חלק 2: Echinacoside מגביר את כמות הזרע בחולדות על ידי מיקוד לקולטן האנדרוגן ההיפותלמי

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

בבקשה, לחץ כאן לחלק 1

לְנַסוֹת יַחַס.

לְנַסוֹת 1. עכברים חולקו באופן אקראי לשש קבוצות, שבעה עכברים בכל קבוצה (n=7).ECH(Echinacoside מ cistanche)(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, סצ'ואן, סין) ניתנה באמצעות צינור תוך קיבה, וניתן טסטוסטרון פרופיונאט (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, סין) בזריקה תוך שרירית פעם ביום למשך 14 ימים לפי התכנון הניסוי הבא: קבוצת ביקורת: מי מלח רגיל (10 מ"ל/ק"ג), ECH_(L)קבוצה (5 מ"ג/ק"ג), ECH_(M)קבוצה (20 מ"ג/ק"ג), ECH_(H)קבוצה (80 מ"ג/ק"ג), TP (15 מ"ג/ק"ג) ו-enzalutamide (מעכב AR, פעם ביום כל יומיים במשך 14 ימים; 20 מ"ג/ק"ג; CAS: 915087- 33-1; אלאדין, שנגחאי, סין).

לאחר שבועיים של טיפולים, העכברים הורדמו עם דיאתיל אתר כדי לאסוף דגימות דם לצורך ניתוח רמות ההורמונים. לאחר מכן נותחו העכברים כדי להפריד בין ההיפותלמוס, האנצפלון פלוס יותרת המוח, האשך והקאודה אפידידימיס. דגימות של cauda epididymis הוכנסו לתמיסת מלח רגילה עם 5 אחוז BSA להערכת איכות הזרע, וההיפותלמוס, האנצפלון פלוס יותרת המוח והאשכים הוקפאו בחנקן נוזלי ואוחסנו ב-80 מעלות להמשך חקירות.

לְנַסוֹת 2. עכברים חולקו באופן אקראי ל-10 קבוצות, חמש חיות לקבוצה. ECH (20 מ"ג/ק"ג) ניתן דרך הפה והעכברים בכל קבוצה הורדמו עם דיאתיל אתר בנקודות הזמן 0.5 שעות, 1 שעות, 1.5 שעות, 2 שעות, 2.5 שעות, 3 שעות, 4 שעות, 6 שעות, 9 שעות ו-12 שעות לאחר המתן לאיסוף דגימות.

פלזמה נאספה והלב נחשף. זלוף של תמיסת מלח רגילה לחדרים השמאליים נערך על ידי מכשיר עירוי עד שהכבד והריאות הולברו. לאחר מכן נאספו ההיפותלמוס והאשכים כדי לקבוע את ריכוזי הרקמות של ECH(Echinacoside מ cistanche).

לְנַסוֹת 3. עכברים חולקו באופן אקראי ל-4 קבוצות, שבע בכל קבוצה. ECH(Echinacoside מ cistanche)ו-BPA (CAS: 80-05-7; אלאדין, שנגחאי, סין) ניתנו באמצעות צינור תוך קיבה פעם ביום במשך 6 שבועות לפי התכנון הניסוי הבא: קבוצה רגילה (שמן תירס, 10 מ"ל/ק"ג, משקל גוף) ד), קבוצת מודל: קבוצת BPA (BPA 200 מ"ג/ק"ג, גוף משקל/שמן תירס), וקבוצת ניסוי: קבוצת BPA פלוס ECH (BPA 200 מ"ג/ק"ג; ECH 20 מ"ג/ק"ג).

לאחר 42 ימי טיפול, העכברים הורדמו עם דיאתיל אתר ודגימות הדם נאספו לצורך ניתוח רמת ההורמונים. האשך וה-cauda epididymis הופרדו ונאספו. ה-cauda epididymis שימש להערכת איכות הזרע והאשך הוקפא בחנקן נוזלי ואוחסן ב-80 מעלות להמשך חקירה.

