חומצה חוץ-תאית מגבילה את חילוף החומרים של פחמן אחד ומשמרת את גזע תאי T
Dec 22, 2023
הצטברות של תוצרי פסולת מטבוליים חומציים בתוך המיקרו-סביבה של הגידול מעכבת פונקציות משפיעות של לימפוציטים מנפחי גידול (TILs). עם זאת, עדיין לא ברור כיצד סביבה חומצית משפיעה על חילוף החומרים וההתמיינות של תאי T. כאן אנו מראים שחשיפה ממושכת לחומצה מתכנתת מחדש את חילוף החומרים התוך תאי של תאי T ואת הכושר המיטוכונדרי ומשמרת את גזע תאי ה-T. מבחינה מכאנית, חמצת חוץ-תאית מוגברת פוגעת בספיגת מתיונין ובמטבוליזם באמצעות ויסות מטה של SLC7A5, ולכן משנה את שקיעת H3K27me3 במקדמים של גנים מרכזיים של תאי T. שינויים אלו מקדמים את השמירה על מצב 'זיכרון דמוי גזע' ומשפרים את התמדה ארוכת טווח in vivo ואת היעילות האנטי-גידולית בעכברים. הממצאים שלנו לא רק חושפים יכולת בלתי צפויה של חמצת חוץ-תאית לשמור על המאפיינים דמויי הגזע של תאי T, אלא גם מקדמים את ההבנה שלנו כיצד חילוף החומרים של מתיונין משפיע על גזע תאי T.
מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche
לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity
【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
העברה מאמצת של תאי T ספציפיים לגידול אנטיגן מייצגת התקדמות גדולה בתחום הטיפול בסרטן, שכן היא הובילה לרגרסיה מוחלטת של גידולים ממאירים מסוימים. היעילות הטיפולית שלו מסתמכת במידה רבה על ההתמדה וההתמיינות של תאי ה-T המועברים1,2. תאי זיכרון T פחות מובחנים הם האוכלוסייה המועדפת להעברת תאי T מאמצת (ACT) בשל התכונות דמויות תאי הגזע שלהם של התחדשות עצמית וריבוי פוטנציאלים3,4. ואכן, הוכח שהשימוש בתאי זיכרון T דמויי גזע ל-ACT משיג תגובות אנטי-גידול מעולה5. בהשוואה לתאי אפקטור T מובחנים סופנית, תאי T דמויי גזע מציגים סימני היכר מובהקים6. תאי T דמויי גזע אנושיים וגם של עכבר מאופיינים בביטוי שלהם של מולקולות המנוסות באנטיגן וקשורות ביות, כולל רמות גבוהות של CD62L ו-CCR7 (ר' 7). ההבנה שלנו לגבי הפרופילים התעתיקים, השינויים האפיגנטיים והמסלולים המטבוליים המווסתים תאי T דמויי גזע התקדמה באופן דרמטי בשנים האחרונות8-10. מספר גורמי שעתוק, כגון TCF1, KLF2 ו-LEF1, דווחו כממלאים תפקידים חיוניים בהנעה או בשמירה על גזע תאי T9. יש לציין כי TCF1 הוא גורם התעתיק המרכזי המקדם יצירת תאי T זיכרון ארוכים11. במהלך זיהומים כרוניים, חלק קטן מתאי T דמויי גזע TCF1+ מקיים תגובות של תאי T נגד זיהום משני1,12. שינויים אפיגנטיים מספקים אמצעי לתאי T גם ליזום את השינויים התעתיקים העומדים בבסיס רכישת מאפייני תאי זיכרון וגם לשמור על דפוסי ביטוי תעתוק אלה13. מחקרים מרובים הוכיחו שטרימתילציה של היסטון H3 ב-K4 (H3K4me3), שינוי הקשור להפעלה, מתקבלת במיקומי גנים הקשורים לזיכרון, כולל TCF7, KLF2, LEF1, CCR7 ו-SELL, במהלך ההתמיינות של CD נאיבי{{47 }} תאי T לתוך תאי T זיכרון, ואילו טרימתילציה של H3 ב-K27 (H3K27me3), שינוי מדכא, אובדת בלוקוסים 13-15 אלה. לעומת זאת, גנים הקשורים לאפקטור (GZMB, PRF1, IFNG ו-TBX21) מדגימים ירידה בשינויים אפיגנטיים מדכאים ומוגברים מפעילים בלוקוסים אלה בתאי T אפקטור13,16. לבסוף, שורות ראיות מצטברות מצביעות על כך שמעגלים מטבוליים מכתיבים החלטות גורל של תאי T ומעצבים את המצב האפיגנטי והתפקוד שלהם17. תאי אפקטור T קצרי מועד הם גליקוליטים מאוד ותלויים במטבוליזם של פחמן אחד18,19, ואילו תאי זיכרון T דמויי גזע מציגים פרופילים מטבוליים מובהקים המאופיינים על ידי חמצון מוגבר של חומצות שומן (FAO) ויכולת נשימה חילוף מיטוכונדריה (SRC), הקרדינל. מאפיינים המעורבים בהתמדה ארוכת טווח20-22. לכן, תכנות מחדש מטבולי חשוב לרכישה יעילה של גזע והישרדות ארוכת טווח של תאי T.
יתרונות cistanche לגברים מחזקים את המערכת החיסונית
המיקרו-סביבה של הגידול המדכא את מערכת החיסון (TME), המאופיינת ב-pH נמוך, היפוקסיה, מניעת גלוקוז והעשרת חומצת חלב, היא המחסום המרכזי המונע התרחבות, התמיינות ותפקוד תקינים של תאי T23,24. ואכן, מתח מטבולי שנכפה על ידי ה-TME פוגע ביכולת המיטוכונדריה ובכושרו, ומעורר אי ספיקה מטבולית תוך גידולית של תאי T וחוסר תפקוד25-28. באופן מסקרן, רוב הלימפוציטים החודרים לגידולים (TIL) אינם מתפקדים, אך חלק קטן מכיל זיכרון דמוי גזע או תכונות מבשרי 7,29. תת-קבוצת TIL דמוית גזע משמרת פוטנציאל שגשוג והתמדה וקשורה לתגובה חיובית לחסימת מחסום חיסונית (ICB) ו-TIL-ACT באנשים עם סרטן11,30. מחקרים קודמים הראו שחמצת חוץ-תאית מוגברת (↑[H+]) דיכאה את הפעילות הציטוליטית של תאי T הן במבחנה והן ב-vivo31-33. בנוסף, ל-TME החומצי יש השפעה ניכרת על הפעילות וההתמיינות של תאים מיאלואידים חודרים לגידול, כגון תאים דנדריטים (DCs) ומקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs)34-36. עם זאת, ההשפעה של ↑[H+] על גזע תאי T והכושר המטבולי נותרה בלתי ידועה במידה רבה. כאן, אנו מדווחים כי חשיפה ארוכת טווח במבחנה ↑[H+ ] מקלה על ההתמיינות של תאי CD8+ דמויי גזע של אדם ועכבר על חשבון תאי T טרמינלי CD8+. מצאנו שטיפול ארוך טווח ב-↑[H+] משפץ את חילוף החומרים של תאי T ומקיים את יכולת הנשימה המיטוכונדריאלית. יתרה מכך, חשיפה מתמשכת ל-↑[H+ ] פוגעת בספיגת מתיונין ובחילוף החומרים, מה שגורם לאחר מכן לירידה בתצהיר H3K27me3 של גנים הקשורים לזיכרון, ובכך מקלה על השמירה על מצב 'זיכרון דמוי גזע'. לבסוף, העברה מאמצת של תאי T שתורבתו בתנאים של ↑[H+]- מראה פעילות אנטי-גידולית חזקה in vivo, בהתאם לפנוטיפ הפחות מותש שלהם. לפיכך, המחקר שלנו חושף את התפקיד הבלתי צפוי של חמצת חוץ-תאית בשימור גזע תאי T באמצעות עיצוב מחדש של מטבוליזם תאי ודפוסים אפיגנטיים.
תוצאות
↑[H+ ] חשיפה מקדמת גזע של תאי T CD8+
כדי לקבוע אם ↑[H+] חוץ תאי משפיע על התמיינות תאי T דמויי גזע, ביצענו ניתוח ציטומטרי זרימה של פנוטיפים דמויי גזע מפתח על תאי T אנושיים שהתרביתו במשך 12 ימים בכל אחד ממדיום הבקרה, ↑[H+] מדיה המכילה 10 mM חומצת חלב (מחקה את ריכוז הלקטט במצבים פתופיזיולוגיים23,35) או מדיום חומצי (~pH 6.6, על ידי חומצה הידרוכלורית) (איור 1א). שיעור גבוה יותר של תאי T דמויי CD8+, כולל זיכרון מוקדם (CD45RO− CD27+) וזיכרון מרכזי (CD45RO+ CD27+), נצפה בתאי T המותנים ב-↑ [H+] לעומת מדיום בקרה (נתונים מורחבים איור 1a). בנוסף, מצאנו שבתאי T שתורבתו במדיום ↑[H+] היה אחוז גבוה יותר של תאים דמויי גזע (CCR7+ CD62L+) (איור 1ב). ראוי לציין, הבחנו בביטוי מוגבר בולט של TCF1, גורם המפתח המניע את התמיינות דמוית גזע וזיכרון מרכזי, ברמת החלבון בתאי CD8+ של עכבר כאחד ונחשפים ל-↑[H+ ] (איור 1c ו נתונים מורחבים איור 1ב). בנוסף, הייתה השפעה תלוית ריכוז [H+] על ביטוי CCR7 ו-TCF1 (תמונה מורחבת 1c). בהתאם לפנוטיפ דמוי גזע של תאי T מותנים ב-↑[H+], ייצור של אינטרפרון תוך תאי (IFN-) ושל גורם נמק של גידול (TNF-) הופחת משמעותית בתאים אלו (איור 1ד).
כדי לחקור טוב יותר את מצב ההתמיינות של תאי T, ביצענו ניתוח רצף RNA (RNA-seq) ומצאנו שחשיפה ארוכת טווח במבחנה ↑[H+] הביאה לפרופיל שעתוק מובהק (נתונים מורחבים איור 1d). חשיפה ל- ↑[H+ ] הובילה להפחתת הביטוי בצורה יוצאת דופן של גנים המקודדים למולקולות אפקטור, כגון PRF1, GZMB ו-IFNG, והקולטן המעכב-שותף BTLA (איור 1e,f ו-Extended Data Fig. 1e). לעומת זאת, תאי T בתרבית ↑[H+] הדגימו ביטוי גבוה יותר של BACH2, CCR7, LEF1 ו-TCF7, המתואמים עם גזע תאי T (איור 1e,f ונתונים מורחבים איור 1e). ניתוח העשרה של מערכי גנים (GSEA) הראה שדפוס התעתיק המושרה על ידי חשיפה ל-↑[H+] דומה לזה של תאי T זיכרון (איור 1g ו-Extended Data Fig. 1f). יתרה מזאת, ניתוח כמותי של תגובת שרשרת פולימראז (qPCR) אישר ביטוי מוגבר של mRNA של BACH2, KLF2, LEF1 ו-TCF7 בעקבות טיפול ↑[H+] (איור 1h). באופן קולקטיבי, תצפיות אלו תומכות בעובדה שטיפול ↑[H+ ] מעצב מאוד את פרופילי התעתיק של תאי T כדי לבסס גזע. יש לציין, מצאנו שטיפול ב-↑[H+] עיכב שגשוג תאי T והטה את התפלגות מחזור התא לכיוון שלב G1 והרחק משלב S (איור משלים. 1a-c). בשלב הבא בחנו את הפעלת תאי T בטיפול ב-↑[H+] במהלך גירוי TCR ומצאנו שלחשיפה ל-↑[H+] אין השפעה משמעותית על הביטוי של סמני הפעלת תאי T או גודל התא (איור משלים. 2a,b). בנוסף, אישרנו עוד שחשיפה של ↑[H+] לאחר הפעלת תאי T עדיין יכולה לגרום למצב דמוי גזע של תאי T (איור משלים. 2c-f). ממצאים אלו שוללים את האפשרות שתאי T שנחשפו ל-↑[H+ ] פשוט עמידים בפני גירוי, בניגוד לאימוץ מצב דמוי גזע.
cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית
דיווחים קודמים הראו שהסביבה החומצית מעכבת בצורה חריפה את הפעילות הציטוליטית של תאי T הן במבחנה והן ב-vivo23,31. מצאנו גם שחשיפה קצרת טווח ל-↑[H+] פגעה בייצור הציטוקינים אך השפיעה מעט על הפנוטיפ דמוי הגבעול בתאי T (נתונים מורחבים איור 1g-i ואיור משלים 3a-c). יתר על כן, ההשפעות המעכבות של ייצור ציטוקינים על ידי חשיפה ל-↑[H+] הן חולפות והפיכות מכיוון שהסרה של ↑[H+] משחזרת במהירות את ייצור הציטוקינים על ידי תאי T (תמונה מורחבת 1h). לפיכך, עיכוב של תפקוד משפיע תאי T על ידי הסביבה החומצית הוא מהיר מאוד, בעוד שתכנות מחדש של גזע תאי T דורש חשיפה ממושכת ל-↑[H+]. מכיוון שלקטט קיים בתמיסה או בצורתו הבלתי מפורקת (חומצה לקטית) או כמלח יונים (נתרן לקטט), ביקשנו בשלב הבא לקבוע אם נתרן לקטט הפגין השפעות דומות על גזע תאי T ומצאנו שנתרן לקטט גם מקדם את חתימות הגזע, למרות שיעילותו הייתה נמוכה בהרבה מזו של טיפול בחומצת חלב (10 מ"מ) (נתונים מורחבים איור 1j,k ואיור משלים 4a-f). ממצאים אלה מצביעים על החשיבות של ↑[H+ ] והן על ההבדל שלו מטיפול ביוני לקטט, באינדוקציה של הפנוטיפ דמוי גזע של תאי CD8+ T.
![Fig. 1 | ↑[H+ ] exposure facilitates the differentiation of stem-like CD8+ T cells. a Schematic of human T cell activation in the indicated conditions: pH 7.4 (–↑[H+ ], control), pH 6.6 (+↑[H+ ], hydrochloric acid), or 10 mM lactic acid (+↑[H+ ]). PBMCs, peripheral blood mononuclear cells. b, Representative CCR7 and CD62L expression profiles in human CD8+ T cells under different conditions at day 12. n = 3 independent samples. c, Representative histograms and quantification of TCF1 expression in human CD8+ T cells under different conditions at day 12. n = 3 independent samples. MFI, mean fluorescence intensity. d, Human T cells were expanded as in a for 12 days and stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) containing brefeldin A (BFA) for 4.5 h. The intracellular expression profile of IFN-γ and TNF-α is depicted for T cells in the pH 7.4 (left), 10 mM lactic acid (middle), or pH 6.6 (right) condition. n = 3 independent samples. e,f, RNA-seq analysis of human T cells that were expanded in control (pH 7.4) or lactic acid (10 mM). Heat map of selected genes (e) and volcano plot of all genes in which genes associated with memory, effector, and exhausted T cells were labeled (f). In the volcano plot, the x-axis represents the log2-transformed fold change (FC) values for cells treated with lactic acid relative to controls at day 12, and the y-axis represents the adjusted P values. n = 4 independent samples. g, GSEA plot comparing control with lactic-acid conditioned T cells for effector versus memory enrichment. NES, normalized enrichment score. h, Quantitative mRNA expression of transcription factors associated with T cell stemness (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) in T cells under the indicated conditions. n = 3 independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were determined by unpaired two-tailed Student's t-test (b–d,h). Nominal P values and false-discovery rates (FDRs) were calculated with the default method of the GSEA software (g).](/Content/uploads/2023842169/20231219104316e880161f05a346bca771aace88a72449.png "Fig. 1 | ↑[H+ ] exposure facilitates the differentiation of stem-like CD8+ T cells. a Schematic of human T cell activation in the indicated conditions: pH 7.4 (–↑[H+ ], control), pH 6.6 (+↑[H+ ], hydrochloric acid), or 10 mM lactic acid (+↑[H+ ]). PBMCs, peripheral blood mononuclear cells. b, Representative CCR7 and CD62L expression profiles in human CD8+ T cells under different conditions at day 12. n = 3 independent samples. c, Representative histograms and quantification of TCF1 expression in human CD8+ T cells under different conditions at day 12. n = 3 independent samples. MFI, mean fluorescence intensity. d, Human T cells were expanded as in a for 12 days and stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) containing brefeldin A (BFA) for 4.5 h. The intracellular expression profile of IFN-γ and TNF-α is depicted for T cells in the pH 7.4 (left), 10 mM lactic acid (middle), or pH 6.6 (right) condition. n = 3 independent samples. e,f, RNA-seq analysis of human T cells that were expanded in control (pH 7.4) or lactic acid (10 mM). Heat map of selected genes (e) and volcano plot of all genes in which genes associated with memory, effector, and exhausted T cells were labeled (f). In the volcano plot, the x-axis represents the log2-transformed fold change (FC) values for cells treated with lactic acid relative to controls at day 12, and the y-axis represents the adjusted P values. n = 4 independent samples. g, GSEA plot comparing control with lactic-acid conditioned T cells for effector versus memory enrichment. NES, normalized enrichment score. h, Quantitative mRNA expression of transcription factors associated with T cell stemness (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) in T cells under the indicated conditions. n = 3 independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were determined by unpaired two-tailed Student's t-test (b–d,h). Nominal P values and false-discovery rates (FDRs) were calculated with the default method of the GSEA software (g).")
