עכברי נוקאאוט Nlrc3 הראו שינויים פתולוגיים בכליות לאחר זיהום ב-HTNV

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

וירוס Hantaan (HTNV) מדביק בני אדם וגורם לקדחת דימומית עםשֶׁל הַכְּלָיוֹתתִסמוֹנֶת(HFRS). הפיתוח של מודלים של בעלי חיים מאופיינים היטב של HFRS יכול להאיץ את הבדיקה של מועמדים לחיסון וחומרים טיפוליים ולספק כלי שימושי לחקר הפתוגנזה של HFRS. מכיוון של-NLRC3 יש תפקידים אימונו-רגולטוריים מרובים, חקרנו את הרגישות של עכברי Nlrc3-/- לזיהום HTNV על מנת לבסס מודל חדש של HFRS. עכברי nlrc3−/− פיתחו ירידה במשקל,דימום כליות,והרחבת צינוריות לאחר זיהום ב-HTNV, משחזרת תסמינים קליניים רבים של HFRS אנושי. יתרה מכך, עכברי Nlrc3−/− נגועים הראו עומסים נגיפיים גבוהים יותר בסרום, טחול וכליות מאשר עכברי C57BL/6 (WT), וחלקם הפגינו יותר הפרעות המטולוגיות ושינויים פתולוגיים משמעותיים בתוך מספר איברים מאשר עכברי WT. התוצאות שלנו מזהות שעכברי Nlrc3−/− נגועים ב-HTNV יכולים לפתח תסמינים קליניים ושינויים פתולוגיים הדומים לחולים עם HFRS, מה שמציע מודל חדש לחקר הפתוגנזה ובדיקה של חיסונים ותרופות מועמדות.

מילות מפתח:HFRS, HTNV, NLRC3, דימום כלייתי, הרחבת צינורית הכליה

מבוא

קדחת דימומית עםשֶׁל הַכְּלָיוֹתתסמונת (HFRS) מציגה נפרופתיה אינטרסטיציאלית חריפה לאחר העברה זואונוטית של נגיפי הנטה ממכרסמים לבני אדם. המחלה מופיעה בעיקר באסיה ובאירופה (1, 2). הפתוגנים הנפוצים ביותר הגורמים ל-HFRS הם וירוס Dobrava (DOBV), וירוס פואומאלה (PUUV), וירוס סיאול (SEOV) ו-Hantaan virus (HTNV), שכל אחד מהם גורם לחומרת HFRS שונה. מאפייני המחלה שונים בצפון ודרום אמריקה, שם זיהום Hantavirus גורם לתסמונת ה-hantavirus pulmonary syndrome (HPS), בעיקר על ידי וירוס האנדים (ANDV) ו-Sin Nombre Virus (SNV) (3).

HFRS מתרחש עם מאפיינים של חום גבוה, יתר לחץ דם,אי ספיקת כליות, ודימום(4). ניתן לחלק אותו לחמישה שלבים קליניים: חום, הלם לחץ דם נמוך, אוליגורי, משתן והחלמה. אפיזודה חריפה של זיהום HTNV המוביל ל-HFRS מלווה לעתים קרובות בתרומבוציטופניה, לויקוציטוזיס, אנמיה, עלייה בקריאטינין בסרום ואנזימי כבד (5). ניתן להסביר את התסמינים והסימנים הקליניים הללו בחלקו על ידי העובדה ש-HTNV תוקף בעיקר את הכליה וגורם לפגיעה כלייתית המאופיינת על ידי דלקת נפריטית חריפה של tubulointerstitial הכוללת חדירת תאים דלקתיים (6), וכתוצאה מכך פוגעת באיברים מרובים אחרים (7)

מכרסמים הם המאגרים הטבעיים של הנטאווירוסים המדביקים בעלי חיים ללא הרף מבלי לגרום למחלות (8). ההפרשות שלהם, כגון רוק, שתן וצואה, הופכות למזהמים פוטנציאליים שיכולים להדביק בני אדם השואפים אירוסולים של חלקיקים קטנים של הפרשות מזוהמות. נגיפי Hanta גורמים בדרך כלל לזיהום א-סימפטומטי בעכברים בוגרים BALB/c ו-C57BL/6 (9), אך מחלה נוירולוגית קטלנית או זיהום מתמשך בעכברים יונקים ועכברים שזה עתה נולדו (10, 11). למרות שהוכחו מומים נפרופתיים ב- PUUV נגועים ב- PUUV מקוק (Macaca fascicularis), בעלי חיים אלו הראו רק פרוטאינוריה קלה, חדירת תאי חיסון וכליות נזק צינורי, בדומה למקרה קל של HFRS (12). בנוסף, אוגרים שנדבקו ב-HTNV דרך האף הובילו לזיהום אסימפטומטי מתמשך, המאופיין בוירמיה ספורדית אך רמות גבוהות של עותקי גנום ויראלי בריאות, במוח ובכליות. חמוסים שנדבקו במינון גבוה של HTNV באמצעות הזרקת שריר הראו ירידה הדרגתית במשקל הגוף (5-12 אחוז לאורך זמן) אך ללא פגעתפקודי כליות,היעדר וירמיה, וחוסר העברת וירוסים לאיברים. במרמוסטים, הזרקה תוך שרירית של HTNV הובילה לרמה גבוהה של המרת סרוק וייצור של נוגדנים מנטרלים; באופן עקבי, לבעלי חיים אלה לא היה נזק לכליות, וירמיה או העברת וירוסים לאיברים (13).

למרות חוסר השלמות שלהם, מודלים של בעלי חיים באמצעות חולדות ועכברים הועסקו רבות כדי לחקור פתוגנזה של Hantavirus (14). יושימאצו וחב'. הראה כי זיהום של עכברי SCID עם HTNV גרם למחלת בזבוז קטלנית עם בצקת ריאות (15, 16), ודלדול הנויטרופילים מנע התפתחות של בצקת ריאות, אך לא נמצאו נגעים דימומיים אופייניים של HFRS (15). שימיזו וחב'. מצא ש-HTNV שבודד מחולי HFRS יכול להדביק עכברי BALB/c בנות שבוע 6-בתוך ורידי, ולגרום לוירמיה למשך 6-9 ימים, המראה סימני מחלה כולל ירידה זמנית במשקל, קמטים בשיער, הפרשת כליות (17 ). באותו דגם עכבר, היה דימום מקרוסקופי בגבול שביןקליפת הכליהו-medulla, אך לא נבדק האם השינויים ההיסטופתולוגיים שנצפו קשורים לתפקוד כליות מופחת. בעכברים מואנשים, זיהום HTNV מוביל לירידה במשקל, ירידה בפעילות, פרווה פרוע ופציעה בריאות, שנראה כי הריאה היא איבר המטרה העיקרי לזיהום ויראלי (18). לכן, עדיין יש צורך במודל חיה מתאים של זיהום HTNV אשר לוכד את רוב תכונות המחלה של HFRS.

ביקורות cistancheלהרחבת צינורית הכליה

NLRs הם המשפחה הבולטת ביותר של קולטני חיסון מולדים תוך תאיים ומשרתים פונקציות שונות בוויסות החסינות המולדת. למרות שה-NLRs הידועים ביותר (למשל, NLRP3) מציגים תפקוד רגולטורי חיובי בהפעלה דלקתית וחיסונית, תת-קבוצה יוצאת דופן של NLRs, המוגדרת כ-NLR מעכבים, מציגה תפקוד מעכב בתגובות דלקתיות. כדי להבין את המנגנון של דיכוי חיסון מולד בתיווך NLR, נבדקו ליגנדים ל-NLR מעכבים כגון NLRC3 ו-NLRX1 (19). NLRC3 הוא מווסת שלילי המחליש תגובת אינטרפרון מסוג I (IFN-I) על ידי סילוק והחלשת ממריץ של הפעלת גנים אינטרפרון (STING) (19). NLRX1, כשומר סף הומיאוסטטי מרכזי בין ביולוגיה של המיטוכונדריה לתגובה אימונולוגית, היה מעורב במגוון רחב של מחלות, הן מונעות על ידי פתוגנים והן אחרת (20). מכיוון שמחלת HTNV מבטאת חוסר ויסות רב של דלקת והפעלה חיסונית, בחרנו בעכברי Nlrc3-/- כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של המחלה.

מחקר זה הראה כי מודל העכברים Nlrc3−/− דומה לפציעה שיטתית שנצפתה בחולים עם HFRS, המאופיינת בתרומבוציטופניה,הרחבת צינורית הכליה, ודימום.ניתוח עומס נגיפי גילה כי עכברי Nlrc3−/− הציגו עומס נגיפי גבוה יותר ברקמות מרובות, כולל סרום, טחול וכליות. המחקרים שלנו מבססים מודל עכבר לזיהום HTNV שימושי להערכת חיסונים ותרופות מועמדות.

שיטות

מניות VVirus

זן HTNV {{0}} נתרם על ידי Changshou Hang (המרכז הסיני לבקרת מחלות ומניעתן) ולאחר מכן נשמר והורחב במעבדה שלנו. תאי Vero E6 שימשו להפצת וירוסים, וטיטרים זיהומיים כומתו באמצעות מינון זיהומיות של תרבית רקמה של 50 אחוז (TCID50) על ידי מבחני אימונופלואורסצנציה (IFA). המרה בין יחידות TCID50 ויחידות יוצרות פלאק (PSUs) התבססה על החישוב הבא: 1 PFUs ≈0.7×TCID50 (21).

דור של דגם Nlrc3 Knockout Mouse

עכברי מסוג פראי מסוג C57BL/6J ודגמי עכבר Nlrc3 (Nlrc3−/−) תוכננו ופותחו על ידי Shanghai Model Organisms Center, Inc (שנגחאי, סין). להשגת עכבר Nlrc3-/-, Cas9 mRNA ו-sgRNA הוכנו על ידי שעתוק במבחנה. שני sgRNA ממוקדים למחיקת אקסונים 2-3 של הגן Nlrc3: 5'- GTTGGTCTAATAAGCATCCTGGG {{10}}', 5'- TCCCATGAAACCATGTCAGAAGG -3'. זיגוטים של עכברי C57BL/6J התקבלו והוזרקו עם Cas9 mRNA ו-sgRNAs מתומללים במבחנה והועברו לנמענים בהריון מדומה. הגנוטיפ של עכברי F0 שהתקבלו זוהה ואושר על ידי PCR ורצף באמצעות זוגות פריימר: F-5'- GTGATGTCTGCTTACC CCGTCTCC -3'; R-5'- GCCTGTGCCGCCCTCTCA -3'. על ידי הצלבה עם עכברי C57BL/6J, עכברי F0 חיוביים נבחרו לקבלת עכברי נוקאאוט Nlrc3 הטרוזיגוטיים מסוג F1. ניתוח PCR ורצף אימת את עכברי F1 שהתקבלו. להשגת העכברים ההטרוזיגוטים Nlrc3−/−, נקבות וזכרים של עכברים הטרוזיגוטיים F1 הוצלבו באופן אקראי. עכברים שהיו בני 6-8 שבועות שימשו לכל המחקרים.

הדבקה בבעלי חיים והכנת דגימות

סך של 5×105 PFUs של HTNV ב-50 ul של מדיה חוסן דרך התוואי התוך-צפקי. עכברים בקבוצות ביקורת קיבלו כמויות זהות של PBS. נעשה שימוש בעשרים עד עשרים וחמישה עכברי Nlrc3−/− או WT. כל סוג של עכברים חולק לחמש קבוצות לדגימה 0, 3, 6, 9 ו-12 ימים לאחר ההדבקה. משקלי גוף וטמפרטורות אנאליות תועדו מדי יום. בכל נקודת זמן, ארבע עד חמש חיות משתי הקבוצות הורדמו לבדיקה. לצורך ניתוח וירולוגי, דגימות רקמה טריות נאספו מהלב, הכבד, הטחול, הריאות, הכליה והמוח ולאחר מכן הוקפאו מיד בדרגה -80. עכברים עברו זילוף עם PBS קר, ואיברים נקבעו ב-4% פרפורמלדהיד למשך 4 שעות לניתוח היסטולוגי ואימונוהיסטוכימי. דגימת דם נאספה לבדיקת עומס נגיפי ובדיקת שגרת דם, וסרום בודד לניתוח ביוכימיה.

בדיקת ציטוקינים

סך של 25 מ"ל סרום מכל עכבר נבדק עבור 13 ציטוקינים שונים עם LEGENDplex™ Mouse Anti-Virus Response Panel (13-plex) (BioLegend) בהתאם להוראות היצרן. ציטומטר FACS Calibur (Becton Dickinson Biosciences, CA) שימש לזיהוי. הנתונים נותחו על ידי LEGENDplex v8.0. תוֹכנָה.

בדיקת RT-PCR בזמן אמת

דגימות רקמה מכל עכבר נשקלו והוטבלו ב-PBS והומוגגו על ידי הומוגנייזר אוטומטי-TissueLyser II (QIAGEN, גרמניה), תוך שימוש בתדירות 30/s וזמן 5 דקות. עבור מיצוי RNA כולל, הומוגנאטים של רקמות של 200 מ"ל הועברו לריאגנט של 500 מ"ל TRIzol, ולאחר מכן מיצוי כלורופורם ומשקע איזופרופנול. 140 מ"ל של דגימות סרום הועברו למאגר AVL בנפח 560 מ"ל המכיל RNA נשא (Qiagen, בריטניה) לצורך מיצוי RNA באמצעות ערכת המיני QIAamp Viral RNA Mini (Qiagen, בריטניה). לבסוף, ה-RNA הומס מחדש במים נטולי RNase. בדיקת RT-PCR בזמן אמת ספציפית ל-HTNV בוצעה לזיהוי RNA ויראלי מכל דגימה. רצפי הפריימר המכוונים ספציפית למקטע של HTNV אומצו באופן הבא: F{{10}'- GATCAGTCACAGTCTAGTCA- 3' ו-R-5'- TGATTCTTCCACCATTTTGT-3'. One-Step TB Green PrimeScript™ RT-PCR Kit II (זמן אמת מושלם) (Takara, יפן) שימש למבחן qRT-PCR. תערובת המאסטר הסופי (20 מ"ל) כללה 2 מ"ל של RNA, 5.6 מ"ל של RNase Free dH2O, 0.8 מ"ל של Forward ו-Reverse primer (10 מ"ל), 0.8 מ"ל של PrimScript 1 Step Enzyme Mix 2 ו-10 מ"ל של 2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4. תנאי הרכיבה שהיו בשימוש היו 42 מעלות למשך 5 דקות, 95 מעלות למשך 10 שניות, ולאחר מכן 40 מחזורים של 95 מעלות למשך 0 שניות, 65 מעלות למשך 15 שניות, ו-95 מעלות למשך 0 שניות. התגובות בוצעו ונותחו בפלטפורמת LightCycler (Roche Diagnostics, ארה"ב).

כימות מוחלט של עומס ויראלי

אוליגונוקלאוטידים של RNA ויראליים כתקן RNA הושגו על ידי שעתוק חוץ-גופית מ-DNA באמצעות MAXIscript Kit (Thermo Scientific, בריטניה), שכללה 562 בסיסים של HTNV RNA הממוקדים על ידי הבדיקה (22), ולאחר מכן הוכמת על ידי ספקטרופוטומטר מיקרו-צלחות אולטרה-מיקרו ( BioTek Epoch, ארה"ב), הריכוז של מלאי ה-RNA הסטנדרטי היה 800 ng/mL. להערכת עומס נגיפי בכל דגימה, ה-RNA הסטנדרטי הוכן בדילול סדרתי פי 10-, החל מ-1010 עותקים ל-103 עותקים לכל תגובה. ל-RNA הסטנדרטי שלנו יש מגבלת זיהוי של 1010 עותקים עד 101 עותקים לכל תגובה, ולפיכך אנו מגדירים את סף הגילוי לבדיקה זו על 100 עותקי גנום לכל תגובה. ניתוח במהלך הריצה, עקומות סטנדרטיות נקבעו עם שיפוע של -3.6624, חיתוך Y של 41.68 מחזורים וערך R2 של 0.9996.

