54(9):2159–2166.e6.

27. שי ר, ואח'. נוגדן מנטרל אנושי מכוון לאתר הקישור לקולטן של SARS-CoV-2. טֶבַע. 2020;584(7819):120–124.

28. Cao Y, et al. נוגדנים מנטרלים חזקים נגד SARS-CoV-2 שזוהו על ידי רצף תאי יחיד בתפוקה גבוהה של תאי B של חולים מחלימים. תָא. 2020;182(1):73–84.

29. Barnes CO, et al. מבנים של נוגדנים אנושיים הקשורים לספייק ה-SARS-CoV-2 חושפים אפיטופים נפוצים ומאפיינים חוזרים של נוגדנים. תָא. 2020;182(4):828–842.

30. Corbett KS, et al. עיצוב חיסון mRNA ל-SARS-CoV-2 מתאפשר על ידי היערכות אב-טיפוס של פתוגנים. טֶבַע. 2020;586(7830):567–571.

31. אמנת פ, ואח'. החדרת שני פרולינים והסרה של אתר המחשוף הפולי-בסיסי הובילו ליעילות גבוהה יותר של חיסון SARS-CoV-2 מבוסס ספייק רקומביננטי במודל העכבר. mBio. 2021;12(2):e02648–20.

32. Sun W, et al. נגיף מחלת ניוקאסל המבטא חלבון ספייק מיוצב של SARS-CoV-2 גורם לתגובות חיסוניות מגנות. נאט קומון. 2021;12(1):6197.

33. Hsieh CL, et al. תכנון מבוסס מבנה של קוצים של SARS-CoV-2 מיוצבים מראש. מַדָע. 2020;369(6510):1501–1505.

34. Gobeil SM, et al. מגוון מבני של ספייק ה-SARS-CoV-2 Omicron. מול תא. 2022;82(11):2050–2068.

35. Yuan M, et al. אפיטופ קריפטי שמור מאוד בתחומי הקישור לקולטן של SARS-CoV-2 ו-SARS-CoV. מַדָע. 2020;368(6491):630–633.

36. Starr TN, et al. מפה מלאה של מוטציות SARS-CoV-2 RBD שבורחות מהנוגדן החד שבטי LY-CoV555 והקוקטייל שלו עם LY-CoV016. Cell Rep Med. 2021;2(4):100255.

37. באום א, ואח'. נוגדני REGN-COV2 מונעים ומטפלים בזיהום SARS-CoV-2 במקוקי רזוס ואוגרים. מַדָע. 2020;370(6520):1110–1115.

38. Wu NC, et al. אופן קישור חלופי של נוגדני IGHV3-53 לתחום הקישור לקולטן SARS-CoV-2. Cell Rep. 2020;33(3):108274.

39. Wu Y, et al. זוג לא מתחרה של נוגדנים מנטרלים אנושיים חוסמים את קישור נגיף COVID-19 לקולטן שלו ACE2. מַדָע. 2020;368(6496):1274–1278.

40. Yuan M, et al. השלכות מבניות ותפקודיות של סחף אנטיגני בגרסאות האחרונות של SARS-CoV-2. מַדָע. 2021;373(6556):818–823.

41. Yan Q, et al. נוגדנים מנטרלים המקודדים ל-Germline IGHV3-53-נמצאים בדרך כלל ברפרטוארי הנוגדנים של חולי COVID-19. Emerg Microbes Infect. 2021;10(1):1097–1111.

42. Zhang Q, et al. נוגדנים ציבוריים חזקים ומגוננים של IGHV3- 53/3-66 ומוטאנט הבריחה המשותף שלהם על ספייק של SARS-CoV-2. נאט קומון. 2021;12(1):4210.

43. Wang Z, et al. נוגדנים מעוררי חיסון mRNA ל-SARS-CoV-2 וגרסאות במחזור. טֶבַע. 2021;592(7855):616–622.

44. Simon V, et al. פאריס וספרטה: מציאת עקב אכילס של SARS-CoV-2. mSphere. 2022;7(3):e0017922.

45. Starr TN, et al. נוגדני SARS-CoV-2 RBD הממקסמים רוחב ועמידות בפני בריחה. טֶבַע. 2021;597(7874):97–102.

46. ​​Walls AC, et al. המבנה, התפקוד והאנטיגניות של הגליקופרוטאין של SARS-CoV-2. תָא. 2020;181(2):281–292.

47. הנדרסון R, et al. שליטה בקונפורמציה של הגליקופרוטאין של SARS-CoV-2. נאט מבנה מול ביול. 2020;27(10):925–933.

48. Shrestha LB, et al. נטרול נרחב של נוגדנים נגד גרסאות SARS-CoV-2 המתעוררות. אימונול קדמי. 2021;12:752003.

49. Greiney AJ, et al. נוגדנים הנגרמים על ידי חיסון mRNA-1273 נקשרים בצורה רחבה יותר לתחום הקושר לקולטן מאשר נוגדנים מזיהום SARS-CoV-2. Sci Transl Med. 2021;13(600):eabi9915.

50. Reincke SM, et al. זיהום ב-SARS-CoV-2 בגרסה בטא מעלה נוגדנים חזקים הספציפיים לשושלת ותגובתיות צולבות. מַדָע. 2022;375(6582):782–787.

