זיהוי של Sitogluside כגורם פוטנציאלי להפחתת פיגמנטציה של העור באמצעות פרמקולוגיה ברשת

איש קשר: ali.ma@wecistanche.com

Haoran Guo,1 Hongliang Zeng,2 Chuhan Fu,1 Jinhua Huang,1 Jianyun Lu,1 Yibo Hu,1Ying Zhou,1 Liping Luo,1 Yushan Zhang,1 Lan Zhang,1 Jing Chen,1 ו-Qinghai Zeng 1

תרופות סיניות מסורתיות רבות (TCMs) עםהלבנת עורמאפיינים נרשמו במרשמים של בן-קאו-גאנג-מו ושל בני אדם, וחלק מהספרות מאשרת שלתמציות שלהם יש פוטנציאל לעכבצִבעָנוּת. עם זאת, מחקרים לא שיטתיים זיהו את מנגנוני הרגולציה הספציפיים של החומרים הפעילים הפוטנציאליים. מטרת מחקר זה הייתה לסנן את המרכיבים ב-TCMs המעכבים את העורצִבעָנוּתבאמצעות מערכת פרמקולוגיה רשתית ולחקור מנגנונים בסיסיים. זיהינו 148 חומרים פעילים פוטנציאליים מ-14 TCM, ובהתבסס על ה"דרגה" הממוצעת של הפרמטרים הטופולוגיים, חמשת ה-TCMs המובילים (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ו-Paeoniae Radix Alba) היו בסבירות גבוהה לגרוםהלבנת עורבאמצעות תהליכים אנטי דלקתיים נבחרו. Sitogluside, המרכיב הנפוץ ביותר בחמשת ה-TCMs המובילים, מעכב מלנוגנזה בתאי מלנומה אנושיים (MNT1) ותאי מלנומה עכברים (B16F0) ומפחית את העורצִבעָנוּתבדג הזברה. יתר על כן, מחקר מכניסטי גילה שסיטוגלוזיד מסוגל להפחית ויסותטירוזינאזביטוי (TYR) על ידי עיכוב מסלולי ERK ו-p38 ועיכוב פעילות TYR. תוצאות אלו מוכיחות כי פרמקולוגיה ברשת היא כלי יעיל לגילוי תרכובות טבעיות בעלות תכונות הלבנת עור וקביעת המנגנונים האפשריים שלהן. Sitogluside הוא מרכיב פעיל חדשני להלבנת עור עם השפעות רגולטוריות כפולות המעכבותTYRביטוי ופעילות.

לחץ כדיתמצית Cistanche DHT להלבנת העור

מבוא

המלנין לא רק קובע את צבע העור, העיניים והשיער של האדם אלא גם ממלא תפקיד מפתח בהסוואה, חיקוי, תקשורת חברתית והגנה מפני קרניים אולטרה סגולות. עם זאת, כאשר מלנין מופק יתר על המידה ומתפזר בצורה חריגה באפידרמיס, הוא גורם למגוון של תנאים, כגון נמשים ומלזמה, שעלולים להשפיע לרעה על היופי הנתפס והביטחון החברתי של האדם [1]. מלנין הוא התוצר הסופי של L-tyrosine בעקבות מספר שלבים של תגובות אנזימטיות והוא מסונתז במלנוזומים מלנוציטים [2]. בעור, מלנוציטים ממוקמים בשכבת הבסיס של האפידרמיס ויכולים לייצר ולהעביר מלנוזומים בוגרים לקרטינוציטים ובכך לגרום לעורצִבעָנוּת [3]. TYRהוא האנזים המגביל את הקצב העיקרי בייצור המלנין [4], ו-Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) הוא גורם השעתוק העיקרי המווסת את הביטוי התעתיק של TYR [5].

לאחרונה, מחקרים מצאו שתגובות דלקתיות ממלאות תפקידים חשובים בוויסות המלנוגנזה [6]. לדוגמה, IL-18, המיוצר על ידי תאי לנגרהנס, תאים דנדריטים וקרטינוציטים באפידרמיס, יכולים להגביר את הביטויים של TRP{{2 }} (חלבון קשור לטירוזינאז 1) ו-TRP-2 (חלבון קשור לטירוזינאז 2) על ידי הפעלת מסלולי ה-p38/MAPK (חלבון מופעל על ידי מיטוגן) ו-PKA (חלבון קינאז A), ובכך לקדם מלנוגנזה[7, 8 ]. TNF- מווסת את ייצור המלנין B16 בעיקר על ידי הפעלת NF-κB [9]. PGe2 (prostaglandin e2), המופרש על ידי פיברובלסטים וקרטינוציטים, הוכח כממריץ את ההתמיינות של תאים דנדריטים ומניע פעילות TYR במלנוציטים דרך מסלולי האיתות cAMP (cyclic adenosine monophosphate) ו- Plc (phospholipase c) [10]. PIH (היפרפיגמנטציה פוסט-דלקתית) הוא סוג של מלניזציה תגובתית של העור [11]. מחלות עור שונות, טראומות או ניתוחים קוסמטיים מובילים לעתים קרובותצִבעָנוּתשל האזור הפגוע, במיוחד אצל אנשים צבעוניים [12]. חולים עם PIH סובלים בדרך כלל מלחץ פסיכולוגי עצום, שמקרים חמורים משפיעים לרעה על איכות חייהם. לכן, נעשה שימוש בתרופות מסוימות המווסתות דלקת לטיפול ב-PIH ובמחלות אחרות הגורמות להיפרפיגמנטציה. לדוגמה, רזברטרול, שהפחית את הנזק הדלקתי בתאי HaCaT [13], נמצא כמעכב את סינתזת המלנין באמצעות ויסות אותות חוץ-תאי של קינאז1/2 ואיתות של phosphoinositide 3-kinase/Akt [14].

