FOXO מווסת את הביטוי של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים ומקדם פגוציטוזיס של המוציטים בחסינות אנטיבקטריאלית של שרימפס

תַקצִיר

חסרי חוליות מסתמכים על חסינות מולדת, כולל חסינות הומורלית ותאית, כדי להתנגד לזיהום פתוגני. מחקרים קודמים הראו כי גורם שעתוק קופסת המזלג O (FOXO) משתתף בתגובות החיסון הריריות של יונקים ובוויסות החיסוני ההומורלי של המעיים של חסרי חוליות. עם זאת, האם FOXO מעורב בוויסות חסינות מערכתית ותאית בחסרי חוליות עדיין לא ידוע. במחקר הנוכחי, זיהינו FOXO משרימפס (Marsupenaeus japonicus) ומצאנו שהוא מתבטא ברמות בסיסיות יחסית בשרימפס רגיל, אך הווסרה משמעותית בשרימפס המאותגר על ידי Vibrio anguillarum. FOXO מילא תפקיד קריטי בשמירה על הומאוסטזיס של המולימפה ומיקרוביוטה של ​​המעי על ידי קידום הביטוי של Relish, גורם התעתיק של מסלול החסר החיסוני (IMD) לביטוי של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs) בשרימפס. מצאנו גם שזיהום פתוגן הפעיל את FOXO וגרם לטרנסלוקציה הגרעינית שלו על ידי הפחתת פעילות AKT של serine/threonine kinase. בגרעין, FOXO המופעל מווסת ישירות את הביטוי של הגנים Amp המטרה שלו ו-Relish נגד זיהום חיידקי. יתר על כן, FOXO זוהה כמעורב בחסינות תאית על ידי קידום הפגוציטוזיס של המוציטים באמצעות הסדרת הביטוי של קולטן הקולטן הפאגוציטוטי C (Src), ושני GTPases קטנים, Rab5 ו-Rab7, הקשורים לסחר בפאגוזומים לליזוזום. בציטופלזמה. יחד, התוצאות שלנו הצביעו על כך ש-FOXO מפעיל את השפעותיו על ההומאוסטזיס של המולימפה והמיקרוביוטה האנטרית על ידי הפעלת מסלול ה-IMD בשרימפס רגיל, וקידום ישיר או עקיף של ביטוי AMP והגברת הפגוציטוזיס של המוציטים נגד פתוגנים בשרימפס נגוע בחיידקים. מחקר זה חשף את הפונקציות השונות של FOXO בחסינות האנטיבקטריאלית הרירית (המקומית) והמערכתית של חסרי חוליות.

יתרונות תוסף cistanche-איך לחזק את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

מבוא

חלבוני תעתוק פקטור O של משפחת המזלג (FOXOs) מעורבים בתהליכים ביולוגיים קריטיים שונים של אורגניזמים, כולל ויסות מחזור התא, תיקון של DNA פגום, חסינות אנטי-סרטנית וויסות תוחלת חיים [1,2]. ליונקים יש ארבעה חלבוני FOXO שונים (FOXO1, FOXO3, FOXO4 ו-FOXO6); עם זאת, לחסרי חוליות יש רק FOXO אחד, הידוע גם בשם Daf-16 ב-Caenorhabditis elegans [3]. פעילות התעתיק של FOXO מווסתת על ידי מספר סוגים של שינויים פוסט-תרגום, כגון זרחון, אצטילציה, מתילציה ו-ubiquitination [4]. שינויים אלה משפיעים על טרנסלוקציה או יציאה גרעינית של FOXO מהגרעין, והאינטראקציה שלו עם מדכאים משותפים ומפעילים, שיכולים לקדם או להפחית את פעילות FOXO ולתווך את הפונקציות הביולוגיות השונות שלו [5,6]. לאחר ההפעלה, FOXO משתתף בתפקודים פיזיולוגיים רבים על ידי ויסות התעתוק של מגוון גני מטרה [7]. FOXOs מופעלים על ידי גירויים חוץ-תאיים שונים, כולל גורמי גדילה, ציטוקינים והורמונים [8]. אותות גדילה, כגון אינסולין או גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1), מקיימים אינטראקציה עם קולטנים של מסלול האינסולין ומפעילים איתות phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), מה שמוביל לזרחון של FOXO על ידי serine/threonine kinase, protein kinase B (AKT) [9]. FOXO מזורחן עובר מעבר מהגרעין לציטוזול, או מונע את מעברו מציטוזול לגרעין, שם הוא הופך להיות בכל מקום, מה שמוביל לפירוקו על ידי הפרוטאזום [10]. לעומת זאת, בהיעדר אותות גדילה חיצוניים, מסלול האיתות PI3K-AKT אינו פעיל, ו-FOXO לא מזורחן עובר לגרעין כדי לקדם שעתוק גן מטרה [11]. FOXO משתתף גם בתגובות חיסוניות מולדות אנטי-בקטריאליות ואנטי-וירוס של חסרי חוליות [12,13]. הפעלה כרונית של FOXO במעיים המזדקנים של תסיסנית מדכאת את הביטוי של חלבון זיהוי פפטידוגליקן SC2 (רגולטור שלילי של מסלול החסר החיסוני (IMD) ושובר הומאוסטזיס חיסוני של המעי [14]. FOXO מווסת ישירות גנים של פפטיד אנטי-מיקרוביאלי (AMP) ברקמות אפיתל של תסיסנית לא נגועה בתגובה ללחץ רעב, שאינו תלוי במסלולי חסינות מולדים המגיבים לפתוגן [15]. עם זאת, זיהום פתוגן יכול גם לגרום לאנטרוציט FOXO להיכנס לגרעין מהציטופלזמה ישירות במעיים תסיסנית [12]. הרגולציה התלויה ב-FOXO של AMPs מתרחשת גם ברקמות אפיתל של יונקים, מה שמצביע על כך שהדבר נשמר מבחינה אבולוציונית בבעלי חיים [16]. מספר מחקרים הראו כי FOXOs מופעלים על ידי פתוגנים או גירוי ציטוקינים בתגובות חיסוניות ברירית [17]. הטרנסלוקציה שלהם לגרעין והקשירה למקדמים של גני המטרה שלהם מעוררת על ידי מסלול הקינאז של חלבון מיטוגן (MAP) ומעוכב על ידי מסלול PI3K/AKT. גני המטרה של FOXOs כוללים מולקולות איתות פרו-דלקתיות, מולקולות הידבקות וקולטני כימוקין [17]. עדיין לא ברור אם FOXOs מעורבים בתגובות החיסון המערכתיות נגד פתוגנים. קידום הביטוי של AMPs נגד פתוגנים הוא מנגנון חשוב של חסינות מולדת הומורלית בחסרי חוליות [18]. בחסינות מולדת של Drosophila, מסלולי ה-Toll וה-IMD מעורבים בוויסות של ביטוי AMP, ו-AMPs ממלאים תפקידים חשובים בחיסול פתוגנים פולשים [19-21]. בדומה לחסינות חרקים, מסלולי Toll, IMD ו-Janus kinase (JAK)/מתמר אותות ומפעילי שעתוק (STAT) מעורבים בוויסות ביטוי AMP בסרטנים [22,23]. האם FOXO יכול לווסת את הביטוי של AMPs ללא תלות במסלולי Toll, IMD ו-JAK/STAT נגד זיהום פתוגנים בסרטנים דורש הבהרה. בנוסף לחסינות הומורלית, חסרי חוליות מסתמכים גם על חסינות תאית כדי לבצע פונקציות חסינות מולדות נגד זיהום פתוגן. פגוציטוזיס על ידי המוציטים הוא אחד המנגנונים החשובים לחסינות תאית נגד זיהום פתוגן [24]. מחקרים קודמים מצאו ש-FOXO1-אוטופגיה מתווכת נדרשת להתפתחות תאי רוצח טבעי (NK) [25]. יתר על כן, FOXO מעורב בקידום פגוציטוזיס חיידקי על ידי נויטרופילים [26]. למרות שאין תאי חיסון מיוחדים בסרטנים, כגון תאי NK או נויטרופילים, המוציטים של שרימפס יכולים להפעיל חסינות מולדת מערכתית נגד זיהום חיידקי פתוגני באמצעות phagocytosis [27]. עם זאת, לא ברור האם FOXO משתתף בפאגוציטוזיס הפתוגן של המוציטים בשרימפס. חקלאות שרימפס היא אחת מהתעשיות הצומחות ביותר בעולם לייצור חלבונים מהחי ותרמה תרומה משמעותית למתן מענה לביקוש המוגבר בעולם לחלבונים מהחי. נכון לעכשיו, הייצור העולמי של שרימפס הוא כ-4.88 מיליון טון בשווי של כ-39 מיליארד דולר [28]. עם זאת, גידול מספר רב של בעלי חיים יחד מביא ללחץ משמעותי של בעלי חיים, אשר מקל על פתוגנים, כולל חיידקים ווירוסים, ריבוי ומחלות קליניות, אשר מביאים להפסדים כלכליים גדולים לתעשייה [29]. מחקרים על מנגנוני חיסון של שרימפס יכולים לספק אסטרטגיות חדשות למניעת ושליטה במחלות [30]. במחקר הנוכחי, זיהינו FOXO בשרימפס קורומה (Marsupenaeus japonicus). לאחר ביטוי Foxo, בעקבות אתגר Vibrio anguillarum, מצאנו כי יכולת פינוי החיידקים ושיעור הישרדות השרימפס ירדו באופן משמעותי. מחקר נוסף הצביע על כך ש-FOXO קידם את הביטוי של AMPs באופן ישיר או עקיף, והגביר את הפגוציטוזיס של חיידקים בשרימפס. נותחו המנגנונים האפשריים של השפעות FOXO נגד זיהום פתוגן בשרימפס.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