איור 1|חשיפה של ↑[H+ ] מקלה על ההתמיינות של תאי T דמויי גזע CD8+. סכימה של הפעלת תאי T אנושיים בתנאים המצוינים: pH 7.4 (–↑[H+ ], בקרה), pH 6.6 (+↑[H+ ], חומצה הידרוכלורית), או 10 mM חומצה לקטית (+↑[H+ ]). PBMCs, תאים חד-גרעיניים בדם היקפיים. ב, פרופילי ביטוי מייצגים של CCR7 ו-CD62L בתאי CD8+ T אנושיים בתנאים שונים ביום 12. n=3 דגימות עצמאיות. ג, היסטוגרמות מייצגות וכימות של ביטוי TCF1 בתאי CD8+ T אנושיים בתנאים שונים ביום 12. n=3 דגימות עצמאיות. MFI, ממוצע עוצמת הקרינה. ד, תאי T אנושיים הורחבו כמו ב-a למשך 12 ימים ועוררו עם פורבול 12-myristat 13-אצטט (PMA) המכיל brefeldin A (BFA) למשך 4.5 שעות. פרופיל הביטוי התוך תאי של IFN- ו-TNF- מתואר עבור תאי T במצב pH 7.4 (משמאל), 10 mM חומצה לקטית (אמצעית), או pH 6.6 (מימין). n=3 דוגמאות עצמאיות. e,f, ניתוח RNA-seq של תאי T אנושיים שהורחבו בבקרה (pH 7.4) או חומצה לקטית (10 mM). מפת חום של גנים נבחרים (e) וחלקת הר געש של כל הגנים שבהם סומנו גנים הקשורים לזיכרון, משפיע ותאי T מותשים (f). בתרשים הר הגעש, ציר ה-x מייצג את ערכי ה-log2-transformed fold change (FC) עבור תאים שטופלו בחומצה לקטית ביחס לבקרות ביום 12, וציר ה-y מייצג את ערכי ה-P המתואמים. n=4 דוגמאות עצמאיות. g, עלילת GSEA המשווה בין בקרה לתאי T מותנים בחומצת חלב להעשרת משפיעה לעומת זיכרון. NES, ציון העשרה מנורמל. h, ביטוי mRNA כמותי של גורמי שעתוק הקשורים לגזע תאי T (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) בתאי T בתנאים המצוינים. n=3 דוגמאות עצמאיות. הנתונים מוצגים כממוצע ± sem ניתוחים סטטיסטיים נקבעו על ידי מבחן t של סטודנט דו-זנב בלתי מזווג (b-d,h). ערכי P נומינליים ושיעורי גילוי כוזב (FDRs) חושבו בשיטת ברירת המחדל של תוכנת GSEA (g).
[H+] מוגבר מפעיל תכנות מחדש מטבולי
מעבר לתוכניות התמלול הייחודיות, תאי T דמויי גזע רוכשים גם תכונות מטבוליות ייחודיות, כולל FAO מוגבר ומטבוליזם גליקוליטי מוגבל17,20,37. כדי לחקור את המאפיינים המטבוליים של תאי T שנחשפו לטווח ארוך במבחנה ↑[H+ ], ביצענו ניתוח העשרה של Gene Ontology (GO) ומצאנו הבדלים משמעותיים בביטוי של גנים הקשורים למסלולים מטבוליים, כגון מטבוליזם של מולקולות קטנות גליקוליזה (איור 2א). ואכן, תאי T עם תנאי ↑[H+] ארוכי טווח הפגינו גליקוליזה מופחתת ומטבוליזם של חומצות אמינו, בניגוד לחילוף חומרים מוגבר של חומצות שומן ארוכות שרשרת (נתונים מורחבים איור 2a,b). בניגוד לחשיפה ארוכת טווח של ↑[H+ ], טיפול קצר מועד ב-↑[H+ ] עיכב את הגליקוליזה בלבד, אך לא היו לו השפעות משמעותיות על FAO (איור משלים 5a). ניתוח PCR כמותי אישר עוד יותר שהגנים הגליקוליזה SLC2A1, SLC2A3 ו-LDHA ירדו באופן משמעותי בתאי T שנחשפו ל-↑[H+] (תמונה מורחבת 2c). לעומת זאת, התניה ↑[H+] קידמה את הביטוי של קרניטין פלמיטוילטרנספראז 1 (מקודד על ידי CPT1A), אנזים מגביל קצב המעורב ב-FAO (תמונה מורחבת 2c). כדי להבהיר עוד יותר את השינויים המטבוליים שנגרמו על ידי ↑[H+] , ביצענו ניתוח מטבולומי חסר פניות ומצאנו 285 תוצרי ביניים ברורים בתאי T שתורבתו עם ↑[H+ ] לעומת בקרות (נתונים מורחבים איור 2d). בפרט, חשיפה ל-↑[H+] הפחיתה באופן משמעותי את תוצרי הביניים הגליקוליטים וחומצות אמינו חיוניות מסוימות במקום להגדיל מספר מיני קרניטין, הצורה המופעלת של חומצות שומן המועברת למיטוכונדריה לצורך חמצון (תמונה מורחבת איור 2e-g). ניתוח שטף מטבולי באמצעות [13C6]גלוקוז או [13C16]palmitate הוכיח שחשיפה ל-↑[H+] מעכבת באופן דרסטי את שילוב [13C6]גלוקוז בתוצרי ביניים של TCA וחומצת חלב תוך קידום שילוב [13C16]palmitate באצטיל-CoA וב-notion שחמצת חוץ-תאית מדכאת את הגליקוליזה ומגבירה את ה-FAO בתאי T (איור 2b-e). תאי T מותני ↑[H+] אלה הציגו מגבלות ביחס לספיגת חומרים מזינים, כפי שהוכחה מירידה בצריכה של [13C6]גלוקוז וספיגה של אנלוגים של שומנים (BODIPY FL C16), ממצא שעשוי לנבוע משיפוע אלקטרוכימי מוגבר. (נתונים מורחבים איור 2h, i).
הספיגה המוגבלת של חומרי הזנה וחילוף חומרים תאי עלולים להוביל לשינויים של רשתות האיתות בתאי T. ניתוח העשרה של GO של תאי T שטופלו בחומצה לקטית גילה שרוב הגנים המושפעים מעורבים בעיקר באיתות PI3K-AKT, mTOR ו-TCR (תמונה מורחבת 3a). איתות mTOR ממלא תפקיד מרכזי בשילוב אותות חיסוניים ורמזים מטבוליים להפעלה תקינה של תאי T, ועיכוב של איתות mTOR מטה את התאים לכיוון היווצרות של תאי T זיכרון CD8+ במקום התמיינות אפקטור38-40. ניתוח ה-GSEA שלנו הצביע על כך שהפעילות של איתות AKT-mTOR וגם של NF-кB בתאי T מותנים ב-↑[H+] פחתה בהשוואה לזו שבתאי T בקרה (איור 2f ונתונים מורחבים איור 3b). זה אושר עוד יותר על ידי ירידה בזרחון של S6 (ב-Ser235 ו-Ser236), 4EBP1 (ב-Thr37 ו-Thr46), AKT (ב-Ser473) ו-NF-кB (ב-Ser536) בתאי T מותנים ב-↑[H+] (איור. 2g,h ונתונים מורחבים איור 3c). mTOR ידוע כמפקח קריטי של תהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל גודל תא, יצירת אנרגיה וסינתזת חלבון41. ואכן, מצאנו שגודל התא של תאי T מותנים ב-[H+] הצטמצם בהשוואה לזה של תאי T בקרה (איור מורחב נתונים 3d). בשלב הבא הערכנו סינתזת חלבון תלוית ביו-אנרגיה בתאי T מותנים ב-↑[H+] באמצעות SCENITH, שיטה חדשה שפותחה המשתמשת בשילוב פורומיצין כקריאה של רמות סינתזת חלבון42. כצפוי, חשיפה של ↑[H+] דיכאה סינתזת חלבון עתיר אנרגיה (איור 2i), מה שמרמז על כך שחילוף החומרים של אנרגיה בתאי CD8+ T השתנה. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם ממצאים קודמים לפיהם עיכוב פעילות mTOR על ידי rapamycin הגדיל את הביטוי של גורמי שעתוק הקשורים לגזע (Extended Data Fig. 3e,f). אם לוקחים את התוצאות שלנו יחד, אנו מסיקים שחשיפה ארוכת טווח של ↑[H+ ] מתזמרת מתג מטבולי ומדכאת פעילות mTOR, ובכך מקלה על רכישה ותחזוקה של גזע תאי T.
cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית
הגבלה מתווכת ↑[H+ ] של מטבוליזם מתיונין משמרת את הגזע האפיגנטי
שורות ראיות מצטברות מצביעות על כך שמטבוליזם של פחמן אחד מכתיב החלטות גורל של תאי T ומעצב את מצבם התפקוד43,44. ניתוח ה-RNA-seq שלנו הראה העשרה לקויה עבור התהליך המטבולי של פחמן אחד וחתימת מחזור מתיונין בתאי T שנחשפו לטיפול ארוך טווח, ולא קצר טווח,↑[H+ ] (איור 3a, נתונים מורחבים איור 4a, ואיור משלים 5ב). בהתאם לכך, חשיפה ל-↑[H+] עיכבה את הביטוי של גנים המקודדים לאנזימים הקשורים למחזור מתיונין (MTR, AHCY ו-BHMT) וכן חילוף חומרים פולאט (SHMT1 ו-SHMT2) (נתונים מורחבים איור 4b). ניתוח מטבולומי נוסף גילה שתאי T שהתרבו בחומצת חלב הראו ירידה ניכרת במטבוליטים תוך-תאיים המעורבים במחזור המתיונין, כולל מתיונין, S-אדנוסילמתיונין (SAM) ו-S-אדנוסיל-הומוציסטאין (SAH), אך עלייה ברמות של סרין והומוציסטאין (מורחבת). נתונים איור 4ג). [13C5] מעקב מתיונין אישר עוד שהספיגה והשפע התוך תאי של מתיונין, SAM תוך תאי מסומן 13C (m+5), SAH (m+4) ו-5'-methyl-thioadenosine (MTA, m +1) הצטמצמו באופן משמעותי בתאי T שנחשפו ל-↑[H+] (איור 3b-d ונתונים מורחבים איור 4d). ראוי לציין, תוספת מתיונין אקסוגנית החזירה את הספיגה והשפע התוך תאי של מתיונין [13C5] וכן את תוצרי הביניים הרלוונטיים בתאי T שנחשפו ל-↑[H+] (איור 3c,d ונתונים מורחבים איור 4d), מה שמצביע על כך שמתיונין אקסוגני תוספת יכולה לשחזר את ספיגת מתיונין ומטבוליזם של תאי T חשופים ל-↑[H+ ]. לאחר מכן חקרנו האם הגבלת מתיונין יכולה להניע את גזע תאי T. מצאנו כי מניעת מתיונין אכן קידמה את האינדוקציה של אוכלוסיית תאי TCF1+ CD8+ אך לא השפיעה על הביטוי של CD62L ו-CD44 (נתונים מורחבים איור 4e,f). כדי להמשיך ולחקור את התפקיד של מטבוליזם מתיונין בגזע תאי T המושרה על ידי ↑[H+], התרבות תאי T עם מדיום ↑[H+] בתוספת מתיונין, SAM או SAH. הפנוטיפ של גזע תאי T המושרה על ידי חמצת חוץ-תאית אכן נאסר בחלקו על ידי תוספת עם מתיונין או SAM, אך לא SAH (איור 3e ו-Extended Data Fig. 4g-i). מתיונין תוך תאי הופך ל-SAM, תורם חשוב של קבוצת מתיל לתגובות מתילציה של DNA והיסטון (נתונים מורחבים איור 5a). לפיכך, אפיינו דפוסי מתילציה של היסטון ומצאנו כי עלייה ב-[H+] הפחיתה מאוד את רמות ה-H3K27me3 הכוללות בתאי T, אך לא הייתה השפעה משמעותית על הביטוי של סמני מתילציה אחרים של היסטון (איור 3f ואיור מורחב נתונים 5b). כצפוי, תוספת מתיונין לתאי T בחשיפה ל-↑[H+] החזירה את הרמה הכוללת של ביטוי H3K27me3 (איור 3f). ההפחתה הספציפית של רמת H3K27me3 שנצפתה בתאי T שעברו טיפול ארוך טווח ↑[H+] הניעה אותנו לשער שחשיפה ל-↑[H+] מווסתת באופן סלקטיבי את המתילטרנספראז הספציפי לשקיעת H3K27me3. ואכן, ראינו ביטוי מופחת משמעותית של EZH2, מתיל-טרנספראז מפתח עבור H3K27me3, הן ברמת ה-mRNA והן ברמת החלבון בתאי T החשופים ל-↑[H+] (נתונים מורחבים איור 5c,d). יתר על כן, עיכוב פעילות EZH2 על ידי מעכב מאוד ספציפי, GSK126, העלה את הביטוי של TCF1, כמו גם את אחוז תאי T CCR7+ CD62L+ CD8+ (תמונה מורחבת 5e,f) , מה שהיה בקנה אחד עם דיווח קודם לפיו EZH2 יכול לווסת את פוטנציאל תאי הזיכרון-T באמצעות שינויים אפיגנטיים סלקטיביים45. כדי לזהות שינויים רחבי הגנום בדפוסים האפיגנטיים של גזע תאי T המושרה על ידי ↑[H+ ], ביצענו את בדיקת CUT&Tag-seq ומצאנו שינויים מינימליים במידתיות של שקיעת H3K4me3 ו-H3K27me3 בקרב קבוצות מטופלות שונות לאורך הפרוטור, גוף הגן ו אזורים בין-גניים (נתונים מורחבים איור 5g). באופן ספציפי, פרופיל אפיגנומי חשף רמה ירידה של סמן היסטון מדכא H3K27me3 בלוקוסים של גנים הקשורים לזיכרון (לדוגמה, TCF7, CCR7, ID3, LEF1 ו- KLF2) בתאי T ארוכי טווח שטופלו ב-↑[H+ ] (איור 3g) . חשוב לציין, הוספה של מתיונין בחשיפה ל-↑[H+] החזירה חלקית את רמת H3K27me3 בלוקוסים לעיל, כמו גם את ביטוי הגנים שלהם, מה שמרמז על תפקיד חשוב למתיונין באפנון האפיגנטי של גנים אלה הקשורים לזיכרון (איור 3g ו- נתונים מורחבים איור 5ח). בהתאם למחקר קודם14, גנים אפקטורים כגון PRF1, GZMB, IFNG, TBX21 ו-NR4A2 רכשו באופן חיובי דפוס היסטון-מתילציה מפעיל (H3K4me3hi ו-H3K27me3lo) (איור 3g). יש לציין, התפוסות של H3K4me3 באזורי פרומטור של גנים אפקטורים אלה נפגעה בתאי T שתורבתו בחשיפה של ↑[H+] ושוחזרו על ידי תוספת מתיונין (איור 3g). בסך הכל, ממצאים אלה מצביעים על כך שהפרעה בתיווך ↑[H+] של מחזור המתיונין מעודדת שימור אפיגנטי של גזע תאי T.