הַלבָּנָהחומרים, כגון הידרוקינון (HQ) וויטמין C, משמשים באופן מסורתי לטיפול בפיגמנטציה [15]. HQ הוא הידרוקסיפנול בעל השפעה מעכבת חזקה על המלנוגנזה. עם זאת, בשל תופעות לוואי שונות כגון דלקת עור מעוררת או אלרגית, שינוי צבע הציפורניים ופגיעה בריפוי פצעים, השימוש ב-HQ מוגבל [16, 17]. ויטמין C מעכבTYRעל ידי אינטראקציה עם copperions באתרים פעילים של TYR, ובכך להפחית את המלנוגנזה. עם זאת, ויטמין C אינו יציב במוצרים מוגמרים. בנוסף, אם ריכוז ויטמין C גבוה מ-20 אחוז, זה יכול לגרום לגירוי בעור [18]. לכן, רכיבים טבעיים ממגוון רחב של מקורות בטוחים, יעילים, יציבים מאוד וקלים לאחסון הם מבוקשים מאוד.

לאחרונה, יותר מרכיבי TCM נמצאו יעילים בעיכוב עורצִבעָנוּת, כגון apigeninand paeoniflorin [19-21]. ה-TCMs עם פעילות הלבנה המתוארות ב-Ben-Cao-Gang-Mu נמצאים בשימוש נרחב כמתכונים סודיים בסין, וכיום, הוכח כי יש להם השפעה של עיכוב פיגמנטציה. לדוגמה, התמצית של Hedysarum multijugum Maxim (קנה השורש של Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge) גורמת להלבנת העור על ידי עיכוב מסלול ה-ERK [22]. התמצית היבשה של Typhonii Rhizoma (קנה השורש של Sauromatum gigan-teum (אנגלית) Cusimano ו-Het.) יכולה למעשה לעכב אתטירוזינאזפעילות במבחנה [23]. ורפואה מבוססת ראיות אישרה גם כי לתמצית של זרע SapindiMukorossi (הפרי של Sapindus mukorossi Gaertn.), המעכב את פעילות טירוזינאז, יש פוטנציאל לשימוש כתוסף תרופות וקוסמטי [24]. חלק מהמרשמים העממיים המסורתיים, אם כי אינם מקובצים לאוסף, נמצאים גם בשימוש נרחב. San-Bai-Tang (SBT) היא דוגמה טיפוסית. Ye et al. הוכיח כי SBT יכול להפחית את ייצור המלנין על ידי עיכוב מסלול האיתות p38/MAPK ופעילות TYR [25]. TCMs אחרים המתוארים במרשמים מסוימים הוכחו גם כןהלבנת עוראפקטים. תמצית Coicis Semen (הזרע של Coix AquaticaRoxb.) מעכבת ייצור מלנין על ידי הורדת ויסות MITF, TYR, TRP-1 ו-TRP-2 [26]. יתר על כן, בדיקת cellassay שלTYRהראה כי Ampelopsis japonica (השורש של Ampelopsis japonica (Thunb.) Makino) עיכב את הפעילות של TYR פטריות ביותר מ-50 אחוז [27]. TCMs ההלבנה שנרשמו במרשמים העתיקים הללו הוכחו כיעילים על ידי טכניקות ניסוי מודרניות, אך רובם מאומתים בצורה של תמציות, והחומרים הפעילים שפועלים אינם ברורים. זה עורר את העניין שלנו בחומרים הפעילים של TCMs עם השפעות הלבנה מתועדות במרשמים עתיקים.

חוץ מזה, ל-TCM או למרשמים יש מרכיבים מורכבים, דרכי פעולה מגוונות וחומרים פעילים לא ידועים. בנוסף, חוסר העקביות של גורמים כגון איכות חומרי הגלם, שיטות עיבוד, טכניקות הכנה, תאימות המרכיבים המשמשים בהרכב וצורות המינון משפיעים יותר על יעילות ה-TCMs [19, 28]. לכן, השימוש ב-TCMs מסוימים עםהלבנת עורההשפעות מוגבלות. לכן דחוף לזהות חומרים פעילים בעלי השפעות הלבנה פוטנציאליות על העור, באמצעות בדיקה שיטתית כדי להבטיח את הבטיחות, היעילות והיציבות של מרכיבים אלה.