תוצאות

FOXO מתבטא ברמות בסיסיות בשרימפס לא מעורער והוא מווסת מוגברת בשרימפס מאוגר עם V. anguillarum

מרצף תעתיק המוציטים של M. japonicus, השגנו את רצף ה-cDNA באורך מלא של Foxo (מספר גישה ל-GenBank: MW080526). השוואת תחומים הראתה שלחלבון FOXO החזוי יש תחום Forkhead (FH), הדומה ל- Homosapiens FOXOs כולל FOXO1, FOXO3, FOXO4 ו-FOXO6, ונושא זרחון AKT דומה (איור S1A). תוצאות הניתוח הפילוגנטי הראו ש-FOXOs חולקו לשני אשכולות כולל FOXOs בעלי חוליות וחסרי חוליות, וה-FOXO השרימפס התקבץ בענף חסרי החוליות בעץ הפילוגנטי (איור S1B). בדומה ל-FOXOs אנושיים [31], ל-FOXO לשרימפס יש אתרי שינוי זרחן של קינאז (ERK) חוץ-תאי ואתרי שינוי אצטילציה של CREB Binding Protein (CBP), אך אין לו אתרי שינוי דה-אצטילציה של sir tuin 1 (SIRT1) ו-c-JUN N-terminal. אתרי שינוי זרחן של קינאז (JNK) (איור S2). נוגדנים פוליקלונליים המזהים שרימפס FOXO הוכנו באמצעות תחום ה-FH הרקומביננטי של FOXO המתבטא ב-Escherichia coli (איור 1A). ניתוח התפלגות הרקמות של FOXO ברמות ה-mRNA והחלבון גילה שהוא בא לידי ביטוי בכל הרקמות שנבדקו (איור 1B). מהלך הזמן של ביטוי FOXO בהמוציטים ובמעיים של שרימפס שאותגר על ידי V. anguillarum נותח באמצעות qPCR ו-Western blotting. התוצאות הראו ש-FOXO עבר ויסות בהמוציטים ובמעיים ברמת ה-mRNA (איור 1C ו-1D) וברמת החלבון (איור 1E ו-1F). תוצאות אלו הצביעו על כך ש-FOXO מעורב בתגובה לזיהום V. anguillarum והניעו אותנו לחקור את התפקוד של FOXO בחסינות לשרימפס.

FOXO משתתף בוויסות הומאוסטזיס של המולימפה והמיקרופלורה של המעי בשרימפס בריא

כדי לחקור את התפקוד של FOXO בהמולימפה ומיקרופלורת הומאוסטזיס במעיים בשרימפס, בוצעה הפרעות RNA ונותח עומס החיידקים. התוצאות הראו שהביטוי של Foxo ירד באופן משמעותי ב-Foxo-RNAi שרימפס (איור 2A ו-2B). השפעות מחוץ למטרה של Foxo RNAi נותחו גם על ידי זיהוי הביטוי של גנים אחרים של משפחת פוקס (כולל Foxk2 ו-Foxn3). התוצאות הראו שהנפילה של Foxo לא הורידה את רמות הביטוי של Foxk2 או Foxn3 (S3A-S3C Fig). באמצעות מבחני ספיגה מערבית ומבחני אימונוציטוכימיה ניאון, צפינו עוד בהפצה התת-תאית של FOXO במעיים ובהמוציטים של שרימפס מאותגר על ידי חיידקים לאחר ההשתקה של Foxo. התוצאות הראו שבהשוואה לקבוצת dsGfp, רמת ה-FOXO בגרעין ירדה משמעותית ב-Foxo-RNAi שרימפס, גם אם השרימפס נדבק ב-V. anguillarum (S3D–S4E' Figs). כל התוצאות לעיל הצביעו על כך שבדיקת Foxo RNAi שלנו יכולה להשתיק באופן ספציפי את Foxo בהמוציטים ובמעיים (כולל בציטופלזמה ובגרעין). לאחר מכן, ניתחנו את עומס החיידקים בהמולימפה ובמעיים לאחר פגיעה של Foxo בשרימפס בתנאים רגילים (ללא אתגר חיידקי). התוצאות הראו שמספר החיידקים בהמולימפה ובמעיים עלה באופן משמעותי לאחר שביטוי Foxo הופל בהצלחה (איור 2C ו-2D). עוד ניתחנו את שיעור ההישרדות של שרימפס Foxo-RNAi ללא אתגר חיידקי, והתוצאות הראו ששיעור ההישרדות של שרימפס Foxo-knockdown ירד באופן משמעותי בהשוואה לזה של הביקורת (איור 2E). כדי לאמת עוד יותר את התוצאות הללו, ניתחנו את שיעור ההישרדות של שרימפס Foxo-RNAi שטופל באנטיביוטיקה והתוצאות הראו שבהשוואה לקבוצת dsGfp, שיעור ההישרדות של השרימפס נטול הנבטים לא ירד משמעותית (איור 2F). כל התוצאות הצביעו על כך ש-FOXO ממלא תפקיד בהומאוסטזיס של המיקרוביוטה in vivo (כולל המולימפה ומיקרוביוטה אנטרית) בשרימפס בתנאים רגילים.

תוסף תוסף cistanche-הגברת חסינות

FOXO משתתף בוויסות ההמולימפה והומיאוסטזיס של מיקרופלורה במעיים על ידי קידום ביטוי Relish ו- Amp בשרימפס בריא

מחקרים קודמים מראים ששרימפס בריא מכיל מספר נמוך אך יציב של חיידקים בהמולימפה במחזור, וכמויות גבוהות אם כי קבועות של חיידקים במערכת העיכול, ואת המשפיענים החיסוניים, כגון פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs) המווסתים על ידי הגורם הגרעיני kappa B (NF) מסלול -κB) ומיני חמצן תגובתיים (ROS) המווסתים על ידי המסלול הכפול אוקסידאז (DUOX), ממלאים תפקיד חיוני בהמולימפה הומאוסטזיס ובמיקרוביוטה של ​​המעיים [32-34]. כדי לחקור את מנגנון המעורבות של FOXO בוויסות הומאוסטזיס של המולימפה ומיקרופלורה במעי בתנאים רגילים, זיהינו לראשונה את ההתפלגות התת-תאית של FOXO בהמוציטים ובמעיים בתנאים נורמליים. התוצאות הראו אות חלש של FOXO בגרעינים של המוציטים של שרימפס ותאי מעי בתנאים רגילים (איור 3A ו-3B), מה שמצביע על כך שמעט FOXO הופעלה על ידי המיקרוביוטה in vivo בשרימפס בתנאים רגילים. ביטוי AMP מווסת על ידי מסלול IMD במעיים של תסיסנית [35]. לכן, הנחנו שגורם השעתוק Relish עשוי להיות גן מטרה של FOXO. זיהינו את ביטוי ה-mRNA של Relish, גורם השעתוק של מסלול ה-IMD, בהמוציטים ובמעיים של שרימפס לאחר ההפלה של Foxo. התוצאות הראו שביטוי Relish ירד באופן משמעותי ב-Foxo-knockdown שרימפס (איור 3C ו-3D), ותוצאות דומות התקבלו ברמת החלבון (איור 3E ו-3E'). התוצאות העלו כי FOXO יכול לקדם את הביטוי של Relish ולהפעיל את מסלול ה-IMD. כדי לאשר ש-FOXO משתתף בהומיאוסטזיס של הלימפה ודרכי העיכול באמצעות איתות IMD, התקבלו שרימפס ללא חיידקים (איור 3F) וזוהו הפעלת RELISH וביטוי AMP. בהשוואה לזה שבביקורת, כמות FOXO ו-RELISH בגרעיני תאי המעי וההמוציטים ירדה באופן משמעותי (איור 3G ו-3H). בינתיים, הביטוי של AMPs, כולל Crustins (CrusI-2 עד 5) וגורמים אנטי-ליפופוליסכרידים (Alf A1, B1, C1, D1 ו-E1), המווסתים אולי על ידי FOXO ו/או RELISH, נבדק בנבט שרימפס חופשי, והתוצאות הראו שביטוי של CrusI-3, Alf-B1 ו-Alf-C1 ירד באופן משמעותי בהמו ציטים ובמעיים של השרימפס (איור 3I ו-3J). בהתחשב בכך שהביטוי של Alf-B1 ו-Alf C1 היה מווסת על ידי מסלול IMD [36], תוצאות אלו הצביעו על כך ש-FOXO משתתף בוויסות ההומאוסטזיס של ההמולימפה ודרכי העיכול בתנאים רגילים דרך מסלול ה-IMD כדי לקדם את הביטוי של AMPs.

