המקבע של קרנובסקי מונע מחפצים להופיע כ-vacuolation הנגזרת מעיבוד רקמות בכליות שטופלו באנטי-סנס אוליגונוקלאוטיד Ⅰ

תַקצִיר: אוליגונוקלאוטיד אנטי-סנסטיפולים (ASO) זוהו כדרך טיפול חדשה עבורמחלות בלתי פתירות. בכליות שטופלו ב-ASOs, וואקוולים, בנוסף לגרגירים בזופיליים, נצפים לעתים קרובות בצינוריות הפרוקסימליות. דיווחים אחדים תיארו ש-vacuoles אלה עשויים להיות תופעה משנית הנובעת מה-חילוץ של ASOsבמהלך עיבוד רקמות. במחקר זה, השווינו את המורפולוגיה הכלייתית לאחר קיבוע עם חיץ מקבע של קרנובסקי או 4% paraformaldehyde phosphate buffer (PFA) עם זה של 10% תמיסת פורמלדהיד נייטראלית (NBF). נקבות חולדות Sprague-Dawley, שטופלו תוך ורידי ארבע פעמים עם 50 מ"ג/ק"ג חומצת גרעין נעולה המכילה אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (LNA-ASOs) במשך שבוע או שבועיים. מבחינה מיקרוסקופית, נצפו ואקוולים וגרגירים בזופיליים בצינוריות הפרוקסימליות בכליות מקובעות עם NBF. גרגירים בזופיליים מעידים על הצטברות של ASOs. יתרה מכך, חלק מה-vacuoles הכילו גם גרגירים בזופיליים חלשים, מה שמצביע על כך שה-vacuoles היו רלוונטיים להצטברות של ASOs. למרות ש-vacuolation מתון נצפתה באבובות הפרוקסימליות, רוב האפיתליות שהושקו בוואקום היו שליליות עבור מולקולת פגיעה בכליות-1 על צביעה אימונוהיסטוכימית. ואקוולים בצינוריות הפרוקסימליות לא נצפו בדגימות שנתונות לקיבוע של קרנובסקי, אם כי נצפו גרגירים בזופיליים. בדגימות הנתונות לקיבוע PFA, נצפו ואקוולים וגרגירים בזופיליים בצינוריות הפרוקסימליות, בדומה לאלו בדגימות הנתונות לקיבוע NBF. בסך הכל, הממצאים שלנו הדגימו אפשרות של הערכת יתר של vacuolation עקב חפצים במהלך עיבוד רקמות בעת שימוש בקיבוע NBF קונבנציונלי. המקבע של קרנובסקי נחשב לחלופה שימושית להבחנה בין ואקואולים מלאכותיים לבין רעילות נפרוטית אמיתית. (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

מילות מפתח:אוליגונוקלאוטיד אנטי-סנס, חפץ,המקבע של קרנובסקי, vacuolation, גרגיר בזופילי, כליה

תוסף Cistanche תוסף תפקודי כליות PhGs75% Ech 30% Act 12%

לאחרונה, טיפולי אנטי-סנס אוליגונוקלאוטידים (ASO) הוקמו כדרכים חדשות לטיפול במחלות בלתי פתירות1, 2. ASOs הם אוליגודאוקסינוקלאוטידים קצרים, סינתטיים, חד-גדיליים, הנקשרים לחומצה ריבונוקלאית ומדכאים ביטוי גנים3.

מבחינה טוקסיקולוגית, רעילות הנגרמות על ידי ASO מסווגות לרעילות תלויות הכלאה, הקשורות לרצף ASO, ורעילות בלתי תלויות בהכלאה, הקשורות לשינוי כימי. רעילות בלתי תלויות בהכלאה נגרמות על ידי שלושה מנגנונים עיקריים: 1) הצטברות ASO, 2) השפעות פרו-דלקתיות, ו-3) השפעות קשירה aptameric4. הצטברות ASOs נצפית בעיקר בכבד ובכליות, והצטברות מוגזמת מובילה לתפקוד לקוי של איברים אלה5. ההשפעה הפרו-דלקתית נגרמת על ידי גירוי של מערכת החיסון המולדת באמצעות קישור לקולטנים דמויי Toll במכרסמים וקופים או הפעלה של מסלול המשלים החלופי באמצעות עיכוב של פקטור H על ידי ASOs בקופים6. אפקט הקישור האפטאמרי גורם להפעלת טסיות דם וצבירה/תרומבוציטופניה לקשירת הקולטן הספציפי לטסיות7. יתרה מכך, קשירה aptameric לחלבונים תוך תאיים בהפטוציטים נחשבת לאחד הגורמים לרעילות הכבד 8-10. כדי לזהות רעילות אלו, חוקרים פיתחו מספר מבחנים לא קליניים; בין אלה, בדיקה היסטופתולוגית היא אחת הבדיקות הרגישות ביותר לאיתור הצטברות ASO.

מבחינה היסטופתולוגית, הצטברות ASOs נצפה בדרך כלל כגרגירים בזופיליים בציטופלזמה של תאי קופפר בכבד או בצינוריות הפרוקסימליות של הכליות. ההצטברות הבולטת של גרגירים בזופיליים נמצאת בקורלציה עם שכיחות מוגברת או חומרה של שינויים ניווניים, הנצפים בדרך כלל כ-vacuolation או ניוון/נמק של האפיתל הצינורי הפרוקסימלי בכליות4. גרגירים בזופיליים בלבד אינם נחשבים למשמעותיים מבחינה טוקסיקולוגית11; לכן, ההבחנה של הצטברות גרגירים בזופילים משינויים ניווניים חשובה להערכת רעילות הקשורות ל-ASO.