איור 7. נתיבים מווסתים על ידי הורמון וחלבון הקשורים לציר HPG שנבחרו ברבייה זכרית כפי שנחזה על ידי מסד הנתונים של נתיב אונטולוגיה ומסד הנתונים של KEGG.

הערות: תהליכים מוסדרים מיוצגים על ידי רקעים של צבעים וצורות שונות, ואירועים רגולטוריים מוצגים באמצעות חיצים וקווים.

ההפניות המקושרות לכל חלבון התבססו על מסד הנתונים של Pathway Ontology ו-KEGG Pathway Database, ואינם רשומים.

קביעת איכות הזרע. הכנת תרחיף זרע. Cauda epididymides נטחנו לתוך 5 מ"ל של מי מלח רגיל עם 5 אחוז BSA והודגרו במשך 5 דקות ב-37 מעלות כדי לאפשר לתוכן שלהם להתפשט לתוך המדיום.

מספר זרע: לפי השיטה המתוארת על ידי Yokoi (2003), תרחיף הזרע המדולל (1:10; v/v; תרחיף זרע/10 אחוז מתנול) הועבר לכל תא ספירה של המוציטומטר והורשה לעמוד למשך 5 דקות ולאחר מכן נספר תחת מיקרוסקופ אור (Nikon, Instruments Inc., יפן) בהגדלה של X200.

כדאיות הזרע: סך של 20 μL של תרחיף זרע מעורבב עם נפח שווה של כתם אאוסין-ניגרוסין למשך 2 דקות; הזרעונים הלא מוכתמים נספרו תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 200.

תנועתיות הזרע: סך של 10 μL של תרחיף זרע הוכנס לשקופית זכוכית ותועדו כניידים או בלתי ניידים תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 200.

קביעת רמות ההורמונים. רמות טסטוסטרון (T) ו-LH כומתו בסרום, אנצפלון פלוס ההומוגניות של יותרת המוח והאשך באמצעות ערכות רדיואימוניות (RIA) (בייג'ינג סין-בריטניה המכון לטכנולוגיה ביולוגית, בייג'ינג, סין). בקצרה, נוגדן אנטי טסטוסטרון או אנטי-LH IgG (100 μL) ונוגדן אנטי-עכבר מצומד 125- נוספו לדגימות או לתקן (100 μL), וערבבו על נדנדה למשך הלילה ב-4 מעלות. לאחר שטיפה שלוש פעמים עם PBS-Tween 20 (500 μL), התערובות עברו צנטריפוגה (3500 סל"ד לדקה) ב-4 מעלות למשך 15 דקות. ערכי ה-CPM של המשקעים הוערכו באמצעות מכשיר רדיואימוני (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, בייג'ינג, סין) והריכוזים של T ו-LH חושבו לפי הנוסחה של תקן עֲקוּמָה. מקדם השונות T ו-LH הוא 2.8 אחוזים ו-3.2 אחוזים בקבוצות המדגם, ו-2.1 אחוזים ו-2.8 אחוזים בקבוצות הסטנדרטיות, בהתאמה.

קביעת ביטויי גנים על ידי PCR כמותי בזמן אמת. סך RNA בודד מרקמות אשכים ואנצפלון קפואים בתוספת יותרת המוח באמצעות ערכת RNA Simple Total RNA (טיאנגן, בייג'ינג, סין). PCR כמותי בזמן אמת (q RT-PCR) בוצע להגברה של cDNA באמצעות 2 × SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, נאנג'ינג, סין). הליך ה-PCR כלל 95 מעלות למשך 30 שניות ואחריו 35 מחזורים של 95 מעלות למשך 15 שניות, 58 מעלות למשך 30 שניות ו-72 מעלות למשך 30 שניות. ניתוח עקומת ההיתוך בוצע על מוצרי PCR כדי לאמת את סגוליות הפריימר וטוהר המוצר. עקומת ניתוק בוצעה עבור כל צלחת כדי לאשר ייצור של מוצר בודד. השפע היחסי של כל mRNA חושב. הפריימרים של PCR המשמשים למחקר מוצגים בטבלה 2.

כתם מערבי. לצורך ניתוח ביטוי AR, המיצוי והבידוד של חלבון ציטופלסמי וחלבון גרעיני בוצעו באמצעות ערכת מיצוי חלבון ציטופלזמי וגרעיני (Beyotime, נאנג'ינג, סין) לפי הוראות היצרן. ריכוזי החלבונים הציטופלסמיים והגרעיניים הוערכו באמצעות ערכת בדיקת חלבון ברדפורד (ביוטיים, ג'יאנגסו, סין). דגימות חלבון (80 ug) הופעלו על ג'ל SDS-PAGE של 12% ו-5% והועברו על גבי ממברנות PVDF. לאחר החסימה, הממברנות הודגרו עם נוגדנים אנטי-AR IgG (1:1,000; Bioss; בייג'ינג סין), ונוגדנים רב-שבטיים נגד GAPDH של עכברים (1:1,000; Wuhan Boster בִּיוֹלוֹגִיטכנולוגיה, ווהאן, סין) או נוגדנים polyclonal anti-Lamin b1 עכברים למשך 2 שעות. הממברנה נשטפה שלוש פעמים עם TBST והודגרה עם נוגדן IgG לארנב מצומד HRP נגד עכבר (1:5,000; Bioss; בייג'ינג סין). האות הוצג באמצעות מערכת ההדמיה ChemiDoc (Tanon-3,500, שנחאי, סין).

בדיקת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). דם נאסף בצינורות זכוכית הפריניזציה. הפלזמה הופרדה על ידי צנטריפוגה מיידית ב-6,000 סל"ד למשך 0 דקות ואוחסנה ב-20 מעלות לניסוי נוסף. דגימות ההיפותלמוס והאשך מכל נקודת זמן אספו והומוגגו עם מתנול. לאחר צנטריפוגה ב-10,000 סל"ד ב-4 מעלות למשך 10 דקות, הסופרנטנט רוכז על ידי N2 והשאריות הומסו ב-50 μL של מתנול וסוננו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. עשרה μL מהנוזל המסונן בדגימה הוזרק למערכת HPLC לצורך ניתוח.

העקומה הסטנדרטית כללה דגימות המכילות 50, 100, 250, 500 ו-750 ng/mL של ECH(Echinacoside מ cistanche)(Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, סצ'ואן, סין). דגימות בקרת איכות פלזמה עם תוספת של 75ng/mL (נמוך), 150 ng/mL (בינוני) ו-300 ng/mL (גבוה) של ECH הוכנו בהתאם למדידת הדיוק והדיוק של השיטה.

כרומטוגרפיה בוצעה עם מערכת HPLC (D2{{10}}00 Elite series, Hitachi, יפן) מחוברת לגלאי UV (L-2400, Hitachi, יפן). ההפרדה בוצעה על עמודה Thermo-C18 (250 מ"מ × 4.6 מ"מ id, 4.6 מיקרומטר חלקיקים) שנשמרה ב-25 מעלות. הפאזה הניידת הייתה שיפוע שהוכן מ-0.1 אחוז חומצה זרחתית המכילה 0.04 אחוז טרימתילאמין (רכיב A) ומתנול (רכיב B). השיפוע הליניארי היה כדלקמן: 70-90 אחוז A מעל 0-2 דקות, 60-70 אחוז A במהלך 2-6 דקות, 55-60 אחוז B במהלך 6-8 דקות ולאחר מכן חזר ל-90 אחוז A ב-8 דקה מיד. קצב הזרימה היה 0.8 מ"ל/דקה. גלאי ה-UV הופעל במהירות 332 ננומטר. אזור השיא הוערך כמדידה האנליטית.

מחקרים פרמקוקינטיים בעכברים. חדירת ECH(Echinacoside מ cistanche)להיפותלמוס ולאשך היה נתון לניתוח פרמקוקינטי עם תוכנת Drug and Statistics (Drug and Statistics, Mathematical Pharmacology Professional Committee of China). פרמטרים פרמקוקינטיים נקבעו באמצעות השיטה הלא-קומקוממנטלית בהתבסס על תיאוריית הרגעים הסטטיסטית. הפרמטרים הפרמקוקינטיים המוקדמים כולל הזמן עד שיא קבוע (Tmax), ריכוז שיא (Cmax), קבוע קצב סילוק (Ke), זמן מחצית חיים של חיסול (T0.5), השטח מתחת לעקומה (AUC{ {4}}–12), נפח הפצה לכאורה (Vc) ופינוי (CL) הושגו לניתוח נוסף. יחסי מוח/פלזמה חושבו על סמך ערכי AUC0-t עבור פלזמה ומוח.

סינתזה וזיהוי של ECH-Ovalbumin (ECH-OVA). סה"כ 9.8 מ"ג ECH(Echinacoside מ cistanche)ו-1.0 מ"ג של בוטנדיול אנהידריד הומסו ב-2 מ"ל פירידין, ערבבו במשך 12 שעות תוך ערבוב בטמפרטורת החדר. התערובת רוכזה על ידי N2 והשארית שולבה עם 10.8 מ"ג של N-hydroxysuccinimide (NHS) ו-19.3 מ"ג של dicyclohexylcarbodiimide (DCC) והומס ב-4 מ"ל N, N-dimethylformamide (DMF) למשך 12 שעות תוך ערבוב בטמפרטורת החדר . לאחר צנטריפוגה ב-2,000 גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות, הסופרנטנט נוסף ל-5 מ"ל של PBS שבו הומס 14.4 מ"ג אולבומין (OVA). התערובת החדשה עורבבה במשך 24 שעות ב-4 מעלות. לאחר מכן, תמיסת התגובה עברה דיאליזה כנגד PBS למשך שלושה ימים. הנוכחות של ECH-OVA אושרה על ידי ספקטרום UV (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD ארה"ב) באורך גל שנע בין 190 ל-400 ננומטר וכן על ידי דנטורציה של PAGE.

ELISA עקיף (iELISA). צלחת מיקרוטיטר צופה ב-ECH-OVA (2 ug/100 μL) והודגרה למשך הלילה ב-4 מעלות. הצלחת נשטפה שלוש פעמים עם PBST ופעמיים עם PBS; ו-5 אחוז PBSM (PBS המכיל 5 אחוז חלב דל שומן) נוספו כדי לחסום את האתרים הלא קשורים ב-37 מעלות למשך שעתיים. לאחר שטיפת הצלחות עם PBST ו-PBS, בארות חולקו ל-4 קבוצות; קבוצת ניסוי, 1 ug AR חלבון כולל/100 μL; קבוצה חיובית, נוגדן אנטי-OVA לארנב (1:1,000); קבוצה שלילית, 1 אג' של אלבומין בסרום בקר; וקבוצה ריקה המכילה PBS. לאחר דגירה של 1.5 שעות, הצלחות נשטפו, ונוספו לקבוצה החיובית 100 μL/באר של IgG מצומד HRP ארנב (1:1,000), 100 μL/באר של אנטי-AR (1:1,000) לקבוצות האחרות. לאחר דגירה של 1.5 שעות, הוסף לצלחות דילול IgG מצומד ב-HRP ארנב (1:5,000). לאחר דגירה ב-37 מעלות למשך שעה, הצלחות נשטפו שלוש פעמים עם PBST ופעמיים עם PBS. לאחר מכן הוסף TMB והודגרה במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר ונוספו 2 M H2SO4 כדי לעצור את התגובה. הספיגה נקראה באורך גל של 450 ננומטר.