איור 1. FOXO עבר ויסות בשרימפס שאותגר על ידי V. anguillarum. (א) ביטוי רקומביננטי של תחום ה-FH של FOXO ב-E. coli וב-Western blotting כדי לזהות FOXO באמצעות נוגדנים רב שבטיים נגד FOXO שהוכנו בארנבות. מסלול 1, סך החלבונים של E. coli עם Foxo-pGEX4T-1. מסלול 2, סך החלבונים של החיידקים לאחר השראת IPTG. מסלול 3, FOXO רקומביננטי מטוהר. נתיב 4, FOXO במעיים של שרימפס לא מטופל זוהה באמצעות Western blotting. M, סמני מסה מולקולרית של חלבון. (ב) התפלגות הרקמות של Foxo ברמות mRNA (פאנל עליון) וחלבון (פאנל תחתון) זוהתה על ידי RT-PCR ו-Western blotting, בהתאמה. ACTB הוא קיצור של -אקטין. (C, D) דפוסי ביטוי ה-mRNA של Foxo בהמוציטים (C) ובמעיים (D) נותחו על ידי qPCR באמצעות ביטוי ממוצע גיאומטרי של -actin ו-Ef-1 כגנים בקרה אנדוגניים. (E, F) דפוסי ביטוי החלבון של FOXO בהמוציטים (E) ובמעיים (F) זוהו על ידי סופג מערבי. תוצאות הניתוח הסטטיסטי של שלושה שכפולים הוצגו בפאנלים התחתונים. הלהקות על הכתם המערבי עבר דיגיטליות באמצעות תוכנת ImageJ על ידי סריקת הלהקות משלוש חזרות עצמאיות. רמות הביטוי היחסיות של FOXO/-actin באו לידי ביטוי כממוצע ± SD, והערך של שרימפס הביקורת נקבע כאחד. פסי שגיאה באיור מציינים SDs (שלושה שכפולים).

FOXO מופעל בשרימפס על ידי אתגר V. anguillarum ומשתתף בפינוי הפתוגנים של ההמולימפה והמעיים

דווח כי FOXO יכול להיות מופעל על ידי גירוי חיידקי או ציטוקינים והוא מועבר לגרעין כדי לווסת את הביטוי של גני מטרה מסוימים ביונקים [17]. כדי לזהות אם FOXO הופעל בשרימפס מאותגר על ידי חיידקים, נותחה התפלגות התת-תאית של FOXO במעיים של השרימפס באמצעות Western blotting. התוצאות הראו שכמות FOXO בציטופלזמה של תאי המעי ירדה בהדרגה מ-2 ל-4 שעות לאחר אתגר V. anguillarum (איור 4A). לעומת זאת, כמות ה-FOXO בגרעין תאי המעי עלתה משמעותית לאחר הדבקה ב-V. anguillarum (איור 4B). כדי לנתח את התפקיד של FOXO בחסינות מערכתית, נעשה שימוש בניסוי אימונוציטוכימי פלואורסצנטי כדי לצפות בטרנסלוקציה הגרעינית של FOXO בהמוציטים של שרימפס 2 שעות לאחר גירוי לארום שנתי V.. מצאנו שהטרנסלוקציה של FOXO הנגרמת על ידי חיידקים לתוך הגרעין גדלה באופן משמעותי, אך לא היה שינוי ברור בשרימפס מאותגר PBS (איור 4C ו-4C'). כדי לחקור אם ה-FOXO שהועבר לגרעין מעורב בפינוי פתוגנים, ניתחנו את עומס החיידקים בהמולימפה ובמעיים ב-FOXO-knockdown שרימפס ב-6 שעות לאחר אתגר חיידקים. מצאנו שאחרי ההפלה של Foxo, עומס החיידקים בהמולימפה ובמעיים גדל באופן משמעותי בהשוואה לזה בקבוצות הביקורת (איור 4D). יתרה מכך, שיעור ההישרדות של שרימפס מסוג Foxo-knockdown הנגועים ב-V. anguillarum ירד באופן משמעותי בהשוואה לזה של הביקורת (איור 4E). תוצאות אלו הצביעו על כך ש-FOXO הופעל בתאי אנטריים והמוציטים, והציעו ש-FOXO משתתף בתגובות חיסוניות מקומיות ומערכתיות נגד זיהום חיידקי.

איור 2. FOXO משתתף בתגובות החיסון האנטיבקטריאליות של המעי (המקומי) והמערכתי. (A, B) יעילות של Foxo-RNAi בהמוציטים (A) ובמעיים (B) של שרימפס, כפי שנקבע באמצעות qPCR (A) ו-Western blotting (B). ניתוח תאריך qPCR באמצעות ביטוי ממוצע גיאומטרי של -actin ו-Ef-1 כגנים בקרה אנדוגניים. פסי שגיאה מציגים SDs. (ג) זיהוי של חיידקי המולימפה של שרימפס Foxo-knockdown על ידי תרבית LB מוצקה (שלוש חזרות); הזרקת dsGfp שימשה כבקרה. יחס הדילול היה 1:10. (ד). מספר החיידקים בהמולימפה ובמעיים ב-Foxo נוק-דאון שרימפס ושרימפס בהזרקת dsGfp ללא אתגר חיידקי. (ה). שיעור ההישרדות של שרימפס Foxo-RNAi ללא אתגר חיידקי. הזרקת dsGfp שימשה כבקרה. (ו). שיעור ההישרדות של שרימפס Foxo-RNAi שטופל באנטיביוטיקה. הזרקת dsGfp שימשה כשליטה. נורמלי: שרימפס מסוג בר לא מטופל באנטיביוטיקה.

איור 3. כמות בסיסית של FOXO עוברת טרנסלוקציה לגרעיני המוציטים ותאי המעי מקדמת ביטוי Relish ובהמשך מפעילה את מסלול ה-IMD כדי לווסת הומאוסטזיס של המולימפה ומיקרוביוטה במעי בתנאים נורמליים. (א) אימונוציטוכימיה שימשה לזיהוי התפלגות תת-תאית של FOXO בהמוציטים של שרימפס רגיל. סרגל קנה מידה=20 מיקרומטר. Cy: ציטופלזמה; Nu: גרעין. (ב) נעשה שימוש ב-Western blotting כדי לזהות את ההפצה התת-תאית של FOXO בתאי מעי משרימפס רגיל ושרימפס נגוע ב-V. anguillarum. (ג) הביטוי של Relish ברמת mRNA זוהה בהמוציטים של שרימפס לאחר הפלה של Foxo על ידי qPCR באמצעות ביטוי ממוצע גיאומטרי של -actin ו-Ef-1 כגנים בקרה אנדוגניים. (ד) הביטוי של Relish ברמת ה-mRNA במעיים של שרימפס לאחר הפלת Foxo זוהה על ידי qPCR באמצעות ביטוי ממוצע גיאומטרי של -actin ו-Ef-1 כגנים בקרה אנדוגניים. (ה) רמת ה-RELISH זוהתה באמצעות סופג מערבי בשרימפס לאחר ההפלה של פוסו. (E') שלושה עותקים של פאנל E חולקו דיגיטליים באמצעות תוכנת ImageJ. (ו) עומס החיידקים של המולימפה ומעי בשרימפס 24 שעות לאחר טיפול אנטיביוטי. (ז) FOXO בגרעין זוהה באמצעות Western blotting בהמוציטים ובמעיים של שרימפס 24 שעות לאחר טיפול באנטיביוטיקה. (ח) RELISH בגרעין זוהה באמצעות Western blotting בהמוציטים של שרימפס ובמעיים ב-24 שעות לאחר הטיפול באנטיביוטיקה. (I, J) הביטוי של Amps בהמוציטים (I) ובמעיים (J) של שרימפס ללא חיידקים נקבע על ידי qPCR באמצעות -actin ו-Ef-1 כגנים התייחסות פנימיים. שרימפס רגיל (הזרקת H2O) שימש כביקורת.