מספר מעבירי מתיונין (SLC), כולל SLC7A5, SLC38A1, SLC38A2 ו-SLC43A2, יכולים לתווך את הובלת מתיונין46. כדי לחקור כיצד חשיפה ל- ↑[H+ ] מפחיתה את ספיגת המתיונין ואת חילוף החומרים בתאי T, ניתחנו את דפוסי הביטוי של SLCs נפרדים ומצאנו ש- ↑[H+ ] הורידה באופן דרמטי את הביטוי של SLC7A5 ו- SLC38A2, אך השפיעה מעט על ביטוי SLC38A1 (Extended). נתונים איור 6א,ב). בנוסף, חשיפה ל-↑[H+] הפחיתה את הביטוי והפעילות של MYC (תמונה מורחבת 6c,d), אשר דווחה לווסתת את הביטוי של מעבירי מתיונין כמו SLC7A5 (ר' 47). עוד הדגמנו תפוסה גבוהה של MYC על מקדם SLC7A5 ובמידה פחותה על מקדם SLC38A2 (נתונים מורחבים איור 6e). חשוב לציין שקישור MYC מופחת באופן משמעותי ללוקוסים אלו נצפתה בתאי T מטופלים ב-↑[H+] ארוכי טווח (נתונים מורחבים איור 6e). בהתאם לתצפיות אלו, ביטוי יתר של MYC שיחזר בצורה יוצאת דופן את הביטוי של SLC7A5 ו-SLC38A2 בתאי T החשופים ל-↑[H+] (תמונה מורחבת 6f). תוצאות אלו תומכות בתפקיד החשוב של MYC בהפחתת הביטוי של מעבירי מתיונין בחשיפה ל-↑[H+]. מעניין לציין שתוספת של מתיונין יכולה גם לשחזר את הביטוי של MYC ו-SLC7A5 בתאי T חשופים ל-↑[H+ ] (נתונים מורחבים איור 6g), מה שמרמז שתוספת מתיונין עשויה לשחזר את יכולת ספיגת המתיונין של תאי T על ידי הגברה של ביטוי מתיונין טרנספורטר SLC7A5 באופן תלוי MYC. מחקר קודם הראה כי SLC7A5 הוא הטרנספורטר המתיונין השכיח ביותר בתאי T משופעלים47. זה, יחד עם הממצאים הקודמים שלנו, מצביעים על כך ש-SLC7A5 עשוי למלא תפקיד חשוב בהגבלת מתיונין הנגרמת על ידי ↑[H+] ושמירה על מצב דמוי גזע. ואכן, מצאנו שביטוי יתר של SLC7A5 פגע חלקית בפנוטיפ דמוי גזע המושרה על ידי ↑[H+] (תמונה מורחבת איור 6h, i), ותמך עוד יותר במעורבות של הטרנספורטר המתיונין SLC7A5 בזיכרון תאי T המושרה על ידי ↑[H+ ] פנוטיפ כמו. על ידי ניתוח תת-אוכלוסיות שונות של תאי T של CD8+, מצאנו ביטוי מופחת של MYC וגם של SLC7A5 בתקליטורי CD8+ דמויי זיכרון (Extended Data Fig. 7a,b), שנמצא בקנה אחד עם הממצאים במבחנה שלנו. לפיכך, ממצאים אלה מצביעים על כך שציר MYC-SLC7A5-מתיונין עשוי לתרום לשימור המצב דמוי הזיכרון של TILs.
![Fig. 2 | ↑[H+ ] exposure triggers metabolic reprogramming and suppresses mTOR signaling. a, GO analysis using RNA-seq data, showing representative differentially expressed metabolic genes in control and lactic-acid-conditioned human T cells (adjusted P value < 4.23 × 10–2). b, Schematic of [13C6]glucose or [ 13C16]palmitate labeling patterns. c, Percentage of the indicated m+3 lactate out of total lactate or of m+3 pyruvate out of total pyruvate in T cells. n = 3 independent samples. d, Percentage of isotopomer for the TCA intermediates, such as citrate (m+2), malate (m+2), and succinate (m+2), derived from [13C6]glucose. n = 3 independent samples. e, Percentage of the indicated m+2 acetyl-CoA out of total acetyl-CoA or of m+2 citrate isotope out of total citrate in T cells from [13C16] palmitate. n = 4 independent samples. f, GSEA with statistical analysis of the gene set associated with mTORC1 signaling in control versus lactic-acid-conditioned (left) or pH 6.6-conditioned (right) human T cells. g,h, Flow cytometric analysis and quantification for S6 phosphorylated at Ser235 and Ser236 (g) and 4EBP1 phosphorylated at Thr37 and Thr46 (h) in human CD8+ T cells under the indicated conditions. n = 3 independent samples. I, Flow cytometric analysis and quantification of energy-intensive protein synthesis in controls or lactic-acid- or pH 6.6-conditioned human T cells. n = 3 independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were determined by one-sided Fisher exact test with Benjamini–Hochberg multiple-comparisons test (a) or unpaired two-tailed Student's t-test (c–e,g–i). Nominal P values and FDRs were calculated with the default method in the GSEA software (f).](/Content/uploads/2023842169/202312191044395da385e9aa8c4673a892ee5262c6dba0.png "Fig. 2 | ↑[H+ ] exposure triggers metabolic reprogramming and suppresses mTOR signaling. a, GO analysis using RNA-seq data, showing representative differentially expressed metabolic genes in control and lactic-acid-conditioned human T cells (adjusted P value < 4.23 × 10–2). b, Schematic of [13C6]glucose or [ 13C16]palmitate labeling patterns. c, Percentage of the indicated m+3 lactate out of total lactate or of m+3 pyruvate out of total pyruvate in T cells. n = 3 independent samples. d, Percentage of isotopomer for the TCA intermediates, such as citrate (m+2), malate (m+2), and succinate (m+2), derived from [13C6]glucose. n = 3 independent samples. e, Percentage of the indicated m+2 acetyl-CoA out of total acetyl-CoA or of m+2 citrate isotope out of total citrate in T cells from [13C16] palmitate. n = 4 independent samples. f, GSEA with statistical analysis of the gene set associated with mTORC1 signaling in control versus lactic-acid-conditioned (left) or pH 6.6-conditioned (right) human T cells. g,h, Flow cytometric analysis and quantification for S6 phosphorylated at Ser235 and Ser236 (g) and 4EBP1 phosphorylated at Thr37 and Thr46 (h) in human CD8+ T cells under the indicated conditions. n = 3 independent samples. I, Flow cytometric analysis and quantification of energy-intensive protein synthesis in controls or lactic-acid- or pH 6.6-conditioned human T cells. n = 3 independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were determined by one-sided Fisher exact test with Benjamini–Hochberg multiple-comparisons test (a) or unpaired two-tailed Student's t-test (c–e,g–i). Nominal P values and FDRs were calculated with the default method in the GSEA software (f).")
איור 2|↑[H+ ] חשיפה מפעילה תכנות מחדש מטבולי ומדכאת איתות mTOR. א, ניתוח GO תוך שימוש בנתוני RNA-seq, המראה גנים מטבוליים מייצגים מייצגים בשליטה ובתאי T אנושיים מותני חומצת חלב (ערך P מתואם < 4.23 × 10-2). ב, סכמטי של דפוסי תיוג [13C6]גלוקוז או [13C16]palmitate. ג, אחוז ה-m+3 lactate המצוין מתוך סך lactate או של m+3 pyruvate מתוך סך pyruvate בתאי T. n=3 דוגמאות עצמאיות. ד, אחוז האיזוטופומר עבור תוצרי הביניים של TCA, כגון ציטראט (m+2), מאלאט (m+2), וסוקסינאט (m+2), שמקורם ב-[13C6]גלוקוז. n=3 דוגמאות עצמאיות. ה, אחוז של m+2 אצטיל-CoA המצוין מתוך סך אצטיל-CoA או של איזוטופ m+2 ציטראט מתוך סך ציטראט בתאי T מ-[13C16] פלמיטאט. n=4 דוגמאות עצמאיות. f, GSEA עם ניתוח סטטיסטי של מערך הגנים הקשור לאיתות mTORC1 בבקרה לעומת תאי T אנושיים מותנים (משמאל) או pH 6.6-. g,h, ניתוח ציטומטרי זרימה וכימות עבור S6 שפוספוריל ב-Ser235 ו-Ser236 (g) ו-4EBP1 שפוספוריל ב-Thr37 ו-Thr46 (h) בתאי CD8+ T אנושיים בתנאים המצוינים. n=3 דוגמאות עצמאיות. I, ניתוח ציטומטרי זרימה וכימות של סינתזת חלבון עתיר אנרגיה בבקרות או בתאי T אנושיים מותנים חומצת חלב או pH 6.6-. n=3 דוגמאות עצמאיות. הנתונים מוצגים כממוצע ± sem ניתוחים סטטיסטיים נקבעו על ידי מבחן פישר מדויק חד צדדי עם מבחן השוואות מרובות של Benjamini-Hochberg (א) או מבחן t של סטודנט דו-זנב ללא זוג (c-e,g-i). ערכי P ו-FDR נומינליים חושבו בשיטת ברירת המחדל בתוכנת GSEA (f).
![Fig. 3 | Increased [H+ ] alters T cell methionine metabolism to preserve epigenetic stemness. a GSEA plot of the gene set associated with one-carbon metabolism and cysteine and methionine metabolism in control versus lactic acid-conditioned human T cells. b, Schematic of [13C5]methionine labeling patterns. c, Percentage of intracellular SAM (m+5), SAH (m+4), and MTA (m+1) derived from [13C5]methionine, out of their respective total pools, in T cells cultured in control conditions or with 10 mM lactic acid or 10 mM lactic acid supplemented with methionine (10 mM + Met). n = 3 independent samples. d, Relative abundance of [12C5]methionine and [13C5]methionine in T cells. e, Representative histogram and quantification of TCF1 in human CD8+ T cells cultured in various conditions. n = 3 independent samples. f, Effects of methionine supplementation on histone methylation in human T cells. H3K4me3, histone H3 trimethylated at K4; H3K79me2, H3 dimethylated at K79; H3K27me3, H3 trimethylated at K27; H3K9me2, H3 dimethylated at K9. n = 3 independent samples. g, Genome track view of representative gene loci showing H3K27me3 (red, above the line) or H3K4me3 (blue, below the line) peaks. CUT&Tag-seq data are from two independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Nominal P values and FDRs were calculated with the default method of the GSEA software (a). Statistical analyses were done using two-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey's multiple-comparisons test (c–f).](/Content/uploads/2023842169/20231219104503793116dde85a413baf8c838599f2d1aa.png "Fig. 3 | Increased [H+ ] alters T cell methionine metabolism to preserve epigenetic stemness. a GSEA plot of the gene set associated with one-carbon metabolism and cysteine and methionine metabolism in control versus lactic acid-conditioned human T cells. b, Schematic of [13C5]methionine labeling patterns. c, Percentage of intracellular SAM (m+5), SAH (m+4), and MTA (m+1) derived from [13C5]methionine, out of their respective total pools, in T cells cultured in control conditions or with 10 mM lactic acid or 10 mM lactic acid supplemented with methionine (10 mM + Met). n = 3 independent samples. d, Relative abundance of [12C5]methionine and [13C5]methionine in T cells. e, Representative histogram and quantification of TCF1 in human CD8+ T cells cultured in various conditions. n = 3 independent samples. f, Effects of methionine supplementation on histone methylation in human T cells. H3K4me3, histone H3 trimethylated at K4; H3K79me2, H3 dimethylated at K79; H3K27me3, H3 trimethylated at K27; H3K9me2, H3 dimethylated at K9. n = 3 independent samples. g, Genome track view of representative gene loci showing H3K27me3 (red, above the line) or H3K4me3 (blue, below the line) peaks. CUT&Tag-seq data are from two independent samples. Data are presented as mean ± s.e.m. Nominal P values and FDRs were calculated with the default method of the GSEA software (a). Statistical analyses were done using two-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey's multiple-comparisons test (c–f).")
איור 3|מוגבר של [H+] משנה את חילוף החומרים של מתיונין של תאי T כדי לשמר גזע אפיגנטי. מגרש GSEA של מערך הגנים הקשור למטבוליזם של פחמן אחד ולמטבוליזם של ציסטאין ומתיונין בבקרה לעומת תאי T אנושיים המותנים בחומצת חלב. ב, סכימה של דפוסי תיוג [13C5]מתיונין. ג, אחוז של SAM תוך תאי (m+5), SAH (m+4) ו-MTA (m+1) שמקורם ב-[13C5]מתיונין, מתוך המאגר הכולל שלהם, ב תאי T בתרבית בתנאי בקרה או עם 10 מ"מ חומצת חלב או 10 מ"מ חומצת חלב בתוספת מתיונין (10 מ"מ + Met). n=3 דוגמאות עצמאיות. ד, שפע יחסי של מתיונין [12C5] ומתיונין [13C5] בתאי T. ה, היסטוגרמה מייצגת וכימות של TCF1 בתאי CD8+ T אנושיים התרבותיים בתנאים שונים. n=3 דוגמאות עצמאיות. ו, השפעות של תוספת מתיונין על מתילציה של היסטון בתאי T אנושיים. H3K4me3, היסטון H3 trimethylated ב-K4; H3K79me2, H3 dimethylated ב-K79; H3K27me3, H3 trimethylated ב-K27; H3K9me2, H3 דימתיל ב-K9. n=3 דוגמאות עצמאיות. g, תצוגת מסלול הגנום של לוקוסים מייצגים של גנים המציגים פסגות H3K27me3 (אדום, מעל הקו) או H3K4me3 (כחול, מתחת לקו). נתוני CUT&Tag-seq הם משתי דגימות בלתי תלויות. הנתונים מוצגים כממוצע ± sem ערכי P נומינליים ו-FDRs חושבו בשיטת ברירת המחדל של תוכנת GSEA (א). ניתוחים סטטיסטיים נעשו באמצעות ניתוח דו-כיווני של שונות (ANOVA) עם מבחן ההשוואות המרובות של Tukey (c-f).
חשיפה ל-↑[H+ ] שומרת על כושר מיטוכונדריאלי
בהתחשב בסינתזת החלבון עתירת האנרגיה המופחתת בתאי T המותנים ↑[H+], שיערנו שחשיפה ארוכת טווח ל-↑[H+] עשויה לגרום לשינויים ניכרים במטבוליזם האנרגטי של התא. הן תאי הבקרה והן ↑[H+] מותנים נותחו באמצעות SCENITH42 על מנת לחשב תלות בגלוקוז, תלות במיטוכונדריה, יכולת גליקוליטית ויכולת חמצון FAO וחומצות אמינו (איור 4a ונתונים מורחבים איור 8a). בהתאם לתוצאות המטבולומיקה ומעקב האיזוטופים שלנו, ראינו חילוף חומרים מוגבר במיטוכונדריה בתאי T החשופים ל-↑[H+ ], בעוד ששיעורי הגליקוליזה הופחתו (איור 4b,c ונתונים מורחבים איור 8b), מה שמצביע על תכנות מחדש של התוך-תאי. חילוף חומרים אנרגטי בתאי T מותנים ב-↑[H+ ]. ניתוח סוס ים גילה עוד שתאי T מותנים ב-↑[H+ ] הראו קצב צריכת חמצן (OCR) גבוה יותר וכן SRC, תכונה קרדינלית של תאי T זיכרון CD8+ ארוכי חיים ושיעור חומצה חוץ-תאי נמוך יותר ( ECAR) (איור 4d–h ונתונים מורחבים איור 8c–f). כיוון שהגברת המסה/איחוי המיטוכונדריה וירידה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (Δψm) חשובים לשמירה על גזע תאי T48-50, בדקנו עוד את הכמות והאיכות של המיטוכונדריה של תאי T מותנים ב-↑[H+ ] ומצאנו כי ↑[H+ ] טיפול משופר מסת המיטוכונדריה הן בתאי T אנושיים והן בעכברים (איור 4i, j ונתונים מורחבים איור 8g, h), אשר שומרים גם על Δψm נמוך יותר (איור 4k ונתונים מורחבים איור 8i). ניתוח אולטרה-מבנה באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) גילה כי לתאי T שנחשפו ↑[H+] היו מיטוכונדריות גדולות ועמוסות בצפיפות שהתפזרו בציטופלזמה והיו להן הרבה קריסטלים הדוקים וצרים בהשוואה לתאי T ביקורת, מה שעולה בקנה אחד עם תוצאות שפורסמו בנושא. למורפולוגיה של מיטוכונדריה בתאי T זיכרון (איור 4l,m). בהתאם לממצא זה, ראינו גם ביטוי גנטי מוגבר של מספר מווסתים קריטיים של היתוך מיטוכונדריאלי בתאי T מותנים ב-↑[H+] (תמונה מורחבת איור 8j), אשר הוצע לשחק תפקיד הכרחי ליצירת תאי T זיכרון50. בסך הכל, ממצאים אלה מצביעים על כך שחשיפה של ↑[H+ ] משפרת את המסה/איחוי המיטוכונדריה ואת הכושר לקידום היווצרות של תאי T דמויי גזע.
מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche
↑[H+ ] חשיפה משפרת את הפעילות האנטי-גידולית של תאי T CD8+
תאי T דמויי גזע מעדיפים השתלה, התרחבות ויעילות אנטי-גידולית באימונותרפיה מאמצת51. כדי לחקור אם תאי T-CD8+ ארוכי טווח במבחנה ↑[H+ ]-מתוחזקות מפגינים התרחבות או התמדה מוגברת בעת העברה, CD45.1+ תאי OT-I T שהורחבו בבקרה או ↑[ מדיום מותנה ב-H+] הועבר באופן אימוץ ל-CD45.2+עכברי C57BL/6N ללא גידול מושתל (איור 5a). למרות שמספר גדל מעט של תאים אפופטוטיים זוהה עם התניה ↑[H+ ] (תמונה מורחבת איור 9a), היה אחוז גבוה יותר משמעותית של תאי T בדם ההיקפי של עכברים שהועברו עם תאי T מורחבים במצב ↑[H+ ] בהשוואה לאלה שהורחבו במדיום בקרה (תאי T בקרה) (איור 5b). באופן דומה, זוהו תדרים גבוהים יותר באופן משמעותי של תאי T בטחול ובלוטות הלימפה (LNs) (נתונים מורחבים איור 9b,c). בנוסף, מצאנו הצטברות מוגברת משמעותית של תאי T בגידולים, טחול ובלוטות לימפה מתנקזות בעכברים נושאי גידול B16-OVA שבהם תאים מורחבים ↑[H+] הועברו באופן אימוץ בהשוואה לזה בעכברים ש קיבלו תאי בקרה, דבר המצביע על כך שתאי CD8+ T שנשמרו ב-↑[H+ ] הם בעלי התמדה משופרת (איור 5c–e ותאי נתונים מורחבים איור 9d). בהתאם לממצאים אלה, אחוז תאי ה-T הזיכרון גדל באופן משמעותי בטחולים וב-LN של עכברים שקיבלו תאי T מותנים ב-↑[H+] (איור 5f ו-Extended Data Fig. 9e). יש לציין, תאי OT-I T המורחבים עם ↑[H+] הפגינו עיכוב משמעותי בצמיחת הגידול בהשוואה לתאי T ביקורת (איור 5g). לאחר מכן חקרנו את היעילות הטיפולית של תאי T עם ↑[H+ ]-Expanded CD19 chimeric-antigen-receptor-modified (CAR) עם מודל גידול in vivo שבו תאי גידול CD19-K562 הוזרקו תת עורית לצלעים של עכברי NCG (איור 5h). מצאנו שחשיפה ל-↑[H+] מקדמת גם גזע של תאי CAR-T אך לא השפיעה על אפופטוזיס (נתונים מורחבים איור 9f), כפי שמעידים עלייה משמעותית באחוזים של CCR7+ CD62L+ גזע דמוי CAR-T תאים כמו גם הביטוי המווסת של TCF1 (תמונה מורחבת 9g, h). בנוסף, היה שיעור גבוה יותר של הצטברות תאי CAR-T באתרי גידול ובטחול של עכברי NCG לאחר עירוי עם תאי T מותנים ב-↑[H+] (איור 5i). כצפוי, עכברי NCG שהועברו באופן אימוץ עם תאי CAR-T שהורחבו ב-↑[H+] הראו פינוי גדול יותר של גידול CD19+ מושתל בהשוואה לאלו שקיבלו תאי CAR-T שהורחבו במדיום בקרה (איור 5j). יחד, נתונים אלה הוכיחו שטיפול ב-↑[H+] מקדם התמדה in vivo ופעילות אנטי-גידולית של תאי T.
חשיפה ל-↑[H+ ] מגבילה את תשישות תאי T
כדי להמשיך ולחקור את ההשפעות של חשיפה מתמשכת ↑[H+ ] על תשישות תאי T במבחנה, מדדנו ביטוי LAG-3 ו-TIM-3 בתאי T אנושיים בעלי התחלה של ↑[H+] שעברו סבבים מרובים של גירוי נוסף עם נוגדנים נגד CD3 והותנו במדיום בקרה (איור 6א). מצאנו גם ביטוי LAG-3 וגם TIM-3 מופחתים בתאי T שנחשפו ל-↑[H+] (איור 6b ונתונים מורחבים איור 10a), מה שמצביע על כך שהטיפול ב-↑[H+] גורם להפחתה תשישות תאי T. יתר על כן, מצאנו שריכוז גבוה של מתיונין מוביל לעלייה בביטוי של סמנים מעכבים, כגון PD-1, LAG-3 ו-TIM-3, בעוד שטיפול עם רמה נמוכה ריכוז מתיונין הפחית מעט את הביטוי של סמנים אלו (איור משלים 6a-c). יש לציין כי בחשיפה ארוכת טווח חוץ גופית ↑[H+ ], התדירות של חדירת TIM-3+ LAG-3+ לתאי OT-I T ותאי CD19-CAR T בתוך הגידולים הייתה במידה רבה מופחת לאחר העברה מאמצת (איור 6c-e ונתונים מורחבים איור 10b), מה שעולה בקנה אחד עם התשישות הנמוכה יותר שלהם במבחנה ושיפור יכולת השליטה בגידולים in vivo. יתרה מזאת, הדגמנו שתאי T עם תנאי ↑[H+] לטווח ארוך הראו ביטוי TOX מופחת משמעותית הן במבחנה והן ב-vivo (איור 6f,g ונתונים מורחבים איור 10c,d). כפי שתואר קודם, ניתן לחלק באופן כללי תאי T מותשים לתת-קבוצה מותשת או מותשת סופית, כפי שנקבע על ידי TCF1 ו-TIM-3 expression52,53. ככזה, מדדנו את דפוס הביטוי של TCF1 ו-TIM-3 ב-CD45.1+ TILs ושמנו לב שהתדירות של תאי T מותשים סופנית של TCF1− TIM-3+ הופחתה במידה רבה, עם אחוז מוגבר באופן משמעותי של TCF1+ TIM-3- תאי T אבות תחת תנאי ↑[H+] (איור 6h). יתרה מכך, הדגמנו גידול של LY108+ TIM-3– אוכלוסיית תאי T אבות (נתונים מורחבים איור 10e) וכן עלייה בתדירות של IFN- + TNF- + T תאים (נתונים מורחבים איור 10f), התומכים עוד יותר בעובדה שתאי T מורחבים במבחנה ארוכי טווח ↑[H+] המורחבים בצורה מאמצת מגבילים את התשישות ומשמרים את הגזע.
דִיוּן
ACT ספציפי לגידול היא גישה מבטיחה לטיפול באנשים עם גידולים עקשניים, אך ההשפעות הטיפוליות מוגבלות במידה רבה על ידי חוסר תפקוד של תאי T ב-TME. לאחרונה, ניתנה תשומת לב רבה למיזוג מוקדם של תאי T עם רעב חולף בגלוקוז, הגבלת גלוטמין או אשלגן חוץ תאי מוגבר (↑[K+]) במהלך תרבית חוץ גופית כדי לשמר את גזע תאי T ולשפר את התוצאות הטיפוליות54-56. במחקר זה, הדגמנו כי טיפוח תאי CD8+ T ברמות גבוהות של [H+] במהלך ה-priming קידם באופן מפתיע את רכישת גזע תאי T והגברת העמידות לתשישות תאי T, ושיפר מאוד את ההשפעות האנטי-גידוליות של תאי T שהועברו באופן אימוץ.
הצטברות מוגזמת של חומצת חלב בתוך TME נחשבת זמן רב כגורם מפתח בבריחה חיסונית של הגידול. לדוגמה, חומצה לקטית וה-TME החומצית הוכחו כדי לדכא את הפעילות הציטוליטית של תאי T של תאי T וייצור ציטוקינים31–33,57. בהתאם לממצאים אלו, מצאנו גם שחשיפה קצרת טווח ל-↑[H+] במבחנה הייתה מספיקה כדי לעכב באופן עמוק את ייצור הציטוקינים של אפקטור, אך לא הייתה לה השפעה על ביטוי TCF1 או על תכונות מטבוליות הקשורות לגזע. עם זאת, טיפול ארוך טווח ↑[H+] קידם באופן בלתי צפוי ביטוי TCF1 ושמר על הפנוטיפ של תאי T דמויי גזע באמצעות תכנות מחדש מטבולי ועיצוב מחדש אפיגנטי. חשיפה של תאי T ל- ↑[H+ ] לאחר הפעלתם המלאה יכולה גם לגרום לפנוטיפ דמוי גזע, ובכך לשלול את האפשרות שתאי T שנחשפו ל-pH נמוך פשוט הפכו לעמידים בפני גירוי, ולא אימצו מצב דמוי גזע. ריכוז חומצת החלב הפיזיולוגי בדם של אנשים בריאים הוא בסביבות 1.5-3.0 מ"מ, אך הוא יכול לעלות ל-10 מ"מ עד 40 מ"מ ב-TME35,58. באמצעות מודל גירוי אנטי-CD3/CD28 מתמשך, Feng et al. לאחרונה דיווחו כי ריכוז גבוה של נתרן לקטט מעלה את רמות H3K27ac במוקד TCF7 super-enhancer באמצעות עיכוב פעילות היסטון דאצטילאז, מה שמוביל לביטוי מוגבר של TCF1 ולקידום של גזע תאי T CD8+59. לעומת זאת, מצאנו שחשיפה ארוכת טווח לריכוז נמוך יחסית של חומצת חלב (10 מ"מ), אך לא נתרן לקטט, יכולה בקלות לעורר חתימה דמוית גזע של תאי T באמצעות הגבלת חילוף החומרים של מתיונין וויסות H3K27me3 שקיעה בלוקוסים גנים הקשורים לגזע, התומך בבירור בוויסות אפיגנטי מובהק על ידי נתרן לקטט וחומצה לקטית. עם זאת, לטיפול בחומציות נמוכה (pH 6.9) אין השפעה משמעותית על ביטוי TCF1 תחת גירוי אנטי-CD3/CD28 מתמשך, דבר המצביע על כך שהחתימות דמויות הגזע של תאי T CD8+ נגרמות על ידי ↑[H+ ] החשיפה עשויה להתגבר על ידי גירוי TCR. הפעלת TCR יכולה לשפר את ספיגת המתיונין ולתכנת מחדש את חילוף החומרים של מתיונין כדי לסייע בהפעלת תאי T19,60. השערנו שגירוי TCR עשוי לחזק את הספיגה של מתיונין בתאי T שטופלו ב-↑[H+ ], שהגבילו את חילוף החומרים של מתיונין, ולכן מטריד את הגזע האפיגנטי המושרה על ידי ↑[H+ ]. בנוסף, תאי T יכולים להשתמש ביוני לקטט כמקור פחמן חוץ תאי כדי להקל על רכישת גזע בנוכחות או בהיעדר גירוי TCR מתמשך. פעילות מטבולית קשורה קשר הדוק להתמיינות תאי T, והתערבויות מטבוליות מסוימות עשויות לקדם מאוד את היווצרות תאי זיכרון-T ארוכי חיים21,37,61,62. בהתאם לכך, הניתוחים המטבולומיים ומעקב האיזוטופים שלנו תומכים ברעיון שחשיפה ארוכת טווח של ↑[H+] מובילה לתכנות מחדש מטבולי בולט, כגון ספיגה מופחתת של גלוקוז וירידה בגליקוליזה ובמטבוליזם של מחזור TCA. מספר מחקרים הראו שתאי זיכרון T CD8+ משתמשים ב-FAO כדי למלא את צורכי האנרגיה שלהם, אם כי זו כנראה הסתגלות להתמיינות של שושלת הזיכרון, וביטוי יתר של Cpt1 מקדם אורך חיים של תאי T21,22,63,64. עם זאת, במודל שלהם של מחיקה גנטית ספציפית לתאי T של Cpt1a, Raud et al. לאחרונה הוכיחו ש-LC-FAO ניתנת במידה רבה להפעלה ויצירת תאי T של CD8+ תאי זיכרון T65. זה נותר אתגר להסביר אי התאמה כזו. בהקשר של המחקר שלנו, אנו משערים שתכנות מחדש של מטבוליזם חומצות שומן המונע על ידי חמצת חוץ תאית קשור ככל הנראה ליצירת תאי T זיכרון, אם כי המנגנון המדויק העומד בבסיס השערה זו דורש חקירה נוספת. יתר על כן, מצאנו שחשיפה ל-↑[H+] עיכבה את פעילות mTOR, אשר עשויה להיגרם על ידי עיכוב גליקוליטי. יש לציין, דיכוי איתות mTOR עשוי גם לתרום למעבר המטבולי מגליקוליזה לנשימה מיטוכונדריאלית. ואכן, תאי T המורחבים ↑[H+] הפגינו שיפור בכושר המיטוכונדריאלי, כפי שהוכח על ידי עלייה ניכרת ב-SRC ובמסה המיטוכונדריאלית וירידה ב-Δψm. חתימות המיטוכונדריאליות הללו, המועשרות בתאי T דמויי גזע וקשורות לאריכות ימים ופעילות אנטי-גידולית מעולה in vivo, מווסתות באופן הדוק על ידי דינמיקת היתוך מיטוכונדריאלי ודינמיקת ביקוע22,48,50. חלבון היתוך הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה OPA1 ממלא תפקיד הכרחי ביצירת תאי זיכרון-T50. בהתאם, מצאנו שחמצת חוץ-תאית קידמה גם את ביטוי OPA1 בתאי T, מה שגרם בסופו של דבר לשיווי המשקל המורפולוגי לקראת היתוך בתאי T. מטבוליטים תאיים רבים הוכחו כתורמים ישירות לשינויים אפיגנטיים. לדוגמה, מטבוליזם של פחמן אחד יכול ליצור את תורם המתיל האוניברסלי SAM עבור מתילציה של היסטון66.
![Fig. 4 | Mitochondrial fitness is sustained in T cells exposed to ↑[H+ ]. a SCENITH analysis of the human T cells in control or lactic-acid-conditioned T cells. A representative translation level (anti-Puro) is shown (n = 3 independent samples). The dashed line represents the background level obtained after 2-deoxy-d-glucose + oligomycin (2-DG+O) treatment. b,c, Quantitative analysis of glycolytic capacity (b) and mitochondrial dependence (c) within a. n = 3 independent samples. d–f, OCR (d) of control and lactic-acid-conditioned T cells was measured in real-time under basal conditions in response to the indicated inhibitors. FCCP, carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxy phenylhydrazone; ROT/ AA, rotenone and antimycin A. Representative statistical analysis of basal OCR (e), maximal respiration (e) and SRC (f). n = 9 tests; 3 independent samples were analyzed and each sample was measured 3 times. g,h, ECAR (g) of control or lactic-acid-conditioned T cells measured in response to the indicated inhibitors. Representative statistical analysis of basal ECAR and stressed ECAR (h). n = 9 tests; 3 independent samples were detected and each sample was measured 3 times. i, Immunoblot analysis of COXIV and TIM23 in human T cells under the indicated conditions. Actin was used as a loading control. j,k, Representative histograms or contour plots and statistical analysis of mitochondrial mass (MTG) (j) and mitochondrial membrane potential (TMRM) (k), respectively, in the control or lactic-acid- or pH 6.6-conditioned human T cells. n = 3 independent samples. l,m, Representative mitochondrial morphology of T cells cultured in the control condition, lactic acid or the pH 6.6 condition for 12 days, analyzed by EM (scale bar, 1 μM) (l). The area of individual mitochondria in T cells (m), n = 45 cells. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.](/Content/uploads/2023842169/2023121910470232da8d22ab0a4279b68730f453fa0325.png "Fig. 4 | Mitochondrial fitness is sustained in T cells exposed to ↑[H+ ]. a SCENITH analysis of the human T cells in control or lactic-acid-conditioned T cells. A representative translation level (anti-Puro) is shown (n = 3 independent samples). The dashed line represents the background level obtained after 2-deoxy-d-glucose + oligomycin (2-DG+O) treatment. b,c, Quantitative analysis of glycolytic capacity (b) and mitochondrial dependence (c) within a. n = 3 independent samples. d–f, OCR (d) of control and lactic-acid-conditioned T cells was measured in real-time under basal conditions in response to the indicated inhibitors. FCCP, carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxy phenylhydrazone; ROT/ AA, rotenone and antimycin A. Representative statistical analysis of basal OCR (e), maximal respiration (e) and SRC (f). n = 9 tests; 3 independent samples were analyzed and each sample was measured 3 times. g,h, ECAR (g) of control or lactic-acid-conditioned T cells measured in response to the indicated inhibitors. Representative statistical analysis of basal ECAR and stressed ECAR (h). n = 9 tests; 3 independent samples were detected and each sample was measured 3 times. i, Immunoblot analysis of COXIV and TIM23 in human T cells under the indicated conditions. Actin was used as a loading control. j,k, Representative histograms or contour plots and statistical analysis of mitochondrial mass (MTG) (j) and mitochondrial membrane potential (TMRM) (k), respectively, in the control or lactic-acid- or pH 6.6-conditioned human T cells. n = 3 independent samples. l,m, Representative mitochondrial morphology of T cells cultured in the control condition, lactic acid or the pH 6.6 condition for 12 days, analyzed by EM (scale bar, 1 μM) (l). The area of individual mitochondria in T cells (m), n = 45 cells. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.")