עגינה מולקולרית. בוצע מחקר עגינה מולקולרית כדי לחקור את אופן הקישור של התרכובת ECH(Echinacoside מ cistanche)לקולטן האנדרוגן האנושי (AR) באמצעות Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). המבנה התלת מימדי (3D) של AR (מזהה PDB: 2YHD) הורד מ-Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). מבנה התלת-ממד של ECH הושג על ידי תוכנת ChemBioDraw Ultra 14.0 ו-ChemBio 3D Ultra 14.0. חבילת AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu) הופעלה ליצירת קבצי קלט העגינה. רשת החיפוש של AR זוהתה כמרכז x: 36.141, מרכז y: 8.513, ומרכז z:

21.304 עם מידות מידה x: 15, מידה y: 15, וגודל z: 15. ערך המיצוי נקבע ל-20. עבור עגינה של Vina, נעשה שימוש בפרמטרי ברירת המחדל אם זה לא הוזכר. התנוחה בעלת הניקוד הטוב ביותר לפי ציון העגינה של Vina נבחרה ונותחה חזותית באמצעות תוכנת PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org).

ניתוח נתונים ושיטות סטטיסטיות. הנתונים נותחו באמצעות תוכנה סטטיסטית SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). הופעלה ANOVA חד כיוונית לצורך השוואה בין הקבוצות. נקבעו מבחני ההשוואה של Tukey של הבדלים משמעותיים בין הקבוצות. התוצאות הובעו כממוצע ± סטיית תקן (SD) באמצעות תוכנת Graph Pad Prism v.7 (GraphPad Software, Inc, קליפורניה, ארה"ב).

אישור אתיקה והסכמה להשתתפות. אישור אתי למחקר זה התקבל מוועדת האתיקה של המכון הטכנולוגי של אניאנג.

הפניות

1. Cano, SN, Misra, M. & Ackerman, KE פעילות גופנית, אימון וציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-גונדאלי אצל גברים ונשים. הורם. מילון 47, 27–43 (2016).

2. Papadopoulos, V. & Miller, WL תפקיד המיטוכונדריה בסטרואידגנזה. השיטות הטובות ביותר. מילון Cl. En. 26, 771–790 (2012).

3. Rone, MB et al. זיהוי של קומפלקס חלבון מיטוכונדריאלי דינמי המניע יבוא, סחר וחילוף חומרים של כולסטרול להורמון סטרואידים. מול. אנדוקרינול. 26, 1868–1882 (2012).

4. Shibari, S., Ylonen, H. & Palme, R. הפרשה ומדידה של מטבוליטים של קורטיקוסטרון וטסטוסטרון בשרקנים (Myodes glareolus). Gen. Comp. אנדוקרינול. 243, 39–50 (2017).

5. O'Hara, L. et al. איתות קולטן אנדרוגן של יותרת המוח מסדיר פרולקטין אך לא גונדוטרופין בעכבר הזכר. PLoS ONE. 10, e0121657 (2015).

6. Amador, AG, Parkening, TA, Beamer, WG, Bartke, A. & Collins, TJ Testicular LH receptors ורמות הורמונים במחזוריות בשלושה מודלים של עכברים למחלות תורשתיות (Tfm/y, lit/lit ו-hyt/hyt). אנדוקרינול. Exp. 20, 349–58 (1986).

7. Bulldan, A., Dietze, R., Shihan, M. & Scheiner-Bobis, G. איתות טסטוסטרון לא קלאסי המתווך באמצעות ZIP9 מעורר ביטוי קלאודין ויצירת צומת הדוקים בתאי Sertoli. תָא. אוֹת. 28, 1075–85 (2016).

8. Walker, WH איתות טסטוסטרון וויסות spermatogenesis. זרעונים. 1, 116–20 (2011).

9. Cao, C. & Kindscher, K. The Medicinal Chemistry of Echinacea Species (ed. Kindscher, K.) 127–145 (Springer, 2016).

10. Jiang, ZH, Jian, W., Li, XP & Zhang, XYאכינאקוסיידוCistanche tubulosa (Schenk) R. Wight משפר את נזקי האשכים והזרע המושרה על ידי ביספנול A בחולדות דרך אנזימים סטרואידוגניים מווסתים בציר הגונדה. J. Etnopharmacol. 193, 321–328 (2016).