51. Wrammert J, et al. נוגדנים בעלי תגובתיות צולבות שולטים בתגובה של תאי B אנושיים נגד זיהום בנגיף שפעת H1N1 מ-2009. J Exp Med. 2011;208(1):181–193.

52. גוטמילר JJ, et al. חשיפה ראשונה לנגיף H1N1 המושרה במגפה נוגדנים מנטרלים באופן נרחב המכוונים לאפיטופים בראש ההמגלוטינין. Sci Transl Med. 2021;13(596):eabg4535.

53. Bajic G, et al. הנדסת אנטיגן שפעת מתמקדת בתגובות חיסוניות לאפיטופ ויראלי תת-דומיננטי אך מגן באופן נרחב. Cell Host Microbe. 2019;25(6):827–835.

54. Nachbagauer R, et al. גישת חיסון אוניברסלית מבוססת-המגלוטינין על נגיף שפעת משרה חסינות רחבה וארוכת טווח בניסוי אקראי מבוקר פלצבו שלב I. נאט מד. 2021;27(1):106–114.

55. Angeletti D, et al. עקיפה של אימונודומיננטיות כדי לכוון לאפיטופים מנטרלים באופן רחב תת-דומיננטיים. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(27):13474–13479.

56. גוטמילר JJ, et al. שיטה יעילה ליצירת נוגדנים חד שבטיים מתאי B אנושיים. שיטות מול ביול. 2019;1904:109–145.

57. אמנת פ, ואח'. בדיקה סרולוגית לזיהוי SARS-CoV-2 סרומרת בבני אדם. נאט מד. 2020;26(7):1033–1036.

58. Stadlbauer D, et al. המרת סירו של SARS-CoV-2 בבני אדם: פרוטוקול מפורט לבדיקה סרולוגית, ייצור אנטיגן והגדרת בדיקה. Curr Protoc Microbiol. 2020;57(1):e100.

59. Torres JL, et al. תובנות מבניות של נוגדן חד שבטי אנושי חד-שבטי חזק מאוד לנטרול SARS-CoV-2. Proc Natl Acad Sci ארה"ב. 2022;119(20):e2120976119.

60. Suloway C, et al. מיקרוסקופיה מולקולרית אוטומטית: מערכת הלגינון החדשה. J Struct Biol. 2005;151(1):41–60.

61. Lander GC, et al. Appion: צינור משולב, מונע מסד נתונים כדי להקל על עיבוד תמונה EM. J Struct Biol. 2009;166(1):95–102.

62. Voss NR, et al. DoG Picker ו- TiltPicker: כלי תוכנה להקלה על בחירת חלקיקים במיקרוסקופ אלקטרוני של חלקיקים בודדים. J Struct Biol. 2009;166(2):205–213.

63. Pettersen EF, et al. UCSF Chimera--מערכת הדמיה למחקר וניתוח חקרניים. J Comput Chem. 2004;25(13):1605–1612.

64. Punjani A, et al. עידון לא אחיד: רגולציה אדפטיבית משפרת שחזור cryo-EM של חלקיק אחד. שיטות נאט. 2020;17(12):1214–1221.

65. Zhang K. Gctf: קביעה ותיקון CTF בזמן אמת. J Struct Biol. 2016;193(1):1–12.

66. זיבנוב י, ואח'. כלים חדשים לקביעת מבנה cryo-EM אוטומטית ברזולוציה גבוהה ב-RELION-3. אלייף. 2018;7:e42166.

67. Casanal A, et al. התפתחויות עדכניות ב-coot לבניית מודל מקרו-מולקולרי של קריו-מיקרוסקופיה אלקטרונים ונתונים גבישיים. חלבון Sci. 2020;29(4):1069–1078.

68. Frenz B, et al. תיקון אוטומטי של שגיאות במבני גליקופרוטאין עם רוזטה. מִבְנֶה. 2019;27(1):134–139.

69. קלהולץ ב.פ. גזירת וזיקוק מודלים אטומיים בקריסטלוגרפיה וב-cryo-EM: הכלים האחרונים של פניקס להקלת ניתוח מבנה. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019;75(קטע 10):878–881.

70. Pettersen EF, et al. UCSF ChimeraX: הדמיית מבנה לחוקרים, מחנכים ומפתחים. חלבון Sci. 2021;30(1):70–82.

71. Otwinowski Z, Minor W. עיבוד של נתוני עקיפה של קרני רנטגן שנאספו במצב תנודה. שיטות אנזימול. 1997;276:307–326.

72. McCoy AJ, et al. תוכנת קריסטלוגרפית Phaser. J Appl Crystallogr. 2007;40(נקודה 4):658–674.

73. Qiang M, et al. נוגדנים מנטרלים ל-SARS CoV-2 נבחרו מספריית נוגדנים אנושית שנבנתה לפני עשרות שנים. Adv Sci (Weinh). 2022;9(1):e2102181.

74. Emsley P, Cowtan K. Coot: כלים לבניית מודלים לגרפיקה מולקולרית. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004;60(קטע 12, חלק 1):2126–2132.

75. Adams PD, et al. PHENIX: מערכת מקיפה מבוססת Python לפתרון מבנה מקרומולקולרי. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010;66(קטע 2):213–221.

76. Montiel-Garcia D, et al. Epitope-Analyzer: כלי אינטרנט מבוסס מבנה לניתוח אפיטופים מנטרלים באופן רחב. J Struct Biol. 2022;214(1):107839.