בשנים האחרונות, היישום של ביולוגיה מערכתית בתחום ה-TCM התקדם מאוד. פרמקולוגיית הרשת של TCM היא חוצה-דיסציפלינה חדשה המשלבת את הפרמקולוגיה של TCMs עם מדעי הרשת, ביולוגיה של המערכת, מדעי החישוב וביואינפורמטיקה [29]. הוא מבין היטב את המורכבות בין תרופות, מחלות ומערכות ביולוגיות מנקודת המבט של רשת "חלבון מורכב/גן-מחלות" [30]. פרמקולוגיה רשתית היא כלי יעיל ושיטתי לחקור את הפעולה הפרמקולוגית, המנגנון, הבטיחות והיבטים אחרים של רפואת צמחים, במיוחד TCMs, ומספקת תובנות חשובות לגילוי תרופות נוכחיות [31, 32].

מרכיבים להלבנת עור

2. חומרים ושיטות

2.1. תהליך פרמקולוגי ברשת

2.1.1. בניית מסד נתונים עבור מרכיבים כימיים

תרשים זרימה של תוכנית הניסוי שנחקרה מתואר באיור 1. ה-TCMs עם השפעות אנטי-פיגמנטציה, המתוארות ב-Ben-Cao-Gang-Mu ובמרשמים עממיים, שימשו לניתוח פרמקולוגי ברשת. Typhonii Rhizoma, Ricini Semen, Hedysarum multijugum Maxim., Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ו-Sapindi MukorossiSemen, המתוארים ב-Ben-Cao-Gang-Mu,הַלבָּנָהותכונות הנמכות צהובות ויכולות להסיר כתמי פנים ושומות. Poria cocos (Schw.) Wolf (הסקלרוטיום של Smilax china L.), Paeoniae Radix Alba, ו-Atractylodes macrocephala Koidz (הקנה השורש של Atractylodes macrocephalaKoidz.) שהם מרכיבי ה-SBT ידועים כמשפרים את מרקם העור ומפחיתים קלואזמה.צִבעָנוּת. צמחי מרפא אחרים המתועדים באופן מסורתי, כגון Bletilla striata (Thunb. Murray) Rchb.F. (קנה השורש של Bletilla striata(Thunb.) Rchb.F.), Ampelopsis japonica, A. dahurica (Fisch.)Benth. Et Hook (קנה השורש של Angelica dahurica (Hoffm.) Benth. and Hook.f. Ex Franch. and Sav.), Atractylodes lancea(Thunb.) Dc. (קנה השורש של Atractylodes lancea (Thunb.)DC.), Fructus Ligustri Lucidi ו-Coicis Semen, נכללו גם במחקר זה. בגלל המספר הגדול של TCM הכלולים במחקר זה, בדיקות מסד נתונים מרובות של רפואה סינית יגרמו לבלבול בעיבוד הנתונים. אנו משתמשים רק במסד הנתונים של מערכות פרמקולוגיה של רפואה סינית מסורתית (TCMSP), מסד נתונים נפוץ יותר, לצורך בדיקות מעקב. המרכיבים הכימיים של TCMs אלה נבדקו ב-TCMSP (עודכן ב-24 באפריל,2020) [33]. דמיון לתרופות (DL) וזמינות ביולוגית דרך הפה (OB) הם פרמטרי סקר נפוצים. תרופות מקומיות או סיסטמיות הן טיפולים נפוצים למחלות פיגמנטציה של העור; לכן, השתמשנו רק ב-DL כקריטריון ההקרנה. קומפלקסים מצוינים עם DL > 0:18 נבחרו כדי להגדיל את שיעור הפגיעה של מועמדים לתרופות.

2.1.2. מפגש בין גני מטרה של TCMs וגנים הקשורים לפיגמנטציה.

מערך הגנים הקשור לצִבעָנוּתנבחר על סמך מסד הנתונים של GeneCards (עודכן ב-24 באפריל 2020), ממנו נבחרו יעדים עם ציון מחלת גיל > 1. בסופו של דבר, זוהו 6180 מטרות הקשורות לפיגמנטציה. ההצטלבות בין גני מטרה של TCMs וגנים הקשורים לפיגמנטציה הומחשה באמצעות דיאגרמת Venn [34].

2.1.3. בניית רשת מתחם-יעד-נתיבים פעילה.

מרכיבים פעילים וגני מטרה מוסדרים נבדקו בהתאם לתוצאות של דיאגרמת Venn. הרשת נבנתה באמצעות תוכנת Cytoscape [35] ושימשה לציון הקשר בין המרכיבים הפעילים של TCMs וגני המטרה שלצִבעָנוּתכל גן מטרה המווסת על ידי מרכיב פעיל ב-aTCM נחשב ל"דרגה" אחת. הפרמטרים הטופולוגיים הממוצעים של "תואר" של כל TCM שימשו להערכת החשיבות של ה-TCM שנבחרו. התרכובות דורגו, וחמשת ה-TCMs המובילים נבחרו לניתוחי מפתח. יתר על כן, מידע מפורט על המרכיבים הפעילים הפוטנציאליים שדווחו כדי לווסת פיגמנטציה נותח.

2.1.4. אנציקלופדיה של קיוטו של גנים וגנום (KEGG) ניתוח העשרה של גני יעד מווסתים על ידי TCMs פוטנציאליים יעילים.

