כיצד החומר הצמחי Acteoside מעכב את תאי הגידול?

איש קשר: אודרי הו וואטסאפ/כ"ס: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

מופשט

מוצרים טבעיים מאופיינים במגוון מבני קיצוני ולכן הם מציעים מקור ייחודי לזיהוי של חומרים אנטי סרטניים חדשים. כאן אנו מדווחים כי החומר הצמחיאקטאוזידבידוד על ידי שיטות פיטוכימיות מתקדמות מעלי ליפיה ציטריודורה הראו ציטוטוקסיות מוגברת נגד תאי גידול גרורתיים; פעל בסינרגיה עם חומרים ציטוטוקסיים שונים ותאי סרטן כימורסיסטיים רגישים.אקטאוסידמהרבה ציסטנצ'הלא היה רעיל בהקשרים תאיים פיזיולוגיים, בעוד שהוא הגביר את עומס החמצון, השפיע על פעילותם של מודולים פרוטאוסטטיים, ודיכא את המטאלופרוטאינזות של מטריצה בקווי תאי הגידול. מתן תוך-צפקי או אוראלי (באמצעות מי שתייה) שלcistancheאקטאוזיד במודל עכבר מלנומה העלה את התגובות נוגדות החמצון בגידולים; עם זאת, רק לידה תוך-צפקית דיכאה את צמיחת הגידולים וגרמה לתגובות חיסוניות אנטי-סרטניות-תגובתיות. זיהוי/ניתוחי כמות של ספקטרומטריית מסה גילו כי אספקה תוך-צפקית שלאקטאוזידהביאה לכך שריכוז התרכובת בפלזמה ובגידולים של עכברים שטופלו היה גבוה יותר באופן משמעותי, מה שמרמז על כך שהיא in vivo אנטי-סרטנית, תלויה בדרך המתן ובריכוז שהושג בגידול. לבסוף, מחקרי מידול מולקולרי ומבחני פעילות אנזימטית הראו כי אקטאוזיד מעכב חלבון קינאז C. באופן חד משמעי, אקטאוזיד טומן בחובו הבטחה כפיגום כימי לפיתוח חומרים אנטי-סרטניים חדשים.

מילות מפתח:אקטאוסידסרטן, תרכובת טבעית, עקה חמצונית, פרוטאוסטזיס, אימונומודולציה,

Cistanche anti-tumor, לחץ כאן כדי לקבל את הדגימה

1. מבוא

קרצינוגנזה מאופיינת בדה-רגולציה של מספר מסלולי איתות תאיים, והיא קשורה לעקה חמצונית תאית מוגברת, משכפלת, מטבולית, גנוטוקסית ופרוטאוטוקסית [1]. כדי להתאים ולהתגבר על פנוטיפים אלה של עקה, תאים ממאירים מווסתים (מלבד אונקוגן) מספר מסלולים לא אונקוגניים שמטרתם לדכא או (לפחות) להקל על הלחץ המתמשך. בין המסלולים הלא-אונקוגניים השונים שנמצאו לעתים קרובות מווסתים במהלך הגידול, נמצאים המודולים של רשת הפרוטאוסטזיס (PN) יחד עם תגובות נוגדות חמצון תאיות [2,3].

מרכיבים מרכזיים של ה-PN הם שני מנגנוני הפירוק העיקריים, כלומר מסלול האוטופגיה-ליזוזום (ALP) ומסלול יוביקוויטין-פרוטאזום (UPP), יחד עם הרשת של המלווים המולקולריים התאיים. ALP מעורבת בעיקר בפירוק של אגרגטי חלבונים ואברונים פגומים [4], בעוד ש-UPP מפרק חלבונים קצרי מועד רגילים וחלבונים שאינם ניתנים לתיקון מקופלים או נפרשים [5–8]. הפרוטאזום הסוקריוטי 26 מורכב מהחלקיקים הרגולטוריים של 19S (RP) ומהחלקיק בעל 20 הניקוד (CP); האחרונה מורכבת מארבע טבעות הפטמריות מוערמות (שתיים מסוג α המקיפות שתיים מסוג β) היוצרות מבנה דמוי חבית. פעילויות הפרוטאזוזום דמוי הכימוטריפסין (CT-L), דמויות טריפסין (T-L) ודמויות קספאזה (C-L) ממוקמות בתת-היחידות הפרוטאזומליות β5, β2 ו-β1 פרוטאסומליות, בהתאמה [6]. היעילות הקלינית המוכחת של מעכבי הפרוטאזומים Bortezomib (Velcade®; נקרא גם PS-341) ו-Carfifilzomib נגד ממאירויות המטולוגיות שונות [9] סיפקה את "הוכחת ההיתכנות" של התמקדות ב-UPP כאסטרטגיה מבטיחה לטיפול בסרטן. הרשת המורכבת של מסלולי הגנה נוגדי חמצון תאיים, שלעתים קרובות מווסתים במהלך קרצינוגנזה [3,10] כוללת אנזימים נוגדי חמצון, כמו גם מספר גורמי שעתוק המעודדים תגובות גנומיות ציטופיות; אלה כוללים את תיבת המזלג O (Foxo) ואת הגורם הגרעיני הקשור לאריתרואיד 2 (Nrf-2). Nrf-2 הוא מרכיב מרכזי בהגנה על תאים מפני נזק חמצוני ו/או קסנוביוטי, שכן הוא מגרה את הביטוי של גנים נוגדי חמצון וגנים שלב II [11-13].

