חלק 1 מחלת כליות כרונית והזדקנות מפחיתים באופן דיפרנציאלי את חומרי העצם והמיקרו-ארכיטקטורה בעכברים C57Bl/6

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

מחלת כליות כרונית והזדקנות מפחיתים באופן דיפרנציאלי את חומר העצם ואת המיקרו-ארכיטקטורה בעכברי C57Bl/6

Chelsea M. Heveran1, Charles Schurman2,*, Claire Acevedo3, Eric W. Livingston4, Danielle Howe5, Eric G. Schaible6, Heather Hunt7, Adam Rauff8, Eve Donnelly7,#, R. Dana Carpenter9, Moshe Levi10, Anthony Lau5, Ted Bateman4 , Tamara Alliston2,*, Karen B. King11, Virginia L. Ferguson1

1המחלקה להנדסת מכונות, אוניברסיטת קולורדו, בולדר, CO

2 המחלקה לכירורגיה אורטופדית, אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו, קליפורניה

3 המחלקה להנדסת מכונות, אוניברסיטת יוטה, סולט לייק סיטי, UT

4המחלקה להנדסה ביו-רפואית, אוניברסיטת צפון קרוליינה, צ'פל היל, NC

5 המחלקה להנדסה ביו-רפואית, המכללה של ניו ג'רזי, יואינג, ניו ג'רזי

6 מקור אור מתקדם, המעבדה הלאומית של לורנס ברקלי, ברקלי, קליפורניה

7 המחלקה למדע והנדסת חומרים, אוניברסיטת קורנל, איתקה, ניו יורק

8 המחלקה לביו-הנדסה, אוניברסיטת קולורדו, דנבר, CO

9המחלקה להנדסת מכונות, אוניברסיטת קולורדו, דנבר, CO

10 המחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית ותאית, אוניברסיטת ג'ורג'טאון, וושינגטון הבירה

11המחלקה לאורטופדיה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת קולורדו, אורורה, קולורדו *אוניברסיטת קליפורניה ברקלי – אוניברסיטת קליפורניה סן פרנסיסקו תוכנית לתואר שני בביו-הנדסה, סן פרנסיסקו, קליפורניה

# חטיבת המחקר, בית החולים לכירורגיה מיוחדת, ניו יורק, ניו יורק

Cistanche יכול לעזור עם מחלת כליות

תַקצִיר

מחלת כליות כרונית (CKD) היא מחלה נפוצה של הזדקנות ומגבירה את הסיכון לשברים על פני גיל מתקדם בלבד. הזדקנות ו-CKD פוגעים באופן שונה במחזור העצם ובמינרליזציה. לפיכך, אנו משערים כי אובדן איכות העצם יהיה הגדול ביותר עם השילוב של גיל מתקדם ו-CKD. הערכנו עצם מעכברי זכר C57Bl/6 של מבוגרים צעירים (6 חודשים), בגיל העמידה (18 חודשים) וזקנים (24 ​​חודשים) זכרים של C57Bl/6 שלושה חודשים לאחר כריתת כליה 5/6, כדי לגרום להליכי CKD או דמה. CKD החמיר את ההפסדים של מיקרו-ארכיטקטורה קליפת המוח והטרבקולרית הקשורים להזדקנות. הזדקנות ו-CKD הביאו כל אחד לקליפת המוח דקה, נקבוביה יותר ופחות ודק יותר טרבקולות. איכות חומרי העצם הופחתה גם עם CKD, ושינויים אלו בחומר העצם היו שונים מאלה הנובעים מגיל. ההזדקנות הפחיתה את חוזק ומודול הכיפוף של העצם השלמה, את מודול הננו-אינדנטציה בקנה מידה מיקרומטר וזן רקמות וקולגן בקנה מידה ננומטר (פיזור רנטגן בזווית קטנה (SAXS)). לעומת זאת, CKD הפחית את העבודה עד לשבר ושונות במודול והרכב רקמת העצם (ספקטרוסקופיה של ראמאן), והגדיל את אחוז הקולגן. הנטל המוגבר של זני הקולגן היה קשור לאובדן הקשיחות ב-CKD. בנוסף, lacunae osteocyte הפכו קטנים יותר, דלילים יותר ומבולבלים יותר עם הגיל עבור עכברי דמה, אך השינויים הקשורים לגיל לא נצפו בבירור ב-CKD. עם זאת, עבור CKD, חללים גדולים יותר היו בקורלציה חיובית עם עלייה ברמות הפוספט בסרום, מה שמצביע על כך שאוסטאוציטים ממלאים תפקיד בהומאוסטזיס מינרלים מערכתי. עבודה זו מוכיחה ש-CKD מפחית את איכות העצם, כולל מיקרו-ארכיטקטורה ותכונות חומרי העצם, ושאובדן איכות העצם עם הגיל מלווה ב-CKD. ממצאים אלה עשויים לעזור ליישב מדוע מסת עצם אינה מנבאת באופן עקבי שברים באוכלוסיית CKD, וכן מדוע אנשים מבוגרים עם CKD נמצאים בסיכון גבוה לשבריריות.

מילות מפתח: CKD; הְזדַקְנוּת; איכות העצם; שבריריות עצם; קולגן

1. הקדמה

מחלת כליות כרונית (CKD) פוגעת בכ-23-36 אחוזים מאוכלוסיית הקשישים וקשורה לסיכון מוגבר לשברים ולתמותה הקשורה לשברים (1,2). אף על פי שאובדן מסת העצם (כפי שנמדד על ידי ספיגה של קרני רנטגן דו-אנרגטי) מנבא שבר עתידי בכל שלבי ה- CKD, אנשים מבוגרים עם מסת עצם נמוכה ו- CKD נוטים יותר לשבר בהשוואה לאלה עם מסת עצם נמוכה וכליה בריאה פונקציה (3). הסיכון לשברים בעצמות גדל בדרך כלל עם CKD בהשוואה להשפעות ההזדקנות בלבד (4,5). לדוגמה, במחקר בן שלוש שנים, לאנשים בגילאי 40-65 עם CKD בינוני עד שלב סופי הייתה עלייה של פי 1.7 - 5.1 בשכיחות השברים בהשוואה לביקורות תואמות גיל, בעוד שבגילאי 65 פלוס, CKD המשיכה לעלות את השכיחות של שבר פי 1.8 - 4.3 על בקרות (4).

מיקרו-ארכיטקטורה של עצם טרבקולרית (10, 13), בעוד שאחרים לא מדווחים על שינויים בהשוואה לבקרה (9). למרות שמחקרים אלו משתנים במין ובזן של מכרסמים, בשיטת האינדוקציה של CKD ובתוצאות שנמדדו, עבודות קודמות אלו מספקות ראיות משמעותיות לכך ש- CKD משנה את איכות העצם.

נותרו מספר שאלות מפתח לגבי האופן שבו איכות העצם יורדת על ידי CKD, המידה שבה ירידה באיכות העצם נובעת מפגמים במינרל לעומת השלב האורגני, כמו גם כיצד שינויים באיכות העצם משפיעים על אובדן קשיחות רקמת העצם. יש לציין, על אף שמספר מחקרים זיהו שינויים בקישורי קולגן ובבשלות רקמות (כלומר, זמן מאז יצירת העצם) ב-CKD, לא ידוע אם אינטראקציות ננומטריות של סיבי קולגן במהלך העמסה מכנית משתנות על-ידי CKD והאם שינויים אלו בננו-מכניקה משפיעים על שלם -קשיחות העצם (11, 12). באופן רחב יותר, טרם דווחה הערכה של שינויים באיכות העצם ובמכניקה בתגובה ל-CKD מסולמות ננו עד עצם שלמה.

גם תפקידו של האוסטאוציט בהשפעה על איכות העצם ב-CKD והזדקנות אינו ברור. תאים אלה מתנהגים בצורה לא תקינה על ידי העלאת ביטוי FGF23 באופן משמעותי בשלב מוקדם בהתקדמות CKD (7, 14). האוסטאוציט חיוני לשמירה על איכות חומר העצם ולוויסות העמידות לשברים בעצמות (15-17). בריאות אוסטאוציטים מסומנת, בחלקה, באמצעות המורפולוגיה הלקונרית. מורפולוגיות לאקונריות של אוסטאוציטים משתנות כאשר האוסטאוציט משתתף בהומאוסטזיס מינרלים, כמו בהנקה (18, 19) והיפופוספטמיה מקושרת x (20). גיאומטריות לאקונריות יכולות גם להפוך לקטנות יותר, דלילות יותר ולא מסודרות יותר עם הזדקנות וחוסר שימוש (21-23). לשינויים במורפולוגיה לאקונרית של אוסטאוציטים עם CKD יש פוטנציאל להשפיע על זני רקמת עצם, שלמות מבנית ורגישות מכנו של אוסטאוציטים (24). עדיין לא ידוע אם CKD משפיע על מורפולוגיות לאקונריות של אוסטאוציטים והאם קשר כזה עשוי להשתנות עם ההזדקנות.

למרות שהאוכלוסיות הנפוצות יותר של CKD כוללות מבוגרים יותר, ההשפעות המשולבות של הזדקנות ו- CKD על איכות העצם טרם נחקרו. מחקרים קודמים קבעו כי ההזדקנות מפחיתה את מודול העצם השלמה, חוזקה ועבודה לשבר בכיפוף (25), קשיחות שבר (26), מיקרו-ארכיטקטורת עצם קליפת המוח והטרבקולרית (27-29), ומגבירה את תכולת המינרלים והבשלות (30, 31). שינויים אלה בעצם עם ההזדקנות מבלבלים ומתרחשים על פני קשקשים של אורכים מרובים, כאשר מכניקת העצם השלמה מושפעת משינויים בחומר רקמת העצם וכן במבנה. שינויים הקשורים לגיל בחומר העצם ובנפח העצם מושפעים בחלקם מירידה בתחלופה של רקמת העצם (כלומר בשלות גבוהה יותר של רקמות) ומאיזון שלילי ביחידה הרב-תאית של העצם, בהתאמה (30,32). שינויים כאלה הקשורים לגיל מנוגדים לתחלופת העצמות החריגה והמינרליזציה המתרחשת לעתים קרובות עם CKD. אובדן מיקרו-ארכיטקטורה קשור לאיזון שלילי, הצפוי עם ההזדקנות ועלול להתרחש ב-CKD (9, 10, 13). עם זאת, בשלות הרקמות עולה עם ההזדקנות ויורדת בהקשר של CKD עם תחלופה גבוהה. קיימים פערים מהותיים בהבנת הבסיס לשבריריות העצם ב-CKD, כמו גם כיצד ההזדקנות וה-CKD בשילוב, מפחיתים את איכות העצם ועמידות לשברים. הבהרת ההשפעות המשולבות של הזדקנות ו-CKD על איכות העצם תמלא את פערי הידע הללו.

מטרת מחקר זה הייתה לחקור את ההשפעות המשולבות של הזדקנות ו-CKD על איכות העצם, מקשקשים ננו-עד דרך עצם שלמה, במודל כירורגי של CKD בעכברים מזדקנים. שיערנו ש-CKD והזדקנות כל אחד מפחיתים את איכות העצם, אך שני גורמים אלה ישפיעו באופן דיפרנציאלי ושלילי על תכונות החומר של רקמת העצם. עוד שיערנו שההשפעות המשולבות של זקנה ו-CKD מזיקות ביותר לאיכות העצם. כדי להעריך השערות אלו, הערכנו את איכות העצם, כולל מיקרו-ארכיטקטורה של קליפת המוח והטרבקולרית ותכונות חומרי עצם קליפת המוח, במבוגרים צעירים באמצעות עכברים מבוגרים עם CKD שנגרמה על ידי כריתת נפרקטומיה 5/6 (5/6 Nx) או ניתוחי דמה.

לגבי cistanche

2. שיטות

2.1 מודל בעלי חיים והכנת דגימה

עכברי זכר C57Bl/6 התקבלו ממושבה לאומית להזדקנות בגילאים 3, 15 ו-21 חודשים. עכברים נשמרו במחזור של 12-שעות אור / 12-שעות כהות, שוכנו בנפרד בכלובי פוליקרבונט עם מצעים סטנדרטיים, הוזנו Harlan Teklad 2920X chow, ואפשרו גישה חופשית למים. עבור כל אחד משלושת הגילאים, עכברים חולקו אקראית לקבוצות CKD או Sham. קבוצת CKD עברה כריתת כליה דו-שלבית. נהלים אלה תוארו בעבר (33). בקצרה, הגישה לכליה השמאלית באמצעות חתך קו אמצע, נפרקה כדי למנוע נזק לשופכן ולאדרנל, ולאחר מכן הוסרה. שבוע לאחר מכן, הכליה הימנית נותקה קפסולה והקוטב העליון והתחתון נכרתו חלקית כדי להשיג ירידה של 2/3 בנפח הכליה. קבוצת הביקורת קיבלה פרוצדורות דמה (כלומר, חתך קו אמצע ללא נזק לכליות) באותו פרק זמן. עכברים הורדמו באמצעות 1.5 אחוז איזופלורן במהלך ההליכים. מנה לאחר הניתוח של בופרנורפין (0.5 מ"ג/ק"ג) ניתנה לאחר הליכים אלו ולפני ההתאוששות, וכן כל 12 שעות במשך היומיים הבאים. עכברים הורדמו לאחר שלושה חודשים באמצעות CO2 ונקע בצוואר הרחם. בנקודת הסיום של המחקר, העכברים היו 6 (מבוגר צעיר; דמה: n=6, CKD: n=7), 18 (בגיל העמידה; דמה: n=8; CKD: n { {25}}), וגיל 24 (ישן; דמה: n=8; CKD: n=8) חודשים. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לשימוש וטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קולורדו דנבר.

עצם הירך השמאלית, השוקה, עצם הזרוע, הרדיוס והאולנה נשמרו לניתוח איכות העצם. השוקה השמאלית נשמרה ב-70 אחוז אתנול ב-4 מעלות צלזיוס. כל העצמות האחרות נעטפו בגזה נטולת פוספט ואוחסנו ב-20 מעלות צלזיוס עד לניתוח.

2.2 כימיה בסרום ובשתן

ניתוח ביוכימיה בסרום בוצע על דם ושתן שנאספו בנקודת הסיום של המחקר. אוריאה בנסיוב ובשתן, כמו גם ריכוזי פוספט, סידן ו-PTH בסרום, נמדדו על פי הוראות היצרן (BioAssays Systems ו- Immunotropics, בהתאמה).