גני מטרה המווסתים על ידי חמשת ה-TCMs המובילים נבחרו כדי לקבוע נתיבי יעד של KEGG ולחקור את המנגנונים האפשריים של מרכיבים פוטנציאליים יעילים ב-TCMs אלה נגדצִבעָנוּתמשאבי ביואינפורמטיקה .DAVID 6.8 שימשו לניתוח ההעשרה של מסלולי יעד של KEGG. הועלו סמלי הגנים של המטרות הפוטנציאליות של החומרים הפעילים היעילים. לאחר מכן הורדו מזהי הגנים שהושגו ונכנסו ל-KOBAS3. הגן שהתאים ערכי p פחות מ-0.05 נבחר.

2.1.5. סימולציית עגינה מולקולרית.

המבנים הדו-ממדיים של סיטוגלוסיד, ארבוטין, ניקוטינמיד, HQ, חומצה קוג'ית וחומצה אסקורבית התקבלו ממסד הנתונים של PubChem. המבנים המכאניים של המולקולות הקטנות עברו אופטימיזציה באמצעות ChemBio3D Ultra 14.0. מבנה הגביש התלת מימדי של פטריותTYR(מזהה PDB: 2Y9X, קואורדינטות עגינה: X =-8:87, Y=−30:74, ו-Z=−41:52) התקבל מ-Protein Data Bank ( PDB) מסד נתונים [36]. מבני הגביש התלת-ממדיים של שישה קולטני ממברנה (קולטן אופיואיד u, PDB ID: 4DKI; קולטן מלנוקורטין 1, PDB ID: 2L1J; קולטן אנדותלין B, PDB ID: 5GLI; קולטן אדרנרגי, PDB ID: 4GBR; קולטן פרוסטגלנדין: קולטן PDB6, PDB6 ; קולטן לגורם תאי גזע, מזהה PDB: 2EC8) התקבלו ממסד הנתונים של PDB. מבני החלבון הוכנו באמצעות AutoDock Tools על ידי הסרת מולקולות מים, הוספת מימן ויצירת קשרים בסדר אפס למתכות ולקשרי דיסולפיד. לבסוף, סימולציות עגינה מולקולריות בוצעו באמצעות AutoDock Vina 1.1.2 [37], והתוצאות נותחו באמצעות PyMoL 1.7.2.1.

2.2. אימות ניסוי

2.2.1. כימיקלים ונוגדנים.

Sitogluside (טוהר גדול או שווה ל-98 אחוז) נרכש מ-ChemFaces (#CFN98, 713, Chem Faces). Dimethylsulfoxide (DMSO) נרכש מ-Sigma-Aldrich. פרפורמלדהיד ניטרלי (4 אחוזים) נרכש מ-Biosharp (Hefei, סין). חומצה Kojic, the Fontana-Masson Stain Kit, Sodium deoxycholate ו-L DOPA נרכשו מ-Solarbio (בייג'ינג, סין). המדיום המותאם של איגל (DMEM) של Dulbecco נרכש מ-Gibco (#C11995500BT, Gibco). סרום בקר עוברי (FBS) וערכת ספירת תאים-8 (CCK8) נרכשו מ-BI (קיבוץ בית-העמק, ישראל). PMA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-אצטט, המפעיל ERK/MAPK) נרכש מ-APExBIO (#N2060, APExBIO). Anisomycin (מפעיל p38/MAPK) נרכש מ-MedChem Express (HY-18982, MedChemExpress). נוגדנים ראשוניים נגד חלבון הקשור ל-ras Rab-27A (RAB27A) (#69295,CST), קינאז מווסת אות חוץ-תאי (ERK) (#4695,CST), p-ERK (#4370, CST), c- יוני N-terminal kinase JNK(#9252, CST), p-JNK (#4668, CST), p38 (#8690, CST), p38 (#4511, CST), proteinCREB קושר תגובת cAMP ( #9107, CST), ו-p-CREB (#9198, CST) נרכשו מ- Cell Signaling Technology. נוגדנים ראשוניים נגד TRP1 (ab235447, Abcam), TRP2 (NBP1-56058, Novusbio), MITF (STJ94134, מעבדת סנט ג'ון),TYR(BS1484, Bioworld), ו-GAPDH (#AP0066, Bioworld) נרכשו מ- Abcam, Novusbio, St. John's Laboratory, ו-Bioworld, בהתאמה.

2.2.2. תרבות תאים וטיפול.

MNT1 ו-B16F0, העשירים במלנוזומים, נמצאים בשימוש נרחב לחקר מלנוגנזה [38]. כתוצאה מכך, שני קווי תאים אלה נבחרו לניסויים הבאים. תאי MNT1 ו-B16F0 תורבו ב-20% או 10% בסרום בקר עוברי (BiologicalIndustries, ישראל) וב-1% פניצילין-סטרפטומיצין (Gibco) ב-DMEM. כל התאים תורבו באינקובטור רטוב ב-37 מעלות ו-5% CO2. Sitogluside הומס ב-DMSO, והריכוז הסופי של DMSO היה<0.1%. pma="" and="" anisomycin="" were="" separately="" dissolved="" in="" dmso,="" and="" the="" final="" concentration="" of="" dmso="" was=""><>

2.2.3. תרבות וטיפול בדג זברה.

עוברי דג זברה ומצע תרבות נרכשו מ-EzeRinka Biotech (נאנג'ינג, סין). פרוטוקול הניסוי אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים Xiangya השלישי של אוניברסיטת מרכז דרום (מס' 2021-S137). ביום הראשון שלאחר הבקיעה, דג הזברה גודלו בצלחת 12-באר (10 perwell), מוגנים מאור, ותורבתו ב-37 מעלות. דג הזברה טופלו בריכוזים שונים של סיטוגלוזיד, ותצלומים צולמו באמצעות מיקרוסקופ הפוך במרווחים של 24 שעות כדי לתעד את השינויים במלנין בזנבות של דג הזברה. לאחר צילום התמונות, תמיסות סיטוגלוזיד בריכוזים שונים נקראו ותועדו ברציפות במשך שבוע.

2.2.4. כדאיות תאים.

כדאיות התא הוערכה באמצעות תאים CCK8.MNT1 ו-B16F0 צופו בצלחות 96-באר בצפיפות של 2000 תאים/באר או 500 תאים/באר. התאים טופלו בריכוזים שונים של סיטוגלוזיד (25, 50,100, 200, 400, 600 ו-800 מיקרומטר). לאחר 24 שעות או 48 שעות, נוספו 10 μLof CCK8 מגיב לכל באר, והתאים הודגרו ב-37 מעלות למשך שעה. כאשר צבעו של המדיום הפך לכתום, התרבית הופסקה, ונעשה שימוש במיקרו-צלחות (PerkinElmer EnVision Xcite, בריטניה) למדידת הספיגה ב-490 ננומטר.

2.2.5. מכתים פונטנה-מאסון מלנין.

תאים טופלו בצלחת 6-בבאר וטופלו בריכוזים שונים של סיטוגלוזיד במשך יומיים, וחומצה קוג'ית כביקורת חיובית נוספה ב-200 מיקרומטר. התאים הונחו לאחר מכן ב-4 אחוז פרפורמלדהיד למשך 15 דקות. לאחר שטיפה במים, התאים הודגרו בתמיסת פונטנה אמוניה-כסף למשך 24 שעות בתא חשוך, נשטפו במים ולאחר מכן הוכנסו להיפוסולפיט למשך 5 דקות נוספות. מיקרוסקופ הפוך שימש כדי לצפות במלנין.

2.2.6. ניסוי שחזור פונקציות.

PMA, כמפעיל מוכר של ERK/MAPK [39, 40], נבדק לציטוטוקסיות באמצעות ניסוי CCK8 בריכוזים שונים (6.25,12.5, 25, 50, 100, 200, 400, ו 800 ng/mL) למשך 24 שעות. ולאחר שתאי MNT1 ו-B16F0 טופלו בריכוזים שונים (25, 50 ו-100 ng/mL) של PMA למשך שעתיים, רמת הזרחון של ERK זוהתה בניסוי westernblotting. בריכוז שנבחר, התאים טופלו ב-0, 1, 2, 4, 6 ו-8 שעות כדי לזהות את זמן ההפעלה האפקטיבי. לאחר שהתאים טופלו עם סיטוגלוזיד (200 מיקרומטר) ו-PMA (25 ננוגרם/מ"ל) במשך 48 שעות (חזרו כל 8 שעות), רמות החלבון שלTYRandp-ERK זוהו. צביעת המלנין של Fontana-Masson זיהתה את תכולת המלנין. Anisomycin [41] הוא המפעיל של p38/MAPK, שריכוז החקירה שלו הוא 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 ו-512 ננומטר, ושיטות הניסוי האחרות זהות ל-PMA.

2.2.7. מדידות פעילות TYR.

תאים טופלו בריכוזים שונים של סיטוגלוזיד במשך יומיים. לאחר עיכול וצנטריפוגה, התאים נספרו והורחבו פעמיים בתמיסת מלח מוגברת בפוספט (PBS). לאחר מכן, נוספו לכל דגימה 500 μL של תמיסה של 0.5 אחוז נתרן דיאוקסיכולאט. הדגימות הודגרו ב-4 מעלות למשך 10 דקות ולאחר מכן ב-37 מעלות למשך 15 דקות. 1 מ"ל של תמיסת L-DOPA של 1 אחוז נוספה, ולאחר מכן 200 μL הוזרמו מיד לתוך 96-צלחת באר. לאחר מכן, נעשה שימוש בקורא לוחות רב-מוד למדידת ערכי הספיגה (A0) ב-475 ננומטר, והמדידה חזרה על עצמה לאחר 30 דקות (A30).TYRהפעילות חושבה כ-(A{{0}}A0)/מספר תא.

2.2.8. בדיקת פעילות TYR.

חיישן פלואורסצנציה קרוב לאינפרא אדום עבורTYRנעשה שימוש בפעילות המבוססת על resorufin כדי להמחיש פעילות בתאים חיים, כפי שתואר קודם [42]. בקצרה, תאי MNT1 ו-B16F0 תורבו בצלחת 6-בבאר וטופלו בריכוזים שונים של סיטוגלוזיד למשך יומיים . נוספה בדיקה של 10 מיקרומטר פלואורסצנטי, ולאחר 4 שעות, התאים הוחלפו ב-PBS. לאחר שהאור האדום היה מלהיב, מיד נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי לצילום תמונות.

2.2.9. מיצוי חלבון ו-Western Blotting.

לאחר שהתאים טופלו בריכוזים שונים של סיטוגלוזיד במשך יומיים, החלבון הסלולרי הכולל הוצא באמצעות theRIPA Lysis Buffer (Thermo Fisher) וקוקטיילים מסוג Protease Inhibitor ו-Phosphatase Inhibitor (Roche). ריכוז החלבון נקבע באמצעות בדיקת חלבון BCA (KeyGEN Biotec). לאחר חסימה עם 1 אחוז BSA, הנוגדנים העיקריים נגדTYR, MITF, TRP1, TRP2, RAB27A,CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, JUK, p-JUK, p38 ו-p-p38 הודגרו עם הממברנות למשך הלילה ב-4 מעלות ב-1: 1000 ו-GAPDH ב-1:3000 הממברנות נשטפו עם TBS-T והודגרו עם נוגדן משני נגד ארנב עיזים ב-1:3000 למשך שעה. הנוגדן המקשר זוהה באמצעות אלקטרוכימילומינסנציה (ECL).

2.2.10. ניתוח סטטיסטי.

תוכנת SPSS22.0 שימשה לניתוח סטטיסטי, ו-T-test של Student או אנליזה חד כיוונית של שונות (ANOVA) שימשה להשוואות קבוצות מרובות. מבחן Mann-Whitney U שימש עבור נתונים לא פרמטריים. p < 0:05="" בכל="" המקרים="" נחשב="" מובהק="" סטטיסטית.="" ∗∗∗p="">< 0:001,="" ∗∗p="">< 0:01,="" ו∗p=""><>

3. תוצאות

3.1. מרכיבים מרוכבים של TCMs.

14 TCMs, מתועדים ב-Ben-Cao-Gang-Mu ובמרשמים עממיים, עם השפעות אנטי-פיגמנטציה נחקרו. סך של 372 מרכיבי רפואה סינית מ-14 TCMs אוחזרו ממסד הנתונים של TCMSP (טבלה משלימה S1).

3.2. גנים מטרה מוסדרים על ידי TCMs וגנים קשורים לפיגמנטציה.

על פי מערכת חיזוי המטרה במסד הנתונים TCMSP, התקבלו סך של 834 גני מטרה מ-14 ה-TCMs. סך של 9431 גנים הקשורים לצִבעָנוּתאוחזרו ממסד הנתונים של GeneCards, מתוכו נבחרו 6180 וציון רלוונטיות > 1.

3.3. דירוג של 14 TCMs ו-Disease-Compound-TargetNetwork.

באמצעות תוכנת Cytoscape, לקחנו את צומת הגנים הרגולטוריים של כל TCM וגנים הקשורים לפיגמנטציה והשגנו את החומרים הפעילים הפוטנציאליים ואת גני המטרה הנפוצים. לאחר מכן, רשת היעד של תרכובת המחלה בין TCM וצִבעָנוּתנבנה. בהתבסס על זה, השגנו את ה"דרגה" הממוצעת של כל מרכיב פעיל ודירגנו את ה-TCM על פי הציונים שלהם. על פי ציוני הדירוג, 5 הצמחים המובילים היו Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim.,Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ו-Paeoniae Radix Alba (איור 2(א)). באמצעות ניתוח KEGG של 220 גני מטרה של 5 ה-TCMs המובילים, 19.3 אחוז מהגנים היו עשירים במסלול האיתות PI3K-Akt, 13.6 אחוז מהגנים היו קשורים למסלול איתות TNF, וכ-12.3 אחוז מהגנים היו קשורים ל-IL{{ 12}}. בנוסף, 37 גנים היו מעורבים במסלול MAPK ו-28 גנים היו מעורבים במסלול HIF-1. מסלולים אלו קשורים קשר הדוק לוויסות חילוף החומרים של המלנין והזדקנות העור. בין 20 מסלולי האיתות המועשרים המובילים, המסלולים הקשורים לדלקת היוו רבע מהם (איור 2(ג)). איורים 2(d)–2(h) מתארים את רשת תרכובת-מטרה למחלה בין Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, Paeoniae Radix Alba ופיגמנטציה, בהתאמה. על פי דיאגרמת Venn של המרכיבים בחמשת ה-TCMs המובילים, מצאנו ש-4TCMs הכילו סיטוגלוזיד ובטא-סיטוסטרול (איור 2(ב), טבלה משלימה S2).

3.4. רכיבים פעילים פוטנציאליים בבלימת פיגמנטציה.

על פי רשת המחלה-תרכובת-מטרה, 148מרכיבים קשורים לצִבעָנוּתהתקבלו מ-14TCMs. באמצעות חיפוש ספרותי, דווח כי 25 מתוך 148 המרכיבים מעכבים מלנוגנזה. ארבעה מרכיבים פעילים דווחו כתמציות צמחים המעכבות מלנוגנזה. 14 מרכיבים פעילים נחקרו, ונגזרותיהם דווחו כדי לווסת פיגמנטציה. מעניין לציין כי ארבעה מרכיבים הוכחו כמקדמים מלנוגנזה, בעוד המנגנון של שישה מרכיבים בוויסות המלנוגנזה עדיין לא ברור. שאר 95 הרכיבים הסיניים הפוטנציאליים טרם נחקרו לוויסות הפיגמנטציה. מידע מפורט על מרכיבים אלה מסופק בטבלה משלימה S3.

3.5. השפעות In Vitro ו-In Vivo של Sitogluside על מלנוגנזה.

לאחר תהליך ההקרנה לעיל, מצאנו שארבעה TCMs ב-TCMs המובילים הכילו סיטוגלוזיד ו-סיטוסטרול. -סיטוסטרול דווח כמעכב הורמון מגרה של מלנוציטים (-MSH), מעורר מלנוגנזה באמצעות מסלול האיתות p38 בתאי מלנומה B16F10 [43]. עם זאת, השפעות אנטי-פיגמנטציה של סיטוגלוזיד והמנגנון הספציפי שלו לא דווחו. לכן, בחרנו ב- Sitogluside כמועמד לתרופה עבור מחקרים אלה. בדיקת CCK8 בוצעה כדי לחקור את הריכוזים הרעילים הפוטנציאליים של סיטוגלוזיד בתאי MNT1 ו-B16F0. התוצאות הראו שלסיטוגלוסיד לא הייתה השפעה ברורה על התפשטות התאים (איורים 3(א) ו-3(ב)) בריכוזים מתחת ל-400 מיקרומטר. צביעת מלנין שבוצעה באמצעות 25, 50, 100 ו-200 מיקרומטר מסיטוגלוסיד הראתה שסיטוגלוזיד יכול להפחית תכולת מלנין בתאי MNT1 ו-B16F0 באופן תלוי מינון (איור 3(ג)). יתר על כן, טיפול סיטוגלוזיד עיכב משמעותית את העורצִבעָנוּתבדג הזברה באופן תלוי זמן ומינון (איור 3(ד)). תוצאות אלו הצביעו על כך שסיטוגלוזיד עיכב מלנוגנזה במבחנה ובאינבו.

3.6. השפעות של Sitogluside על ביטוי TYR.

מהתוצאות הקודמות, סיטוגלוזיד יכול להפחית ביעילות את תכולת המלנין, אך האופן שבו הוא מווסת תהליך זה עדיין לא ידוע ולכן מעניין. בדיקת ווסטרן בוצעה כדי לזהות את הביטוי של גנים הקשורים למלנוגנזה (TYR,MITF, TRP1, TRP2 ו-RAB27A) ברמת החלבון. תוצאות הניתוחים הוכיחו שביטוי TYR היה מופחת משמעותית וביטויי MITF ו-TRP1 היו מווסתים באופן מתון לאחר טיפול סיטוגלוזיד (איור 4(א)). מכיוון ש-MAPK ו-PKA הם מסלולי האיתות המקדמים המסדירים את TYR, חקרנו עוד את השינויים בחלבוני המפתח בשני המסלולים הללו. לאחר שתאי MNT1 ו-B16F0 טופלו ב-sitogluside במשך יומיים, רמות הזרחון של ERK ו-P38 היו מווסתות באופן משמעותי. , בעוד שלא היו שינויים משמעותיים ברמות הכוללות של חלבוני CREB, ERK, JNK ו-p38 או ברמות הזרחון של JNK ו-CREB (איור 4(ב), איור S1A). על פי התוצאות של ניסוי CCK8, מצאנו ש-PMA מתחת ל-100 ng/mL אינו רעיל לשני התאים (איור S1B), ו-25 ng/mL PMA עשוי להגביר את רמת הזרחון של ERK. רמת הפוספורילציה של ERK ירדה בהדרגה לאחר 4 שעות (איור S1C-D). באמצעות צביעת מלנין Fontana-Masson, מצאנו ש-PMA יכול להגדיל באופן משמעותי את תכולת התמלנין בתאי MNT1 ו-B16F0. תוצאות ה-Westernblotting גם מצביעות על כך ש-PMA יכול להגביר את רמת הזרחן של ERK, וסיטוגלוסיד יכול להפחית את רמת הזרחון של ERK המווסתת על ידי PMA. על ידי עיכוב רמת הזרחון של ERK והפחתת רמת החלבון שלTYR, Sitogluside מפחית את תכולת המלנין המוגברת על ידי PMA (איורים 4(ג) ו-4(ה), איור S2A). יחד עם זאת, מצאנו כי לאניסומיצין יש תוצאות דומות. אניסומיצין מתחת ל-8 ננומטר אינו רעיל לשני התאים, ו-2 ננומטר אניסומיצין יכול להגביר באופן משמעותי את רמת הזרחון של p38. לאחר 8 שעות, רמת הפוספורילציה של p38 עדיין גבוהה (איור S1B, איור S1E-F). התוצאות של צביעת מלנין Fontana-Masson ו-Western blotting גם מצביעות על כך שסיטוגלוסיד יכול לעכב את רמת הזרחון של p38 המווסתת על ידי אניאיזומיצין, מפחיתה את התוכן של חלבון TYR ומעכבתצִבעָנוּת(איורים 4(ד) ו-4(f), איור S2B). לכן, סיטוגלוסיד עשוי להפחית את ביטוי TYR על ידי עיכוב מסלולי ERK/MAPK ו-p38/MAPK. עם זאת, המנגנון שבאמצעותו סיטוגלוסיד מעכב את מסלולי האיתות הללו נותר לא ברור. עקבנו אחר קולטני הממברנה במעלה הזרם של מסלולי האיתות הללו והשתמשנו בעגינה מולקולרית כדי לחקור את המנגנון של ויסות מסלולים במורד הזרם. אנרגיות הקישור בין סיטוגלוזיד לששת קולטני הממברנה, כלומר האופיואיד u, מלנוקורטין 1, גורם תאי גזע, אנדותלין B, אדרנרגי וקולטני פרוסטגלנדין היו -7.8,-5.8, {{9 }}.5, -5.4, -3.4 ו-0 kal/mol, בהתאמה. דרך עגינה מולקולרית, מצאנו שבין קולטני שישה ממברנות, לסיטוגלוסיד יש זיקה גבוהה מאוד לאופיואיד u, מלנוקורטין 1, ולקולטנים של גורם הצמיחה של תאי גזע (איור 4(g)). אנו משערים שסיטוגלוסיד עשוי לעכב את מסלולי ERK/MAPK ו-p38/MAPK על ידי קשירה לקולטני הממברנה שהוזכרו לעיל, ובכך להפחית את ביטוי TYR.