אנו ואחרים הצענו לאחרונה כי התמקדות בתלות בגידולים אלה (כלומר, מודולים פרוטאוסטטיים ו/או מסלולי תגובה נוגדי חמצון) או עלייה ברמות התאית של ROS בהקשר של גנוטיפ שעבר שינוי מציעים חלון טיפולי פוטנציאלי להרג סלקטיבי של תאי הגידול [3,14]; בתמיכה, דווח על הרג סלקטיבי של תאים סרטניים על ידי מולקולה קטנה שהעלתה את רמות ה-ROS התאית [2]. הצפי הוא שגישות קומבינטוריות הכוללות גם הפעלה של תגובות חיסוניות אנטי-סרטניות-תגובתיות [15] צפויות למקסם את החלון הטיפולי המוצע על ידי עיכוב תגובות PN ונוגדות חמצון ו/או על ידי העלאת רמות ה-ROS התאיות.

מוצרים טבעיים (תמציות או תרכובות טהורות) (NPs) ממקורות שונים (צמחים, אורגניזמים ימיים, מיקרואורגניזמים וכו') נבדקים על פי יכולתם לפעול כחומרים אנטי-סרטניים בשל המגוון המבני הקיצוני שלהם ומורכבותם הכימית, כמו גם משום שהם פועלים באופן פליאוטרופי ומווסתים מספר מסלולי איתות תאיים [16]. על פי הדיווחים, NPs מפעילים תגובות אנטי-דלקתיות, אנטי-סרטניות ו/או אנטי-גרורתיות [16,17] וגם מתחמקות מהתנגדות למולטי-דרוגים [18,19]. בין אלה, תרכובות פנוליות (כולל גליקוזידים פנילתנואידים) משכו עניין משמעותי בשל תפקידן המדווח במניעה ו /או טיפול במחלות אנושיות שונות.

אקטאוזיד (שם מדעי: Acteoside), המכונה גם קוסאג'ין או ורבסקוסייד [20], הוא גליקוזיד פנילתנואידי המבודד מדיקוטילדונים רבים. על פי הדיווחים, אקטאוזיד מפעיל כמה פעילויות ביולוגיות מעניינות, כולל תכונות נוגדות חמצון, נוגדות דלקת ואפופטוזיס תאי [21,22]. עם זאת, הפעילות הפוטנציאלית שלה נגד הגידול לא טופלה. אנו מדווחים כאן, כי אקטאוזיד הראה ציטוטוקסיות מוגברת נגד תאים סרטניים של יונקים ללא השפעות רעילות נראות לעין בהקשרים תאיים פיזיולוגיים. יתר על כן, אקטאוזיד דיכא את צמיחת הגידול במלנומה במודל של עכבר in a vivo, על ידי (בין היתר) הפעלת תגובות חיסוניות אנטי-סרטניות-תגובתיות.

תמצית ציסטנצ'ה אנטי-סרטנית

2. חומרים ושיטות

2.1. חומר צמחי ומיצוי

עלי ליפיה ציטריודורה מיובשים (Lamiaceae) (4.5 ק"ג) נרכשו מהשוק המקומי באתונה, יוון. העלים נוקבו וחולצו על ידי ערבוב מכני במשך 12 שעות עם מתנול (2 × 20 ליטר). התמצית המתנולית התאדה ליובש ונשטפה בתערובת של CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 ליטר). השאריות הבלתי מסיסות הופרדו ויובשו, והפיקו אבקה ירוקה-צהובה (450 גרם).