2.3 מיקרו-CT

מיקרו-ארכיטקטורה הוערכה עבור העצם הקורטיקלית של עצם הירך האמצעי והעצם הטראבקולרית של השוקה הפרוקסימלית באמצעות microCT עבור כל עכברי המחקר (μCT, Scanco 80, Scanco AG, Basserdorf, שוויץ). עצם הירך הופשרה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס לפני הסריקה. הסריקה בוצעה בגודל ווקסל של 10 מיקרומטר, בעקבות שיטות רכישה וניתוח שתוארו קודם לכן (10). פרמטרים של קליפת המוח כללו נפח עצם / נפח כולל (BV/TV), שטח עצם / שטח כולל (BA/TA), נקבוביות קליפת המוח (Ct. Po), עובי קליפת המוח (Ct. Th), צפיפות מינרלים כוללת (TMD), רגע של אינרציה על הציר המדיאלי-לטרלי (IML), המרחק בין המרכז לבין משטח העצם בכיוון הקדמי-אחורי (C), ומומנט האינרציה הקוטבי (pMOI) (34). פרמטרים טרבקולריים כללו מספר טרבקולרי (Tb.N), מרווח טרבקולרי (Tb.Sp), עובי טרבקולרי (Tb.Th), נפח עצם (BV), נפח כולל (TV), נפח עצם / נפח כולל (BV/TV), צפיפות עצם נפחית (vBMD), וצפיפות קישוריות (Conn.D). לאחר microCT, עצם הירך שוב נעטפו בגזה ספוג פוספט ואוחסנו ב-20 מעלות צלזיוס לאפיון מכני של העצם השלמה.

2.4 תכונות מכניות וחומריות של עצם שלמה

בעקבות microCT, עצם הירך השמאלית עברו כיפוף שלוש נקודות (Insight II Material Testing System, 250 N load cell, MTS Systems Corporation, Eden Prairie MN). עצם הירך הוסרה מגזה נטולת מלח מוגפת בפוספט ונבדקו עד לכישלון באמצעות קצב סטייה של 5 מ"מ לדקה על סדן מותאם אישית עם טווח של 8 מ"מ. עקומות תזוזה של עומס נותחו עבור תכונות מכניות כולל קשיחות, עומס מקסימלי, תזוזה בעומס מירבי, אנרגיה בעומס מירבי, עומס בתפוקה, תזוזה בתשואה, אנרגיה בתשואה, עקירה לאחר תשואה, עומס בשבר, תזוזה בשבר, ואנרגיה בשבר. נקודת התפוקה הוגדרה כחתך של קו דק שנמשך עם ירידה של 10 אחוז בשיפוע מהקשיחות המשיקית הראשונית ועקומת העומס-תזוזה. באמצעות IML ו-C מ- µCT, הערכנו את תכונות החומר כולל מודול כיפוף, מתח תפוקה, מתח סופי וקשיחות מנתוני כיפוף שלוש נקודות באמצעות משוואות כיפוף קרן סטנדרטיות כפי שהוחלו על עצם הירך של העכבר (35).

2.5 ניתוח אלמנטים סופיים של נוקשות של השוקה הפרוקסימלית

כדי לחקור את ההתנהגות המכנית של עצם, נעשה שימוש במודל חישובי סופי (FE) כדי לדמות דחיסה צירית של השוקה הפרוקסימלית בכל מודל. השוקה הפרוקסימלית נבחרה מכיוון שהשוקה היא מבנה נושא עומס בעכברים ומהווה אתר נפוץ לניתוח תכונות העצם באמצעות microCT. נתוני תמונת MicroCT של השוקה הפרוקסימלית (עצם קליפת המוח והטרבקולרית) יוצאו כפרוסות תמונת 16-bit DICOM לצורך פילוח ובנייה נוספים של מודלים סופיים הספציפיים לנושא. נתוני תמונת DICOM יובאו לתוך Mimics Innovation Suite 18 (Materialise, לובן בלגיה) לעיבוד תמונה ופילוח כדי ליצור מודל FE מתאים לאותו אזור השוקה הפרוקסימלי של העצם מנותח באמצעות microCT. רקמת העצם הופרדה מרקמות אחרות בתמונה באמצעות סף פילוח של 313 מ"ג/סמ"ק (36,37). לאחר פילוח אזור העצם, רשת ה-FE הספציפית לנושא יצאה, שהכילה את התאים הקורטיקליים והטרבקולריים כאחד. מודל FE השתמש ברשת FE משושה בגודל אלמנט איזוטרופי של 10 מיקרומטר.

רשתות ה-FE שיוצאו מ-Mimics יובאו לתוך ABAQUS CAE 6.9 לצורך הקצאת תכונות החומר, יישום תנאי גבול והדמיית עומס מכני צירי. תכונות החומר של העצם צוינו כהומוגניות, איזוטרופיות ואלסטיות ליניאריות (Modul Young, E= 10 GPa ו-Poisson's Ratio, v= 0.3). כדי לדמות דחיסה צירית, הוחל תנאי גבול קבוע על הצמתים במשטח התחתון של העצם, ותזוזה כלפי מטה של ​​5μm (0.5 אחוז מגובה מקטע העצם) הוחלה על הצמתים על המשטח העליון של העצם. קשיחות מבנית העצם חושבה ככוח התגובה (N) על העקירה המופעלת.

2.6 פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה

דפורמציה של סיבי קולגן במהלך בדיקת מתח חד-צירי של אולנאות ורדיוסים משולבים נמדדה באמצעות פיזור סינכרוטרון עם זווית קטנה של רנטגן (SAXS) בקו קרן 7.3.3 במקור האור המתקדם (LBNL, ברקלי, קליפורניה) (38). עצמות היו מאובטחות עם דבק ונייר זכוכית בין מהדקים בקצוות המרוחק והפרוקסימלי שלהן. בדיקות עקיפות בוצעו עם TST350 בדיקת מתיחה (Linkam Scientific Inc.) על דגימות הלחות בקצב תזוזה של 2.5 מיקרומטר/שנייה. במהלך הבדיקה, הדיאפיזה של העצם נחשפה לקרני רנטגן של 10 keV למשך 0.1 שניות כל 5 שניות. הקרינה הכוללת הוגבלה ל-30 קילו-ג'י כדי להפחית את כל השפעות החשיפה על הביצועים המכניים (39). מרווח הקולגן D, המייצג את אזורי הפער החוזרים בתוך מבנה העל של הקולגן, מופיע כשיא עקיפה בולט של Bragg בתבנית SAXS. דפורמציה ספציפית לקולגן במהלך בדיקת המתיחה נמדדה על ידי מעקב אחר השינוי בעמדות השיא של Bragg בכמויות עומס הולכות וגדלות. תוך שימוש בתוכנית LabVIEW מותאמת אישית, השינוי המתקדם הזה בדפוס הפיזור הומר לזן פיבריל קולגן על ידי נורמליזציה למרווח ה-d בעומסים אפס, כפי שנדון בעבר (40). מתח הרקמות חושב מכוחות שנרשמו בשלב הבדיקה חלקי מדידות שטח החתך של העצמות שנבדקו. שטחי החתך המסוכמים של האולנה והרדיוס נמדדו מנקודת האמצע של אורך האולנר באמצעות הדמיה רפלקטיבית של שדה בהיר (Leica DM, מטרה פי 20) וכומתו באמצעות ImageJ (41). זני רקמה של עצם שלמה התקבלו עם חבילת MATLAB מותאמת אישית Digital Image Correlation (DIC) שעקבה ומדדה מרחקים בין רשת של נקודות על גבי דגימת העצם לאורך הבדיקה. הזנים שהתקבלו ב-DIC שולבו עם מתחים ברמת הרקמה כדי ליצור עקומות מתח-מתח סטנדרטיות. מודול אלסטי ליניארי הופק מעיקולים אלה וכן מתח תפוקה ומתח תפוקה כפי שהוגדר על ידי 0.2 אחוז היסט נקודת התשואה. זן הרקמות הותאם בזמן לזני קולגן מ-SAXS בתפוקה ובמתח מרבי על מנת לייצר השוואות של רכיבים נושאי מתח עם עצם במהלך דפורמציה.

ניתוח מבוקר של אולנה/רדיוס המרוכב במהלך בדיקת המתיחה בוצע על ידי התאמת המתח ברמת הרקמה מתמונות המצלמה הדיגיטלית לזנים המחושבים לפי תבניות פיזור קרני הרנטגן. סרטונים דיגיטליים נבדקו באופן עצמאי על ידי שני צופים מאומנים לשבר והחלקה של רקמות (למשל החלקה בין האולנה לרדיוס). אירועים אלה הותאמו לאחר מכן לעקומות המתח וכל נתוני המתח-מתח נקטעו לשבר הראשון. רק נתונים עד השבר הראשון נשקלו בניתוח. דגימות לא נכללו אם הייתה החלקה בין אחיזת המתיחה לבין העצמות, או אם הייתה החלקה בין הרדיוס שהתרחשה לפני השבר הראשון. דגימות לא נכללו גם אם הייתה התאמה גרועה בין עקומות המתח של הרקמה ו-SAXS, מה שמצביע על כך שנקודת הקרן התמקדה באולנה אך רוב המתח הועבר לרדיוס.

2.7 הערכה מותאמת לאתר של הרכב ומודולוס רקמת העצם בקנה מידה מיקרו

לאחר כיפוף שלוש נקודות, עצם הירך התייבשה מבחינה היסטולוגית בסדרה מדורגת של אתנול, נוקה באצטון והוטמעה ב-PMMA. עצמות משובצות נחתכו בחלק האמצעי של הירך באמצעות מסור יהלום במהירות נמוכה (Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). הדגימות נטחנו באמצעות נייר סיליקון קרביד רטוב (60{{10}} ו-1200 גריט), ולאחר מכן לוטשו עם משחות אלומינה (9, 5, 3, 1, 0.1, 0.05 מיקרומטר) ובגדים משובחים של Rayon (South Bay Technologies, San Clemente, CA) עד לגימור סופי של 0.05 מיקרומטר. דגימות עברו צלילים בין כל שלב ליטוש.

ספקטרוסקופיה של ראמאן בוצעה במפות המשתרעות על עובי קליפת המוח עם מערכת מותאמת אישית: מערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית של Renishaw inVia (Renishaw, Wotton-under-Edge, Gloucestershire, בריטניה) באמצעות אור לייזר באורך גל של 785 ננומטר שנותב דרך כבלים סיבים אופטיים ל-5{ {4}} אובייקטיבי x (NA 0.75) מותקן על שלב Z ננו-אינטר (TI 950, Hysitron, Minneapolis, MN). עבור כל מיקום נאספו 10 הצטברויות של 10-חשיפות שניות. שורות של שלושה שקעים ברווח של 15 מיקרומטר זה מזה התרחבו כל 10 מיקרומטר בעובי הקורטיקלי.

קו הבסיס הפלורסנטי הופחת בהתאמה פולינומית מסדר 11, וקרניים קוסמיות הוסרו באמצעות תוכנת Renishaw WIRE. ספקטרום PMMA ייחוס הופחת מכל נקודה באמצעות קוד MATLAB מותאם אישית. הספקטרום המתוקן הללו נותחו לאחר מכן עבור פרולין (855 ס"מ-1), ν1 פוספט (961 ס"מ-1) ו-ν1 קרבונט (1071 ס"מ-1). לאחר מכן חושבו יחסי שטח עבור מינרל: מטריקס (פוספט: פרולין),

קרבונט: פוספט, וגבישיות (היפוך של חצי רוחב בגובה מקסימלי מלא של שיא הפוספט v1).

לאחר מכן בוצעה הננו-אינדנטציה במיקומים שהותאמו לאתרים שהוערכו באמצעות ספקטרוסקופיה של ראמאן. קצה כדורי של 5 מיקרומטר הכניס את העצם במהירות של 30 ננומטר לשנייה עד שהושג עומק מרבי של 500 ננומטר. עומק זה נשמר במשך 120 שניות כדי לאפשר פיזור של אנרגיה ויסקו אלסטית. מודול מופחת (Er) חושב באמצעות ניתוח Oliver-Pharr, בהתחשב ב-45 האחוזים הראשונים של עקומת הפריקה (42,43).

2.8 כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים

עצם הזרוע נותחה מכל הרקמה הרכה, ומח העצם הוסר במים. Humeri היו C, ולאחר מכן צנטריפוגה כדי לאדות עודף HCl. דגימות מסוננות דוללו 1:5 ב-10 אחוז אצטוטריל ו-0.05 אחוז חומצה heptafluorobutyric (HFBA), הועמסו על שלב הפוך Gemini-NX C{{7} } עמודה (Phenomenex, Torrance, CA), ונותחה עבור קישורים צולבים hydroxylysylpyridinoline (HP), lysyl pyridinoline (LP) ו-pentosidine בהתאמה לשיטות שתוארו על ידי Bank etal(44). פרטים על מערכת HPLC (דגם 126, Beckman-Coulter, Fullerton, CA) מתוארים בהרחבה ב-Oren etal(45). הפרדת קישורי קולגן הייתה כרוכה בפרוטוקול הבא: 15 דקות. של הממס המכיל 24 אחוז מתנול ו-0.15 אחוז HFBA, 10 דקות. של הממס המכיל 40 אחוז מתנול ו-0.05 אחוז HFBA, ו-10 דקות. של הממס המכיל 75 אחוז אצטוטריל ו-0.1 אחוז HFBA. העמודה עברה איזון ב-24 אחוז מתנול ו-0.15 אחוז HFBA למשך 10 דקות לפחות. בין ריצות מדגם. פסגות קולגן צולבות נמדדו עם גלאי פלואורסצנטי (FP1520, JASCO; Easton, ML). אורכי גל עירור ופליטות היו 295 ננומטר ו-400 ננומטר, בהתאמה, עבור HP ו-LP. Pentosidine זוהה עם עירור של 328 ננומטר ופליטת 378 ננומטר. עקומות כיול נוצרו מהעוצמות הנמדדות של חמישה דילולים של מכייל המכיל HP ו-LP מטוהרים (Quidel Corporation) ו-pentosidine (L. Sayre, Case Western Reserve University, Cleveland, OH).