איור 4|כושר המיטוכונדריאלי נשמר בתאי T שנחשפו ל-↑[H+ ]. ניתוח SCENITH של תאי T אנושיים בתאי T בקרה או חומצת חלב. מוצגת רמת תרגום מייצגת (אנטי-פורו) (n=3 דוגמאות עצמאיות). הקו המקווקו מייצג את רמת הרקע שהתקבלה לאחר טיפול ב-2-deoxy-d-glucose + oligomycin (2-DG+O). b,c, ניתוח כמותי של יכולת גליקוליטית (ב) ותלות במיטוכונדריה (ג) בתוך a. n=3 דוגמאות עצמאיות. d-f, OCR (d) של תאי T מותני בקרה וחומצת חלב נמדדו בזמן אמת בתנאים בסיסיים בתגובה למעכבים המצוינים. FCCP, קרבוניל ציאניד-p-trifluoromethoxy phenylhydrazone; ROT/AA, rotenone and antimycin A. ניתוח סטטיסטי מייצג של OCR בסיסי (e), נשימה מקסימלית (e) ו-SRC (f). n=9 בדיקות; נותחו 3 דגימות עצמאיות וכל דגימה נמדדה 3 פעמים. g,h, ECAR (g) של תאי T מותני בקרה או חומצת חלב שנמדדו בתגובה למעכבים המצוינים. ניתוח סטטיסטי מייצג של ECAR בסיסי ו- ECAR הדגיש (ח). n=9 בדיקות; אותרו 3 דגימות עצמאיות וכל דגימה נמדדה 3 פעמים. i, ניתוח Immunoblot של COXIV ו- TIM23 בתאי T אנושיים בתנאים המצוינים. אקטין שימש כבקרת טעינה. j,k, היסטוגרמות או קווי מתאר מייצגים וניתוח סטטיסטי של מסת המיטוכונדריה (MTG) (j) ופוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (TMRM) (k), בהתאמה, בבקרה או ב-pH 6.{{30} }תאי T אנושיים מותנים. n=3 דוגמאות עצמאיות. l,m, מורפולוגיה מיטוכונדריאלית מייצגת של תאי T בתרבית במצב הבקרה, חומצת חלב או תנאי pH 6.6 למשך 12 ימים, מנותחת על ידי EM (סרגל סולם, 1 מיקרומטר) (l). השטח של מיטוכונדריה בודדים בתאי T (m), n=45 תאים. הנתונים מוצגים כממוצע ± sem ניתוחים סטטיסטיים נעשו באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנב בלתי מזווג.
![Fig. 5 | ↑[H+ ]-expanded T cells display enhanced anti-tumor activity. a,b, Control or lactic-acid-expanded CD8+ T cells were analyzed for persistence after adoptive transfer (n = 6 mice). Freshly isolated mouse CD45.1+ OT-I T cells were activated with mouse IL-2 and plate-bound anti-mouse CD3 and anti-mouse CD28 antibodies for 2 days and then maintained in a culture medium with mouse IL-2 until adoptive transfer (CD3&CD28+IL-2). A schematic of the animal experiment (a) as well as representative FACS plots and statistical analysis of CD45.1+ and CD45.2+ T cells in the blood are shown in (b). c–g, CD45.1+ OT-I T cells were expanded in control or lactic acid medium for 7 days and transferred into B16-OVA-tumor-bearing mice, and the infiltration of ratio was evaluated (n = 5 mice). A schematic of the animal experiment using B16-OVA tumor-bearing mice (c), as well as representative FACS plots (left) and statistics for the number (right) of transferred CD45.1+ OT-I T cells in the tumor (d). s.c., subcutaneous injection. Statistics for the percentage of CD45.1+ T cells (e) and representative data (left) and statistics for the percentage (right) of CD62L+ CD44+ CD45.1+ T cells (f) in the spleen are shown. Tumor growth curve (g) (n = 5 mice, day 14). h–j, CD19-CAR T cells were expanded in control or lactic acid medium for 12 days and transferred into CD19-overexpressing K562 tumor-bearing NCG mice, and the infiltration ratio in tumor and spleen was evaluated (n = 6 mice). A schematic of the animal experiment (h), a representative percentage of transferred T cells in the tumor and spleen (i), and tumor growth curves (j) are shown (n = 6 mice, day 10). Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.](/Content/uploads/2023842169/20231219104719ae22f2dc6bc348bda4bf8bfe75b347db.png "Fig. 5 | ↑[H+ ]-expanded T cells display enhanced anti-tumor activity. a,b, Control or lactic-acid-expanded CD8+ T cells were analyzed for persistence after adoptive transfer (n = 6 mice). Freshly isolated mouse CD45.1+ OT-I T cells were activated with mouse IL-2 and plate-bound anti-mouse CD3 and anti-mouse CD28 antibodies for 2 days and then maintained in a culture medium with mouse IL-2 until adoptive transfer (CD3&CD28+IL-2). A schematic of the animal experiment (a) as well as representative FACS plots and statistical analysis of CD45.1+ and CD45.2+ T cells in the blood are shown in (b). c–g, CD45.1+ OT-I T cells were expanded in control or lactic acid medium for 7 days and transferred into B16-OVA-tumor-bearing mice, and the infiltration of ratio was evaluated (n = 5 mice). A schematic of the animal experiment using B16-OVA tumor-bearing mice (c), as well as representative FACS plots (left) and statistics for the number (right) of transferred CD45.1+ OT-I T cells in the tumor (d). s.c., subcutaneous injection. Statistics for the percentage of CD45.1+ T cells (e) and representative data (left) and statistics for the percentage (right) of CD62L+ CD44+ CD45.1+ T cells (f) in the spleen are shown. Tumor growth curve (g) (n = 5 mice, day 14). h–j, CD19-CAR T cells were expanded in control or lactic acid medium for 12 days and transferred into CD19-overexpressing K562 tumor-bearing NCG mice, and the infiltration ratio in tumor and spleen was evaluated (n = 6 mice). A schematic of the animal experiment (h), a representative percentage of transferred T cells in the tumor and spleen (i), and tumor growth curves (j) are shown (n = 6 mice, day 10). Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.")
איור 5|↑ [H+ ] תאי T מורחבים מציגים פעילות אנטי-גידולית משופרת. a,b, Control או תאי T CD8+ מורחבים בחומצת חלב נותחו עבור התמדה לאחר העברה מאמצת (n=6 עכברים). עכבר מבודד טרי CD45.1+ תאי OT-I T הופעלו עם עכבר IL-2 ונוגדנים אנטי-עכבר CD3 ו-CD28 נגד עכבר הקשורים לצלחת במשך יומיים ולאחר מכן נשמרו במצע תרבות עם עכבר IL-2 עד להעברה מאמצת (CD3&CD28+IL-2). סכימה של הניסוי בבעלי חיים (א) וכן עלילות FACS מייצגות וניתוח סטטיסטי של CD45.1+ ו-CD45.2+ תאי T בדם מוצגים ב-(ב). c–g, CD45.1+ תאי OT-I T הורחבו במדיום בקרה או חומצת חלב למשך 7 ימים והועברו לעכברים נושאי גידול B16-OVA, והחדירת היחס הוערכה (n=5 עכברים). סכימה של הניסוי בבעלי חיים באמצעות עכברים נושאי גידול B16-OVA (c), כמו גם חלקות FACS מייצגות (משמאל) וסטטיסטיקה עבור המספר (מימין) של CD45 שהועבר.1+ OT- תאי T בגידול (ד). sc, הזרקה תת עורית. סטטיסטיקה עבור האחוז של CD45.1+ תאי T (ה) ונתונים מייצגים (משמאל) וסטטיסטיקה עבור האחוז (מימין) של CD62L+ CD44+ CD45.1+ תאי T (ו ) בטחול מוצגים. עקומת צמיחת הגידול (g) (n=5 עכברים, יום 14). h–j, CD19-תאי CAR T הורחבו במדיום בקרה או חומצת חלב למשך 12 ימים והועברו ל-CD19-המבטאים יתר על המידה עכברי NCG נושאי גידול K562, ויחס ההסתננות בגידול ובטחול היה מוערך (n=6 עכברים). סכימה של הניסוי בבעלי חיים (h), אחוז מייצג של תאי T שהועברו בגידול ובטחול (i), ועקומות צמיחת הגידול (j) מוצגים (n=6 עכברים, יום 10). הנתונים מוצגים כממוצע ± sem ניתוחים סטטיסטיים נעשו באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנב בלתי מזווג.
![imageFig. 6 | ↑[H+ ] exposure restricts T cell exhaustion. a Schematic of chronic stimulation of human T cells in vitro. b, Representative FACS plots for LAG-3 and TIM-3 in chronically stimulated human T cells cultured in control or lactic acid conditions. n = 3 independent samples. c, The expression of LAG-3 and TIM-3 in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). d, Quantification of the expression of LAG-3, TIM-3 and PD-1 in CD45.1+ TILs from B16-OVA-tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). e, The expression of LAG-3 and TIM-3 in tumor-infiltrating CD19-CAR T cells from CD19-K562 tumor-bearing NCG mice, as determined by flow cytometry (n = 6 mice). f, The expression of TOX in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). g, The histograms and statistical analysis of TOX in tumor-infiltrating CD19-CAR T cells from CD19-K562 tumor-bearing NCG mice (n = 6 mice). h, Left, representative flow cytometry plots for TIM-3 and TCF1 in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). Right, the percentage of TCF1+ TIM-3– or TCF1– TIM-3+ populations. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.](/Content/uploads/2023842169/20231219104739789f56482ec84fdf8c79bfbf223df3ca.png "imageFig. 6 | ↑[H+ ] exposure restricts T cell exhaustion. a Schematic of chronic stimulation of human T cells in vitro. b, Representative FACS plots for LAG-3 and TIM-3 in chronically stimulated human T cells cultured in control or lactic acid conditions. n = 3 independent samples. c, The expression of LAG-3 and TIM-3 in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). d, Quantification of the expression of LAG-3, TIM-3 and PD-1 in CD45.1+ TILs from B16-OVA-tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). e, The expression of LAG-3 and TIM-3 in tumor-infiltrating CD19-CAR T cells from CD19-K562 tumor-bearing NCG mice, as determined by flow cytometry (n = 6 mice). f, The expression of TOX in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). g, The histograms and statistical analysis of TOX in tumor-infiltrating CD19-CAR T cells from CD19-K562 tumor-bearing NCG mice (n = 6 mice). h, Left, representative flow cytometry plots for TIM-3 and TCF1 in CD45.1+ TILs from B16-OVA tumor-bearing C57BL/6N mice (n = 5 mice). Right, the percentage of TCF1+ TIM-3– or TCF1– TIM-3+ populations. Data are presented as mean ± s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed Student's t-test.")
איור 6|↑[H+] חשיפה מגבילה את תשישות תאי T. סכימה של גירוי כרוני של תאי T אנושיים במבחנה. ב, מגרשי FACS מייצגים עבור LAG-3 ו-TIM-3 בתאי T אנושיים בעלי גירוי כרוני שהתרבית בתנאי בקרה או חומצת חלב. n=3 דוגמאות עצמאיות. ג, הביטוי של LAG-3 ו-TIM-3 ב-CD45.1+ TILs מעכברי B16-OVA נושאי גידול C57BL/6N (n=5 עכברים ). ד, כימות הביטוי של LAG-3, TIM-3 ו-PD-1 ב-CD45.1+ TILים מ-B16-C57BL הנושאת OVA/ 6N עכברים (n=5 עכברים). ה, הביטוי של LAG-3 ו-TIM-3 בתאי CD19-CAR T חודרים לגידולים מעכברי NCG נושאי גידול CD19-K562, כפי שנקבע על ידי ציטומטריית זרימה (n=6 עכברים). ו, הביטוי של TOX ב-CD45.1+ TILs מעכברי B16-OVA נושאי גידול C57BL/6N (n=5 עכברים). g, ההיסטוגרמות והניתוח הסטטיסטי של TOX בתאי CD19-CAR T החודרים לגידולים מעכברי NCG נושאי גידול CD19-K562 (n=6 עכברים). h, משמאל, עלילות ציטומטריית זרימה מייצגות עבור TIM-3 ו-TCF1 ב-CD45.1+ TILs מעכברי B16-OVA נושאי גידול C57BL/6N (n=5 עכברים) . נכון, האחוז של אוכלוסיות TCF1+ TIM-3– או TCF1– TIM-3+. הנתונים מוצגים כממוצע ± sem ניתוחים סטטיסטיים נעשו באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנב בלתי מזווג.
מטבוליטים, כגון S-2-hydroxyglutarate ו-hydroxybutyrate, דווחו לתפקד כמווסתים אפיגנטיים של התמיינות תאי זיכרון-T67,68. התוצאות שלנו הראו שטיפול מתמשך ↑[H+ ] מגביל את ספיגת מתיונין ומטבוליזם מתיונין עם ירידה במתיונין תוך תאי, SAM ו-SAH באמצעות עיכוב הביטוי של מעבירי מתיונין. תוצאות אלו עשויות להסביר חלקית מדוע תאי T אינם מסוגלים להתחרות על תאי גידול עבור ספיגת מתיונין ב-TME69. מבחינה מכאנית, הדגמנו שחשיפה ל-↑[H+] הפחיתה באופן דרמטי את ביטוי MYC ואת הקישור שלו למקדם SLC7A5, וכתוצאה מכך התוצאה היא ירידה בביטוי SLC7A5 ופגיעה במטבוליזם של מתיונין בתאי T. באופן מסקרן, תוספת מתיונין יכולה לשחזר את הביטוי של MYC ו-SLC7A5, כמו גם את השטף של מחזור המתיונין בתאי T חשופים ל-↑[H+ ], מה שמצביע על כך ששיקום יכולת ספיגת המתיונין נובע ככל הנראה מוויסות על של הטרנספורטר המתיונין SLC7A5 באופן תלוי MYC. דווח כי פעילות mTOR מסדירה את תרגום MYC70. בהתאם לכך, שיערנו ש-↑[H+ ]-הורדה המושרה של MYC נובעת ככל הנראה מהדחקה תרגום דרך עיכוב פרוגרסיבי של mTOR ופגיעה בספיגה של מתיונין. דיכוי כזה עשוי להתהפך על ידי תוספת מתיונין אקסוגנית, אם כי המנגנון המדויק זקוק למחקר נוסף. SAM שמקורו במחזור מתיונין נחשב לתווך מתילציה של היסטון ועיצוב מחדש אפיגנטי במהלך התמיינות תאי אפקטור-T8,71. בהתאם לירידה ב-SAM התוך תאי בתאי T מורחבים ↑[H+ ], מצאנו שהשפע הכולל של H3K27me3 והתפוסה שלו במקדם של לוקוס תאי גזע T הופחתו מאוד. H3K27me3 ו-H3K4me3 משתנים באופן סלקטיבי באופן שמתאם לביטוי של גנים מרכזיים בתוכנית האפקטור או הגזע של תאי T14. אכן, הייתה העשרה נמוכה יותר של H3K4me3 בתוך מקדמי גנים אפקטורים בתאי T מורחבים ↑[H+]. לפיכך, הרמות המופחתות של SAM תורם מתיל הנובעות מפגיעה בספיגת מתיונין ומטבוליזם במצב ↑[H+ ] מובילות לשינויים אפיגנטיים שבסופו של דבר מעדיפים התמיינות תאי T למצב זיכרון. מעניין שהוספת מתיונין בחשיפה ל-↑[H+ ] לא רק מצילה את הביטוי של MYC ו-SLC7A5 בתאי T החשופים ל-↑[H+ ], אלא גם משחזרת את הרמה הכוללת של ביטוי H3K27me3, התומכת בתפקיד חשוב עבור MYC-SLC7A5 ציר מטבוליזם מתיונין בוויסות גזע אפיגנטי המושרה על ידי ↑[H+ ]. ואכן, מצאנו שביטוי יתר של SLC7A5 פגע חלקית בפנוטיפ דמוי הגבעול המושרה על ידי ↑[H+], ותמך עוד יותר בתפקידו הקריטי של טרנספורטר המתיונין SLC7A5 ברכישת הפנוטיפ דמוי הזיכרון של תאי T בחשיפה ל-↑[H+].
היסטורית חשבו שרוב TILs מותשים עקב חשיפת TCR מתמשכת בתוך גידולים, אך באופן פרדוקסלי תת-קבוצה קטנה של קלונוטיפים של תאי T ב-TIs המבטאים את גורם השעתוק TCF1 שומרת על תכונות דמויות תאי גזע. הממצאים שלנו חשפו שחשיפה ל-↑[H+ ] מקזזת את תפקוד המשפיעים של תאי T ומשמרת את גזע תאי ה-T באמצעות ציר חילוף החומרים MYC-SLC7A5-מתיונין, מה שמספק הסבר אפשרי לפרדוקס הנוכחי מדוע חלק קטן מה-TI עדיין מכיל גזע- כמו זיכרון או מאפיינים מקדימים. למעשה, דווחו ממצאים דומים לפיהם יוני אשלגן ב-TME ממלאים תפקיד כפול המשפיע הן על תפקוד משפיע תאי ה-T והן על הגזע56,72, ותומכים עוד יותר בהשפעות המורכבות של גורמים מדכאים חיסוניים של TME (לדוגמה, גירוי TCR כרוני, היפוקסיה ונמוך גלוקוז) על תפקוד והתמיינות של תאי T. בנוסף, האזורים החומציים בתוך הגידולים הם מאוד דינמיים ומווסתים מבחינה מרחבית וזמנית, וככל הנראה הכושר של תאי T המותאמים לחמצת חוץ-תאית מואפל כאשר הם נתקלים בגורמי TME קשים אחרים שיכולים להשפיע על תפקוד השפעת תאי T תוך-גידולי והתמיינות. בנוסף, ראינו ביטוי גבוה יותר של MYC בתאי T מותשים באופן סופני (LY108− TIM-3+) מאשר בתאי T מותשים אבותיים (LY108+ TIM-3–), כלומר בהתאם לדיווחים קודמים לפיהם תאי MYClo T רוכשים את גורל הזיכרון73. בהתאם לירידה בביטוי SLC7A5 וספיגת מתיונין בתאי T שנחשפו ל-↑[H+ ], הביטוי של SLC7A5 הופחת משמעותית גם באוכלוסיית תאי T LY108+ TIM-3-מותשת אבות בתוך גידולים, מה שמציע שציר הרגולציה MYC-SLC7A5-מתיונין עשוי לפעול גם ב-vivo. כעת ניכר כי לתאי זיכרון T דמויי גזע מובחנים פחות יש השפעות טיפוליות אנטי-גידוליות מעולות הודות להתמדה ארוכת הטווח שלהם ועמידותם להתפתחות של תפקוד לקוי51,74. סיפקנו כאן הוכחות משכנעות לכך שתאי T-CD8+ בעלי תנאי ↑[H+] ארוכי טווח הראו התמדה מוגברת ויכולת אנטי-גידולית מעולה in vivo, עם אוכלוסיית תאי T מותשים באופן סופני (TCF1- TIM{ {39}} ) ותת-קבוצה מוגברת של אבות (TCF1+ TIM-3–) בתוך גידולים. לסיכום, המחקר הנוכחי שלנו מספק תובנות לגבי ההשפעות הרב-ממדיות של חשיפה ל-↑[H+] על דיכוי תפקוד השפעטור של תאי T והשפעתו המקבילה על גזע תאי T.
שיטות
עכברים וקווי תאים
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מכון סוז'ו לרפואת מערכות (ISM-IACUC-0151-R), ובעלי חיים אוכסנו במתקני עכברים ספציפיים ללא פתוגנים. עכברים אוכסנו בתנאים סטנדרטיים, עם 12-h/12-h מחזורי אור/חושך וטמפרטורה מבוקרת של 22-24 מעלות ולחות של 60%, עם מזון ומים ללא הגבלה זמינות, ונבדקו מדי יום. כל עומסי הגידול לא חרגו מההרשאה שאושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכון סוז'ו לרפואת מערכות. CD45.1+ עכברים טרנסגניים מסוג OT-I TCR על רקע C57BL/6N שוכנו יחד. CD45.2+ עכברי נקבות C57BL/6N בגילאי 6-8 שבועות נרכשו מ-Vital River כמקבלות. עכברי NCG (NOD/ ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt) בנות 6-8 שבועות נרכשו מ- GemPharmatech. עבור ניסוי עצמאי אחד in vivo, עכברי CD45.1+ ו-CD45.2+ (6-12 שבועות) היו מתאימים למין. תאי HEK-293T מ-American Type Culture Collection (ATCC) נשמרו במדיום DMEM בתוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. קו תאי המלנומה של העכבר B16, מ-ATCC, הועבר לבטא OVA ונשמר במדיום DMEM בתוספת של 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. תאי K562 מ-ATCC הועברו לביטוי CD19 אנושי ותופחו במדיום RPMI 1640 בתוספת של 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1% GlutaMAX, 0.1 M HEPES, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 1 מ"מ נתרן ופירובאט מיקרומטר -מרקפטואתנול. כל הריאגנטים הנ"ל נרכשו מגיבקו.
בידוד תאי T ראשוניים, הפעלה והתמרה רטרו-ויראלית
לימפוציטים מסוג T של עכבר {{0}} בודדו מהטחול של עכברים זכרים או נקבות OT-I של 6-12 שבועות על ידי שימוש בערכת בידוד תאי T נאיבית CD8 (BioLegend) ותופחו ב-RPMI{{5} } מדיום בתוספת של 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 1% GlutaMAX, 1 מ"מ נתרן פירובט, 0.1M HEPES ו-50 מיקרומטר -מרקפטואתנול בנוכחות IL של עכבר -2 (20U/ml, Peprotech). עבור ניסוי עצמאי אחד במבחנה, העכברים הזכרים והנקבות (6-12 שבועות) בשימוש היו מתאימים למין. תאים מטוהרים הופעלו על ידי נוגדנים נגד עכבר CD3 (2 ug/ml, BioLegend) ואנטי עכבר CD28 (1 ug/ml, BioLegend) במשך 48 שעות. תאים חד-גרעיניים בדם היקפיים אנושיים (PBMCs) מתורמים בריאים נרכשו מ-Sailybio ותורבתו במדיום RMPI-1640 בתוספת 5% Human Serum AB (Gemini), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 1% GlutaMAX, 1 מ"מ נתרן פירובט, 0.1 M HEPES ו-50 מיקרומטר -מרקפטואתנול בנוכחות IL אנושי -2 (100 U/ml, Peprotech). נוגדנים חד שבטיים אנטי-אנושיים CD3 (1 ug/ml, BioLegend) ואנטי-אנושי CD28 (1 ug/ml, BioLegend) שימשו להפעלת PBMCs למשך 3 ימים. תאי T מטוהרים של עכברים ובני אדם הופעלו והורחבו בתנאי התרבית המצוינים: pH 7.4, pH 6.6, חומצה לקטית (Sangon) או נתרן לקטט (Sangon). המטבוליטים הבאים שימשו להשלמה של pH 6.6 או חומצת חלב (10 מ"מ): מתיונין 800 מיקרומטר (MCE), SAM 100 מיקרומטר (MCE), או SAH 100 מיקרומטר (Sigma). עבור התמרה ויראלית, 1 × 106 PBMCs הופעלו לכל באר ב24-צלחות באר. לאחר 48 שעות של הפעלה, רוב המדיום הוחלף בסופרנטנט רטרו-ויראלי לא מרוכז עם 10 ug/ml polybrene (Santa Cruz). לאחר צנטריפוגה ב-600 גרם למשך 90 דקות ב-30 מעלות, תאים תורבו באינקובטור למשך 24 שעות עם מדיום טרי. ההמרה חזרה על עצמה כעבור 24 שעות ולאחר מכן הוחזרה למדיום טרי לתרבית. קולטן לגורם גדילה עצבי בעל זיקה נמוכה (LNGFR) שימש כדי לכמת את יעילות הזיהום.
ציטומטריית זרימה
תאים נצבעו בנוגדנים ניאון ולאחר מכן נותחו על ידי ציטומטריית זרימה. עבור צביעת סמן פני השטח, התאים נצבעו בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטי ובערכת כתמי תאים מתים ניתנים לתיקון (Invitrogen) במאגר FACS (מלוח מבוצר פוספט (PBS) עם 2% FBS), ולאחר מכן קבוע עם 2% פרפורמלדהיד (Casmart) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. עבור צביעה תוך-תאית של חלבוני פוספו, תאים שנצבעו מראש נקבעו באמצעות מאגר קיבוע (BioLegend) ולאחר מכן נצבעו בנוגדנים ספציפיים לפוספו במאגר פרמיביליזציה (Invitrogen). לזיהוי של ציטוקינים תוך תאיים, תאים עוררו עם פורבול מיריסטאט אצטט (PMA) בנוכחות Brefeldin A (BFA) (BioLegend) למשך 4.5 שעות. לאחר מכן, התאים הצבועים מראש נקבעו ונצבעו בנוגדני ציטוקינים במאגר פרמיביליזציה. לצביעה תוך-תאית, התאים נצבעו מראש עם ערכת תאים מתים לתיקון חי/מת ונוגדנים מצומדים פלואורסצנטית במאגר FACS כדי לזהות סמני משטח. לאחר מכן, התאים נקבעו למשך 30 דקות על קרח באמצעות FOXP3/Transcription Factor Fixation Buffer (Invitrogen) והוצבעו בנוגדנים של פקטור שעתוק במאגר פרמיביליזציה. לאחר צביעה, התאים הושעו מחדש במאגר FACS לציטומטריית זרימה. נתוני ציטומטריית זרימה נאספו על ידי BD LSR Fortessa ו-BD FACSDiva (v8.0.2), ונותחו עם תוכנת FlowJo (v10.4). אסטרטגיות שער ייצוגיות מסופקות באיור 10ב של נתונים מורחבים.
רצף RNA
ניתוח RNA-seq בוצע באמצעות 12-תאי T מורחבים ביום שתורבתו בתנאים המצוינים כפי שמוצג באיור 1a. בקצרה, 12 ימים לאחר התרחבות תאי T, ה-RNA הכולל הוצא על ידי הומוגניזציה ב-TRIzol (Takara) והקפאה בצינורות ללא RNase עם חנקן נוזלי. שלמות ה-RNA הוערכה באמצעות ה-Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). הספריות נבנו באמצעות ערכת הכנה לדוגמה של TruSeq RNA (FC-122-1001, Illumina). לאחר מכן רצפו הספריות באמצעות פלטפורמת Illumina NovaSeq 6000 (PE150), ונוצרו כ-40 מיליון קריאות קצה מזווגות (Novogene). ספירות הקריאה הגולמיות חולצו ולאחר מכן נורמלו על ידי גורמי גודל הספרייה שלהם באמצעות DESeq2 (v1.28.1). נעשה שימוש בטרנספורמציה הלוגריתם המוסדר (r-log) כדי לייצב את השונות על פני הדגימות. ניתוח העשרה של מסלולי GO ו-KEGG של גנים המובעים בצורה דיפרנציאלית בוצע עם פרופיל אשכול (v3.16.0). מפות חום ביטוי נוצרו עם חבילת R 'pheatmap' (v1.0.12). GSEA v.4.0 שימש לניתוח GSEA.
CUT&Tag-seq
CUT&Tag-seq בוצע כפי שתואר קודם75, באמצעות ערכת Assay CUT&Tag אוניברסלי Hyperactive עבור Illumina (TD903, Vazyme). בקצרה, תאי T אנושיים הורחבו למשך 12 ימים בתנאי בקרה, חומצת חלב או חומצה לקטית עם 800 מיקרומטר מתיונין. לאחר מכן, 1 × 105 תאי T חולקו לחילוץ חומרים גרעיניים והודגרו עם חרוזי ConA בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. תאים הושעו מחדש במאגר נוגדנים של 50 μL מעורבב מראש עם נוגדן ראשוני (אנטי-H3K27me3 או אנטי-H3K4me3) והודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות. הדגימות הודגרו עם הנוגדן המשני בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ולאחר מכן הודגרו יחד עם החלבון A/G-Tn5 טרנספוסאז בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי להפריע לקיטוע ה-DNA. נעשה שימוש ב-DNA מטוהר להכנת הספרייה ורצף באמצעות PE150 על ידי רצף Illumina Nova6000.
ניתוח CUT&Tag-seq
FastQC (v{{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) שימש כדי לבדוק את איכות הקריאה ברצף. קריאות נקצצו באיכות לציון Phred מינימלי של 20 באמצעות trimmomatic (v0.39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) . כל הקריאות שהופקו על ידי CUT&Tag-seq של H3K27me3 ו-H3K4me3 היו מיושרות לגנום האנושי hg38 באמצעות Bowtie2 (v2.2.8) (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) עם אפשרויות: –local– very-sensitive-local–no-unal–no-mixed–no-discordant–phred33 -I 10 -X 700. הדגימות ללא ספייק-אין נורמלו בשיטת ChIPseqSpikeInFree, שהיא שיטת נורמליזציה חדשה לקביעה יעילה של גורמי קנה מידה עבור דגימות על פני מצבים וטיפולים שונים76. עבור H3K27me3, peaks נקראו באמצעות MACS2 (v2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_ peak_calling_macs .html) עם האפשרויות '-g hs -f BAMPE–keep-dup all– broad–broad-cutoff 0.1'. עבור H3K4me3, קריאת שיא השתמשה ב-MACS2 עם הפרמטרים '-g hs -q 0.01 -f BAMPE–keep-dup all'. פסגות צוינו ב-ChIPseeker (v1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ ChIPseeker/), והדמיות נוצרו באמצעות deepTools (v3.5.1) (https://deeptools.readthedocs.io/en /develop/) ו-pyGenomeTracks (v3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).
qRT–PCR
RNA כולל בודד עם TRIzol (Takara) ותעתיק לאחור ל-cDNA עם HiScript Reverse Transcriptase (Vazyme), בהתאם להוראות היצרן. עבור PCR כמותי בזמן אמת, נעשה שימוש במערכת ABI prism 7500 בזמן אמת PCR (Thermo Fisher) ו-2×SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake) בהתאם להוראות היצרן. ACTB שימש כתקן פנימי. הביטוי היחסי של mRNA חושב באמצעות שיטת 2−ΔΔCT. ניתן למצוא רצפי פריימר המשמשים עבור qPCR בטבלה משלימה 1.
סופג מערבי
לניתוח ביטוי חלבון, תאים נאספו ונשטפו עם PBS קר, והחלבון הכולל הוצא באמצעות 1% SDS (Sangon) על קרח. ריכוז החלבון נמדד על ידי ערכת בדיקת חלבון BCA (Merck). דגימות חלבון הופרדו על ידי ג'לים SDS-PAGE ולאחר מכן הועברו לממברנות PVDF (Millipore). ממברנות נחסמו עם חלב 5% ללא שומן ב-PBS המכיל Tween20. לאחר החסימה, ממברנות הודגרו עם נוגדנים ראשוניים למשך הלילה ב-4 מעלות ונוגדנים משניים מצמודים ל-HRP למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. אות HRP פותח על ידי electrochemiluminescence (ChemeMINI610) ונאסף על ידי Sage Capture (v2.19.12). ניתוח הנתונים בוצע באמצעות תוכנת ImageJ (v1.8.0).
ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלי
בכל באר של צלחות באר {{0}}, PBMCs הופעלו על ידי נוגדנים אנושיים אנטי-CD3 ואנטי-CD28 במשך 3 ימים ותופחו במדיום RPMI-1640 בתנאים שונים במשך 12 ימים. לאחר מכן, נאספו 1 × 106 PBMCs וקובעו במאגר קיבוע מקורר מראש (2.5% גלוטאראלדהיד, חיץ פוספט 0.1 M (PB), pH 7.4) למשך הלילה ב-4 מעלות. לאחר שטיפה עם PBS שלוש פעמים, התאים קובעו לאחר מכן ב-1% אוסמיום טטרוקסיד ב-PBS למשך 2 שעות, התייבשו והוטמעו בשרף של Spurr, לפי הנוהל הסטנדרטי. קטעים דקים במיוחד נצבעו באורניל אצטט ובציטראט עופרת. מורפולוגיה מיטוכונדריאלית צולמה באמצעות Hitachi HT-7800 מיקרוסקופ אלקטרונים העברה (TEM) (v01.20) ומצלמת AMT-XR81DIR.
נוגדנים וריאגנטים
נוגדנים ששימשו לניתוח ציטומטרי זרימה היו כדלקמן. APC אנטי-אנושי NGFR (קטגוריה מס' 345108, 1:1,000 עבור FACS), FITC אנטי-אנושי CD4 (קטגוריה מס' 357406, 1:200 עבור FACS), Pacific Blue אנטי-אנושי CD8 (מספר קטגוריה 300928, 1:200 עבור FACS), APC-Cy7 אנטי-אנושי/עכבר CD44 (מספר קטגוריה 103028, 1:200 עבור FACS), PE אנטי-אנושי CCR7 (מספר קטגוריה 353204, 1 :200 עבור FACS), PE אנטי-אנושי TNF- (מספר קטגוריה 502909, 1:200 עבור FACS), PE-Cy7 אנטי אנושי CD45RO (מספר קטגוריה 304230, 1:200 עבור FACS), APC אנטי- IFN- אנושי (מספר קטגוריה 502512, 1:200 עבור FACS), PE-Cy7 אנטי-אנושי LAG-3 (מספר קטגוריה 369310, 1:200 עבור FACS), PE אנטי-אנושי TIM{{ 52}} (מספר קטגוריה 345006, 1:200 עבור FACS), BV711 אנטי אנושי PD -1 (מספר קטגוריה 329928, 1:200 עבור FACS), Percp-Cy5.5 אנטי אנושי CD62L (מספר קטגוריה 304824, 1:200 עבור FACS), APC אנטי-אנושי CD27 (מספר קטגוריה 302810, 1:200 עבור FACS), BV711 אנטי עכבר CD8 (מספר קטגוריה 100748, 1:200 עבור FACS ), PE-Cy7 אנטי עכבר CD62L (מספר קטגוריה 104418, 1:200 עבור FACS), APC-Cy7 אנטי עכבר CD45.2 (מספר קטגוריה 830789, 1:200 עבור FACS), Pacific Blue אנטי- עכבר CD45.1 (מספר קטגוריה 110722, 1:200 עבור FACS), APC נגד עכבר Ly108 (קט. לא. 134610, 1:200 עבור FACS), PE anti-mouse LAG-3 (מספר קטגוריה 125207, 1:200 עבור FACS), Alexa Fluor 488 anti-c-MYC Antibody (קטגוריה מס' 626811, 1 :200 עבור FACS), PE נגד עכבר TNF- (מספר קטגוריה 506306, 1:200 עבור FACS), ו-APC אנטי עכבר IFN- (מספר קטגוריה מס' 505810, 1:200 עבור FACS) נרכשו מ-BioLegend . ערכת תאים מתים לתיקון חי/מת, PerCP-eFluor710 PD נגד עכבר-1 (מספר קטגוריה 46-9981-82, 1:200 עבור FACS), PE phosphor-S6 (Ser235/236) (חתול . מס' 12-9007-42, 1:200 עבור FACS), PE נגד אדם/עכבר TOX (מספר קטגוריה 12-6502-82, 1:200 עבור FACS), ו-PE-Cy7 נגד TIM נגד עכבר{ {149}} (מספר קטגוריה 25-5870-82, 1:200 עבור FACS) נרכשו מ-Thermo Fisher. Alexa Fluor 647 anti-TCF1 (קטגוריה מס' 6709, 1:200 עבור FACS) וזרחן-4E-BP1 (Thr37/46) (קטגוריה מס' 2846, 1:200 עבור FACS) נרכשו מ- טכנולוגיית איתות תאים. Alexa Fluor 647 anti-puromycin (מספר קטגוריה MABE343-AF647, 1:800 עבור FACS) נרכש מ- Merck. נוגדנים ששימשו ל-Western blots היו כדלקמן. ארנב אנטי-פוספו-אקט (Ser473) (קט. מס' 4060, 1:1,000 עבור IB), אנטי-פוספו-NF-κB p65 (Ser536) (קטגוריה מס' 3033, 1:1 ,000 עבור IB), anti-c-MYC (קטגוריה מס' 18583, 1:1,000 עבור IB), anti-EZH2 (קטגוריה מס' 5246, 1:1,{ {200}} עבור IB), אנטי-טרי-מתיל-היסטון H3 (Lys27) (מספר קטגוריה 9733, 1:1,000 עבור IB), אנטי-טרי-מתיל-היסטון H3 (Lys4) (מספר קטגוריה 9751, 1:1,000 עבור IB), אנטי-די-מתיל-היסטון H3 (Lys9) (מספר קטגוריה 4658, 1:1,000 עבור IB) , אנטי-די-מתיל-היסטון H3 (Lys79) (מספר קטגוריה 5427, 1:1,000 עבור IB), אנטי-היסטון H3 (מספר קטגוריה 9715, 1:1,{{242 }} עבור IB), אנטי-COXIV (קטגוריה מס' 850, 1:1,000 עבור IB), אנטי-ארנבת IgG (מקושרת ל-HRP) (קטגוריה מס' 7074, 1:2,{ {253}} עבור IB), ו-IgG אנטי-עכבר (מקושר HRP) (מספר קטגוריה 7076, 1:2,000 עבור IB) נרכשו מ- Cell Signaling Technology. עכבר anti-Tim23 (מספר קטגוריה 611223, 1:1,000 עבור IB) היה מ-BD Biosciences. עכבר אנטי- -אקטין (מספר קטגוריה 66009-1-Ig, 1:5,000 עבור IB), אנטי-SLC7A5 (מספר קטגוריה 67951-1-Ig, 1: 1,000 עבור IB), וארנב anti-SLC38A1 (מספר קטגוריה 12039-1-AP, 1:1,000 עבור IB) היו מ-Proteintech. ארנב אנטי-SLC38A2 (מספר קטגוריה BMP081, 1:1,000 עבור IB) נרכש ממעבדות רפואיות וביולוגיות.
בדיקה מטבולית של תאי T
כדי לבדוק את ספיגת BODIPY FL C16 בתאי T שטופלו בשליטה או ↑[H+ ], תאי T הומסו עם 1 מיקרומטר BODIPY FL C16 (Invitrogen) מומס טרי למשך שעה, ולאחר מכן נשטפו פעמיים עם PBS לפני צביעת פני השטח. כדי להמשיך ולחקור את התלות המטבולית בקבוצות טיפול שונות, בוצעו ניסויים בשיטת SCENITH (מטבוליזם אנרגטי של תא יחיד על ידי עיכוב תרגום)42. בקצרה, תאי T נזרעו ב96-צלחות באר ב-1 × 106 תאים/מ"ל. לאחר מכן טופלו התאים עם בקרה (Ctrl), 2-deoxy-d-glucose (ריכוז סופי 100 mM), אוליגומיצין (ריכוז סופי 5 מיקרומטר), או תערובת של המעכבים בריכוזים הסופיים למשך 40 דקות ב-37 תואר . Puromycin (ריכוז סופי 10 ug/ml) הוסף במהלך 30 הדקות האחרונות. לאחר טיפול בפורומיצין, התאים נשטפו ב-PBS קר ונצבעו מראש עם ערכת תאים מתים לתיקון חיים/מתים ונוגדנים נגד סמני משטח. צביעה של פורומיצין תוך תאי מלווה בתהליך הצביעה של גורמי שעתוק תוך תאי.
ניתוח מטבולומי עם LC-MS/MS
ניתוח מטבולומי ואיסוף דגימות בוצעו כמו בדוחות קודמים77. בקצרה, PBMCs הופעלו בנפרד ב24-צלחות באר על ידי אנטי-CD3/CD28 אנושי למשך 3 ימים ותופחו במדיום RPMI 1640 עם בקרה או חומצת חלב עד יום 12. לאחר מכן, 8 × 106 תאים לדגימה (n=4 דגימות עצמאיות לקבוצה) נאספו והועברו לצינור של 1.5-ml לצנטריפוגה ב-300 גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות ולאחר מכן נשטף עם PBS קר. לאחר צנטריפוגה ב-300 גרם למשך 5 דקות שוב, נוספו 80% מתנול קר ומערבלים במרץ כדי לשבש לחלוטין את גלולת התא, ולאחר מכן התאים הועברו למקפיא ב-80 מעלות. דגימות עברו צנטריפוגה ב-12,000 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות. הסופרנטנט נאסף. לבסוף, התמציות עברו ליאופיל ונותחו על ידי UHPLC-MS/MS ב-Novogene. קבצי הנתונים הגולמיים שנוצרו על ידי UHPLC–MS/MS עובדו באמצעות ה-Compound Discoverer (v3.1, Thermo Fisher) כדי לבצע יישור שיא, איסוף שיא וכימות עבור כל מטבוליט. תוכנת Metaboanalyst (v5.0) שימשה לניתוח נתונים נוסף, ולאחר מכן נבחרו מסלולים מועשרים באופן משמעותי באמצעות P < 0.05.
ניסויי תיוג יציב-איזוטופים
השטף המטבולי של 13C בוצע על תאי T באמצעות שיטות שתוארו קודם לכן60,78,79. בקצרה, PBMCs הופעלו לכל באר בצלחות 24-בארים עם אנטי-CD3/CD28 אנושי למשך 3 ימים, כמתואר לעיל. עבור [13C6] מעקב אחר גלוקוז, המדיום הוחלף לאחר 11 ימים ל-RPMI נטול גלוקוז (Gibco) בתוספת של 10% FBS בדיאליזה (Thermo Fisher Scientific), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 50 מיקרומטר. -מרקפטו-אתנול ו-0.1 M HEPES, המכילים 11 מ"מ [13C6] גלוקוז (מעבדות איזוטופ בברידג') עם בקרה או 10 מ"מ חומצה לקטית, למשך 24 שעות. למעקב אחר [13C16] פלמיטאט, 2 × 107 תאי T הופעלו והונחו במדיום שלם עם תנאי ביקורת או 10 מ"מ חומצת חלב כמתואר לעיל ביום 12, המכיל 200 מיקרומטר [13C16] פלמיטאט (מעבדות איזוטופ של Cambridge), למשך 8 ח. למעקב אחר מתיונין [13C5], תאי T הורחבו בשליטה, חומצת חלב או חומצה לקטית עם 800 מיקרומטר מתיונין למשך 12 ימים. לאחר מכן, 4 × 107 תאי T הוחלפו למדיום RPMI מלא ללא מתיונין (Gibco) ותופחו בתנאי בקרה, חומצת חלב או חומצה לקטית בתוספת מתיונין (המכילה 100 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, או 800 מיקרומטר [13C5] מתיונין) (מעבדות איזוטופים ב-Cambridge), למשך 8 שעות. הסופרנטנטים בהתאמה נאספו ולאחר מכן אוחסנו ב-80 מעלות. תאים נגררו על ידי צנטריפוגה (300 גרם, 4 מעלות, 5 דקות), נשטפו פעמיים עם מי מלח, והוקפאו מיד בחנקן נוזלי ואוחסנו ב-80 מעלות. המטבוליטים חולצו על ידי שימוש ב-HPLC בדרגה 80% מתנול קר כקרח וסוחררו לזמן קצר, ולאחר מכן הוספה של 200 מ"ל מים בדרגת HPLC, ולאחר מכן 500 מ"ל כלורופורם בדרגת HPLC (יחס מתנול: מים: כלורופורם, 5:2:5 ). התערובת עברה מערבולת וצנטריפוגה כדי להשיג הפרדת פאזות. הסופרנטנטים יובשו על ידי ספין ואקום להפקה לאחר מכן, ולאחר מכן הודגרו עם 2% (משקל/נפח) מתוקסמין הידרוכלוריד (226904, Sigma-Aldrich) בפירידין למשך 60 דקות ב-37 מעלות, והודגרו על ידי N-methyl-N-( tert-butyldimethylsilyl) trifluoroacetamide עם 1% tert-butyldimethylchlorosilane (TBDMS, 18162-48-6, Regis Technologies) למשך 30 דקות ב-45 מעלות. נגזרות הגלוקוז [13C6] נותחו על ידי GC-HRMS, כרומטוגרף הגז Trace 1310 (Thermo Fisher) עם העמודה DB–35MS (Agilent Technologies), ומערכת Q Exactive GC Orbitrap GC–MS/MS (Thermo Fisher). מבחני מטבולומי GC–MS/MS נערכו על ידי Metabo-Profile. המטבוליטים זוהו וכומתו על ידי Xcalibur (v4.1) ו-TraceFinder (v5.1) (Thermo Fisher), כולל זמן שמירה, יחס מטען למסה של שברי יונים ועוצמת שיא. נגזרות [13C16]palmitate ו-[13C5]מתיונין נותחו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה - ספקטרומטר מסה משולש קוואדרופול (UPLC-TQMS). הנתונים הגולמיים מ-UPLC-TQMS נותחו באמצעות תוכנת MassLynx של Waters (v4.1, Waters) לצורך מיצוי שיא, אינטגרציה, זיהוי וכימות של המטבוליטים. שפת R (v4.1.1) שימשה לניתוח סטטיסטי לאחר מכן.
מודל גידול B16 ואימונותרפיה של העברת תאים מאמצת
כדי לחקור את הפעילות האנטי-גידולית של תאי T in vivo, 0.2 × 106 B16-תאי מלנומה OVA הוזרקו תת עורית לעכברי נקבות C57BL/6N. תשעה ימים לאחר השתלת הגידול, לעכברים הוזרקו לווריד 5 × 106 תאי T מעכברי OT-I נקבות שהורחבו למשך 7 ימים בתנאים שונים. עכברים נושאי גידול קיבלו 5 Gy של הקרנה תת קטלנית לפני ACT. אזור הגידול נמדד כל יומיים וחושב כאורך (מ"מ) × רוחב (מ"מ). עכברים עם אזור גידול שמתקרב ל-300 מ"מ הורדו. כדי לחקור את ההתמדה של תאי T מורחבים בתנאים שונים, 4 × 106 CD45.1+ תאי T מעכברי OT-I נקבות הועברו באופן אימוץ לעכברי C57BL/6N נקבות. שבוע לאחר מכן, עכברים הורדמו והתאים מדם מבודדים, טחול ובלוטות לימפה נספרו. השיעור של תאי T שהועברו נקבע על ידי העברת תאי T המבטאים CD45.1+ ו-CD45.2+ באמצעות ציטומטריית זרימה.
מודל עכברי NCG וטיפול ב-CD19-CAR-T
עכברי NCG נקבות הושתלו תת עורית בתאי K562 בגודל 1 × 106 CD19-. כאשר נפחי הגידול הגיעו ל-75 מ"מ, עכברים קיבלו 5 × 106 תאי T שאינם עברו התמרה ותאי CD19-CAR T בתרבית בשליטה או מדיום המכיל חומצת חלב של 10 מ"מ. צמיחת הגידול נמדדה כל יומיים עם קליפרים אלקטרוניים וחושב לפי אורך (מ"מ) × רוחב (מ"מ). עכברים עם שטח גידול גדול מ-300 מ"מ הורדו. הגידולים נאספו, עוכלו ועובדו עם Percoll (Sigma), ולאחר מכן נקבעו תפקוד תאי ה-T והפנוטיפ על ידי ציטומטריית זרימה.
קצב צריכת חמצן בסיסי וניתוח קצב החמצה חוץ-תאי
לצורך ניתוח של מאפיינים מטבוליים, ה-OCR וה-ECAR הוערכו על ידי מנתח XF24 של סוסון ים (Agilent). בקצרה, תאי T אנושיים שהתרביתו בתנאים שונים במשך 12 ימים טופלו מראש במדיום XF לא מבוצר (RPMI 1640 ללא חציצה המכיל 10 mM גלוקוז 1 mM נתרן פירובט ו-2 mM גלוטמין) . לאחר מכן, זרעו תאי T אנושיים ב-0.5 × 106 תאים לבאר במיקרו-לוחית של תרבית תאים XF24 והודגרו באינקובטור ללא CO2 למשך שעה אחת ב-37 מעלות. כדי לשפר את היצמדות התא, הצלחות סובבו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ב-100 גרם עם אפס בלם. צריכת חמצן והחמצה חוץ-תאית נותחו בתנאים בסיסיים ובתגובה ל-1.25 מיקרומטר אוליגומיצין, 50 מ"מ 2-דאוקסי-ד-גלוקוז, 1.5 מיקרומטר FCCP, 0.5 מיקרומטר רוטנון ו-0.5 מיקרומטר אנטי-מיצין A. חישוב SRC. ה-OCR הבסיסי מה-OCR המקסימלי.
ChIP–qPCR
חיסון כרומטין (ChIP) בוצע בהתאם להוראות היצרן שסופקו עם ערכת הגזירה האנזימטית של ChIP-IT express (Active Motif). בקצרה, 15 מיליון תאי T אנושיים שהתרביתו בתנאים של בקרה או 10 מ"מ חומצת חלב נקבעו עם פורמלדהיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ותגובת הקיבוע הופסקה על ידי הוספת 1× גליצין. תאים קבועים נגרמו עם PMSF וקוקטייל עיכוב חלבון ואוחסנו ב-80 מעלות לפני התמוגגות התא. לאחר מכן, הגלולה המופשרת הושעתה מחדש במאגר תמוגה קר כקרח של 1 מ"ל עם PMSF וקוקטייל עיכוב חלבון על קרח למשך 30 דקות כדי להשיג חומר גרעיני. לאחר מכן, הגלולה הגרעינית הושעתה מחדש ועוכלה בקוקטייל אנזימטי לגזירת כרומטין למשך 15 דקות ב-37 מעלות. כרומטין גזוז הודגר עם חרוזים מגנטיים של חלבון G עם אנטי-c-MYC (CST, מס' קטגוריה 18583, 1:100 ל-ChIP) ואנטי-IgG (CST, מס' 2729, 1:100 ל-ChIP) בשעה 4 מעלות בלילה. לאחר מכן, חרוזים מגנטיים נשטפו עם מאגרי צ'יפ ארבע פעמים ונפלטו עם חיץ elution 50 ul. ה-DNA שנפלט עבר קישור הפוך למשך 2.5 שעות ב-65 מעלות ולאחר מכן טוהר על ידי מיצוי פנול-כלורופורם. ה-DNA המטוהר שימש לביצוע ChIP-qPCR כדי לזהות את העשרה של MYC במקדמי גנים של מטרה. ניתן למצוא את הפריימרים המשמשים ל-ChIP–qPCR בטבלה משלימה 2.
ניתוח המסה והפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה
מסת המיטוכונדריה ופוטנציאל הממברנה נותחו באמצעות MitoTracker Green ו-tetramethyrhodamine methyl ester (TMRM). תאים נצבעו ב-250 nM MitoTracker Green (Thermo Fisher) או 50 nM TMRM (Thermo Fisher) באינקובטור ב-37 מעלות (5% CO2) למשך שעה אחת לפני צביעה של פני התא. תאים נשטפו עם חיץ FACS שלוש פעמים, ואחריו צובעים סמני משטח לניתוח FACS נוסף.
ניתוח סטטיסטי
ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות GraphPad Prism גרסה 8.0. התוצאות מוצגות כממוצע ± sem מבחן t Student's Two-tailed שימש להשוואת טיפולים עם קבוצות ביקורת. ANOVA דו-כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של Tukey של Sidak או של Dunnett הוחל להשוואות מרובות. P < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.
הפניות
1. Gattinoni, L., Speiser, DE, Lichterfeld, M. & Bonini, C. T זיכרון תאי גזע בבריאות ומחלות. נאט. Med. 23, 18–27 (2017).
2. Gao, S. et al. תאי זיכרון T דמויי תאי גזע: פרספקטיבה מהצד האפל. Cell Immunol. 361, 104273 (2021).
3. Rosenberg, SA & Restifo, NP העברת תאים מאמצת כאימונותרפיה מותאמת אישית לסרטן אנושי. מדע 348, 62–68 (2015).
4. Ribas, A. & Wolchok, JD אימונותרפיה נגד סרטן באמצעות חסימת מחסום. מדע 359, 1350–1355 (2018).
5. Lugli, E., Galletti, G., Boi, SK & Youngblood, BA מצבי גזע, אפקטור ומצבים היברידיים של תאי T זיכרון CD8+. טרנדים Immunol. 41, 17–28 (2020).
6. Galletti, G. et al. שתי תת-קבוצות של אבות תאי T דמויי גזע של CD8+ עם התחייבויות גורליות ברורות בבני אדם. נאט. אימונול. 21, 1552–1562 (2020).
7. Gattinoni, L. et al. תת-קבוצה של תא T זיכרון אנושי עם תכונות דמויות תאי גזע. נאט. Med. 17, 1290–1297 (2011).
8. Franco, F., Jaccard, A., Romero, P., Yu, YR & Ho, PC ויסות מטבולי ואפיגנטי של תשישות תאי T. נאט. Metab. 2, 1001–1012 (2020).
9. Kaech, SM & Cui, W. בקרת תעתיק של אפקטור וזיכרון CD8+ התמיינות תאי T. נאט. כומר אימונול. 12, 749–761 (2012).
10. Huang, Q. et al. ההתמיינות הראשונית של תאי T זיכרון CD8+ ספציפיים לגידול כמגיבים בתום לב לחסימת PD-1/PD-L1 בבלוטות לימפה מתנקזות. תא 185, 4049–4066 (2022).
11. Siddiqui, I. et al. תאי Tcf1+ PD-1+ CD8+ תוך-גידוליים בעלי מאפיינים דמויי גזע מקדמים שליטה בגידול בתגובה לחיסון ולטיפול אימונותרפי עם חסימת נקודות ביקורת. חסינות 50, 195–211 (2019).
12. ז'נט, ג' ואח'. תפקיד חיוני של ה-Wnt pathway effector Tcf-1 לביסוס זיכרון תאי T CD8 פונקציונלי. פרוק. Natl Acad. Sci. ארה"ב 107, 9777–9782 (2010).
13. Henning, AN, Roychoudhuri, R. & Restifo, NP בקרה אפיגנטית של התמיינות תאי T CD8+. נאט. כומר אימונול. 18, 340–356 (2018).
14. Crompton, JG et al. קשר השושלת של תת-קבוצות תאי T CD8+ מתגלה על ידי שינויים מתקדמים בנוף האפיגנטי. Cell Mol. אימונול. 13, 502–513 (2016).
15. Yu, B. et al. נופים אפיגנטיים חושפים גורמי שעתוק המווסתים את ההתמיינות של תאי T CD8+. נאט. אימונול. 18, 573–582 (2017).
16. עראקי, י' ועוד. ניתוח רחב של הגנום של מתילציה של היסטון מגלה ויסות מבוסס מצב כרומטין של שעתוק גנים ותפקוד של תאי T זיכרון CD8+. חסינות 30, 912–925 (2009).
17. Moller, SH, Hsueh, PC, Yu, YR, Zhang, L. & Ho, PC תוכניות מטבוליות מתאימות חסינות של תאי T בזיהום ויראלי, סרטן והזדקנות. Cell Metab. 34, 378–395 (2022).
18. Phan, AT et al. מטבוליזם גליקוליטי מכונן תומך בהתמיינות זיכרון אפקטור של תאי T CD8+ במהלך זיהום ויראלי. חסינות 45, 1024–1037 (2016).
19. Sinclair, LV et al. בקרת קולטן אנטיגן של מטבוליזם מתיונין בתאי T. eLife 8, e44210 (2019).
20. O'Sullivan, D. et al. תאי T של תקליטור זיכרון8+ משתמשים בליפוליזה מהותית בתא כדי לתמוך בתכנות המטבולי הדרוש להתפתחות. חסינות 41, 75–88 (2014).
21. Pearce, EL et al. שיפור זיכרון תאי T CD8 על ידי אפנון חילוף החומרים של חומצות שומן. טבע 460, 103–107 (2009).
22. Van der Windt, GJ et al. קיבולת הנשימה המיטוכונדריאלית היא מווסת קריטית של פיתוח זיכרון תאי T של תאי CD8+. חסינות 36, 68–78 (2012). 23. Boedtkjer, E. & Pedersen, SF המיקרו-סביבה של הגידול החומצי כמניע של סרטן. אננו. כומר פיזיול. 82, 103–126 (2020). 24. Thommen, DS & Schumacher, TN תאי T תפקוד לקוי בסרטן. תא סרטן 33, 547–562 (2018).
25. Scharping, NE et al. המיקרו-סביבה של הגידול מדכאת ביוגנזה מיטוכונדריאלית של תאי T כדי להניע אי ספיקה מטבולית תוך-גידולית של תאי T וחוסר תפקוד. חסינות 45, 374–388 (2016).
26. Yu, YR et al. דינמיקה מיטוכונדריאלית מופרעת ב-CD8+ TIL מחזקים את תשישות תאי T. נאט. אימונול. 21, 1540–1551 (2020).
27. Chang, CH et al. תחרות מטבולית במיקרו-סביבה של הגידול היא מניע להתקדמות הסרטן. תא 162, 1229–1241 (2015).
28. Scharping, NE et al. מתח מיטוכונדריאלי המושרה על ידי גירוי מתמשך תחת היפוקסיה מניע במהירות את תשישות תאי T. נאט. אימונול. 22, 205–215 (2021).
29. Jansen, CS et al. נישה תוך-גידולית שומרת ומבדילה תאי CD8 T דמויי גזע. טבע 576, 465–470 (2019).
30. Im, SJ et al. הגדרת תאי CD8+ T המספקים את פרץ ההתרבות לאחר טיפול ב-PD-1. טבע 537, 417–421 (2016).
31. Haas, R. et al. לקטט מווסת מעגלים מטבוליים ופרו-דלקתיים בשליטה על נדידת תאי T ותפקודי אפקטור. PLoS Biol. 13, e1002202 (2015).
32. Wu, H. et al. תאי T מייצרים נישות חומציות בבלוטות הלימפה כדי לדכא את פונקציות האפקטור שלהם. נאט. Commun. 11, 4113 (2020).
33. Calcinotto, A. et al. מודולציה של חומציות מיקרו-סביבה הופכת אנרגיה בלימפוציטים T החודרים לגידולים אנושיים ועכברים. Cancer Res. 72, 2746–2756 (2012). 34. גוטפריד, ע' ואח'. חומצת חלב שמקורה בגידול מווסתת הפעלת תאים דנדריטים וביטוי אנטיגן. דם 107, 2013–2021 (2006).
35. Colegio, OR et al. קיטוב פונקציונלי של מקרופאגים הקשורים לגידול על ידי חומצת חלב שמקורה בגידול. טבע 513, 559–563 (2014).
36. Erra Diaz, F. et al. חמצת חוץ-תאית ועיכוב mTOR מניעים את ההתמיינות של תאים דנדריטים ממקור מונוציטים אנושיים. Cell Rep. 31, 107613 (2020).
37. Sukumar, M. et al. עיכוב חילוף החומרים הגליקוליטי משפר את הזיכרון של תאי ה-CD8+ ואת התפקוד האנטי-גידולי. ג'יי קלין. להשקיע. 123, 4479–4488 (2013).
38. Scholz, G. et al. אפנון של איתות mTOR מעורר היווצרות של תאי זיכרון T דמויי תאי גזע. EBioMedicine 4, 50–61 (2016).
39. Pollizi, KN et al. mTORC1 ו-mTORC2 מווסתים באופן סלקטיבי את התמיינות תאי T של CD8+. ג'יי קלין. להשקיע. 125, 2090–2108 (2015).
40. Zhang, L. et al. מטרת יונקים של קומפלקס rapamycin 2 שולטת בהתמיינות זיכרון תאי CD8 T באופן תלוי Foxo. נציג תא 14, 1206–1217 (2016).
41. Zhou, H. & Huang, S. תפקיד של איתות mTOR בתנועתיות תאי גידול, פלישה וגרורות. Curr. חלבון Pept. Sci. 12, 30–42 (2011).
42. Arguello, RJ et al. SCENITH: שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה לפרופיל פונקציונלי של חילוף החומרים באנרגיה ברזולוציה של תא בודד. Cell Metab. 32, 1063–1075 (2020).
43. רון-הראל, נ' ואח'. ביוגנזה מיטוכונדריה ועיצוב מחדש של פרוטאום מקדמים חילוף חומרים של פחמן אחד להפעלת תאי T. Cell Metab. 24, 104–117 (2016).
44. Han, C., Ge, M., Ho, PC & Zhang, L. Fueling antitumor-תאי T-חסינות: מטבוליזם של חומצות אמינו נבדק מחדש. סרטן אימונול. מילון 9, 1373–1382 (2021).
45. Kakaradov, B. et al. ויסות שעתוק ואפיגנטי מוקדם של התמיינות תאי T CD8+ נחשף על ידי רצף RNA חד-תא. נאט. אימונול. 18, 422–432 (2017).
46. Wang, W. & Zou, W. חומצות אמינו והטרנספורטרים שלהן בחסינות תאי T ובטיפול בסרטן. מול. תא 80, 384–395 (2020).
47. Marchingo, JM, Sinclair, LV, Howden, AJ & Cantrell, DA ניתוח כמותי של האופן שבו Myc שולט על פרוטאומים של תאי T ומסלולים מטבוליים במהלך הפעלת תאי T. eLife 9, e53725 (2020).
48. Sukumar, M. et al. פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי מזהה תאים בעלי גזע משופר עבור טיפול תאי. Cell Metab. 23, 63–76 (2016).
49. Alizadeh, D. et al. IL15 משפר את הפעילות האנטי-גידולית של תאי CAR-T על ידי הפחתת פעילות mTORC1 ושימור פנוטיפ הזיכרון של תאי הגזע שלהם. סרטן אימונול. מילון 7, 759–772 (2019).
50. Buck, MD et al. הדינמיקה המיטוכונדריאלית שולטת בגורל תאי T באמצעות תכנות מטבולי. תא 166, 63–76 (2016).
51. Krishna, S. et al. תאי T CD8 דמויי גזע מתווכים את התגובה של אימונותרפיה של תאים מאמצים נגד סרטן אנושי. מדע 370, 1328–1334 (2020).
52. Burger, ML et al. היררכיות דומיננטיות של אנטיגן מעצבות פנוטיפים של תאי TCF1+ של אבות CD8 בגידולים. תא 184, 4996–5014 (2021).
53. Guo, Y. et al. תכנות מחדש מטבולי של תאי CD8+ מותשים באופן סופני על ידי IL-10 משפר חסינות נגד גידולים. נאט. אימונול. 22, 746–756 (2021).
54. Klein Geltink, RI et al. התניה מטבולית של תאי CD8+ אפקטור T לטיפול בתאים מאמצים. נאט. Metab. 2, 703–716 (2020).
55. Suzuki, J., Nabe, S., Yasukawa, M. & Yamashita, M. Glutamine מווסת את הפעילות האנטי-גידולית של תאי T CD8. Gan To Kagaku Ryoho 47, 11–15 (2020).
56. Vodnala, SK et al. גזע וחוסר תפקוד של תאי T בגידולים מופעלים על ידי מנגנון נפוץ. Science 363, eaau0135 (2019).
57. Bosticardo, M. et al. הפעלה מוטה של לימפוציטים T אנושיים עקב pH חוץ-תאי נמוך מנוגדת על ידי קוסטימולציה של B7/CD28. יורו J. Immunol. 31, 2829–2838 (2001).
58. Pucino, V. et al. הצטברות לקטט באתר של דלקת כרונית מעודדת מחלה על ידי גרימת חיווט מטבולי מחדש של תאי T CD4+. Cell Metab. 30, 1055–1074 (2019).
59. Feng, Q. et al. לקטט מגביר את הגזע של תאי CD8+ T כדי להגביר את החסינות נגד גידולים. נאט. Commun. 13, 4981 (2022).
60. Roy, DG et al. חילוף החומרים של מתיונין מעצב את התגובות של תאי עוזר T באמצעות ויסות של תכנות מחדש אפיגנטי. Cell Metab. 31, 250–266 (2020).
61. Zhang, L. & Romero, P. בקרה מטבולית על החלטות גורל של תאי T CD8+ וחסינות נגד גידולים. טרנדים מול. Med. 24, 30–48 (2018).
62. Cham, CM, Driessens, G., O'Keefe, JP & Gajewski, TF מניעת גלוקוז מעכבת אירועי מפתח מרובים של ביטוי גנים ותפקודי אפקטור בתאי CD8+ T. יורו J. Immunol.38, 2438–2450 (2008).
63. O'Sullivan, D. et al. תאי T של תקליטור זיכרון8+ משתמשים בליפוליזה מהותית בתא כדי לתמוך בתכנות המטבולי הדרוש להתפתחות. חסינות 49, 375–376 (2018).
64. Lin, R. et al. חמצון חומצות שומן שולט בהישרדות תאי זיכרון של תאי זיכרון CD8+ באדנוקרצינומה בקיבה. סרטן אימונול. שו' 8, 479–492 (2020).
65. Raud, B. et al. פעולות Etomoxir על תאי T מווסתים וזיכרון אינן תלויות בחמצון חומצת שומן בתיווך Cpt1a. Cell Metab. 28, 504–515 (2018).
66. Sharma, U. & Rando, OJ תשומות מטבוליות לאפיגנום. Cell Metab. 25, 544–558 (2017).
67. Tyrakis, PA et al. S-2-hydroxyglutarate מווסת את גורל CD8+ לימפוציטים T. טבע 540, 236–241 (2016).
68. Zhang, H. et al. בטא-הידרוקסי-בוטיראט שנוצר על ידי קטוגנזה הוא מווסת אפיגנטי של פיתוח זיכרון תאי T של CD8+. נאט. Cell Biol. 22, 18–25 (2020).
69. ביאן, י. ואח'. סרטן SLC43A2 משנה את חילוף החומרים של מתיונין של תאי T ומתילציה של היסטון. טבע 585, 277–282 (2020).
70. וול, מ' ואח'. בקרה תרגום של c-MYC על ידי rapamycin מקדמת התמיינות מיאלואידית סופנית. דם 112, 2305–2317 (2008).
71. Yerinde, C., Siegmund, B., Glauben, R. & Weidinger, C. Control Metabolic of epigenetics ותפקידה בהתמיינות ותפקוד תאי T CD8+. חֲזִית. אימונול. 10, 2718 (2019).
72. אייל, ר' ואח'. דיכוי חיסוני יוני בתוך המיקרו-סביבה של הגידול מגביל את תפקוד האפקטור של תאי T. טבע 537, 539–543 (2016).
73. Guo, A. et al. רכיבים מורכבים של cBAF ו-MYC משתפים פעולה בשלב מוקדם בגורל תאי T CD8+. טבע 607, 135–141 (2022).
74. Raynor, JL, Chapman, NM & Chi, H. בקרה מטבולית של יצירת תאי T זיכרון וגזע. קר אביב הארב. פרספקטיבה. ביול. 13, a037770 (2021).
75. קאיה-אוקור, HS et al. CUT&Tag לפרופיל אפיגנומי יעיל של דגימות קטנות ותאים בודדים. נאט. Commun. 10, 1930 (2019).
76. Jin, H. et al. ChIPseqSpikeInFree: גישת נורמליזציה של ChIP-seq לחשיפת שינויים גלובליים בשינויי היסטון ללא ספייק-אין. ביואינפורמטיקה 36, 1270–1272 (2020).
77. Sellick, CA, Hansen, R., Stephens, GM, Goodacre, R. & Dickson, AJ מיצוי מטבוליטים מתאי יונקים מתורבת השעיה לפרופיל מטבוליטים גלובלי. נאט. פרוטוק. 6, 1241–1249 (2011).
78. Li, C. et al. קטבוליזם של חומצות אמינו מווסת פרוטאוסטזיס של תאי גזע המטופואטיים באמצעות ציר GCN2-eIF2. תא גזע 29, 1119–1134 (2022).
79. Wenes, M. et al. נשא הפירובט המיטוכונדריאלי מווסת את התמיינות תאי T בזיכרון ואת תפקוד אנטי-גידול. Cell Metab. 34, 731–746 (2022).
