ניתוח פיטוכימי, אנטי-שגשוג חוץ-גופני, נוגד חמצון חלק 1

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

רקע כללי:Rumex rothschildianus הוא החבר היחיד במדור ייחודי מהסוג Rumex, במשפחת הפוליגונציים. מין זה הוא שנתי נדיר מאוד נדיר, אנדמי לפלסטין המשמש באופן מסורתי כמזון ולטיפול במחלות שונות. לכן, החקירה הנוכחית נועדה לסנן את המרכיבים הכימיים, נוגדי חמצון, אנטי-עמילאז, אנטי-גלוקוזידאז, לצפות את ההשפעות הציטוטוקסיות של ארבעה חלקי ממסים של עלי R. rothschildianus.

שיטות:אבקה מיובשת של עלי ר. רוטשילדיאנוס הופצה בארבעה ממסים בעלי קוטביות שונות. בוצעו מספר בדיקות פיטוכימיות איכותיות וכמותיות לקביעת מרכיבי התמציות. הניתוח הקולורימטרי שימש לקביעה כמותית של פנולים, פלבנואידים וטאנינים. בדיקות חוץ גופיות בוצעו כדי להעריך את התמציות של נוגדי חמצון, אנטי-עמילאז, אנטי-א-גלוקוזידאז, ולצפות פעילויות מעכבות, כמו גם ציטוטוקסיות על ידי בדיקת MTS נגד קו תאי קרצינומה צוואר הרחם (HeLa) וקו תאי סרטן השד (MCF7).

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

תוצאות:שבריר האצטון של עלי R. rothschildianus הראה את המשמעותי ביותרנוגד חמצוןפעילות, עקב התוכן הגבוה ביותר של פלבנואידים ופנולים, עם ערך ICso של 6.3±0.4 ug/ml, בהשוואה ל-3.1±0.9 ug/ml עבור Trolox, ולגבי Trolox. פעילות עיכוב ליפאז שבריר האצטון הראה את הפעילות החזקה ביותר עם ערך ICso של 26.3±{{10}}.6 ug/ml, בהשוואה לביקורת חיובית של orlistat ICso 12.3 ug/ml. אותה תמצית הייתה המעכב החזק ביותר של a-עמילאז ו-a-glucosidase, עם ערכי ICso של 19.1±0.7 ug/ml ו-54.9±0.3 ug/ml, בהתאמה, בהשוואה. עד 28.8, 37.1±0.3 ug/ושל acarbose, בהתאמה. חלק ההקסאן הראה 99.9 אחוז עיכוב של תאי HeLa ו-97.4 אחוז עיכוב עבור תאי MCF7.

סיכום:חלק האצטון של עלי R. rothschildianus עשוי לספק מקור לתרכובות ביו-אקטיביות לטיפול בלחץ חמצוני. באופן דומה, חלק ההקסאן מצביע על הפוטנציאל האנטי-גידול המבטיח של R. rothschildianus. ברור שהאינדיקציות הראשוניות הללו זקוקות לטיהור נוסף של תרכובות פעילות פוטנציאלית, ובסופו של דבר, מחקרים in vivo כדי לקבוע את יעילותן.

מילות מפתח:Rumex rothschildianus, נוגד חמצון, ליפאז, עמילאז, טרולוקס, פיטוכימיה, פעילות אנטי-שגשוגית

רקע כללי

צמחים שימשו כטיפול מאז ימי קדם. שורשים, זרעים, קליפות עץ, עלים ופרחים שימשו כולם למטרות תיקון. כיום, תרופות סינתטיות זמינות ויעילות בטיפול במגוון רחב של מחלות; עם זאת, חלק מהאנשים עדיין מעדיפים תרופות צמחיות מכיוון שהן נתפסות כפחות מזיקות לגוף האדם [1,2]. צמחי מרפא הם בהגדרה המקור לתרכובות פיטוכימיות בעלות פעילות טיפולית. תכונות אלו מסתמכות על נוכחותם של מטבוליטים משניים שונים, כגון פנולים, טרפנואידים ואלקלואידים [3]. Rumex rotschildianus אהרון. הוא החבר היחיד במדור ייחודי מהסוג Rumex, במשפחת Polygonaceae. מין זה הוא שנתית נדירה מאוד להפליא, אנדמית בפלסטין. גובהו הממוצע הוא 45 ס"מ והוא מאופיין בגבעולים זקופים המחזיקים עלי פטוטרת רדיקליים, שהם קצרים-חפזים בבסיסם וקצרים בקודקודם. פרחים בקוטר של 3-4 מ"מ, בעוד שלפרחי פיסטלה קוטר של כ-2 מ"מ עם שכבה קרומית קוריאטית [4]. Rumex spp. נפוצים באזורים שונים של טורקיה, ומיוצגים על ידי 22 מינים. כמה מהמינים הנפוצים ביותר הם R. patientia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus ו-R. caucasicus הם צמחים רב-שנתיים המופצים באנטוליה האמצעית והמזרחית בגובה של {{10 }} מ' מעל פני הים. הסוג Rumex נמצא בשימוש נרחב ברפואה המסורתית בטורקיה לטיפול בהפרעות, כגון עצירות, שלשולים ואקזמה [5, 6]. לסוג יש גם השפעות משלשלות, משתנות, נוגדות חום, ריפוי פצעים ואנטי דלקתיות. אנשים רבים בחלק המזרחי של טורקיה משתמשים בעלים הצעירים של Rumex spp. כחומר משמר בגבינה, וכן נותן ארומה למאכל [7].

מגוון מחקרים בוצעו על מיני רומקס, כגון פעילויות אנטי-מיקרוביאליות המדווחות עבור מינים מסוימים. כמה פיטוכימיקלים ביו-אקטיביים נמצאו בעבר ב-Rumex Vicarious L, כגון קרוטנואידים, טוקופרולים, פוליפנולים, פלבנואידים וחומצה אסקורבית, שיש להם תפקיד כנוגדי חמצון וחומרים טבעיים לניקוי רעלים. הצריכה התזונתית של פיטוכימיקלים נוגדי חמצון, כמו קרוטנואידים,פנולים, ופלבנואידיםעשוי להגן מפני מחלות לא מדבקות בבני אדם, כגון סרטן, הפרעות קרדיווסקולריות ובעיות בריאות אחרות הקשורות ללחץ חמצוני [5, 8]. ידוע כי רדיקלים חופשיים מזיקים ממלאים תפקיד חשוב בבעיות בריאותיות רבות, כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם, דלקת מפרקים שגרונית, קטרקט,מחלת אלצהיימר, ומחלות ניווניות אחרות הקשורות להזדקנות. נוגדי חמצון הם רכיבים מועילים המנטרלים את הרדיקלים החופשיים הללו לפני שהם יכולים לתקוף תאים, ומכאן שהם מונעים נזק לחלבוני תאים, שומנים ופחמימות. מגוון נוגדי חמצון טבעיים וסינטטיים הוצעו לטיפול במחלות אנושיות. עניין כזה בתפקידם של נוגדי חמצון בבריאות האדם עורר מחקר בתחומי מדעי המזון וצמחי מרפא, הערכת תפקודם של צמחי מרפא כנוגדי חמצון. פעולה נוגדת חמצון כוללת יכולת סילוק רדיקלים חופשיים, עיכוב של חמצון שומנים, יכולת קלאטת יוני מתכת וגם הפחתת יכולת [9,10].

סרטן הוא אחת מבעיות הבריאות העולמיות ביותר. הפיתוח והגילוי של תרופות חדשות נגד סרטן נותרו חשובים ביותר בשל גורמים שונים. גורמים אלה כוללים טיפולים שעלולים לגרום לתופעות לוואי גדולות או עלולים להיות יקרים למדי. חלופות בטוחות יותר מבחינה ביולוגית ובמחיר סביר יותר עדיין רצויות מאוד [11-14].

כמה מיני צמחים נחשבים למקורות פוטנציאליים של מולקולות ביו-אקטיביות כגון אטרופין מעלי בלדונה, קוקאין מעלי קוקה, וינקריסטין מצמח וינקה ועוד רבים אחרים שעדיין ממלאים תפקיד חשוב ברפואה המודרנית [15,16].

השפעות טיפוליות שימושיות יכולות להגיע מערבוב מוצרים משניים הקיימים בצמחי מרפא. תרכובות אלו הן לרוב מטבוליטים משניים, כמו אלקלואידים, סטרואידים, טאנינים, פלבנואידים ופנולים, אשר מסונתזים ומושקעים בחלקים ספציפיים של צמחים אלו [17,18]. המחקר הנוכחי חוקר את פעילויות אנטי-א-עמילאז, אנטי- -גלוקוזידאז, אנטי-ליפאז, אנטי-שגשוג ונוגדי חמצון במבחנה של חלקים שונים המופקים מעלי R. rothschildianus.

שיטות

חומר צמחי, כימיקלים ומכשירים

עלי R. rothschildianus נקצרו מאזורים מערביים של פלסטין, בין פברואר למרץ 2018. הם זוהו על ידי ד"ר נידאל ג'רדאת, מהמעבדה לפרמקוגנוזה באוניברסיטה הלאומית An-Najah, תחת קוד דגימת השובר Pharm-PCT{{3} }. כל הכימיקלים נרכשו מ-Sigma-Aldrich. ספקטרופוטומטר-UV/Visible (תואר ג'נווי 7135, Stafford-shire, בריטניה), ניירות סינון (Whitman No. 1, וושינגטון, ארה"ב), מכשיר שייקר (Memmert 531-25-1, שטוקהולם, שוודיה), מכשיר rotavap (Heidolph) -VV 2000, Schwa-bach, גרמניה), מטחנה (Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, סין), איזון אלקטרוני (Radwag, AS 220/c/2, Torunska, פולין), מייבש הקפאה-BT85 (Millrock Technology, סין) ו-cryo-desiccator (Mill-rock technology, BT85, Kingston, ארה"ב) היו בשימוש.

הכנת תמציות ופירוק

אבקה מיובשת של עלי R. rothschildianus חולצה על ידי הוספת ממיסים ברצף על סמך הקוטביות שלהם, החל מהממס הלא קוטבי הקסאן, ולאחר מכן אצטון (ממס אורגני אפרוטי קוטבי), מתנול (אלכוהול קוטבי), ולבסוף מים מזוקקים (א) ממס פרוטי קוטבי). עבור כל מיצוי, כ-25 גרם של עלים יבשים טחונים הונחו ב-0.51 הקסאן למשך 72 שעות במכשיר שייקר ב-100 סיבובים לדקה ב-25 מעלות. ראשית, ההקסאן הוחלף ב-0.5 ליטר אצטון, ולאחר מכן החלפה כללה נפחים שווים של מתנול ומים. הדגירות בממסים היו כמתואר לעיל עבור הקסאן. כל חלק אורגני סונן ורוכז תחת ואקום במאייד סיבובי, בעוד שהחלק המימי ייבוש באמצעות מייבש הקפאה. לבסוף, כל השברים הגולמיים אוחסנו ב-4 מעלות [19,20].

התשואה של כל שבר חושבה באמצעות הנוסחה הבאה:

הערכה פיטוכימית ראשונית

בדיקות סקר פיטוכימיות של עלי R. rothschildianus בארבעה חלקים בוצעו כדי לזהות מטבוליטים משניים פעילים. התוצאות האיכותיות הובעו כ- (פלוס) עבור נוכחות ו- (-) עבור היעדר פיטוכימיקלים ביו-אקטיביים[10,21].

קביעת התוכן הפנולי הכולל (TPC)

ההליך לקביעת TPC התבסס על זה של Cheung et al. TPC התבטא במיליגרם של שווי חומצה גאלית לגרם משקל יבש של עלים (מ"ג GA/ג משקל יבש). תמיסת נתרן קרבונט שהוכנה טריה של 7.5 אחוז הוכנה על ידי הנחת 7.5 גרם Na2CO3 בבקבוקון נפח והתאמת הנפח ל-100 מ"ל עם מים מזוקקים. תמיסת ייחוס סטנדרטית (תמיסת חומצה גאלית) הוכנה על ידי המסת 100 מ"ג של חומצה גאלית במים מזוקקים לנפח סופי של 100 מ"ל. מתוך כך, בוצע דילול סדרתי לקבלת תמיסות של חומצה גאלית ב-100,70,50,40 ו-10ug/ml）. תמיסות המניות של השברים מעלים הוכנו על ידי המסת 100 מ"ג של תמצית צמחים במים מזוקקים, והותאמו לנפח כולל של 100 מ"ל. תערובות תגובה הוכנו על ידי ערבוב של 0.5 מ"ל מכל תמיסה עם 2.5 מ"ל של ריאגנט Folin-Ciocalteu של 10 אחוז, שהומס במים עם 2.5 מ"ל של 7.5 אחוז נתרן ביקרבונט. צינורות הדגימה הודגרו במשך 45 דקות ב-45 מעלות. לאחר מכן, הספיגה של כל אחד נמדדה בספקטרופוטומטר באורך גל של 765 ננומטר. דגימות העבודה הוכנו בשלושה עותקים עבור כל ניסוי אנליטי, שממנו חושבו ערכי הממוצע וסטיית התקן [21].

קביעת תכולת הפלבנואידים הכוללת (TFC)

ה-TFC בארבעת שברי העלים של R. rotschildianus הוערך באמצעות עקומת כיול של רוטין (תרכובת ייחוס סטנדרטית). התוצאות הובעו כמיליגרם של רוטין שווה ערך לגרם משקל יבש של תמצית עלים (מ"ג RU/g משקל יבש). עקומת כיול לרוטין נקבעה באמצעות דילולים סדרתיים שנוצרו מתמיסת מניות של 1{{10}}0 ug/ml. להכנת תמיסת המניות, 10 מ"ג של רוטין הומס ב-10 מ"ל מים מזוקקים ולאחר מכן דילל ל-100 מ"ל. לאחר מכן, תמיסת המניות דוללה כדי לספק רוטין בריכוזים של 10, 30, 40,50,70 ו-100 ug/ml. להכנת תמיסת עבודה, 0.5 מ"ל מכל תמיסת חלק מעורבב עם 3 מ"ל מתנול, 0.2 מ"ל 10 אחוז AlCl3, 0.2 מ"ל 1M אשלגן אצטט, ו-5 מ"ל מים מזוקקים, ולאחר מכן הודגרה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. השלבים הקודמים חזרו על עצמם עבור כל אחד מהשברים, ולאחר מכן נמדדה ספיגה באורך גל של 415 ננומטר. לבקרה ריקה, הוקמה תמיסת עבודה עם מים מזוקקים במקום תמצית הדגימה. הדגימות הוכנו בשלושה עותקים עבור כל ניסוי אנליטי, שממנו חושבו ערכי הממוצע וסטיית התקן [22].

קביעת תכולת הטאנין הכוללת (TTC) הפרוטוקול של Sun et al. שימש לקביעת TTC בארבעת שברי עלי R. rothschildianus, בהיותו ההליך הנפוץ ביותר. קטצ'ין שימש כתרכובת ייחוס לבניית עקומת כיול. הוכן סטוק של 100ug/ml במתנול, שממנו נוצרה סדרת דילול כדי לתת ריכוזי קטצ'ין של 10, 30, 50,70 ו-100 ug/ml. תמיסה של 4 אחוזים של ונילין במתנול הוכנה טרי. פתרונות מלאי של השברים ב-100 ug/ml הוכנו באמצעות מתנול כממס. לתמיסת העבודה, 0.5 מ"ל מכל תמיסת חלק מעורבב עם 3 מ"ל תמיסת ונילין ו-1.5 מ"ל של HCl מרוכז. התערובת הורתה לעמוד במשך 15 דקות, ולאחר מכן נמדדה הספיגה ב-500 ננומטר, באמצעות תמיסת עבודה שהוגדרה עם מתנול במקום תמצית הדגימה כחסר. כל דגימות העבודה נותחו בשלושה עותקים, מהם חושבו ערכי הממוצע וסטיית התקן. סך הטאנין בכל חלק בא לידי ביטוי במונחים של שווי ערך לקטצ'ין (מ"ג CAE/גרם משקל יבש של עלים)[23].

שיטת פעילות נוגדת חמצון

המבחן החופשי 2,2-דיפניל-פיקרילהידראזיל (DPPH) שימש למדידת פעילות נוגדת חמצון בשברים השונים של עלי R. rothschildianus. תמיסת מניות של 1000ug/ml מכל חלק צמחי הוכנה במתנול. בנוסף, הוכנה גם תמיסה של 1000 ug/ml של Trolox (תקן הייחוס). סדרת דילול הוכנה מתמיסות המניות עבור כל חלק, ונותנת שישה דילולים סדרתיים ב-2, 5, 10,20, 50 ו-100 ug/ml. מ"ל אחד מכל דילול תמצית היה מעורבב עם 1 מ"ל 0.002 גרם/מ"ל DPPH במתנול. מ"ל אחד של מתנול הוסף כדי לתת נפח עבודה סופי של 3 מ"ל. תמיסת DPPH הוכנה טרי, מכיוון שהיא הייתה רגישה מאוד לאור. בקרת החסר של ריכוזי הסדרה הייתה DPPH במתנול ביחס של 1:2, ללא תוספת תמצית. כל תמיסות העבודה הודגרו בטמפרטורת החדר (25 מעלות) בחושך למשך כ-30 דקות. לאחר מכן נמדדו צפיפויות אופטיות עם ספקטרופוטומטר באורך גל של 517 ננומטר. המשוואה הבאה שימשה לחישוב אחוז עיכוב DPPH עבור כל חלק של צמחים, עם Trolox כתרכובת הסטנדרטית:

כאשר, Ag היא הספיגה המתועדת של התמיסה הריקה, ו-Ats היא הספיגה המתועדת של תמיסת הדגימה שנבדקה [21].

בדיקת עיכוב ליפאז של הלבלב החזירי

פתרונות מלאי של 500 ug/ml נוצרו מכל חלק של צמח ב-10 אחוז DMSO. מהן נוצרה סדרת דילול של חמישה ריכוזים של 50,100,200, 300 ו-400 ug/ml. תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל של ליפאז לבלב חזירי במאגר Tris-HCl הוכנה טריה ממש לפני השימוש. המצע, p-nitrophenyl butyrate (PNPB) הוכן על ידי המסת 20.9 מ"ג ב-2 מ"ל אצטוניטריל. עבור כל תמיסת עבודה, 0.1 מ"ל ליפאז לבלב חזיר מעורבב עם חלק של 0.2 מ"ל צמחי מכל אחד מסדרת הדילול. Tris-HCl נוספה כדי להפוך את הנפח הסופי של תמיסות העבודה ל-1 מ"ל, והן הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, נוספה לכל מבחנה 0.1 מ"ל תמיסת p-nitrophenyl butyrate. התערובת הודגרה למשך 30 דקות נוספות ב-37 מעלות. פעילות הליפאז הלבלב נקבעה על ידי מדידת ההידרוליזה של PNPB ל-p-nitrophenolate ב-410 ננומטר, באמצעות ספקטרופוטומטר UV. אותו הליך חזר על עצמו באמצעות אורליסטט כתרכובת ייחוס סטנדרטית. אחוז עיכוב ליפאז על ידי שברי צמחים חושב באמצעות המשוואה הבאה:

כאשר, Ap היא הספיגה הרשומה של התמיסה הריקה, ו-Ats היא הספיגה המתועדת של תמיסת הדגימה שנבדקה [24]. בדיקה מעכבת א-עמילאז

A100 מ"ג מכל חלק הומס בכמה מילימטרים של 10 אחוז DMSO, ולאחר מכן הומס עוד עד 100 מ"ל ב-0.02 M Na HPOq/ NaH-PO4,0.006M NaCl, pH 6.9 כדי לתת לבסוף תמיסות מניות בריכוזים של 1000 ug/ml. מתוך אלה, הוכנו הדילולים הבאים של 10,50,70,100 ו-500 ug/ml, תוך שימוש ב-10 אחוז DMSO כמדלל. נפח של 0.2 מ"ל של 2 יחידות/מ"ל עמילאז לבלב חזיר היה מעורבב עם 0.2 מ"ל

חלק צמח והודגרה למשך 0דקה אחת ב-30 מעלות. לאחר הדגירה, נוספו 0.2 מ"ל של תמיסה טרייה של 1 אחוז עמילן במים, ולאחר מכן הודגרו הצינורות למשך שלוש דקות נוספות לפחות. בשלב זה, התגובה הופסקה על ידי הוספת 0.2 מ"ל 3,5-דיניטרו סליצילית (DNSA) מגיב צבעוני ונדולל ב-5 מ"ל מים מזוקקים, לפני שחומם ל-90 מעלות למשך 10 דקות במים מֶרחָץ. לאחר מכן התערובת צוננה לטמפרטורת החדר, והספיגה נמדדה ב-540 ננומטר. הביקורת הריקה הוכנה באמצעות אותן כמויות שתוארו לעיל, אך החלפת חלק הצמח במאגר של 0.2 מ"ל. אקרבוז שימש כהתייחסות סטנדרטית בעקבות ההליך שתואר לעיל. פעילות מעכבת א-עמילאז חושבה באמצעות המשוואה הבאה:

כאשר, Ag: היא הספיגה של הדגימה הריקה, ו-Ar היא הספיגה של דגימת הבדיקה [25].

מאמר זה מופק מ-Jaradat et al. BMC רפואה וטיפולים משלימים (2021) 21:107