ניתוח רמות החלבון על ידי Western Blotting

ליזטים של רקמות הוכנו מדגימות רקמה של עכברים. ערכת בדיקת חלבון של חומצה Bicinchoninic (BCA) (Thermo Scientific, בריטניה) שימשה לזיהוי ריכוז חלבון. לניתוח חלבון, 30 מ"ג של חלבון כולל מכל דגימה הועלו על ג'ל SDS-polyacrylamide והועברו לממברנות NC. לאחר מכן, תמיסת חלב רזה של 5 אחוזים שימשה לחסימה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן, 1:1000 מדולל את הנוגדן החד שבטי 1A8 נגד HTNV-NP (הוכן ומטוהר על ידי המעבדה שלנו) (23, 24) הוסף והודגרה ב-4 מעלות למשך הלילה. לבסוף, ממברנות הודגרו עם נוגדנים משניים, IgG ארנב אנטי-עכבר מצומד HRP, או IgG של עכבר נגד ארנב מצומד HRP בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן נוסף המצע הכימי-אורני של HRP כדי לזהות את החלבונים. ניתוח דנסימטרי של עוצמת פס החלבון בוצע באמצעות תוכנת Image J (NIH, ארה"ב). b-actin שימש כבקרת טעינה לנורמליזציה.

בדיקת אימונוהיסטוכימיה

דגימות רקמות הוטבעו בפרפין וחתכו לפרוסות של 4 מ"מ לצביעה אימונוהיסטוכימיה. המקטעים עוברים דה-פראפיניזציה והידרציה והשבתה של פרוקסידאזים אנדוגניים. קטעים עברו אחזור אנטיגן במאגר ציטראט (PH=6) ב-95 מעלות למשך 10 דקות. לאחר מכן, נעשה שימוש בסרום עיזים רגיל ב-5% לחסימה בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות. ה-mAb 1A8 שימש כנוגדן העיקרי לאנטיגן HTNV NP והודגרה עם קטעי רקמה ב-4 מעלות למשך הלילה. זה היה ואחריו צביעה עם FITC anti-עכבר IgG (Invitrogen) ב-37 מעלות למשך שעה אחת, ולאחר מכן DAPI למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. 3DHISTECH (הונגריה) שימש לרכישת תמונה ו-CaseViewer2.4 לניתוח נתונים.

בדיקת היסטולוגיה

על מנת לשמר את מורפולוגיה של תאים ורקמות, נעשה שימוש בפורמלין נייטרלי מבוקרת ב-4 אחוזים כדי לתקן דגימות רקמה לניתוח היסטופתולוגי. רקמות אלו עובדו למקטעים של 5 מ"מ ולאחר מכן נצבעו בהמטוקסילין ואאוזין (H&E). לבסוף, החתכים נבדקו במיקרוסקופ אור, והתמונות נלכדו על ידי 3DHISTECH (הונגריה), נותחו על ידי CaseViewer2.4. דרגת הנגעים נמדדה חזותית באמצעות מערכת 4-ציונים מוגדרת מראש: בגבולות נורמליים כמו 0, מינימלית כ-1, קלה כ-2, בינונית כ-3, חמורה עד 4.

לימודי נושאים בבעלי חייםכל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לניסויי מעבדה של מרכז החיות של האוניברסיטה הצבאית הרפואית הרביעית. (מס' 20210403).

סטָטִיסטִיקָההנתונים נותחו באמצעות תוכנת GraphPad Prism 9. אלא אם צוין אחרת, כל הנתונים הוצגו כממוצע ± סטיית התקן (SD). נעשה שימוש במבחני t או ANOVA חד כיווני כפי שצוין באגדות הדמויות. ערך P של פחות מ-0.05 נחשב משמעותי.

תוצאות

זיהוי עומס נגיפי באיברים שונים של עכברים Nlrc3−/− לאחר זיהום תוך-פריטוניאלי עם HTNV

כדי לאפיין את הרגישות של עכברי Nlrc3−/− לזיהום HTNV, קבוצה של עכברי Nlrc3−/− הודבקה תוך צפקית ב-5×105 PFUs של HTNV לכל עכבר, תוך שימוש בעכברי WT כביקורות. כל החיות נוטרו מדי יום עבור תסמינים קליניים, טמפרטורה ומשקל הגוף. עכברים הוקרבו ב-3, 6, 9 ו-12 ימים לאחר הזיהום (dpi) כדי לנתח פרמטרים שונים של מעבדה, עומסים ויראליים ופתולוגיה. עכברי Nlrc3−/− החלו לרדת במשקל ב-4 dpi, וב-6 dpi, נרשמה ירידה במשקל של מעל 5 אחוז ממשקל הגוף ההתחלתי שלהם. לשם השוואה, עכברי WT לא הראו ירידה במשקל (איור 1A). לא נרשם חום בשתי הקבוצות (איור 1B). על מנת להעריך את ההפצה והשכפול של HTNV בעכברים מאותגרים ויראליים, הסרום והאיברים העיקריים (כולל לב, כבד, טחול, ריאה, כליות ומוח) נאספו לכימות מוחלטת של מספרי עותקי RNA ויראלי. התוצאות הראו כי וירמיה התרחשה ב-3 dpi בשתי הקבוצות (עכברים Nlrc3-/−: 943 ± 140 עותקים מקבילים למ"ל; עכברי WT: 803 ± 277 עותקים למ"ל). יש לציין כי העומס הנגיפי בסרום של עכברי WT הגיע לשיא של 3 dpi וירד במהירות לאחר מכן, בעוד שבעכברי Nlrc3-/−, העומס הנגיפי שמר על רמת ביניים עד 6 dpi ולאחר מכן ירד בהדרגה לרמה הנמוכה של 9 dpi (איור 1C). בנוסף, אספנו את הדם המלא של עכברים נגועים ב-HTNV בימים 0, 3, 6 ו-9 לאחר ההדבקה כדי לקבוע את השכפול הנגיפי בדם. התוצאות הראו שהעומס הנגיפי עלה ב-3 dpi ולאחר מכן ירד, דבר המצביע על שכפול ויראלי בתאי הדם. כפי שמוצג באיור משלים 1, מספר העותקים הוויראליים בעכברי Nlrc3-/- היה גבוה מזה בעכברי WT (עכברי Nlrc3-/-: 5752 ± 502 עותקים למ"ל; עכברי WT: 3589 ± 869 עותקים למ"ל) ב-3 dpi. יתרה מכך, עומסים ויראליים גבוהים פי 2- זוהו בטחול של עכברי Nlrc3−/− (3033 ± 175 עותקים מקבילים למ"ג) מאשר עכברי WT (1520 ± 425 עותקים למ"ג) ב-6 dpi; אותו דפוס נצפה בכליות ב-9 dpi (עכברים Nlrc3-/-: 500 ± 87 עותקים שווה ערך למ"ג; עכברי WT: 270 ± 40 עותקים למ"ג) (איור 1C). בסך הכל, עומסים נגיפיים צנועים גבוהים יותר זוהו בעכברי Nlrc3-/- מאשר עכברי WT.