לאחר מכן נורמלו ריכוזי Crosslink לריכוז הקולגן. הקולגן הוערך מריכוז הידרוקסיפרולין בתוך המדגם שנותח לקשרים צולבים. מנה של המדגם שנותח עבור קישורים צולבים היה מדולל 1:50 ונגזר עם 9-פלואורוניל מתיל כלורופורמט (46). הפתרונות הבאים שימשו עבור פרוטוקול חומצות אמינו (1) 20 mM חומצת לימון, 5 mM tetramethylammonium chloride, ו-0.01 אחוז נתרן אזיד, pH 2.85; (2) 20 מ"מ נתרן אצטט, 5 מ"מ טטרה-מתיל אמוניום כלוריד, ו-0.01 אחוז נתרן אזיד, pH 4.5, ו-(3) 100 אחוז אצטוטריל. פרופיל פליטת השיפוע הוא כדלקמן: מ-0-11.5 דקות. שיפוע של 75 אחוז (1) / 25 אחוז (3) עד 60 אחוז (1)/40 אחוז (3), ב-13 דקות. לעבור ל-64 אחוז (2) / 36 אחוז (1), מ-13.1 -18 דקות. שיפוע של 64 אחוז (2) / 36 אחוז (3) עד 62 אחוז (2) / 38 אחוז (3), ולאחר מכן ב-18 דקות. מעבר ל-25 אחוז (2) / 75 אחוז (3) עד סוף הריצה ב-23 דקות.. העמודה עברה איזון ב-75 אחוז (1) / 25 אחוז (3) למשך 10 דקות לפחות. בין ריצות מדגם. שיאי חומצות אמינו נוטרו בגירוי של 254 ננומטר ופליטת 630 ננומטר. עקומת כיול נוצרה מחמישה דילולים של תקן חומצות אמינו שהוכן מהידרוליזט של קולגן (Sigma-Aldrich #A9531, St. Louis, Missouri). לקולגן יש ריכוז קבוע של הידרוקסיפרולין, ולכן ריכוז ההידרוקסיפרולין הומר לריכוז של קולגן (285 מול הידרוקסיפרולין למול קולגן).

2.9 מדידת גילאי פלורסנט

AGEs פלואורסצנטי בכל דגימה נקבעו על ידי בדיקה פלואורומטרית המשווה את הקרינה האנדוגנית בתפזורת של רקמת העצם לתקן כינין. מנה של העצם שעברה הידרוליזה שהופסקה מחדש עם התקן הפנימי עבור HPLC היה מדולל במים DI לריכוז של 1.6 ug עצם/מ"ל תמיסה. הקרינה של ההידרוליזט המדולל ותמיסת מניות מדוללת סדרתית של כינין (מלאי: 10 ug quinine/ml 0.1 N H2SO4) נמדדו בצלחת 96-באר (מוצר #3370, Corning) באמצעות קורא microplate רב-מצבי (Synergy H1, BioTek) בעירור של 360 ננומטר ובפליטה של ​​460 ננומטר.

AGEs פלואורסצנטי בתפזורת נורמלו לתכולת הקולגן של רקמת העצם באמצעות בדיקה קולורימטרית של הידרוקסיפרולין. בקצרה, ההידרוליז דילל עוד יותר לפי תמיסת מניות של μ/ed של הידרוקסיפרולין (200 מיקרוגרם L-hydroxyproline/ml 0.001 N HCl). כלוראמין-T הוספה להידרוליזט המדולל כדי להתחיל את התגובה, והתמיסות הודגרו במשך 20 דקות. בטמפרטורת החדר. התגובה הופסקה על ידי הוספת 3.15 M חומצה פרכלורית, ולאחר 5- דקות. תקופת הדגירה בטמפרטורת החדר, נוספה p-dimethylaminobenzaldehyde. לאחר מכן, התמיסה הודגרה באמבט מים של 60 מעלות למשך 20 דקות, ולאחר מכן צוננה במים קרים בחושך לטמפרטורת החדר. הספיגה של הדגימות והתקנים נמדדה באורך גל של 570 ננומטר באמצעות קורא microplate. AGEs פלואורסצנטי מדווחים ביחידות של ng quinine fluorescence/mg קולגן.

2.10 3 גיאומטריות לאקונריות של אוסטאוציטים

השוקה השמאלית התייבשה מבחינה היסטולוגית בסדרה מדורגת של אתנול ונצבעה ב-1 אחוז פוקסין בסיסי (47). לאחר מכן נוקו הטיביות עם אצטון והוטמעו בפולי(מתיל) מתאקרילט (PMMA). דגימות משובצות נחתכו לרוחב 1 מ"מ פרוקסימלית לצומת השוקה-פיבולה עם מסור במהירות נמוכה (Buehler Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). הוכן קטע קרקע מהמקטע הדיסטלי עם עובי מטרה של 200 אום (Exakt 400 CS, Exakt Technologies Inc, Oklahoma City, OK).

הדמיה של קטעי קרקע בוצעה בשידור עם מיקרוסקופ לייזר קונפוקאלי של Zeiss LSM 710, עם עירור של 555 ננומטר, מסנן פס פס של 568-1000 ננומטר ומטרת טבילת שמן פי 40. הרזולוציה בכיווני x, y ו-z הייתה 0.447 ו-0.493 מיקרומטר, בהתאמה. ערימות z אנכיות הושגו דרך הטווח הנראה לעין של lacunae osteocyte (50-100 µm של עומק הדמיה). תמונות תלת מימד של lacunae osteocytes נבנו ונותחו עבור גיאומטריות lacunares באמצעות קוד פתוח 3D Osteocyte Lacunae Analysis תוכנית ו-MATLAB v17 (21) ). בקצרה, כל תמונה דו-ממדית בתוך מחסנית z הייתה מפולחת אוטומטית כדי להגדיר חסרים, אשר שוחזרו לאחר מכן בתלת-ממד. בהתבסס על אליפסואידים בהתאמה הטובה ביותר, נותחו הלקות עבור נפח, שטח פנים, מרכז המסה הקרוב ביותר, כדוריות (יחס בין הרדיוסים הלקוניים הקטן ביותר לגדול ביותר, שבו 1=כדור), טווח תטא (ערך מוחלט של ההפרש של וקטור תלת-ממדי המתאר את כיוון הציר הראשי מהכיוון הממוצע של כל הלקונות), אופטיות (-1=פרולטית מושלמת, 1=אובלטית לחלוטין), וצפיפות מספר לאקונרית (מספר אוסטאוציטים/נפח תמונה).

2.11 ניתוח נתונים

הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע. עבור כל מערך מ-Raman ספקטרוסקופיה וננו-אינדנטציה נקבעו ממוצעים כך שלכל עצם היה ערך אחד עבור כל מידה בקנה מידה מיקרו. באופן דומה, סטיית תקן חושבה עבור כל מערך כדי להעריך את השונות המרחבית של רקמת העצם בקנה מידה מיקרו. ההשפעות של הזדקנות ו-CKD, כמו גם האינטראקציה ביניהם, נבדקו עם ANOVA דו-כיווני עבור כל הפרמטרים. משתנים תלויים שונו במידת הצורך כדי לעמוד בהנחות של נורמליות שיורית והומוסקדסטיות. המשמעות עבור ההשפעות העיקריות נקבעה לפני כן ל-p < 0.05.="" במקרה="" של="" אינטראקציה="" משמעותית="" בין="" גיל="" ל-ckd,="" בוצעו="" בדיקות="" פוסט-הוק="" לבדיקת="" השפעת="" ckd="" בכל="" גיל.="" שגיאה="" משפחתית="" נשלטה="" עבור="" ניתוחים="" פוסט-הוקיים="" אלה="" באמצעות="" אלפא="" מותאם="" בונפרוני,="" שהביאה="" לאלפא="" קריטי="" של="" 0.05="" 3="0.017." תוצאות,="" שבהן="" להשוואות="" השפעות="" פשוטות="" היו="" ערכי="" p="" בין="" 0.017="" ל-0.05,="" התפרשו="" כלא="">

נסיגה לינארית בוצעה כדי לבדוק אם מדידות איכות העצם ננו-מיקרוסקופיות מנבאות קשיחות מכנית של העצם השלמה. מכיוון שתכונות מכניות של עצם שלמות מראות תלות חזקה בגיל, רגרסיה ליניארית זו כללה את הגיל כמשתנה. מתאמים של Spearman הוערכו גם עבור גיאומטריות lacunar osteocyte ומדדים מכימיה בסרום ושתן, וכן עבור PTH ומדדים של איכות עצם בקנה מידה מיקרו. מובהקות עבור רגרסיות ליניאריות ומתאמים נקבעה ל-p < 0.05.="" minitab="" (v17)="" שימש="" עבור="" כל="">

חריגים זוהו באמצעות מבחן Grubbs (רמת מובהקות=0.05). מספר חריגים לא נכללו בניתוחי סידן ואוריאה בסרום. חריג כל אחד עבור 24-חודש Sham ו-CKD לא נכלל עבור כל ניתוחי המיקרו-ארכיטקטורה של קליפת המוח והטרבקולרית, כמו גם ניתוח FEA. חריג אחד לא נכלל בקבוצת ה-CKD של 24-חודש לניתוח LP, וחורג אחד לא נכלל בקבוצת ה-Sham של 24-חודש עבור קשיחות, עבודה עד שבר ועקירה שלאחר התשואה. נמצאה חריגה אחת נפרדת של 24- חודש עבור סטיית התקן של מודול הננו-אינדנטציה וסטיית התקן של הגבישיות.