מחקרים קודמים הצביעו על כך שפעילות התעתוק של FOXO מווסתת על ידי שינוי זרחון וכי ה-Serine/Threonine kinase AKT מווסת את פעילותם של גורמי שעתוק Forkhead על ידי זרחון שלהם ועיכוב טרנסלוקציה לא ברורה שלהם [9,37]. כדי לחקור אם העלייה של FOXO בגרעין לאחר זיהום בחיידקים פתוגניים מושפעת מ-AKT, זיהינו לראשונה את התוכן של FOXO בציטופלזמה ובגרעין על ידי סופג מערבי לאחר ההפלה של Akt של שרימפס. התוצאות הראו שכמות ה-FOXO בגרעין ההמוציטים ותאי המעי עלתה באופן משמעותי לאחר הורדת ביטוי Akt (איור 5A ו-5B) בשרימפס 2 שעות לאחר ההדבקה ב-V. anguillarum (איור 5C ו-5C'). כדי לאמת את תוצאות הניסוי, השתמשנו גם במבחן אימונוציטוכימיה כדי לבחון את ההתפלגות התת-תאית של FOXO בהמוציטים של שרימפס לאחר ההפלה של Akt. התוצאות הראו ש-FOXO גדל באופן משמעותי בגרעין המוציטים כאשר Akt הפיל 2 שעות לאחר ההדבקה ב-V. anguillarum (איור 5D ו-5D'). כדי לחקור האם הזיהום הפתוגן משפיע על פעילות AKT, זיהינו את שינוי הזרחון של AKT לאחר זיהום הפתוגן באמצעות נוגדן אנושי p-AKT (Ser473) (אתר הזרחון של AKT שרימפס הוא Ser486) ומצאנו שרמת ה-AKT הפוספוריל ירדה באופן משמעותי ב המוציטים והמעיים של שרימפס לאחר 30 דקות של זיהום V. anguillarum (איור 5E ו-5F). תוצאות אלו הצביעו על כך שזיהום פתוגן יכול להפחית את רמת ה-AKT הפוספוריל, המעכב את פעילות האנזים ומפחית את יכולתו של AKT לזרחן FOXO. ה-FOXO הלא-מזרחן חודר לגרעין ומעורר את הביטוי של גני המטרה שלו. האיור מציין SDs.

תמצית cistanche

זיהום פתוגן מפחית את הפעילות של AKT וגורם לטרנסלוקציה גרעינית של FOXO

FOXO מפעיל הגנה חיסונית מפני חיידקים פולשים על ידי ויסות הביטוי של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים בשרימפס הנגועים בחיידקים

כדי לחקור את המנגנון שבו FOXO משפיע על התגובה נגד זיהום חיידקי בשרימפס, זיהינו תחילה את הגנים המשפיעים החיסוניים המווסתים על ידי FOXO. לאחר ההפלה המוצלחת של Foxo בהמוציטים ובמעיים של שרימפס עם או בלי V. anguillarum challenge, רמות הביטוי של CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 ו-Alf-E1 ירדו באופן משמעותי בשרימפס המושתק בהשוואה עם אלה בקבוצת הביקורת (איור 6A ו-6B). כדי לאמת עוד יותר את התוצאות, זיהינו גם את הביטוי של ארבעה AMPs לאחר השבתת Akt. התוצאות הראו שהביטוי של ארבעת ה-AMPs עלה באופן משמעותי 6 שעות לאחר זיהום V. anguil larum בהשוואה לזה בקבוצת הביקורת (איור 6C ו-6D). בהשוואה ל-AMPs עם רגולציה מוגברת (כולל Alf-B1, ו-Alf-C1) במצב תקין (איור 3I ו-3J), גן נוסף של AMPs (CrusI-3, Alf-E1) היה מווסת גם בשרימפס הנגוע ב-V אנגווילרום (איור 6A ו-6B). המחקר הקודם שלנו הצביע על כך ש-RELISH קידם את הביטוי של Alf-B1 ו-Alf-C1 בשרימפס [36]. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-FOXO עשוי לווסת ישירות את ביטוי AMP, כגון CrusI-3 ו-Alf-E1, ללא תלות בנתיב האיתות של IMD. כדי לאשר את ההשערה, בוצע בדיקת ChIP כדי לזהות אם FOXO יכול להיקשר למקדם של Alf-E1. הושג רצף המקדם של Alf-E1 (איור S4) ונחזה אתרי הקישור של FOXO (איור 6E). תוצאת ה-ChIP הראתה ש-FOXO יכול להיקשר למקדם Alf-E1 (איור 6F). תוצאות אלו העלו כי FOXO משתתף גם בחסינות אנטיבקטריאלית על ידי ויסות ישיר של הביטוי של AMPs בשרימפס.

איור 4. FOXO הועבר לגרעין בשרימפס שאותגר על ידי V. anguillarum. (A, B) דפוסי ההפצה של FOXO בציטופלזמה (A) ובגרעין (B) של תאי מעי של שרימפס מאותגרים על ידי חיידקים, כפי שנותחו באמצעות סופג מערבי (לוחות תחתונים של A ו-B). להקות הסופג המערביות עבר דיגיטליות באמצעות תוכנת ImageJ על ידי סריקת הלהקות משלוש חזרות. רמות הביטוי היחסיות של FOXO/-actin או FOXO/Histone 3 באו לידי ביטוי כממוצע ± SD, והערך של שרימפס הביקורת נקבע כאחד. (ג) הטרנסלוקציה הגרעינית של FOXO בהמוציטים של שרימפס 2 שעות לאחר V. אתגר anguillarum זוהה באמצעות מבחני אימונוציטוכימיים ניאון. הזרקת PBS שימשה כבקרה. סרגל קנה מידה=20 מיקרומטר. (C') ניתוח סטטיסטי של פאנל C הקולקליזציה של גרעינים מוכתמים ב-FOXO ו-DAPI בהמוציטים נותחה על ידי תוכנת WCIF ImageJ. (ד) מספר החיידקים בהמולימפה ובמעיים של שרימפס Foxo-knockdown בעקבות הזרקת V. anguillarum; הזרקת dsGfp בשרימפס בעקבות הזרקת חיידקים שימשה כביקורת. (ה) שיעור ההישרדות של שרימפס Foxo-RNAi נגוע ב-V. anguillarum. הזרקת dsGfp שימשה כבקרה.

FOXO מקדם פגוציטוזיס של המוציטים נגד חיידקים על ידי קידום ביטוי SRC

מחקרים קודמים דיווחו ש-FOXO מקיים אינטראקציה ישירה עם אזורי הפרומוטור של CXCR2 ו-CD11b כדי לווסת את הפגוציטוזיס של נויטרופילים ביונקים [26]. כדי לבדוק אם FOXO קשור לפגוציטוזיס המוציטים בחסינות אנטיבקטריאלית של שרימפס, בדקנו את שיעור הפגוציטים לאחר הפרעה ל-Foxo בשיטות שונות. לאחר ההפקה של Foxo, הקצב הפאגוציטי והאינדקס הפאגוציטי של קבוצת Foxo-נוק-דאון היו נמוכים משמעותית מאלו של קבוצת הביקורת (dsGfp) (איור 7A ו-7A'). השתמשנו גם ב-flow cytometry כדי לכמת את קצב הפגוציטים של המוציטים לאחר ההשתקה של Foxo. התוצאות הראו ששיעור ציטוזיס הפאג של קבוצת Foxo-RNAi ירד גם הוא באופן משמעותי בהשוואה לזה של קבוצת dsGfp (איור 7B ו-7B'). כדי לאמת עוד יותר את התוצאות הללו, בדקנו גם את הקצב הפגוציטי לאחר פגיעה באקט. התוצאות הראו כי בהשוואה לאלו של קבוצת הביקורת, הקצב הפגוציטי והאינדקס הפאגוציטי עלו באופן משמעותי (איור 7C ו-7C'). תוצאות אלו הצביעו על כך ש-FOXO מקדם פגוציטוזיס של המוציטים בשרימפס. כדי לחקור כיצד FOXO משפר את הפגוציטוזיס המוציט בשרימפס, זיהינו את הביטוי של גנים שדווחו בעבר המעורבים בפאגוציטוזה של שרימפס. מדווחים שהם מעורבים בפגוציטוזיס של המוציטים [38,39] של קולטן נבלות מסוג B (SRB) ו-Class C (SRC). מצאנו שרמת ביטוי ה-mRNA של Src, ולא של Srb, ירדה באופן משמעותי לאחר השתקה של Foxo בהמוציטים ובמעיים (איור 7D ו-7E), בעוד שהביטוי של Src גדל באופן משמעותי לאחר השבתת Akt בשרימפס (איור 7F). תוצאות דומות התקבלו ברמת החלבון (איור 7G ו-7G'). תוצאות אלו הציעו כי FOXO מקדם פגוציטוזיס המוציטים של פתוגנים בשרימפס על ידי קידום ביטוי SRC.

FOXO מקדם את הביטוי של RAB5 ו-RAB7 במהלך phagocytosis בשרימפס

מחקרים קודמים הראו שה- GTPases הקטנים, RAB5 ו- RAB7, הם הרגולטורים העיקריים של ההובלה של שלפוחית ​​אנדוציטוזה חדשה לאנדוזומים מוקדמים ומאוחרים [40]. RAB5 הוא מווסת מפתח של אירועי ההיתוך הראשוניים ומהווה סמן של אנדוזומים מוקדמים [41,42]. RAB7 נחוץ לאיחוי פאגוזום-ליזוזום מאוחר והוא סמן של אנדוזומים מאוחרים [43]. כדי לחקור אם RAB5 ו-RAB7 מעורבים בפינוי פתוגנים בשרימפס, ניתחנו תחילה את דפוסי הביטוי של Rab5 ו-Rab7 ומצאנו ששני ה- GTPases הקטנים היו מווסתים בשרימפס מאוגר עם חיידקים (איור S5A-S5D). ניתחנו עוד את שיעור ההישרדות של שרימפס Rab5-RNAi ו-Rab7-RNAi לאחר התגרות חיידקית, והתוצאות הראו ששיעור ההישרדות של שרימפס נוק-דאון Rab5 ו-Rab7 ירד באופן משמעותי בהשוואה לזה של הביקורת ( איור S5E ו-S5F). תוצאות אלו העלו כי RAB5 ו-RAB7 ממלאים תפקידים חשובים בעמידות בפני פתוגנים חיידקיים. כדי לחקור אם RAB5 ו-RAB7 מעורבים בפאגוציטוזיס בתיווך FOXO, בחנו את רמות ביטוי ה-mRNA של Rab5 ו-Rab7 לאחר הפרעה לביטוי Foxo בשרימפס. התוצאות הראו שרמות הביטוי של Rab5 ו-Rab7 ירדו באופן משמעותי בהמוציטים ובמעיים (איורים 8A ו-S6A). ואילו הביטוי של Rab5 ו- Rab7 עלה באופן משמעותי לאחר ההפלה של Akt בשרימפס (איור 8B). כדי לאשש עוד יותר את התוצאות שלעיל, זוהו גם רמות החלבון של RAB5 ו-RAB7 ב-Foxo או Akt knockdown שרימפס. בהשוואה לקבוצת הזרקת dsGfp, רמות RAB5 ו-RAB7 ירדו באופן משמעותי גם בהמוציטים ובמעיים ב-Foxo-knockdown שרימפס אך עלו באופן משמעותי ב- Akt-knockdown שרימפס שעתיים לאחר גירוי על ידי V. anguillarum (איורים 8C-8D'; S6B ו-S6B'). תוצאות אלו הצביעו על כך ש-RAB5 ו-RAB7 משתתפים בציטוזיס פאג'ים בתיווך FOXO של המוציטים בשרימפס. עוד גילינו כי RAB5 ו-RAB7 היו ממוקמים יחד עם V. anguillarum בהמוציטים של שרימפס (איור 9). ביחד, התוצאות הצביעו על כך ש-RAB5 ו-RAB7 מעורבים בפאגוציטוזיס בתיווך FOXO בשרימפס.

איור 5. זיהום פתוגן הפחית את פעילות ה-AKT, אשר קידם טרנסלוקציה גרעינית של FOXO בהמוציטים ובתאים אנטריים של שרימפס. (א, ב) יעילות של Akt-RNAi בהמוציטים ובמעיים של שרימפס, כפי שנקבע על ידי qPCR באמצעות ביטוי ממוצע גיאומטרי של -אקטין ו-Ef-1 כגנים בקרה אנדוגניים (A) ו-Western blotting (B). (ג) כמות FOXO בציטופלזמה ובגרעין המעיים משרימפס Akt-knockdown נותחה על ידי סופג מערבי. dsGfp שימש כפקד. (C') הניתוח הסטטיסטי של פאנל (C). תוכנת ImageJ שימשה לדיגיטליזציה של הלהקות על ידי סריקת תמונות של שלוש חזרות. (ד) הטרנסלוקציה הגרעינית של FOXO בהמוציטים של שרימפס Akt-knockdown זוהתה 2 שעות לאחר אתגר V. anguillarum באמצעות בדיקה אימונוציטוכימית ניאון. dsGfp שימש כפקד. סרגל קנה מידה=20 מיקרומטר. (ד') ניתוח סטטיסטי של (ד). תוכנת WCIF ImageJ שימשה לנתח את הלוקליזציה המשותף על ידי יחס עוצמת הקרינה של גרעין אנטי-FOXO (ירוק) ו-DAPI מוכתם (כחול) בהמוציטים לאחר קיבוע ערך החשיפה. (E, F) שינוי תוכן של AKT מזורחן (p-AKT) בהמוציטים (E) ובמעיים (F) של שרימפס מאותגר על ידי V. anguillarum. הלוחות התחתונים הם דמויות דיגיטליות של (E) ו-(F) המבוססות על פסים של סופג מערבי וניתוח סטטיסטי, בהתאמה.

תה Cistanche

דִיוּן

FOXO, כגורם שעתוק חשוב מאוד, משתתף בתפקודים פיזיולוגיים ומטבוליים רבים [44,45]. במחקר הנוכחי, זיהינו FOXO משרימפס (M. japonicus) ומצאנו שהוא משתתף בוויסות ההומאוסטזיס של ההמולימפה והמיקרוביוטה האנטרית על ידי ויסות ביטוי AMP בתנאים נורמליים. FOXO יכול להיות מופעל על ידי זיהום חיידקי בשרימפס ולהעביר אותו לגרעין, שם הוא מווסת באופן ישיר ועקיף (על ידי מסלול IMD) את הביטוי של AMPs. FOXO הגביר ביטוי של גנים הקשורים לפגוציטוזיס, כגון SRC ו-GTPases קטנים, RAB5 ו-RAB7, כדי לקדם פגוציטוזיס המוציט נגד פתוגנים. לכן, שרימפס FOXO ממלא תפקידים שונים בתגובה חיסונית מערכתית ומקומית (אנטרית) נגד פתוגנים (איור 10). בהשוואה ל-FOXOs אנושיים, ל-FOXO לשרימפס יש רצף חומצות אמינו שמור יחסית ואתרי זרחון AKT; עם זאת, אתר הזרחון השני של AKT של שרימפס FOXO הוא תריאונין במקום סרין. זרחון AKT של FOXO שולט בהובלה הגרעינית והציטופלזמית של FOXO [9]. במחקר זה, מצאנו ש-AKT קשור לשליטה בכניסה הגרעינית של FOXO. לאחר זיהום V. anguillarum, רמת ה-AKT הפוספוריל ירדה באופן משמעותי, מה שהצביע על כך שפעילות AKT ירדה בשרימפס הנגועים בפתוגן, ובכך הגבירה את החזקת הגרעין או הטרנסלוקציה הגרעינית של FOXO, ובעקבות זאת גרמה לביטוי של גנים מטרה, כגון Relish ו-Amp, כדי להתנגד מפני זיהום פתוגן. מחקרים קודמים מצאו ש-FOXO משתתף בהומאוסטזיס של המיקרופלורה של המעי תסיסנית על ידי דיכוי הביטוי של חלבון זיהוי פפטידוגליקן SC2 (הרגולטור השלילי של מסלול IMD) כדי להפעיל את המסלול לביטוי AMP [14]. RELISH דווח כגן יעד מרכזי של FOXO בבקרת סבילות להיפוקסיה ב-Drosophila [46]. כמו בעלי חיים אחרים, מערכת העיכול של השרימפס מכילה מיקרוביוטה גבוהה וקבועה יחסית. עדויות מתגברות מגלות גם שההמולימפה של חלק מחסרי חוליות בריאים במים, כולל שרימפס, מכילה גם כמויות יציבות של חיידקים [47]. המחקר הקודם שלנו מצא שלקטין מסוג C משתתף בוויסות ההומאוסטזיס של מיקרוביוטה המולימפה על ידי שמירה על הביטוי של AMPs [34], אך איננו יודעים אילו מסלולי אותות מעורבים בוויסות ביטוי AMP. כאן, התוצאות שלנו הצביעו על כך ש-FOXO מעורב בוויסות הומאוסטזיס של המולימפה ומיקרופלורה אנטרית באמצעות איתות IMD בתנאים רגילים. בשרימפס לא נגוע, הפגיעה של Foxo הביאה להפחתה משמעותית של ביטוי של Relish, ושיעור ההישרדות של השרימפס ירד משמעותית, גם ללא זיהום חיידקי. מצאנו גם כמות קטנה של FOXO בגרעין של תאי שרימפס רגילים. לכן, אנו חושבים ש-FOXO משתתף בוויסות ההומאוסטזיס של המולימפה והפלורה האנטרית בתנאים רגילים על ידי קידום ביטוי Relish ולאחר מכן שיפור ביטוי AMP על ידי מסלול IMD. תוצאות אלו הצביעו על כך ש-FOXO משתתף בחסינות מקומית ומערכתית כדי לקדם הומאוסטזיס של מיקרוביוטה של ​​ההמולימפה ומערכת העיכול בשרימפס. חסינות הומורלית ממלאת תפקיד קריטי בעמידות לזיהום פתוגן בשיעורים הפוכים באמצעות ייצור סוללת AMPs [21,48]. התגובה ההומורלית כוללת את הסינתזה וההפרשה הניתנת להשראה של AMPs, המשתחררים לתוך ההמולימפה כתגובה מערכתית, או משתחררים על פני האפידרמיס או חלל מערכת העיכול כתגובה מקומית [19]. ביטוי AMP מוסדר בעיקר על ידי מסלולי האיתות Toll/Dif ו-IMD/Relish בזבובי פירות [49]. נכון לעכשיו, זוהו מספר משפחות של AMPs בשרימפס, כולל קראסטינים, גורמים אנטי-ליפופוליסכרידים (Alfs) ופנאיידינים [50]. המחקר הנוכחי הראה ש-FOXO יכול ישירות או בעקיפין (באמצעות איתות IMD/Relish) לווסת את הביטוי של AMPs, כולל CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 ו-Alf-E1. חשבנו שהפעלה נמוכה של FOXO בהמוציטים ובמעיים של שרימפס בתנאים רגילים יכולה לווסת את גן המטרה העיקרי של Foxo, כלומר, Relish, כדי לשמור על ההומיאוסטזיס של המיקרוביוטה in vivo. במהלך ההדבקה, הפתוגנים הפולשים מפעילים את FOXO, שרובו מועבר לגרעין, שם הוא מווסת יותר גנים מטרה, כולל כמה AMPs, כגון Alf-E1 ו-CrusI-3, בנוסף ל-Relish. ביחד, FOXO משתתף בוויסות של הומאוסטזיס של המולימפה ומיקרוביוטה של ​​המעי בשרימפס בריא באמצעות הפעלה ברמה הבסיסית של איתות IMD בהמולימפה ובמערכת העיכול. זיהום פתוגן מפעיל את FOXO על ידי הפחתת פעילות AKT ומקדם את הביטוי של AMPs באופן ישיר ועקיף בחסינות מערכתית ובחסינות מקומית (מעיים). פגוציטוזיס היא תופעה בתיווך קולטן, אקטין ותלויה ב-ATP, המופעלת על ידי קישור של חלקיקים או פתוגנים לקולטנים ציטוממברניים ספציפיים, ומייצגת תהליך חיסוני חשוב דרכו יכול המארח להגן על עצמו מפני פתוגנים [24]. GTPases קטנים, כגון RAB5 ו-RAB7, מעורבים בהמשך שיפוץ ממברנות ותעבורת שלפוחית ​​בפאגוציטוזה. המחקר הקודם שלנו דיווח כי קולטני הסורר SRB ו-SRC מעורבים בפאגוציטוזיס המוציטים כקולטנים בשרימפס [38,39]. במחקר הנוכחי, מצאנו כי לאחר ההפלה של Foxo, ביטוי Src ירד בצורה ניכרת, ושיעור הפגוציטוזיס של המוציטים ירד באופן משמעותי, מה שמצביע על כך ש-Src הוא גן מטרה של FOXO וש-FOXO מעורב בפאגוציטוזיס בתיווך SRC של חיידקים פתוגניים. FOXO יכול גם לקדם את הביטוי של שני GTPases קטנים, RAB5 ו-RAB7. GTPases קטנים אלה מעורבים בהעברה ברצף של הפגוזומים המוקדמים והמאוחרים, והם הקובעים העיקריים של הפגוזומים [51]. פגוזומים נודדים מהפריפריה של התא לאזור התוך תאי, כאשר RAB5 מוחלף ב-RAB7 במהלך ההובלה, והסחורה הסופית מועברת לליזוזום לפירוק [52,53]. מצאנו גם ש-RAB5 ו-RAB7 יכולים להתמקם יחד עם הפתוגנים בהמוציטים, מה שהצביע על כך שהפתוגנים עברו פגוציטים על ידי המוציטים בשרימפס על ידי מעבר דרך פאגוזומים מוקדמים ומאוחרים לפני שפורקו לבסוף בליזוזומים. לכן, FOXO מעורב בתגובה החיסונית התאית על ידי קידום פגוציטוזיס של המוציטים. לסיכום, התוצאות שלנו מצביעות על כך ש-FOXO לא רק משתתף בוויסות הומאוסטזיס של מיקרוביוטה בתנאים רגילים אלא גם בפינוי של חיידקים פתוגניים בשרימפס נגוע על ידי קידום הביטוי של AMPs ופגוציטוזיס של המוציטים.