Vacuoles, אשר נצפים לעתים קרובות בצינוריות הפרוקסימליות של הכליות של קופי cynomolgus שטופלו ב-ASO, מכילים חומר בזופילי ומציגים את אותה התפלגות כללית בתוך התאים כמו גרגירים בזופיליים11, 12. כמה דיווחים העלו שתהליך הקיבוע עשוי להשפיע על הופעת הצטברות ASO בתוך התא הפאגוליזוזומלי5, 11. בנוסף, Henry et al. ואנגלהרדט תיארו ש-vacuoles בצינוריות הפרוקסימליות עשויות להיות תופעה משנית הנובעת ממיצוי של ASOs במהלך העיבוד, משום שה-vacuoles נעדרים בכליות מקובעות זלוף פרפורמלדהיד/גלוטראלדה הייד5, 11. ואקואולים בצינוריות הפרוקסימליות של ה-monkeycyno tubules של ה-monkeycyno tubules. עם mipomersen הוערכו להופיע במהלך תהליך הקיבוע13.

לפיכך, אף על פי ש-vacuolation עקב טיפול ASO עשוי להיות חפץ במקרים מסוימים, השערה זו לא הוכחה בבירור, ואף דיווחים לא זיהו את שיטת הקיבוע המתאימה להערכה טוקסיקולוגית. בהתאם לכך, במחקר זה, השווינו את המורפולוגיה הכלייתית לאחר קיבוע עם חיץ מקבע של קרנובסקי או 4% paraformaldehyde phosphate buffer (PFA) עם זה של 10% תמיסת פורמלדהיד נייטראלית (NBF). בנוסף, הדגמנו את התועלת של המקבע של קרנובסקי כמקבע חלופי למניעת ריקון שמקורו בחפצים.

חולדות Sprague-Dawley בנות ארבעה שבועות נרכשו מ-Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, יפן) והתאקלמו לתנאי מעבדה. החיות נשמרו בתנאים מבוקרים (12-מחזור אור/חושך שעות, טמפרטורה של 23 ± 2 מעלות, לחות יחסית של 50 ± 25%) והותרה להם גישה חופשית לתזונה מסחרית סטנדרטית (CR-LPF חיטוי; Oriental Yeast Co., Ltd., טוקיו, יפן) ומי ברז. 20 בעלי חיים הוקצו לארבע הקבוצות הבאות (עם חמש בעלי חיים כל אחת): הקבוצה שטופלה בתמיסת מלח 1-לשבוע (Control- 1W), הקבוצה שטופלה בתמיסת מלח 2-שבועית (Control{ {14}}W), קבוצת החומצה הנעולה של 1-שבוע המכילה אנטי-סנס אוליגונוקלאוטיד (LNA-ASO) (ASO-1W), וקבוצת 2-שבוע שטופלה ב-LNA ASO (ASO-2W). החיות היו בנות 5 שבועות בזמן התחלת מתן 50 מ"ג/ק"ג LNA-ASO. LNA-ASO ניתנה לווריד ארבע פעמים בסך הכל לפי המשטר הבא: ימים 1, 4, 8 ו-11 בקבוצת ASO-2W; וימים 1, 2, 3 ו-4 בקבוצת ASO-1W. החיות בקבוצות Control-1W ו-ASO-1W הוקרבו ביום 7. החיות בקבוצות Control-2W ו-ASO-2W הוקרבו ביום 14. בכל נתיחה סופנית נאספו דגימות דם לפתולוגיה קלינית מוריד הבטן בהרדמה עמוקה עם איזופלורן. לאחר דגימת דם, כל החולדות הורדו בהורדה על ידי חיתוך מיידי של אבי העורקים הבטני. פני הגוף החיצוניים, חללי החזה והבטן והקרביים נבדקו מקרוסקופית, והכליות השמאלית הוסרו ועובדו לבדיקה מיקרוסקופית. כל ההליכים בוצעו בהתאם לכללי האכלה ואחסון של חיות ניסוי וניסויים בבעלי חיים של Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation.

דגימות סרום התקבלו באמצעות צנטריפוגה של דגימות הדם ב-4 מעלות. ניתוח ביוכימי בסרום בוצע באמצעות מכשיר TBA-2000FR (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, יפן) כדי להעריך את רמות החנקן אוריאה בדם (BUN) והקריאטינין (CRE)

הכליות נקבעו באמצעות שלוש תמיסות קיבוע כדלקמן: לאחר חלוקת הכליה לרוחב לשלושה מקטעים, החלק האמצעי כולל אגן הכליה, נקבע ב-10% NBF למשך 5 ימים; החלק הגולגולתי תוקן במקבע של קרנובסקי (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., טוקיו, יפן); והחלק הזנב היה מקובע ב-4% PFA למשך 17 שעות ב-4 מעלות ולאחר מכן הונח ב-10% NBF למשך 24 שעות. כל דגימה קבועה התייבשה והוטמנה בפרפין. קטעי רקמה הוכנו לצביעה של המטוקסילין ואאוזין (H&E). צביעה אימונוהיסטוכימית בוצעה באמצעות נוגדנים המכוונים למולקולת פגיעה בכליות-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA; דילול 1:300) וחלבון ממברנה 2 (LAMP{{ 13}}; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ארה"ב; דילול 1:1000) לאחר שליפת אנטיגן (חיץ ציטראט, pH 6.0, מחומם למשך 10 דקות או מחומם בלחץ למשך 20 דקות). Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., טוקיו, יפן) שימש כנוגדן המשני.

שירות תומך של Wecistanche:

דוא"ל:wallence.suen@wecistanche.com

ווטסאפ/טלפון:+86 15292862950

קנה לפרטי מפרטים נוספים:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop