זיהום טבעי של Parvovirus בחתולי דיג בר (Prionailurus Viverrinus) חושף לוקליזציה ויראלית קיימת בכליות
Feb 25, 2022
תַקצִיר
קרניבור פרוטופו-וירוס-1 (CPPV-1), זן ויראלי המכיל גרסאות של וירוס פנלוקופניה חתולים (FPV) ו-Parvovirus של כלבים (CPV), מופץ באופן נרחב בקרב טורפים ביתיים ופראיים הגורמים למחלות קטלניות מערכתיות. חתולי דיג בר (Prionailurus viverrinus), מין פגיע בעולם, נמצאו מתים. בבדיקה שלאחר המוות של הפגרים התגלו נגעים במעי, בטחול ובשֶׁל הַכְּלָיוֹת. זיהוי אנטיגן CPPV-1 ברקמות אלו, באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ואימונוהיסטוכימיה (IHC), תמכה בזיהום על ידי הנגיף. חיוביות PCR ו-IHC ב רקמות כליותחשף לוקליזציה לא טיפוסית של הנגיף בזמן הכלאה באתרו (ISH) ומיקרוסקופ אלקטרונים העברה (TEM) עם טכניקת הפופ-אוף אישרו את התיאור הראשון של לוקליזציה ויראלית בכליות. אפיון גנום מלא וניתוח חומצות אמינו מסקנות של ה-CPPV שהתקבל-1 מחתולי הדייג חשפו את FPV כגורם סיבתי. רצפי FPV שזוהו הראו מוטציות חומצות אמינו ב-I566M ו-M569R בחלבון הקפסיד. ניתוחים פילוגנטיים ואבולוציוניים של רצפי גנום מקודדים מלאים גילו שהגנום של חתול הדייג CPPV-1 מקובץ גנטית לגנום FPV שבודדו מחתולי בית בתאילנד. מאז שנות ה-70, הוכח שהגנומים הללו חולקים אבולוציה גנטית עם זני FPV סיניים. מחקר זה הוא העדות הראשונה לזיהום CPPV-1 בחתולי דיג והוא הראשון שהראה את הלוקליזציה שלוכליות. ממצאים אלה תומכים בטווח המארחים הרב של נגיף פרבו זה ומצביעים על כך שזיהומי CPPV-1 קטלניים עלולים לגרום לקרניבורים בר פגיעים אחרים.
מילות מפתח: רקמת כליה; מחלות כליות, כליות, כליות, צינוריות כליות
מבוא
הסוג Prionailurus, משפחת Felidae, מסווג כקבוצה של חתולי בר מנומרים, קטנים בגודלם, שמקורם באסיה [1]. הסוג Prionailurus כולל ארבעה מיני חתולי בר המוכרים רשמית, כולל חתול נמר (P. bengalensis), חתול בעל ראש שטוח (P. planiceps), חתול מנוקד חלוד (P. rubiginosus) וחתול דייג (P. viverrinus) [2]. חתול הדייג חי בעיקר בקרבת ביצות ומנגרובים. הוא חי אך ורק בדרום ודרום מזרח אסיה והוא נפוץ יותר בתאילנד [3, 4]. כיום, אוכלוסיות חתולי דייגים מאוימות מכיוון שהשטחים הביצות שבהם הם חיים נהרסו במהלך העשור האחרון. כתוצאה מכך, מין זה נחשב כיום לפגיע ונמצא ברשימה האדומה של האיגוד הבינלאומי לשימור הטבע (IUNC) [3]. בשל אובדן בית הגידול שלהם, מושבות חתולי דייגים נודדות ומתגוררות מדי פעם באזורים שבהם חיים בעלי חיים ובני אדם מבויתים [5]. תופעה זו של סביבה משותפת עלולה להוביל לגלישה מוגברת של פתוגנים בין חיות בר וחיות בית רגישות ולהיפך. דיווחים על התפרצויות קטלניות בחיות בר או חיות בית, שייתכן שנבעו מדליפת פתוגנים, תועדו במהלך העשורים האחרונים [6-9]. לפיכך, יש לבחון את דינמיקת ההעברה של פתוגנים מאותם בעלי חיים וצריכה בדיקה נוספת.
CISTANCHE ישפר את תפקוד הכליות/כליות
קרניבור פרוטופו-וירוס-1 (CPPV-1), זן ויראלי הכולל נגיף מינק אנטיטיס (MEV), נגיף דביבון פרבו (RPV), וירוס פנלוקופניה חתולים (FPV) וגרסאות של נגיף פרבו-כלבים (CPV), היה מוכר כפתוגן חשוב הקשור למחלות קטלניות במשפחות כלביים ו-Felide בר וביתיים כאחד [10, 11]. השערה של FPV, פתוגן נפוץ של מיני Felidae, הוא אב קדמון משותף של CPV [12-14]. CPV מדביק לעתים קרובות בעלי חיים ממשפחת ה-Canidae וישנן עדויות הולכות וגדלות לזיהום אצל המקבילה למשפחת Felidae [9, 15, 16]. בעבר, השערה של FPV ו-CPV היא וירוס מוגבל מארח. עם זאת, מספר ממצאים הצביעו לאחר מכן על כך שחלק מהחיות ממשפחת ה-Canidae עשויות למלא תפקיד כמאגר עבור FPV או להיפך [11, 17, 18]. יתרה מכך, מספר דוחות הצביעו על כך שגרסאות ה-FPV וה-CPV (CPV-2a, -2b ו--2c) חולקות מארחים רגישים. מארחים אלה הם לא רק חיות בית, אלא גם מגוון מינים טורפים [15, 19, 20], דבר המצביע על טווח מרובה מארחים של CPPV-1 [11].
משנת 1996 עד 1997, וריאנטים של CPV זוהו לראשונה בחתולי נמר וזכו בתחילה כ-Parvovirus של חתול נמר (LCPV), מה שמרמז על התיאור הראשון של CPPV-1 בסוג Prionailurus [21, 22]. חלק מזני LCPV אלו התגלו כסותרים גנטית מה-CPV-2a ו--2b שתוארו קודם לכן עקב מוטציה של חומצת האמינו G300A בחלבון הקפסיד (VP). זה הביא לשינוי בתכונות האנטיגניות שלו, המשמש כעת כנקודת מוטציה ייחודית להבדיל בין CPV-2c מגרסאות CPV אחרות [22]. גילוי הגרסה החדשה של CPV (הידועה כיום בשם CPV-2c) בחתולי נמר תמך ברעיון של אבולוציה משותפת של CPPV-1 בקרב מיני בעלי חיים. מאוחר יותר, דווחו זיהומים של גרסאות FPV ו-CPV בחתולי נמר [9]. זה הצביע על כך שמינים אחרים באותו הסוג כמו החתול הנמר (הסוג Prionailurus) עשויים להיות רגישים לזיהום CPPV-1. עד כה, הרגישות לזיהום CPPV-1 במינים אחרים בסוג Prionailurus עדיין לא ידועה במידה רבה. פענוח כיצד וריאציות CPPV-1 מתפתחות וכיצד מתנהגות וריאציות חדשות עשויות לעזור להבהיר כיצד למנוע התפרצות אפשרית של הגרסה החדשה. גם אם הנגיף החדש זוכה לטווחים רחבים יותר של מארח, התפרצויות קטלניות או נגעים לא טיפוסיים הקשורים לזיהום עלולים להיראות במארח חדש ורגיש. מחקר זה מתאר זיהום קטלני ב-CPPV-1 בחתולי דיג בר (Prionailurus viverrinus). אפיון גנטי של ה-CPPV שהושג-1 מגלה את FPV כגורם סיבתי. ממצא זה מספק את העדות הראשונה לזיהום FPV במין זה, והוא חושף את הטרופיזם התאי הייחודי של נגיף זה. בירור נוסף של זיהום FPV והגרסאות שלו במין זה הכרחי לחשבון שלו לזיהום עולמי במינים פגיעים רבים.
חומרים ושיטות
בעלי חיים ובדיקה שגרתית לאחר המוותביוני 2019, שני חתולי דיג בר (P. viverrinus), ייעדו תיק מס. 1 ו-2 נמצאו מתים באזור הפרברים במחוז נאקהון רצ'סימה, תאילנד. מאוחר יותר באוגוסט 2019, חתול דייג נוסף, המיועד לתיק מס. 3, חולץ מהאזור בו נמצאו שני חתולי הדייגים הראשונים. בשל חומרת ההתייבשות, מקרה מס. 3 מתו במהלך הפניה לבית החולים לבעלי חיים. שלושת חתולי הדייגים הללו הוגשו לחקירה שלאחר המוות כתהליך שגרתי. למרבה הצער, דגימות של בעלי חיים מבויתים מסתובבים חופשיים או מיני בר המאוחסנים באותו אזור לא היו זמינות; לפיכך, הם לא נכללו במחקר זה. בוצעה בדיקה שגרתית שלאחר המוות בכל חתולי הדייג. איברים חיוניים סלקטיביים כולל ריאות, כבד, לב, טחול, וכִּליָהנדגמו מכל חתולי הדייג, בעוד שהמעי ובלוטת הלימפה המזנטרית נאספו בנוסף מחתול דייג מס' 3. כל הרקמות שנבחרו הוגשו לבדיקה היסטולוגית ונדגמו בנפרד לבדיקות מולקולריות נוספות. לצורך היסטולוגיה, הרקמות טופלו ב-10 אחוז (v/v) פורמלין נייטרלי מאוחסן במשך 24 שעות לפחות ועובדו באופן שגרתי. אחר כך הם נצבעו בהמטוקסילין ואאוזין
(H&E) באמצעות נהלים סטנדרטיים לפני חקירה על ידי פתולוג וטרינרי מוסמך ACVP (TK). דגימות רקמה טריות שהתקבלו משלושת חתולי הדייג אוחסנו ב-80°C למחקרים מולקולריים. כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות בעקבות אישור הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת Chulalongkorn (מס' 1931036).
בדיקות מולקולריות כלליות וירולוגיותדגימות הרקמה הטריות כולל לב, ריאה, כבד, טחול, וכִּליָהשל כל חתולי הדייג בתוספת רקמות נוספות של בלוטות הלימפה המעיים והמזנטריות של חתול דייג מס. 3, הועברו למיצוי חומצת גרעין ויראלית על ידי הומוגזציה אינדיבידואלית שלהם עם 1 אחוז (v/v) תמיסת מלח פוספט (PBS). לאחר מכן, כל חומצת הגרעין הוויראלית חולצה באמצעות ערכה מסחרית למיצוי חומצת גרעין ויראלית II (Geneaid, Taipei, Taiwan) בעקבות הצעת היצרן. לאחר מכן, חומצות הגרעין שחולצו הוסמכו וכומתו לפי יחס הספיגה שלהן A260/A280 בשיטת הספקטרופוטומטריה (NanoDrop, Thermo Scientific™, Waltham, MA, ארה"ב). כל חומצות הגרעין המופקות עברו עוד חקירה מולקולרית ויראלית באמצעות ניתוח תגובת שרשרת פולימראז (PCR) עם מספר לוחות בדיקת PCR של משפחה פאן-וירולוגית, כולל זיהוי של הרפסווירוס [23], paramyxovirus [24], pneumovirus [25], calicivirus [26], וירוס שפעת [27], בוקאווירוס [26, 28], וירוס פרבו [29] ונגיף קורונה [30, 31]. פרוטוקולי ה-PCR, הריאגנטים, תנאי הרכיבה והבקרות החיוביות/שליליות המשמשות בתגובות מתוארים בקובץ S1. זיהוי PCR ספציפי של הגן גליצרלדהיד- 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) של חתולים שימש כבקרה פנימית כפי שתואר קודם [32]. לאחר מכן, אמפליקוני ה-PCR החיוביים הוצגו באמצעות פלטפורמת אלקטרופורזה נימית QIAxcel (Qiagen, Hilden, גרמניה) כפי שתואר בעבר [33]. האמפליקונים החיוביים של כל בדיקת PCR טוהרו והועברו לרצף Sanger דו-כיווני (Macrogen Inc, סיאול, דרום קוריאה). עקב אוטוליזה מתונה של הרקמות, לא ניתן היה לבצע חקירה בקטריולוגית על חתולי דייג אלו.
זיהוי CPPV-1 במקום באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC), הכלאה באתרו (ISH) ומיקרוסקופיה של אלקטרונים העברה (TEM)
בדיקה מולקולרית וירולוגית ראשונית גילתה אמפליקונים חיוביים של PCR pan-parvovirus ותוצאות הרצף הראו גם רצפי DNA פוטנציאליים של CPPV-1. ממצאים אלו הניעו אותנו לאשר עוד יותר את נוכחותו של CPPV-1 ולמקם את התפלגות ה-CPPV-1 ברקמות של חתולי דיג. רקמות מוטבעות פרפין מקובעות בפורמלין (FFPE) כולל ריאות, כבד, לב, טחול,כִּליָהוהמעי עברו זיהוי CPPV-1 IHC באמצעות נוגדן מונוקלוני אנטי-פרבו-וירוס של עכבר (ab59832, Abcam, Cambridge, בריטניה) עם מערכת זיהוי חזרת פרוקסידאז (HRP) (EnVision polymer, Dako, Glostrup, דנמרק) . בקצרה, קטעי ה-FFPE נחתכו לעובי של 4-מיקרומטר והוסרו עוד יותר מהפראפין והוסרו. לאחר מכן, השקופיות טופלו מראש, פרוקסידאז אנדוגני נחסמו ועובדו כפי שתואר קודם [11]. קטעים מרקמת המעי של חתול נגוע ב-FPV וכלב נגוע ב-CPV שימשו כביקורות חיוביות, בעוד שקטעים זהים הודגרו עם IgG מטוהרים של עז-עכבר וארנב (ריאגנט לבקרה שלילי אוניברסלי IHC, קוד ADI-950-231-0025, אנזו לייף Sciences, Farmingdale, NY, USA), שימשו כבקרות שליליות. בהקשר לשֶׁל הַכְּלָיוֹתנמק צינורי קיים באזורים שבהם נצפו אותות חיוביים ל-CPPV-1 IHC,כִּליָהחלקים של כל חתולי הדייג עברו צביעה מיוחדת של Periodic AcidSchiff (PAS), על מנת להדגים את הארכיטקטורה התאית שלכִּליָהרקמות.
CISTANCHE ישפר מחלת כליות/כליות
יתר על כן, ה-FFPEכִּליָהקטעים של חתול דייג מס. 1 ו-3 עברו ניתוח ISH ו-TEM על מנת לתמוך בתוצאה של צביעה חיובית של CPPV-1 IHC ולהדגים בצורה אולטרה מבנית את החלקיקים הנגיפים ברקמות כליות, בהתאמה. עבור ISH, בדיקת ה-CPPV-1 DNA המכסה 393 bp [34] של הגן הקפסיד של CPPV-1 נבנתה באמצעות ערכת PCR DIG Synthesis Probe (Roche Diagnostics, באזל, שוויץ), לפי הצעות היצרן. תגובת המחזור התרמית והמצב בוצעו כמתואר קודם [34] למעט באמצעות שימוש באוליגונוקלאוטידים המסומנים דיגוקסיגנין (DIG). בדיקת ההכלאה שנבנתה הוצגה ואושרה על ידי רזולוציית גודל באלקטרופורזה של 1.5 אחוז (w/v) agarose gel. ה-ISH עם DNA כרומוגני נעשה כמתואר קודם [26] עם שינויים קלים. בקצרה, לאחר דה-פראפיניזציה, הרטבה ושטיפה לאחר מכן ב-PBS, שקופיות FFPE בעובי 4-מיקרומטר עברו עיכול פרוטאוליטי, פוסט-קיבוע וקדם-הכלאה. לאחר מכן, השקופיות הוכלאו עם הבדיקה של 25 ng/μL ISH ב-42 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אותות ההכלאה הוצגו על ידי צימוד עם 100 μL של שברי Fab anti-DIG-AP (Roche, Basel, שוויץ) (1:200 בפתרון 1X Blocking) בשילוב עם Liquid Permanent Red (LPR) (Dako, Glostrup, דנמרק) . השקופיות נצבעו אז עם המטוקסילין. משקעים אדומים במתאם של מורפולוגיה תאית נחשבו חיוביים עבור ISH. עבור בקרות שליליות, בדיקות נגיף האמנון (TiLV) [35] הופעלו, במקום בדיקה CPPV-1. דגימות ה-TEM הוכנו בהתאם לטכניקות פופ-אוף עם שינויים [36-38] והוצבעו במתכות כבדות כפי שתואר קודם לכן [39, 40]. מבנה האולטרה נחקר באמצעות TEM (HT7800; Hitachi, טוקיו, יפן) המופעל ב-80 קילו וולט
אפיון גנטי באורך מלא של CPPV חתול דייג-1מכיוון שהתוצאות של בדיקת PCR וירולוגית ו-IHC היו הסכמות והתוצאות של רצפי גנום חלקיים של VP-2 שהתקבלו מ-PCR pan-parvoviral הצביעו על דמיון גנטי בין המקרים מס. 1 ו-2, אך לא עבור מקרה מס' 3, אפייננו עוד את רצף ה-CPPV-1 באורך מלא מחתולי הדייגים הללו (מקרה מס' 1 ו-3) וסיווגנו את מקור ה-CPPV-1 באמצעות קבוצה של זוגות פריימר מנוונים ספציפיים ל-FPV ו-CPV שאוחזרו מפרסום קודם [26]. בקצרה, חומצות הגרעין המופקות המתקבלות מטחול וכליותשל שני חתולי דייג בתוספת רקמת מעיים נוספת של חתול דייג מס. 3, הוגברו בנפרד באמצעות GoTaq1 Hot Start Green Master Mix (Promega, Madison, WI, ארה"ב) ופריימרים ספציפיים (S1 File). תנאי ה-PCR תוארו בעבר [26]. אמפליקוני היעד הוצגו באמצעות אלקטרופורזה של 2 אחוז (w/v) ג'ל agarose וטיהרו נוסף באמצעות ערכת מיצוי ג'ל DNA של Monarch (New England Biolab, פרנקפורט, גרמניה) לפני רצף Sanger מסחרי. רצפי הגנום המלאים של מבודדי CPPV-1 שהתקבלו משני חתולי הדייגים הופקדו ב-GenBank (מספרי גישה MW145540-MW145541).
ניתוחים פילוגנטיים, רקומבינציה ואבולוציוניים של CPPV של חתול דייג-1 רצפי הגנום באורך מלא של זני החתול הדייג CPPV-1 היו מיושרים עם רצפי ה-CPPV המלאים שפורסמו-1 שהתקבלו ממינים מארחים שונים , זמין ב-GenBank באמצעות MAFFT V. 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) ותוכנת MEGA7 (http://www.megasoftware.net). יישורי הרצף עברו לאחר מכן לבניית עץ פילוגנטי. העץ הפילוגנטי נוצר בשיטת הסבירות המקסימלית (ML) עם מודל Hasegawa–Kishino–Yano עם התפלגות גמא (HKY פלוס G), אשר נבחר באמצעות אלגוריתם המודל Find-Best-fit ב-MEGA7 לפי קריטריון המידע הבייסיאני . העץ היה קשור עם 1,000 שכפולים. דמיון צמדי של רצף בין גנומים CPPV-1 חושב באמצעות מודל הסיכוי המרבי המרבי והמרחק האבולוציוני שלהם נותח ב-MEGA7. זהויות הנוקלאוטידים בזוגיות נוצרו והוצגו בפורמט Microsoft Excel (קובץ S2). רצף יישור הפלט של CPPV-1 שימש לאחר מכן כתבנית לניתוח רקומבינציה גנטית באמצעות שתי חבילות תוכנה עצמאיות סטטיסטית. בקצרה, היישור זיהה את זני הרקומבינציה הפוטנציאליים תוך שימוש ב-Recombination Detection Program 4 (RDP4) Package V. תוכנת Beta 4.94 משולבת, וזו הוצלבה עם עלילת דמיון וניתוח אתחול בחבילת התוכנה SimPlot גיל V. 3.5.1. הגדרות התוכניות והפרשנות של התוצאות נערכו כפי שתואר קודם [26, 41].
Fלניתוח אבולוציוני של חתול הדייג CPPV{{0}}, אוחזר מערך נתונים של 224 רצפי גנום מלאים המכילים 26 רצפי FPV, 6 MEV ו-192 CPV, שמקורם כולם מ-18 מדינות בין 1979 ל-2019. ממסד הנתונים של GenBank. ניתוח אבולוציוני בוצע עם 2 רצפי ה-CPPV-1 הפוטנציאליים שהתקבלו מחתולי דיג באמצעות מודל ה-Bayesian Markov Monte Carlo (BMCMC) מיושם ב-BEAST V. 2.4.8 [42]. ה-jModelTest [43] בוצע כדי לזהות את מודל החלפת הנוקלאוטידים המתאים ביותר עבור רצפי יישור מרובים. דגמי ההחלפה המתאימים ביותר תחת מודלים רגועים וקפדניים של לוג-נורמליים בגדלים קבועים של אוכלוסיה כקודמים יושמו כדי להסביר שיעורי התפתחות מגוונים בין השושלות. תדרי הבסיס הקודמים והאמפיריים של קו הרקיע הבייסיאני הושגו תחת מודל השעון המתאים ביותר ופעלו עבור 100 מיליון רשתות, דגימה כל דור 10,000, כאשר 10 האחוזים הראשונים נמחקו כצריבה. התכנסות הפרמטרים אושרה על ידי חישוב גודל המדגם האפקטיבי באמצעות תוכנית TRACER V. 1.7.0 [44]. עצי האמינות המקסימלית של ה-Clade צוינו באמצעות TreeAnnotator V. 1.8.3 [42]. העץ הפילוגנטי עם סטייה משוערת, ציר זמן משתנה, הסתברות אחורית וצפיפות אחורית של 95 אחוזים הגבוהה ביותר (HPD) נוצר והוצג באמצעות FigTree V. 1.4.3 [45].
מחקר רטרוספקטיבי של אנטיגן CPPV-1 בטורפים של חיות ברעל מנת לחקור את התפקיד של CPPV-1 הקשור לתחלואה ותמותה עם סיבות לא ידועות בקרב טורפים בר בעבר הרחוק והאחרון, נכללו 305 דגימות טריות סלקטיביות למיצוי גנומי ומיקוד זיהוי של ה-CPPV{{2} } גן קפסיד כמתואר לעיל. דגימות אלה התקבלו מאז 2013 כספוגיות צואה או כתוכן מעי. הם התקבלו מ-136 חיות מגן חיות מ-27 מינים טורפים שונים (טבלה S1). תוצאות ממצאים שלאחר המוות ולוקליזציה של רקמות של חתול דייג CPPV-1 כל חתולי הדייגים המנוממים היו כחושים בינוניים עם דרגות שונות של התייבשות בעוד ש-2 מתוך 3 חתולי הדייג (מקרה מס' 1 ו-2) הראו אוטוליזה מתונה. בולט, הטחול וכליותהיו צפופים בכל חתולי הדיג. לחתול דייג מס' 3 היו נגעים מקרוסקופיים של דלקת מעיים קטרלית שהכילו תוכן חום-צהבהב מימי בלומנם וגודש של בלוטת הלימפה המזנטרית. מבחינה היסטולוגית, הריאה של חתול דייג מס. 3 גילה גודש חמור עם חדירת תאים חד-גרעיניים ב-alveoli. הכבד הראה דלקת כבד פרי-פורטלית קלה, המאופיינת בחדירת תאים חד-גרעיניים בשלישיות פורטל הכבד. דרגות דומות של גודש בטחול עם מספר מועט של זקיקים לימפואידיים בטחול נצפו בכל חתולי הדייג. זקיקי הלימפה התרוקנו והזקיקים הלימפואידים הנותרים בתוך ארכיטקטורת טחול ממוטטת עם מספר מוגבר של טרבקולות טחול בולטות (איור 1A). היו מפוזרים פסולת קריורקטית של לימפוציטים עם
איור 1. זיהום CPPV-1 בחתולי דיג. תמונות H&E (A, C) ו-CPPV-1 IHC (B, D) מדגימות מחתולי דיג. (א) חתול דייג מס. 1. טחול דחוס מפושט עם מספר דל של זקיקים לימפואידים. מרכז אחד מהזקיקים הלימפואידים הנותרים הכיל חומר פיבריל אאוזינופילי (פיברין) מעורבב עם פסולת קריורקטית מפוזרת של לימפוציטים (לימפוציטוליזה) (הכנס). מספרים מעטים של לימפוציטים אלה הכילו גופי הכללה תוך-גרעיניים בזופילים בגודל 5-7 מיקרון השוליים את הכרומטין הגרעיני (חץ). (ב) חתול דייג מס. 3. קיצור של villi עם קריפטות מורחבות מדי פעם שהכילו חומרים חלבוניים אאוזינופיליים ומרופדים בתאי אפיתל קריפטה מוחלשים במידה ניכרת או נמקית (הכנסה). תאי אפיתל קריפטה רבים היו pyknotic ו-karyorrhectic ותאים נדירים הכילו גופי הכללה תוך גרעיני בזופיים דומים (חצים). (ג) חתול דייג מס. 1. הפעילות החיסונית של CPPV-1 נצפתה לעתים קרובות בציטופלזמה של תאים חד-גרעיניים באזור זקיק הלימפה של הטחול. (ד) חתול דייג מס. 3. אותות CPPV-1 IHC זוהו בצורה מפוזרת ואותות הפעילות החיסונית היו מקומיים בצורה ניכרת בציטופלזמה של תאי אפיתל קריפטליים (הוספה). פסים מציינים 25 מיקרומטר עבור (A) ו-120 מיקרומטר עבור (B-D).
הצטברויות של חומרים פיברילים אאוזינופיליים במרכז זקיק כזה. מספרים מעטים של לימפוציטים אלה מכילים 5-7 מיקרומטר גופי הכללה תוך גרעיניים בזופילים השוליים את הכרומטין הגרעיני. קיצור של דלי מעיים עם קריסת ארכיטקטורת רירית היה קיים בקטע המעי של חתול דייג מס. 3 (איור 1B). חלק מהקריפטות הורחבו, והן הכילו חומר חלבוני אאוזינופילי והיו מצופים בתאי אפיתל קריפטה מוחלשים במידה ניכרת או נמקית. תאי אפיתל קריפטליים רבים היו pyknotic ו-karyorrhctic ותאים נדירים הכילו גופי הכללה תוך גרעיניים בזופילים דומים. CPPV-1 IHC שימש כדי להדגים את נוכחות הנגיף ברקמות ולתיאור התפקיד הפתולוגי של CPPV-1 בנגעים שנצפו בבדיקה שגרתית שלאחר המוות. התאים החד-גרעיניים השוכנים בטחול חשפו פעילות חיסונית אינטנסיבית חיובית של CPPV-1 בכל חתולי הדייג (איור 1C). הפעילות החיסונית נצפתה גם ברוב הציטופלזמה של תאי אפיתל קריפטליים והייתה תואמת לנגעי המעיים של חתול דייג מס. 3 (איור 1D). יש לציין, דרגות שונות שלצינורית כליהvacuolation ומולטיפוקלשֶׁל הַכְּלָיוֹתשטפי דם היו ניכרים בכל חתולי הדיג (איור 2A). כמהשֶׁל הַכְּלָיוֹתתאי אפיתל צינורי היו היפראוזינופיליים עם pyknosis גרעיני, בעוד שתאי אפיתל צינורי צינוריים נדירים חשפו גרעיני שלפוחיות עם כרומטין גרעיני שולי (איור 2B). בהקשר לכִּליָהנגעים, ביצענו בנוסף צביעת PAS כדי להדגים את הארכיטקטורה הסלולרית שלרקמת כליהוכדי לשלול היפוקסיה מערכתית כגורם אפשרי לנגע זה. צביעת PAS הדגימה אתצינורית כליהממברנות הבסיס היו שלמות (איור 2B, הוספה). בתוך הכִּליָהמקטעים, תיוג חיסוני CPPV-1 היה חזק ונראה לעתים קרובות בציטופלזמה שלצינורית כליהתאי אפיתל (איור 2C) ותאי אורותל ב-אגן כליותבכל המקרים. לא נצפתה עדות לתגובה אימונוגנית בבקרות השליליות (איור S1). הלוקליזציה הלא טיפוסית של CPPV-1 ברקמות כליותשנחשף על ידי IHC הציע שעלינו לבצע חקירות נוספות כדי לאשר את הנוכחות והלוקליזציה של ה-CPPV-1 בכִּליָהבאמצעות ISH ו-TEM עם טכניקת פופ-אוף. ה-CPPV-1 ISH-אימוניות פעילות הייתה חיובית בכל חתולי הדייג וממוקמת באופן מפוזר בגרעין שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתתאי אפיתל צינורי, שבהם נצפו הנגעים הצינוריים (איור 2D). לא נצפתה תגובה בבקרות השליליות (איור S1) בהתאם לתוצאות של אותות אימונולוגיים חיוביים של ISH שהתמקמו בגרעין שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתנצפו תאי אפיתל, מספר רב של חלקיקים ויראליים קטנים צפופים באלקטרונים, המוערכים בקוטר של כ-19-22 ננומטר. אלה התקבצו בגרעינים של אלהצינורית כליהותאי אורותל (איור 3).
זיהוי CPPV של חתול דייג-1 וניתוח גנומיבראש ובראשונה, לוחות ה-PCR המשפחתיים הספציפיים לווירוסים שונים, כולל הרפסווירוס, פרמיקו-וירוס, פנאומו-וירוס, קליצי-וירוס, נגיף השפעת, בוקא-וירוס, וירוס הקורונה וה-parvovirus נבדקו על דגימות חומצת גרעין ויראלית שחולצו. זה חשף תוצאות חיוביות רק עם ה-Pan-parvovirus PCR במעי, בלוטות הלימפה וכִּליָהדוגמאות של שלושת חתולי הדייגים. לעומת זאת, פאן-PCRs אחרים לגילויי הנגיף האחרים היו שליליים בכל דגימות הרקמה שנבדקו מתוצאות שהתקבלו בעבר של חיוביות PCR של פאן-פרווווירוס בכל חתולי הדייג, אפיינו עוד את רצפי הגנום המקודדים בשני חתולי דייג באמצעות מספר זוגות פריימר ב מופק דגימות חומצת גרעין שהתקבלו מהמעי (מקרה מס' 1) וכִּליָה(תיק מס' 3). 4,462 ו-4,430 זוגות הבסיס של גנומים מקודדים שלמים של שני זני CPPV-1 של חתולים דייגים זוהו וסומנו כזן 19ZP004-TH/2019 (תיק מס' 1, מס' גישה MW145540) ו-19ZP{ {12}}TH/2019 (תיק מס' 3, מס' הצטרפות MW145541), בהתאמה. לאחר ניתוח גנטי, הגנומים המקודדים המלאים חשפו תוצאות דומות מבחינה גנטית בקרב זני CPPV-1 שהתקבלו מחתולי דיג על ידי כך שהראו ש-CPPV של חתול דייגים אלה-1 היו FPV. השוואה נגזרת של חומצות אמינו בין גרסאות CPPV-1 לחתולי הדייג FPV מתוארות בטבלה 1. יש לציין, חתול הדייג FPV חשף מוטציות ייחודיות של חומצות אמינו של I566M ו-M569R בחלבון המבני (VP1 ו-2) , שלא זוהו בגרסאות קודמות של CPPV-1.
איור 2. זיהום CPPV-1 בחתולי דיג. H&E הדגמתי (A), צביעת PAS (B), CPPV-1 IHC (C) והכלאה באתרו (ISH) (D) של צילומי מיקרוסקופ שלכִּליָהמחתולי דיג. (א, ב) חתול דייג מס' 3. (א) מולטיפוקלשֶׁל הַכְּלָיוֹתדימום עםצינורית כליהריקון. מעט תאי אפיתל צינוריים היו היפראוזינופיליים עם גרעינים פיקוטיים (הכנס, חיצים). (ב)צינורית כליהתאי אפיתל הציגו ואקוול ציטופלזמי והגרעינים של תאי אפיתל נדירים הם בעלי שלפוחיות עם כרומטין גרעיני בשוליים. צביעת PAS הדגישה קרום בסיס שלם (מוכנס). (ג) חתול דייג מס. 2. CPPV-1 IHC-אימוניות (צבע חום כהה) נצפתה באופן מפוזר בצינוריות כליהומתגלה לעתים קרובות בציטופלזמה שלצינורית כליהאפיתל (הכנס). (ד) חתול דייג מס' 1. CPPV-1 ISH-אימוניות (צבע ורוד אדמדם) נצפתה בשפע בצינוריות כליה(כוכביות), והוא התמקם בגרעינים שלצינורית כליהאפיתל (הכנס, חיצים). פסים מציינים 50 מיקרומטר עבור (A, C) ו-120 מיקרומטר עבור (B, D).
ניתוח פילוגנטי ואבולוציונילצורך השוואת הקשר הגנטי בין CPPV-1 של חתול דייג שזוהה לבין גנומים אחרים של CPPV-1 שפורסמו בעבר, בוצע ניתוח פילוגנטי המבוסס על רצף גנום מקודד מלא. העץ הפילוגנטי של ML הראה שרוב ה-FPV, MEV וה-CPV יצרו קליד מאוד ברור בין הקבוצות (איור 4). שני הגנומים CPPV-1 מחתולי הדייגים שנחקרו (מסומנים על ידי משולשים אדומים) התקבצו יחד עם אותו שושלת של רצפי FPV שפורסמו בעבר שהתקבלו ממארחים שונים, מה שמאשר שהתקבלו
איור 3. CPPV-1 חלקיקים ויראליים בגרעין שלצינורית כליהתאי האפיתל. מיקרוסקופ אלקטרונים העברה (TEM) באמצעות טכניקת פופ-אוף. הדגמה אולטרה-סטרוקטורלית של התקבצות של חלקיקים צפופים באלקטרונים (חצים). גודל החלקיקים האיקוסהדרלי היה בקוטר 19-22 ננומטר הממוקם בגרעין שלצינורית כליהתאי אפיתל (הכנס). סרגלי קנה מידה כפי שמוצג באיור.
CPPV של חתול דייג-1 היו FPV. הגנומים שזוהו היו מקובצים יחדיו וקשורים ביותר לגנום FPV שזוהה בחתולי בית בתאילנד (מספר הרשאה MN127780). כדי להבהיר יותר את התהליך האבולוציוני של זיהוי CPPV של חתול דייג -1, נערכו מספר זיהויים של רקומבינציה וניתוחים אבולוציוניים על מערך נתונים של 224 רצפי גנום שלמים של CPPV-1. ניתוח הרקומבינציה גילה שלא נמצאו אירועי רקומבינציה ברצפי CPPV-1 של חתול דייג. העץ האבולוציוני של נתונים אלה הראה שני קלידים מופרדים עיקריים (איור 5). קלייד אחד כלל FPV ו-MEV וקלייד אחר כלל את כל רצפי ה-CPV. שיעור האבולוציה הכולל נאמד ב-1.08 × 10-4 החלפות/אתר/שנה (95 אחוז HPD: 1.95-2.87 × 10-4). העץ האבולוציוני הראה שרצפי FPV של חתול דייג התקבצו באותו שושלת של FPV כמו זה שבודד מתאילנד. הם חלקו אבולוציה גנטית עם גנום FPV שזוהה בחתולי בית בסין וייתכן שמקורם זהה מאז 1970 בערך.
דִיוּן
מחזור של גרסאות CPPV-1 הכוללות CPV ו-FPV זוהו בטורפים ביתיים וברבים כאחד. בעוד שזיהום קטלני של CPPV-1 בכלבי וחתולי בית נפוץ, זיהום זה נראה באופן ספורדי אצל טורפים פראיים [46]. מספר מחקרים הצביעו על כך שקרניבורי בר רבים רגישים לזיהום CPPV-1 כולל חתולי בר, מינקים, לוטרות, בואש, דביבונים, שועלים, זאבים, זאב ערבות, סיבטים ומרטן [11, 19]. במיוחד לסוג Prionailurus, רק חתולים נמרים דווחו שנדבקו בגרסאות CPPV-1 [9]. במחקר זה, אנו מתארים את הזיהום הטבעי של FPV, חבר ב-CPPV-1, בחתולי דיג בר (Prionailurus viverrinus). זהו הדוח הראשון עם תיאור של תפוצה ויראלית מובהקת וטרופיזם ברקמות כליותכפי שאושר באמצעות זיהוי אנטיגני באמצעות ניתוח PCR, IHC, ISH ו-TEM של מבנה האולטרה.
נצפתה העברה בין המינים של וריאנטים של CPPV-1 בין טורפים ביתיים ופראים, וכמה התפרצויות קטלניות של CPPV-1 הוערכו כקשורות לגלישה של פתוגנים בין בתי גידול [9, 11]. בשל האובדן הנוכחי של בית גידול לחיות בר, מושבות בר נודדות וחולקות בתי גידול עם חיות בית, מה שהוביל לגלישה מוגברת של פתוגנים בין בעלי חיים רגישים. במחקר זה, מצאנו שהגנומים של חתול הדייג CPPV-1 חלקו דפוס אבולוציוני עם זני FPV שזוהו ב
איור 4. טופולוגיה פילוגנטית החושפת את הקשר הגנטי של רצפי הקידוד באורך מלא בין חתול הדייג CPPV-1 וגרסאות CPPV-1 אחרות. העץ הפילוגנטי הראה שרצפי החתול הדייג CPPV-1 (מסומנים על ידי משולשים אדומים) התקבצו יחד עם הגנום של FPV עם הגנום הכי קשור לגנום FPV שזוהה בחתול התאילנדי (MN127780). צוינו מספרי ההצטרפות ל-GenBank של רצפי CPPV-1 שתוארו קודם לכן בניתוח זה.
חתולי בית בתאילנד. תוצאות אלו מראות דפוס אבולוציוני דומה לזני FPV מאבות קדמונים משותפים שבודדו מחתולי בית בסין מאז שנות ה-70. תוצאה זו עשויה לרמוז על עדות אפשרית להעברה בין מינים בין חתולי בית לחתולי דייג או על התפתחות משותפת של גרסאות ה-CPPV-1. עם זאת, בשל המגבלה של דגימות שהתקבלו מבעלי חיים מסתובבים חופשי באותם בתי גידול והמספר הקטן של חתולי דייגים שנחקרו, לא ניתן היה לזהות את המאגר העיקרי של ה-CPPV-1 במחקר זה ויש צורך בחקירה נוספת . למרות שמספר מחקרים הצביעו על כך ששאריות חומצות אמינו שונות בגן הקפסיד קשורות הן ליכולת להדביק מארחים חדשים והן לאנטיגניות של CPPV-1 [18, 47], המוטציה של חומצת אמינו יחידה בעמדה 300 של חלבון קפסיד (VP2) דווח כגורם מרכזי לטווחי מארח מרובים [48]. במחקר זה, וריאנט ה-CPPV-1 שהושג מחתולי הדייגים חשפה את אותם דפוסי חומצות אמינו כפי שנמצאו ברצפי FPV, עם נוכחות של אלנין (A) כקביעת חומצות אמינו מפתח במיקום קפסיד 300. בעוד חלבון הקפסיד של חתול הדייג של CPPV-1 חשף חומצות אמינו אספרגין (N) ואלאנין (A) הממוקמות בעמדות 564 ו-568, בהתאמה (אשר נחשבות קריטיות לשכפול FPV במארח החתולי), 2 מוטציות ייחודיות של חומצות אמינו בעמדות I566M ו-M569R. מוטציות אלו יכולות להבדיל בין הנגיף הזה לבין גרסאות CPPV-1 שתוארו קודם לכן. ניתוח קודם של שחזור אבות מצא כי FPV יכול להדביק טורפים שונים עם מעט שינויים בגן VP2 [49]. לפיכך, נגיף ה- FPV דמוי ה- FPV נקרא באופן זמני כווירוס חדשני שזוהה בחתולי הדייג, וזה עשוי לתמוך בזיהוי הראשון של נגיף זה במין זה. עם זאת, מספר קטן של חתולי דיג שנחקרו בהשוואה למספר קטן של רצפים אחרים עשויים שלא לתת פרשנות מוחשית. זה דורש מחקר נוסף כדי להסיק מסקנות ברורות יותר.