איור 6. FOXO מבצע את תפקידיו האנטיבקטריאליים בשרימפס על ידי ויסות הביטוי של AMPs. (A, B) הביטוי של Amps בהמוציטים (A) ובמעיים (B) של Foxo-knockdown שרימפס, כפי שנקבע על ידי qPCR באמצעות ביטוי ממוצע גיאומטרי של -actin ו-Ef-1 כגנים בקרה אנדוגניים; הזרקת dsGfp בשרימפס שימשה כשליטה. הנתונים נותחו סטטיסטית באמצעות מבחן Mann-Whiteny U. (C, D) הביטוי של Amps בהמוציטים (C) ובמעיים (D) של Akt knockdown שרימפס נותח על ידי qPCR באמצעות ביטוי ממוצע גיאומטרי של -actin ו-Ef-1 כגנים בקרה אנדוגניים; הזרקת dsGfp בשרימפס שימשה כשליטה. הבדלים משמעותיים נותחו באמצעות ANOVA חד כיווני. (ה) דיאגרמה סכמטית של אתרי הקישור החזויים של FOXO על האמרגן Alf-E1. (F) נעשה שימוש ב-ChIP ו-RT-PCR כדי לזהות את הקישור של FOXO לרצף המקדמים של Alf-E1 באמצעות פריימרים (Alf-E1-F ו-Alf-E1-R, טבלה 1). RT-PCR שימש גם להגברת אזור הקידוד של Alf-E1 עם פריימרים RT-PCR (Alf-E1-RT-F ו-Alf-E1-RT-R. טבלה 1) באמצעות ה-ChIP השיג DNA כתבנית. נוגדן IgG שימש כבקרה, והמקטע המוגבר של DNA גנומי רגיל שימש כדי לאשר את פס היעד.

איור 7. FOXO משפר פגוציטוזיס המוציטים של פתוגנים בשרימפס על ידי קידום ביטוי SRC. (א) hemocyte phagocytosis של V. anguillarum נצפתה באמצעות בדיקה אימונוציטוכימית ניאון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. V. anguillarum סומן ב-FITC (ירוק) וגרעיני תאים נצבעו ב-DAPI (כחול). החץ האדום מציין את המוציטים הפאגוציטים. סרגל קנה מידה=20 מיקרומטר. (א') ניתוח סטטיסטי של הקצב הפאגוציטי ואינדקס הפאגוציטי ב-Foxo-knockdown שרימפס. קבוצת הזרקת dsGfp שימשה כביקורת. חמש מאות המוציטים נספרו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בכל ניסוי. הנתונים נותחו סטטיסטית באמצעות מבחן t של Student. (ב) phagocytosis חיידקי על ידי hemocytes מנותח באמצעות cytometry זרימה. ההמוציטים הפגוציטים המכילים חיידקים (R2) הופרדו מהמוציטים שאינם פגוציטים (R3) בהתבסס על אות פלואורסצנטי של חיידקים מסומנים בהמוציטים באמצעות תוכנת IDEAS Application v6.0. (ב') שיעור הפאגוציטים של המוציטים בהתבסס על נתוני הזרימה הציטומטרית. שלושת אלפים המוציטים נספרו עבור כל ניתוח ובוצעו שלוש חזרות. קבוצת dsGfp שימשה כביקורת. (ג) hemocyte phagocytosis של V. anguillarum ב Akt knockdown שרימפס להתבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה=10 מיקרומטר. (ג') ניתוח סטטיסטי של קצב פגוציטי ואינדקס פגוציטי מבוסס על נתונים בפאנל (C). (ד) רמת ביטוי ה-mRNA של Srb ו-Src בהמוציטים מ-Foxo knockdown shrimp מנותחת על ידי qPCR באמצעות ביטוי ממוצע גיאומטרי של -actin ו-Ef-1 כגנים בקרה אנדוגניים. הזרקת dsGfp שימשה כבקרה. (ה) ביטוי ה-mRNA של Srb ו-Src במעיים של שרימפס Foxo-RNAi מנותח על ידי qPCR באמצעות ביטוי ממוצע גיאומטרי של -actin ו-Ef-1 כגנים בקרה אנדוגניים. (ו) ביטוי ה-mRNA של Src בהמוציטים של שרימפס Akt-RNAi מנותח על ידי qPCR באמצעות ביטוי ממוצע גיאומטרי של -actin ו-Ef-1 כגנים בקרה אנדוגניים. (ז) רמת החלבון של SRC בהמוציטים של שרימפס Foxo-RNAi או Akt-RNAi, כפי שנותח באמצעות סופג מערבי. הזרקת dsGfp משמשת כשליטה. (ז') הניתוח הסטטיסטי המבוסס על נתונים של שלושה שכפולים של פאנל (G).

חומרים ושיטות

אמירה אתית

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הלאומיות של סין (GB 14922.2-2011 ו-GB 14925-2010). ניסויי הארנב להכנת נוגדנים במחקר בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי צוות ה- Animal Care & Welfare Commit בבית הספר למדעי החיים של אוניברסיטת שאנדונג (SYDWLL-2021-54). האישור על פי תקנות השימוש בשרימפס במחקר שלנו לא היה הכרחי מכיוון שהמחקר שלנו השתמש במספר מצומצם של שרימפס נפוצים הנצרכים לעתים קרובות על ידי הקהילה הרחבה.

בעלי חיים

שרימפס בריא (Marsupenaeus japonicus), במשקל של כ-6-10 גרם כל אחד, הושגו משוק המוצרים המימיים בצ'ינגדאו, מחוז שאנדונג, סין. לפני הניסוי, שרימפס תורבת במשך יום אחד לפחות במערכת תרבית השרימפס עם מי ים מאווררים ב-23-25 ​​מעלות צלזיוס להסתגלות לסביבה החדשה.