לאחר מכן, בדקנו את רמות הנוקלאופרוטאין של HTNV (NP). כפי שמוצג באיורים 2A, C, עכברי Nlrc3-/- הציגו רמות אנטיגן ויראלי גבוהות יותר מאשר עכברי WT בטחול ובכליות. ניתוח סטטיסטי של אנטיגנים ויראליים בכליות ובטחול הוצג באיורים 2B, D, בהתאמה. רמות נמוכות של אנטיגנים ויראליים זוהו בלב, בכבד, בריאות ובמוח של עכברי Nlrc3-/- (איור משלים 2). רמות חלבון NP ויראלי בלב, בריאות ובמוח של עכברי Nlrc3−/− היו נמוכות מעכברי WT ברמת חלבון (איורים משלימים 2B, F, H), אך המשמעויות הסטטיסטית הוצגו בין הלב והמוח הן ב-mRNA ורמות חלבון (איורים משלימים 2A, E, I). ממצא זה הציע כי ויראלי פעיל

שכפול התרחש בדם, בטחול ובכליות של עכברי Nlrc3-/- לאחר זיהום ב-HTNV. לבסוף, השתמשנו באימונופלואורסצנטי כדי לזהות את רמות הביטוי של HTNV NP בטחול ובכליות. עוצמת הקרינה HTNV NP FL הייתה גבוהה יותר בכליותשֶׁל הַכְּלָיוֹתצינוריות (איור 2E) ועיסה אדומה בטחול (איור 2F) של עכברי Nlrc3-/- מאשר עכברי WT ב-6 dpi ו-9 dpi. יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שעכברי Nlrc3-/- רגישים יותר לזיהום תוך צפקי של HTNV.

בדיקות הדם השגרתיות של עכברים Nlrc3−/− לאחר זיהום של HTNV

מקובל נרחב שפתולוגיה של HFRS היא בעיקר בתיווך חיסוני, כולל קומפלקסים של מערכת החיסון, הפעלת משלים, תגובת תאי T (24-26) וייצור ציטוקינים המושרה על ידי HTNV (26, 27), מה שגורם לפציעה באיברים מרובים. בנוסף, טרומבוציטופניה היא תכונה קלינית שכיחה בקרב אלה שנדבקו בנגיפים של קדחת דימומית ויראלית (VHF). לפיכך, ביצענו תחילה בדיקה המטולוגית באמצעות דם מלא שנאסף מעכברי Nlrc3-/- ו-WT ב-3, 6, 9 ו-12 dpi. התוצאות הראו שספירת ה-PLT בעכברי WT ירדה ב-3dpi ולאחר מכן התאוששה בהדרגה, אך הן המשיכו לרדת בעכברי Nlrc3−/− עד שהגיעו לערך הנמוך ביותר ב-9 dpi, נמוך משמעותית מזה ב-WT ב-9 dpi (P<0.05) (figure="" 3a).="" the="" decrease="" of="" wbc="" counts="" was="" observed="" on="" 3="" dpi="" and="" then="" gradually="" recovered="" to="" normal="" levels="" in="" both="" mouse="" strains="" (figure="" 3b).="" to="" further="" dissect="" the="" subset="" changes="" in="" wbcs,="" we="" analyzed="" on="" 0,="" 3,="" 6="" dpi="" the="" number="" of="" monocytes,="" neutrophils,="" lymphocytes,="" and="" t="" cells="" by="" routine="" blood="" tests="" combined="" with="" fellow="" cytometry="" assay.="" the="" number="" of="">

גדל באופן משמעותי בעכברי Nlrc3-/- ב-6 dpi אך לא בעכברי WT (איור 3C). הנויטרופילים בשני סוגי העכברים ירדו מעט אך התאוששו לרמה ממוצעת ב-6 dpi (איור 3D). מספר הלימפוציטים ירד באופן משמעותי ב-3 dpi, בעוד שהם החלו לעלות בעכברי WT ב-6 dpi, ספירת הלימפוציטים נותרה ברמה נמוכה ב-6 dpi בעכברי Nlrc3-/- (איור 3E). היחס בין תאי CD3 פלוס CD4 פלוס T לעומת תאי CD3 פלוס CD8 פלוס T בדם היקפי נקבע על ידי ציטומטריה נלווית ונמצא מוגבר ב-3 dpi ולאחר מכן התהפך במהירות ב-6 dpi, בהתאם לשינויים שנצפו לעתים קרובות בחולי HFRS (איור 3F), שבהם תאי CD4 פלוס T ירדו באופן דרמטי, ותאי CD8 פלוס T נותרו ללא שינוי או מורחבים כפיצוי כדי לגרום ליחס הפוך של CD4/CD8. ממצאים אלו הצביעו על כך שחיסון תוך-צפקי של HTNV לעכברי Nlrc3-/- גרמה במידה מסוימת למאפיינים הקליניים העיקריים של חולים שנדבקו ב-HTNV, כגון טרומבוציטופניה ויחס הפוך של תאי CD4/CD8 T.

שינויים פתולוגיים בכליה של עכברים נגועים ב-Nlrc3−/− מראים דימום ביניים כליות והתרחבות צינוריות כליה.לאחר מכן, שינויים פתולוגיים של עכברים נגועים ב-HTNV הוערכו על ידי צביעת H&E ונמצאו שהם קיימים בכליה של כל עכברי Nlrc3-/- הנגועים המתבטאים בבצקת שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתתאי אפיתל צינוריים. ב-6 dpi, נצפו נגעים דימומיים ב-שֶׁל הַכְּלָיוֹתמדולה (איור 4א).צינורית כליההתרחבות נצפתה בשלב מוקדם של 3 dpi, חומרתה הגיעה לשיא של 9 dpi ונמשכה עד 12 dpi, והיא בולטת יותר בעכברי Nlrc3-/- מאשר בעכברי WT (איורים 4B, C). ממצאים אלו הצביעו על כך

אותה נפרופתיה חריפה המאופיינת בצינוריות כליההתרחבות ודימום בין-סטיציאלי בכליותהושרה בעכברי Nlrc3-/- הנגועים ב-HTNV. באשר לשינויים פתולוגיים אחרים בכבד, בטחול, בריאות, שתי קבוצות העכברים הללו הראו תוצאות דומות. אלה כללו בעיקר hematopoiesis חוץ מדולרי בטחול, התעבות דופן המכתשית בריאה וניוון כבד (איורים משלימים 3A-F). בהתבסס על האמור לעיל, המאפיינים הפתולוגיים שנצפו בכליה של עכברי Nlrc3−/− במהלך השלב החריף של זיהום HTNV דומים מאוד לשינויים הקליניים-פתולוגיים במקרים של HFRS אנושיים.

בהתבסס על זה, בדקנו עוד את המדדים הקשורים של דם ושתן בעכברים עבור הפרעות תפקודיות של הכליה. סרחי עכברים נאספו להערכת אלנין אמינוטרנספראז (ALT), שבריר קריאטין קינאז MB (CK-MB), אוריאה, וכן חומצת שתן (UA). כפי שמוצג באיור 4D, בהשוואה לעכברי WT בקרה, רמת UA בסרום עלתה באופן משמעותי ב-3 dpi בעכברי Nlrc3-/-, CK-MB בסרום עלתה משמעותית ב-9 dpi בעכברי Nlrc3-/-, אך רמות בסרום. של ALT, UREA ו-CREA לא הראו עלייה (טבלה משלימה 1).

שֶׁל הַכְּלָיוֹתהמעורבות ב-HFRS הנגוע ב-PUUV כוללת פרוטאינוריה חולפת, המטוריה מיקרוסקופית אך נדירה נראית לעין, ו-AKI אוליגורית, ואחריה פוליאוריה והתאוששות. המאפיין האופייני של פרוטאינוריה במחלה זו היה הירידה המהירה שלה לאחר השלב החריף של המחלה (6). בעוקבה גדולה של חולים עם דלקת נפריטיס אקוטית של tubulointerstitial הנגרמת על ידי אטיולוגיות שונות, פרוטאינוריה נמצאה רק ברבע מהחולים, בעוד שרק 2 אחוזים מכלל החולים, נמצאה פרוטאינוריה בטווח נפרוטי (28). אספנו את השתן ב-0, 3, 6 dpi ומצאנו שרמות החלבון בשתן עלו ב-3 dpi, השלב החריף של הזיהום. ריכוז החלבון בשתן עלה באופן משמעותי והערך הממוצע היה קרוב ל-0.3 גרם/ליטר ב-3 dpi בעכברי Nlrc3-/- ועכברי WT הנגועים (איור 4E).

לבחון את התאים הדלקתיים שחדרו לתוכםשֶׁל הַכְּלָיוֹתביניים לאחר זיהום ב-HTNV, ביצענו צביעת אימונוהיסטוכימיה (IHC) עם CD3, F4/80 ו-CD11b. התוצאות הראו שקבוצה של תאי חיסון חיוביים ל-CD3 חדרה לתוך ה-שֶׁל הַכְּלָיוֹתinterstitial לאחר זיהום HTNV (איור 5A), ותאי מיאלואיד חיוביים ל-CD11b הופיעו ב-cortical tubulointerstitial (איור 5B). השיעור של תאי CD3 פלוס T החודרים ותאי CD11b פלוס מיאלואידים גבוה משמעותית בעכברי Nlrc3-/- נגועים מאשר עכברי WT, אך מקרופאגים חיוביים ל-F4/80 התפזרו בכל רחבי קליפת הכליה והמדולה ולא הראו מובהקות ההבדל בין שני סוגי העכברים הללו (איור 5C).

זיהום HTNV גרמה לתגובת ציטוקינים חזקה בעכברים Nlrc3−/−

ייצור יתר של ציטוקינים דלקתיים מדווח בדרך כלל אצל נבדקים עם HFRS והוליד את ההשערה שחוסר ויסות ציטוקינים עשוי לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה של המחלה. והרי וחב'. (8) מצא כי ציטוקינים מרובים נוצרו על ידי תאים שונים, כגון מקרופאגים, מונוציטים ולימפוציטים, בתגובה לאותות פרו-דלקתיים כגון זיהום ויראלי. וואנג וחב'. דיווח כי ריכוזי הסרום של TNF-a, IL-6, IFN-g, IL-8, IP-10 ו-RANTES (אך לא IL-4) היו גבוהים מאוד בחולי HFRS (29), בהשוואה לביקורות; וכי הריכוזים הגבוהים ביותר נמצאו בדרך כלל בשלבי החום, לחץ הדם והאוליגורי, במיוחד במקרים חמורים וקריטיים של HFRS. רמות גבוהות של IL-6 בפלזמה היו קשורות לחמורותשֶׁל הַכְּלָיוֹתכישלון וטרומבוציטופניה ב-HFRS המושרה על ידי PUUV ויכולים לשמש כסמן לחומרת המחלה.

התוצאות שלנו הראו שזיהום HTNV הוביל לייצור מוגבר של ציטוקינים, כולל CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a ו-IFN-g ב עכברים Nlrc3−/−, ורמות הציטוקינים הללו הגיעו לשיא של 6 או 9 dpi; לשם השוואה, לעכברי WT היו תגובות ציטוקינים חלשות יותר לאורך תהליך ההדבקה (איור 6).

לסיכום, מצאנו במחקר זה שאחרי חיסון תוך-צפקי של HTNV, עכברי Nlrc3-/- מפתחים ירידה במשקל,דימום כליות, והרחבת צינוריות. תכונות אלה דומות לתסמינים קליניים של HFRS יותר מכל מודלים אחרים של בעלי חיים שפורסמו בעבר. יתרה מכך, עכברי Nlrc3−/− הראו גם עומס ויראלי גבוה יותר בסרום, בטחול ובכליות מאשר עכברי WT ועכברי Nlrc3−/− פיתחו הפרעה המטולוגית ושינויים פתולוגיים משמעותיים במספר איברים, ובכך לבסס זיהום HTNV של Nlrc3−/ - עכברים כמודל חדש לחקר HFRS.

דִיוּן

מודל העכבר HFRS המתואר כאן מדגים כי עכברי Nlrc3-/− נגועים ב-HTNV מייצגים מודל חיה קטן מתאים שעשוי לשמש להערכת חיסוני HFRS וטיפולים. מודל העכבר Nlrc3−/− דומה לפציעה שיטתית שנצפתה בבני אדם, המאופיינת בתרומבוציטופניה, לימפוציטופניה, רמות מוגברות בסרום של AST (תפקוד כבד), LDH, שבריר קריאטין קינאז MB ו-UA(הפרעה בתפקוד הכליות). יתר על כן, עכברי Nlrc3−/− פיתחו ירידה במשקל ונראית לעיןדימום כליות. שכפול ויראלי ושינויים היסטופתולוגיים באיברי מטרה זוהו בריאות, טחול, כבד וכליות. בנוסף, נמצאה רמה מתונה גבוהה יותר של עומסי RNA ויראלי בדם, בטחול ובכליות של עכברי Nlrc3−/−. לשם השוואה, עכברי WT פיתחו שינויים היסטולוגיים קלים למרות זיהוי RNA ויראלי בדם, בטחול ובכליות.

Our findings are generally in agreement with what would be expected for HTNV infection-induced HFRS and signify an improvement over previously published animal models. It has been reported that hemorrhagic fever (HF) virus infection in animal models can lead to a spectrum of diseases from asymptomatic to mild and severe and often transient viremia. A transient weight loss usually manifests mild illness, but severe disease showed more significant weight loss (>20 אחוז) (30). לדוגמה, אוגרים שנדבקו ב-HTNV דרך האף הובילו לזיהום אסימפטומטי מתמשך, המאופיין בוירמיה ספורדית אך רמות גבוהות של עותקי גנום ויראלי בריאות, במוח ובכליות. חמוסים שנדבקו במינון גבוה של HTNV באמצעות הזרקת שריר הראו ירידה הדרגתית במשקל הגוף (5-12 אחוז לאורך זמן) אך ללא פגעתפקודי כליות, היעדר וירמיה וחוסר העברת וירוסים לאיברים. במרמוסטים, הזרקה תוך שרירית של HTNV הובילה לרמה גבוהה של המרת סרוק וייצור של נוגדנים מנטרלים; באופן עקבי, לבעלי חיים אלה לא היה נזק לכליות, וירמיה או העברת וירוסים לאיברים (13).

באשר לתצפית ששינויים המטולוגיים שנצפו רק בנקודת זמן בודדת ושינויים בציטוקינים אינם משמעותיים, אנו חושבים שניתן להסביר אותם על ידי אופי זיהום HTNV, הדומה לזיהומים ויראליים רבים אחרים הפוגעים במספר איברים, ולכן לעתים קרובות קשה למצוא שינויים מתמשכים של פרמטר בודד. באופן כללי, הממצאים שלנו עולים בקנה אחד עם הידע הקיים בתחום. יתר על כן, הגילוי של עכברי Nlrc3−/− בעלי רגישות רבה יותר לזיהום ב-HTNV ומראה שינויים רבים הדומים לשינויים הפתולוגיים של HFRS הוא תרומה חדשה לתחום. מקובל בדרך כלל שתאי אנדותל כלי דם אנושיים הם היעדים העיקריים לנגיף האנטה. , מה שמוביל לדרגות משתנות של התרחבות נימים כללית ובצקת (31).

ניתן למצוא אנטיגנים נגיפיים בתוך האנדותל הנימים של רקמות שונות (נגיפי האנטה מכוונים את חדירות תאי האנדותל על ידי רגישות של תאים לגורם החדירות של כלי הדם VEGF, בעוד אנגיופואטין 1 וספינגוזין 1-פוספט מעכבים חדירות מכוונת הנטאווירוס). ניתוח היסטולוגי הראה שנצפתה הכליה של עכברי Nlrc3−/−צינוריות כליההתרחבות ב-9 dpi, עכברים Nlrc3-/− עם שינויים פתולוגיים חמורים יותר מאשר עכברי WT והתמידו ב-12 dpi. בעכברי Nlrc3−/− נצפו בצקת תאי אפיתל צינורי כליה ודימום בין-סטיציאלי כלייתי יוצא דופן בכליה. יתרה מכך, המטופואזה חוץ-מדולרית בולטת בעיסה האדומה של הטחול נצפתה ב-6, 9 ו-12 dpi, והתרחבות מרכז נבט ומספר מוגבר של תאי ענק מרובי גרעיניים ב-12 dpi. הכבדים הראו גם ניוון הפטוציטי חמור ונמק מפוזר בימים 3, 6, 9 ו-12 dpi. דלקת ריאות ועיבוי דופן המכתשית נצפו ב-6 dpi. ממצא זה מצביע על כך שלזיהום HTNV הייתה השפעה משמעותית וארוכת טווח על הכבד והכליה בעכברים Nlrc3-/- נגועים ב-HTNV. בנוסף, עכברי Nlrc3-/- הראו בולטיםהרחבת צינורית הכליה, דימום בין תאי והפרעה בתפקוד הכלייתי לאחר זיהום ב-HTNV. רמת ה-UA בסרום עלתה באופן משמעותי ב-3 dpi, אינדיקציה ברורה לתפקוד לקוי של הכליות. ריכוז החלבון בשתן עלה משמעותית והערך הממוצע היה קרוב ל-0.3 גרם/ליטר ב-3 dpi בעכברי Nlrc3-/- הנגועים. אותה מגמה של עליית UA לא נצפתה בעכברי WT. תוצאות אלו מצביעות על כך שהמודל שלנו משחזר מאפיינים פתולוגיים נוספים של זיהום HTNV אנושי.

חלבון N (NP) מיוצר בשפע בתאים נגועים ב-hantavirus וניתן לזהות אותו מוקדם כ-4 שעות לאחר ההדבקה (32). מאפיינים אלו מסבירים את הסיבה העיקרית לכך שנקודת הסיום של ELISA היא זיהוי חלבון N ו-hantavirus N ומבחני חיסון להערכת מספר החלקיקים הנגיפיים והתקדמות זיהום ויראלי. שיטות שונות עשויות להשפיע על התוצאות שהושגו ועל המסקנות שהושגו. חלבון ויראלי ווירמיה הם שני פרמטרים שונים של זיהום ויראלי, והם עשויים שלא תמיד להשתנות באופן סינכרוני. התוצאות של PCR כמותי בזמן אמת הראו שעלייה חולפת של רמות NP התרחשה ב-6 dpi בטחול, כאשר ייתכן שהנגיף עבר שכפול חולף, ולאחר מכן פינוי שלו לאחר מכן. כצפוי, נצפתה הצטברות חלבון ויראלי לאחר שיא הווירמיה, שהופיעה ב-3 dpi. ואכן, שכפול ויראלי בטחול ובכליות נשמר ברמה מתונה על 9 ו-12 dpi, מלווה בסינתזת חלבון N (טחול ב-9 dpi: עכברים WT: 192 ± 128 עותקים למ"ג; עכברים Nlrc3-/-: 431 ± 229 עותקים למ"ג; טחול ב-12 dpi: עכברי WT: 160 ± 85 עותקים למ"ג; עכברים Nlrc3-/−: 226 ± 118 עותקים למ"ג). עם זאת, כמות HTNV NP ברמת חלבון הגיעה למקסימום ביום 6 pi ונשארה מוגברת לאורך 9 ו-12 dpi. ההבדל בקינטיקה של עותקי RNA ויראלי וכמות החלבון עשוי לשקף את הדעיכה הדיפרנציאלית שלהם באיברים שונים.

תפקידם של ציטוקינים בדרך כלל מורכב יותר במודלים של מחלות. ב-HFRS המושרה על ידי PUUV, חמורכשל כלייתיוטרומבוציטופניה קשורים לרמות גבוהות של IL-6 בפלזמה (33). הניתוח שלנו הראה שזיהום HTNV הוביל לייצור מוגבר של ציטוקינים, כולל CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a ו-IFN-g ב עכברי Nlrc3-/−, אבל לא באותה מידה בעכברי WT. ראוי לציין כי ב-9 dpi, עכברים Nlrc3−/− הראו שינויים פתולוגיים יוצאי דופן בטחול ובכליות שלהם, מלווים בתגובת ציטוקינים חזקה בשלב זה. ממצאים אלה מצביעים על כך שרמה גבוהה של ציטוקינים עשויה להיות קשורה לפתוגנזה של המחלה.

לסיכום, התוצאות שעליהן אנו מדווחים כאן מוכיחות כי לאחר חיסון עם HTNV דרך התוך-צפקית, עכברי Nlrc3-/- מפתחים ירידה במשקל, טרומבוציטופניה, rתפקוד לקוי של האנל, ודימום.אלה דומים יותר לתסמינים הקליניים של HFRS מכל מודלים אחרים של בעלי חיים שפורסמו בעבר. מודל זה יכול לשמש להערכת חיסונים ותרופות פוטנציאליות ומחקר מעמיק של פתוגנזה של HFRS in vivo.