2.2. טיהור ניתוח אקטאוזיד ו-UPLC-HRMS

חלק (10 גרם) מהשאריות הנ"ל היה נתון לכרומטוגרפיה של זרם נגדי באמצעות מנגנון כרומטוגרפיית מחיצה צנטריפוגלית מהירה (FCPC) (קרומטון, צרפת); תערובת של EtOAc/EtOH/H2O ביחס 5/0.5/4.5 שימשה כמערכת ממסים דו-פאזית. השברים שנאספו היו נתונים לכרומטוגרפיה בשכבה דקה; לאחר מכן הכרומטוגרמות נצפו תחת מנורת UV (254 ו-365 ננומטר) והודמיינו על ידי ריסוס עם מתנול ונילין סולפט ואחריו חימום במשך שתי דקות. בסך הכל 2.1 גרם של אקטאוזיד (טוהר ≥ 90%) בודדו בתהליך הנ"ל. זיהוי האקטאוזיד בוצע על ידי ספקטרום תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וספקטרומטריית מסה (MS), בעוד שטוהרו נקבע על ידי ניתוח UPLC-MS ו-NMR; לפרטים ראו חומרים ושיטות.

2.3. קווי תאים

פיברובלסטים עובריים של ריאות אנושיות (תאי IMR90) יחד עם B16. ו1, ב16. קווי תאי העכבר F10, YAC-1 ו-WEHI-164 התקבלו מאוסף תרביות הרקמה האמריקאי (ATCC). קווי תאי האוסטאוסרקומה האנושיים U2 OS ו-Sa OS נתרמו בחביבות על ידי פרופ' ו' גורגוליס (בית הספר לרפואה, האוניברסיטה הלאומית והקפודיסטרית של אתונה, יוון), בעוד שתאי האוסטאוסרקומה של KH OS וקווי תאי האוסטאוסרקומה הכימורסיסטנטיים [23] היו תרומה של ד"ר א. גונוס (הקרן הלאומית למחקר הלני, יוון). קווי תאי סרטן העכברים C5N ו-A5 שייכים למודל רב-שלבי של קרצינוגנזה של עור עכברים [24,25] ונתרמו על ידי פרופ' א. בלמיין (מרכז הסרטן המקיף, אוניברסיטת קליפורניה, ארה"ב). תנאי התרבות של קווי התאים המשומשים מדווחים ב- Suppl. חומרים ושיטות.

היתרון של תמצית ציסטנצ'ה: אנטי-סרטן

2.4. מודל עכבר מלנומה

זכרי עכברי C57BL/6 (25-30 גרם של משקל, 6-8 שבועות של גיל) התקבלו ממכון הפסטר ההלני ושוכנו תחת טמפרטורה מבוקרת (22 מעלות צלזיוס) ופוטופריוד (12 שעות אור:12 שעות חשוך) עם גישה חופשית למים ולמזון. עכברים חוסנו באופן תת עורי עם 105 B16. תאי מלנומה F1 (ב-100 μL PBS) והוקצו באופן אקראי ל-3 קבוצות (n = 5/קבוצה). כאשר הגידולים הפכו מוחשיים (יום 11) עכברים קיבלו אקטאוזיד דרך שני מסלולים; או תוך-צפקית (IP) (1 מ"ג/עכבר מדולל ב-200 μL PBS; בסך הכל 6 מנות הניתנות כל יומיים) או דרך הפה על ידי מי שתייה (OR)(2.5 מ"ג/עכבר; בסך הכל 13 מנות במשך 13 ימים רצופים). עכברי בקרה קיבלו PBS. צמיחת הגידול נרשמה כל יומיים על ידי מדידת הצירים העיקריים והמינוריים של הגידולים שנוצרו באמצעות קליפר דיגיטלי. המדידות הוסבו לנפח הגידול באמצעות הנוסחה: נפח הגידול (cm3) = ציר ראשי × ציר מינורי2 × 0.5. ביום ה-28, בעלי חיים הומתו על ידי נקע צוואר הרחם, וטחולים הוסרו באופן אספטי. הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים עם ממצאים דומים.

ספלנוציטים בודדו מטחולים הומוגניים בנפרד ומיד נבדקו לציטוטוקסיות שלהם לעומת B16. F1, YAC-1 ו-WEHI-164 מטרות תאים. ציטוטוקסיות הוערכה על סמך זיהוי חשיפה ל-CD107 על פני התא, כתוצאה מדגרנולציה של תאי אפקטור. ספלנוציטים (105 תאים/באר) עברו תרבית משותפת עם מטרות במיקרו-לוחות תחתית U של 96-בארות ביחס אפקט למטרה (E: T) של 100:1, ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2. בכל באר נוספו נוגדנים חד-שבטיים נגד CD107a ואנטי-CD107 b מצומדים ב-FITC (25 μL/mL) ו-monensin (6 μL/mL; כולם מ-BD Biosciences). התאים נקטפו 6 שעות מאוחר יותר ונותחו באמצעות ציטומטר זרימת flflow של FACSCanto II. במקביל, גידולים נכרתו ועובדו עבור בדיקות במורד הזרם כפי שמתואר ב- Suppl. חומרים ושיטות.

השפעות תמצית ציסטנצ'ה: אנטי גידול וסרטן