לוקליזציות CPPV-1 של חתול דייג נצפו ברקמות שונות כולל תאי אפיתל מעיים ותאי לימפה, כאשר לוקליזציית הרקמות השכיחה ביותר של זיהום CPPV-1 נמצאה במינים אחרים [20, 26, 50, 51 ]. מעניין לציין כי מאז חקירה ראשונית של גילוי גנומי ויראלי באמצעות PCR ולוקליזציה ויראלית באמצעות IHC גילתה לוקליזציה ויראלית מובהקת ברקמות כליות, ביצענו צביעת PAS כדי להדגים את הארכיטקטורה הסלולרית שלרקמת כליהולמנוע היפוקסיה מערכתית כגורם אפשרי לנמק צינורי. צביעת PAS גילתה שהממברנות הבסיסיות הצינוריות ביותר היו שלמות, מה שמצביע על כך שנגע זה עשוי שלא לנבוע מהיפוקסיה מערכתית [52]. עם זאת, סיבות אחרות כגון נמק צינורי המושרה על ידי רעל עלולות לגרום לנגע זה. לפיכך, התפקיד של זיהום פרווווירוס דמוי FPV הקשור לכִּליָהנגעים עדיין זקוקים לחקירה נוספת. יתר על כן, ניסינו להבהיר יותר לוקליזציה קיימת של הנגיף ברקמת כליהבאמצעות ISH ו-TEM עם טכניקת ה-Pop-off [37] באזורים שבהם זוהתה CPPV-1 IHC-immunoreactivity. החלקיקים צפופי האלקטרונים נצפו בגרעין שלצינורית כליהתאי אפיתל ותאי אורותל, התומכים בפעילות החיסונית החיובית במקום של CPPV-1 ברקמת כליה. חתולים נגועים ב-FPV משילים את הנגיף בעיקר בצואה, אך תוארה נוכחות של וירוס פעיל בשתן [53, 54]. מחקרים אחרונים הצביעו על כך שלזיהום בנגיף הפרבו יש תפקיד בכשל כלייתי[55]. עם זאת, הלוקליזציה של FPV וה-CPV המקבילה ב-רקמת כליהלא נחקר בעבר. יתר על כן, עכברכִּליָהפרבו-וירוס (MKPV) הוכח כנגיף נפרוטרופי על ידי הצגת זיקה להדביק ולהתמקם בצינורית כליהתאי אפיתל, וכתוצאה מכךמחלות כליות [56, 57].
בהתבסס על הידע שלנו, לוקליזציה של CPPV-1 בכליותלא תואר קודם לכן. זה מרמז על התיאור החדש של לוקליזציה ויראלית ייחודית במין זה או אפילו אם ניתן למצוא אותה בחתולים נגועים ב-FPV. ממצא זה עשוי לתמוך במחקרים קודמים שמצאו FPV בשתן. ממצאים פתולוגיים ייחודיים עשויים להיות סובייקטיביים ועשויים להיראות כזיהום אצל אנשים. לפיכך, חקירה רחבת היקף של CPPV של חתול דייג-1 תקל על פרשנות מוחלטת. בנוסף, דגימות שהוגשו בעיקר מחיות מתות וכבר עברו ניתוח אוטומטי שלאחר המוות אינן מתאימות לאיסוף איברים נוסף מחיות אלו. לפיכך לא הצלחנו לקבוע את הלוקליזציה הוויראלית באיברים אחרים. הבהרה של לוקליזציה ויראלית לא טיפוסית של CPPV של חתול דייג-1 תהיה חקירה שימושית.
CISTANCHE ישפר מחלת כליות/כליות
CPPV-1 זוהה בטורפים פראיים שונים והוא קשור להתפרצויות קטלניות. העדויות השליליות לזיהוי רטרוספקטיבי של CPPV-1 בדגימות פרא בגן חיות במחקר זה עשויות לנבוע מאי מגע קרוב בין בעלי חיים רגישים או, מצד שני, אחסון ממושך של דגימות שמשפיע על יציבות החומרים הגנומיים. הזיהוי החדש של CPPV-1 הקשור לזיהום תמותה של חתולי דייג במחקר זה מעלה חששות לגבי מחלה חדשה שעלולה להיות ארסית בחיה פגיעה זו. לכן, מחקר נוסף של העברת CPPV-1 בחתולי דיג חיוני כדי למנוע אובדן של מיני בעלי חיים רגישים אחרים. בהתאם, יש לשים דגש על אסטרטגיות מניעה על מנת לנהל זיהומי CPPV-1, לא רק במין זה אלא גם בחיות בית שמסתובבות חופשי ועשויות לשמש כמארחים פוטנציאליים לנגיף זה.