איור 8. RAB5 ו-RAB7 מעורבים בפאגוציטוזיס בתיווך FOXO של המוציטים בשרימפס. (A, B) qPCR שימש כדי לנתח את רמות ביטוי ה-mRNA של Rab5 ו-Rab7 בהמוציטים של Foxo-knockdown shrimp (A) ו- Akt-knockdown shrimp (B) עם ובלי זיהום חיידקי. ה-qPCR השתמש בביטוי ממוצע גיאומטרי של -actin ו-Ef-1 כגנים בקרה אנדוגניים. (ג) רמות החלבון של RAB5 ו-RAB7 בהמוציטים של שרימפס Foxo-knockdown ב-2 שעות לאחר אתגר V. anguillarum נקבעו באמצעות סופג מערבי. (ג') הניתוח הסטטיסטי המבוסס על נתונים של שלושה שכפולים של פאנל (C). (ד) רמות החלבון של RAB5 ו-RAB7 בהמוציטים של שרימפס Akt-knockdown ב-2 שעות לאחר אתגר V. anguillarum נקבעו באמצעות סופג מערבי. (ד') הניתוח הסטטיסטי המבוסס על נתונים של שלושה שכפולים של פאנל (ד).

ניתוח ביואינפורמטי

רצף ה-cDNA באורך מלא של Foxo התקבל מרצף תעתיק של המוציטים ותעתוק המעי של M. japonicus (BGI, שנזן, סין). מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של Foxo הוגברה באמצעות זוג פריימרים (Foxo-EX-F ו-Foxo-EX-R; טבלה 1) לאישור הרצף. ה-cDNA המתאים תורגם קונספטואלית להשגת רצף החלבון המוסק באמצעות כלי ה-ExPASy-Translation (http://cn.expasy.org/). ניתוח דמיון בוצע באמצעות BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/), וחיזוי ארכיטקטורת התחום בוצע באמצעות SMART (http://smart.emblheidelberg.de). עץ פילוגנטי של FOXOs ממינים שונים נבנה באמצעות תוכנית MEGA 6.0 [54].

איור 9. RAB5 ו-RAB7 מתמקמים יחד עם V. anguillarum. שיתוף הלוקליזציה של RAB5 ו-RAB7 עם FITC שכותרתו-V. anguillarum בהמוציטים של שרימפס, כפי שנותח באמצעות בדיקה אימונוציטוכימית פלואורסצנטית. החיידקים סומנו ב-FITC (ירוק) והוזרקו לשרימפס. המוציטים נאספו מחמישה שרימפס לאחר 30 דקות ושעה לאחר הזרקת חיידקים והודגרו עם נוגדנים אנטי-RAB5 או אנטי-RAB7. הנוגדן המשני היה antirabbit IgG Alexa-546 (אדום). גרעינים נצבעו ב-DAPI (כחול). לוקליזציה משותפת בהמוציטים מסומנת על ידי חיצים לבנים. סרגל קנה מידה=10 מיקרומטר.

איור 10. ייצוג סכמטי של מעורבות FOXO בחסינות מולדת מקומית ומערכתית בשרימפס. (א) בתנאים לא נגועים, FOXO שומר על ההומיאוסטזיס של ההמולימפה והמיקרוביוטה של ​​המעי על ידי קידום Relish ולאחר מכן ביטוי AMP. (ב) בתנאים נגועים, זרחון AKT מופחת על ידי זיהום פתוגן, וכתוצאה מכך עלייה בתכולת FOXO בגרעין. FOXO מקדם ישירות את הביטוי של Relish ו-AMPs כדי לחסל פתוגנים פולשניים; מצד שני, FOXO מקדם את הפגוציטוזיס של פתוגנים דרך מסלול הפגוציטוזיס בתיווך SRC.

אתגר חיידקים ואיסוף דגימות

Vibrio anguillarum (ATCC 43305) שהושג מ-Marine College, אוניברסיטת שאנדונג (Wei Hai, סין) ועכשיו נשמר במעבדה שלנו. V. anguillarum התרבית בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס במדיום LB ותופח מחדש במשך 4 שעות בחיסון 1:100 ביום השני. החיידקים בשלב הצמיחה הלוגריתמי נאספו בצנטריפוגה ב-5000 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ונשטפו פעמיים עם מי מלח מבוצר פוספט (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, ו-1.8 mM KH2PO4 pH 7.4). V. anguillarum מושלה מחדש בתמיסת מלח מפוצלת בפוספט לאתגר שרימפס. כ-2 × 107 יחידות יוצרות מושבות (CFU)/שרימפס הוזרקו לבטן של כל שרימפס באמצעות מזרק מיקרו. לקבוצת הביקורת הוזרק אותו נפח של PBS. ההמוציטים, הלב, הלבלב, הזימים, הקיבה והמעיים נאספו מלפחות שלושה שרימפס לצורך מיצוי RNA וחלבונים. לאיסוף המוציטים, ההמולימפה חולצה מהסינוס הגחוני באמצעות מזרק שהוטען מראש ב-0.8 מ"ל של חיץ נוגד קרישה (10% נתרן ציטראט), ולאחר מכן עברה צנטריפוגה במהירות ב-700 × גרם למשך 8 דקות ב-4°C לבידוד המוציטים.

מיצוי RNA וחלבונים, וסינתזת cDNA

RNA כולל הוצא מההמוציטים ואיברים שונים של שרימפס באמצעות TRIzol (ET101, Transgen, בייג'ינג, סין). חלבונים מהאיברים השונים חולצו באמצעות בדיקת Radioimmunoprecipitation (RIPA) Lysis Buffer (P0013B, Beyotime, Jiangsu, סין). סינתזת cDNA של גדיל ראשון בוצעה באמצעות ערכת סינתזת cDNA (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Biological Materials-abm, ונקובר, קנדה), בהתאם להוראות היצרן.

טבלה 1. רצפים של פריימרים בשימוש במחקר זה.

מאסטרמיקס; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, קנדה), בהתאם להוראות היצרן.

ביטוי רקומביננטי והכנת נוגדנים

רצף ה-cDNA של Foxo הוגבר על ידי תגובת שרשרת פולימראז בשעתוק הפוכה (RT-PCR) באמצעות פריימרים Foxo-EX-F ו-Foxo-EX-R (טבלה 1). מוצרי ה-PCR המטוהרים עוכלו לאחר מכן באמצעות אנזימי הגבלה וקשרו לתוך פלסמיד pGEX-4T-1 (GE Healthcare, Piscataway, ניו ג'רזי, ארה"ב). והפלסמידים שנבנו הועברו לתאי Escher ichia coli Rosseta (DE3). ביטוי חלבון הושרה באמצעות 1 mM isopropyl- - D-thio galactopyranoside ב-37°C. החלבונים הרקומביננטיים עברו כרומטוגרפיה זיקה באמצעות שרף גלוטתיון (GST) (C600031, BBI, שנחאי, סין), בהתאם להוראות היצרן. אנטיסרה של ארנב נגד FOXO הוכנה על פי שיטה שתוארה בעבר [55].

סופג מערבי

החלבונים שהופקו מאיברים או המוציטים שונים הופרדו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל (SDS-PAGE) של 10% סודיום דודציל סולפט פולי-אקרילאמיד. החלבונים בג'לים של SDS-PAGE הועברו לממברנת חנקתי תאית באמצעות חיץ העברה (25 mM Tris-HCl, 20 mM גליצין, 0.037% mM SDS ו-20% אתנול) והודגר בחלב דל שומן 5% או 3% אלבומין בסרום בקר (BSA) בתמיסת מלח טריס (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8.0) למשך שעה אחת עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הדגירה הממברנות עם אנטי-סרום ראשוני: Anti-FOXO בדילול 1:100, אנטי-RAB5 ב-1:25, אנטי Rab7 ב-1:25, אנטי-בטא אקטין (ACTB) ב-1:250 (הוכן במעבדה שלנו ); נוגדנים פולי שבטיים של היסטון-3 (A2348, ABclonal, ווהאן, סין, 1:2500); נוגדנים פוליקלונליים אנטי-פוספורילטים (p)-AKT (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, סין, 1:500) ומנערים בעדינות במשך הלילה ב-4°C. לאחר כביסה שלוש פעמים עם TBST (0.1% Tween-20 נוסף ל-TBS), הממברנות הודגרו עם נוגדן משני (ZB2308 ZSGB-Bio, בייג'ינג, סין, 1:5,000) או ( ZB2301 ZSGB-Bio, בייג'ינג, סין, 1:5,000) למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין. רצועות החלבון האימונראקטיביות פותחו באמצעות תמיסת nitrotetrazolium כחול כלוריד (A610379, BBI) ומלח P-toluidine (A610072, BBI) בתנאי חשיכה או באמצעות כימילומינסנציה מוגברת (ECL). -אקטין או היסטון-3 השתמשו בהתייחסותs.

תפוצת רקמות ודפוסי ביטוי בשרימפס מאותגרים על ידי חיידקים

התפלגות הרקמות של Foxo/FOXO בהמוציטים, הלב, הזימים, ליחה, הקיבה והמעיים נותחה באמצעות RT-PCR עם פריימרים Foxo-F ו-FOXO-R (טבלה 1) ובאמצעות סוטה מערבית עם נוגדנים נגד FOXO, בהתאמה. הליך ה-PCR כלל דגירה ראשונית ב-94°C למשך 3 דקות; ואחריו 35 מחזורים של 94°C למשך 30 שניות, 50˚C למשך 30 שניות ו-72˚C למשך 30 שניות; ואחריו 72˚C למשך 10 דקות. תוצרי ה-PCR נותחו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל agarose (1.5% agarose). הגן -אקטין (-actin-F ו-actin-R; טבלה 1) שימש כבקרה פנימית. דפוסי הביטוי של מהלך הזמן של Foxo/FOXO ברמות ה-RNA והחלבון בשרימפס שאותגר עם V. anguillarum נותחו באמצעות PCR בזמן אמת כמותי (qPCR) במחזור תרמי (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, גרמניה) ועל ידי western blotting, בהתאמה. הליך qPCR כלל: 95˚C למשך 10 דקות; 40 מחזורים ב-95˚C למשך 10 שניות ו-60˚C למשך 50 שניות; ולאחר מכן תקופת התכה מ-65˚C עד 95˚C. קבצי ה-Expression pro של Foxo הופקו בשיטת 2-ΔΔCT [56] תוך שימוש בממוצע הגיאומטרי של שני גני הבקרה הפנימיים של -actin ו-Ef-1 לנורמליזציה. היעילות של זוג פריימר ב-qPCR נותחה לפי שיטת MIQE [57] עם דילול לוגריתמי פי 10- של תערובת cDNA ליצירת עקומה סטנדרטית ליניארית.

בידוד של חלבונים גרעיניים וציטופלסמיים

רקמת המעי נותחה משרימפס ונשטפה ב-PBS שלוש פעמים. מיצוי חלבון בוצע באמצעות ערכת מיצוי חלבון גרעיני וציטופלזמי (R0050, Solarbio, בייג'ינג, סין) בהתאם להוראות היצרן. לפחות שלושה שרימפס שימשו למיצוי חלבון כדי לבטל הבדלים בודדים.

בדיקת הפרעות RNA

כדי לנתח את תפקוד הגנים, ביצענו מבחני הפרעות RNA (RNAi). מספר זוגות של פריימרים המכילים את רצף המקדם T7 (Foxo-RI-F ו-Foxo-RI-R; Rab5-RI-F ו-Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F ו-Rab7 -RI-R; Akt-RI-F ו-Akt-RI-R. טבלה 1) תוכננו כדי להגביר את התבניות לסינתזת dsRNA. באמצעות פולימראז T7 RNA (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) ותבנית cDNA, סנתזנו את שברי ה-dsRNA. חלבון פלואורסצנטי ירוק כפול גדילי dsGfp RNA שימש כבקרה, שהוגבר באמצעות Gfp-RI-F ו-Gfp -RI-R (טבלה 1) כפריימרים לסינתזה של dsGfp. לאחר מכן, שברי ה-dsRNA (50 ug/כל אחד) הוזרקו למקטע הבטן של M. japonicus באמצעות מזרק מיקרו והזרקה שנייה בוצעה כעבור 12 שעות תוך שימוש באותה מנה. יעילות הפרעות RNA נותחה באמצעות PCR כמותי בזמן אמת של שעתוק לאחור (qRT-PCR, הכוללת שעתוק הפוך של RNA ליצירת cDNA, ששימש אז כתבנית במבחן qPCR) או ווסטרן סופג 24 שעות לאחר ההזרקה השנייה. -אקטין שימש כהתייחסות פנימית.

הפניות

1. Calnan DR, Brunet A. The FoxO code. אונקוגן. 2008; 27(16):2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.

2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS, et al. גירוי מסלול תיקון DNA המופעל על ידי גורם שעתוק המזלג FOXO3a דרך החלבון Gadd45. מַדָע. 2002; 296 (5567):530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.

3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. יחי FOXO: פירוק התפקיד של חלבוני FOXO בהזדקנות ואורך החיים. תא מזדקן. 2016; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.

4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. בקרת שכבה משולשת-זרחון, אצטילציה ו-ubiquitination של חלבוני FOXO. מחזור התא. 2005; 4(7):908–913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. Regulation of FoxO transcription factors by acetylation and pro tein-protein interactions. Bba-Mol Cell Res. 2011; 1813(11):1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.

6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. גורמי שעתוק FOXO: המשמעות הקלינית שלהם וויסותם. Biomed Res Int. 2014; 2014:1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.

7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J, et al. גנים הפועלים במורד ה-DAF-16 כדי להשפיע על תוחלת החיים של Caenorhabditis elegans. טֶבַע. 2003; 424(6946):277– 284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. מסלולי אינסולין/IGF-1R, SIRT1 ו-FOXOs - פלטפורמת אינטראקציה מסקרנת עבור עצמות ואוסטאוסרקומה. אנדוקרינול פרונט (לוזן). 2019; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.

9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, et al. אקט מקדם את הישרדות התאים על ידי זרחון ועיכוב גורם שעתוק של המזלג. תָא. 1999; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.

10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA, et al. Skp2 מעכב FOX01 בדיכוי הגידול באמצעות פירוק בתיווך יוביקוויטין. P Natl Acad Sci ארה"ב. 2005; 102(5):1649– 1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.

11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA, et al. גורם שעתוק ראש המזלג DAF-16 משדר אותות מטבוליים ואריכות ימים דמויי אינסולין ב-C. elegans. טֶבַע. 1997; 389 (6654):994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.

12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Instinal FoxO איתות נדרש כדי לשרוד זיהום אוראלי ב-Drosophila. רירית אימונול. 2016; 9(4):927–936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.

13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO מווסת התערבות RNA ב-Drosophila ומגן מפני זיהום בנגיף RNA. P Natl Acad Sci ארה"ב. 2015; 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.

14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 מקדם הומאוסטזיס חיסוני במעיים כדי להגביל commen sal dysbiosis ולהאריך את תוחלת החיים. תָא. 2014; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.

15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P, et al. ויסות תלוי FOXO של הומאוסטזיס חיסוני מולד. טֶבַע. 2010; 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.

16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M, et al. גורמי שעתוק FOXO מווסתים מנגנוני חיסון מולדים בתאי אפיתל נשימתיים. J Immunol. 2013; 190(4):1603–1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.

17. Graves DT, Milovanova TN. חסינות רירית וגורמי שעתוק FOXO1. אימונול קדמי. 2019; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.

18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. פפטידים אנטי-מיקרוביאליים: מחסרי חוליות ועד חולייתנים. Immunol Rev. 2004; 198:169–184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.

19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Immunity in Drosophila melanogaster - מהכרה מיקרוביאלית לפיזיולוגיה של אורגניזם שלם. Nat Rev Immunol. 2014; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.

20. Hoffmann JA, Reichhart JM. חסינות מולדת של תסיסנית: פרספקטיבה אבולוציונית. נאט אימונול. 2002; ג(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.

21. חסינות Hultmark D. Drosophila: נתיבים ודפוסים. Curr Opin Immunol. 2003; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.

22. Li FH, Xiang JH. ההתקדמות האחרונה במחקרים על החסינות המולדת של שרימפס בסין. Dev Comp Immunol. 2013; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.

23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. קשירה של תחום ה-coil-coil של לקטין מסוג C לקולטן Domeless מפעילה ישירות את מסלול JAK/STAT בתגובה החיסונית של השרימפס לזיהום בקטריאלי. PLoS Pathog. 2017; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.

24. Gordon S. Phagocytosis: תהליך אימונוביולוגי. חֲסִינוּת. 2016; 44(3):463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.

25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ, et al. נדרשת אוטופגיה בתיווך FoxO1- להתפתחות תאי NK ולחסינות מולדת. נאט קומון. 2016; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.

26. Dong G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J, et al. FOXO1 מווסת את פעילות נויטרופילים הנגרמת על ידי חיידקים. אימונול קדמי. 2017; 8:1088–1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.

27. Wang XW, Zhao XF, Wang JX. לקטין מסוג C נקשר לבטא-אינטגרין כדי לקדם פגוציטוזיס המוציטי בחסר חוליות. J Biol Chem. 2014; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.

28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. ללמד שרימפס הגנה עצמית כדי להילחם בזיהומים. טרנדים ביוטכנולוגיה. 2019; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.

29. Flegel TW. הופעה היסטורית, השפעה ומצב נוכחי של פתוגני שרימפס באסיה. J Invertebr Pathol. 2012; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.

30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. הגנה אנטי-ויראלית בשרימפס: מחסינות מולדת ל-intionfec ויראלית. Antivir Res. 2014; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.

31. Obsil T, Obsilova V. יחסי מבנה/תפקוד העומדים בבסיס הרגולציה של גורמי שעתוק FOXO. אונקוגן. 2008; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.