3.7. השפעת Sitogluside על פעילות TYR.

מאזTYRהוא האנזים המרכזי בסינתזת המלנין, הוא היעד הבולט ביותר לעיכוב מלנוגנזה. רוב מוצרי הקוסמטיקה או הבהרת העור הזמינים באופן מסחרי, כגון HQ,arbutin וחומצה קוג'ית, הם מעכבי TYR. השתמשנו בסיטוגלוסיד ובחלקם השתמשנו קליניתהלבנת עורסוכנים (ארבוטין, ניקוטינאמיד, חומצה קוג'ית, HQ וחומצה אסקורבית) לביצוע עגינה מולקולרית עם TYR. האינטראקציות המפורטות בין סיטוגלוסיד לסוכנים שהוזכרו לעיל עםTYRמוצגים באיור 5(א). אנרגיות הקישור של שש התרכובות הללו היו -6.2, -6.4, -5.6, -5.7, -5.4 ו-{{ 11}}.4 קק"ל/מול, בהתאמה. מקובל לחשוב שכאשר אנרגיית הזיקה היא -4, היא מציינת כוח מחייב, וכאשר היא גדולה או שווה ל--7.0, היא מעידה על כוח מחייב חזק. צד סיטוגלו דורג במקום השני בזיקה, מעט חלש יותר מארבוטין, ומציג יכולת שילוב יוצאת דופן יחסית.

במקביל, נעשה שימוש בניסוי המרה של L-DOPA כדי לזהות את הפעילות של TYR, תוך שימוש בחומצה קוג'ית כביקורת חיובית. התוצאות הראו שסיטוגלוזיד עיכב פעילות TYR בתאי MNT1 ו-B16F0 באופן תלוי ריכוז, וקבוצת הריכוז הגבוה (200 מיקרומטר) הראתה אפקט מעכב שווה ערך לזה שמוצג ב-200 מיקרומטר קוג'יק חומצה (איורים 5(ב) ו-5(ג)). בנוסף, תוצאות ניסוי הבדיקה של TYR הראו שכאשר ריכוז הסיטוגלוזיד עלה, עוצמת הקרינה ירדה בהדרגה בתאים, ועוצמת הקרינה של קבוצת הריכוז הגבוה הייתה קרובה לזו של חומצה קוג'ית של 200 מיקרומטר בתאי MNT1 ו-B16F0 (איור 5(ד), איור S2C). תוצאות אלו מצביעות על כך שסיטוגלוזיד יכול לעכב ביעילותTYRפעילות בתאי MNT1 ו-B16F0. יתרה מכך, אנו משערים שסיטוגלוזיד, כתרכובת סטרול טבעית, עשוי לחדור ישירות לממברנה התא ולהיקשר ל-TYR ולעכב את פעילותו, ובכך לעכב את המלנוגנזה.

4. דיון

במחקר זה, השתמשנו בפרמקולוגיה ברשת כדי לחקור את מנגנוני הפוטנציאלהלבנת עורמרכיבים שנמצאו ב-14 TCM, מתועדים במרשמים של Ben-Cao-Gang-Mu ואנשים אחרים, בעיכובצִבעָנוּת. המחקר גם הציע שיטה חדשנית המשתמשת בפרמטר הטופולוגי הממוצע "תואר" של כל מרכיב פעיל כדי להעריך את היעילות הפוטנציאלית של צמחי המרפא. על פי ה"תואר" הממוצע נבחרו Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarummultijugum Maxim., Ampelopsis japonica, PseudobulbusCremastrae Seu Pleiones ו-Paeoniae Radix Alba, ובאמצעות ניתוח העשרה של KEGG של הגנים המווסתים על ידי חמשת ה-TCMs הללו, זה היה בלתי צפוי של 25 אחוזים מועשרים. מסלולי איתות היו קשורים לדלקת, כולל מסלולי איתות IL-17, TNF, HIF-1, PI3K-Akt ו-MAPK.

לאחרונה, הוכח שמגוון של מתווכים דלקתיים מפעילים או מעכבים מסלולי איתות הקשורים למלנוגנזה המקדמים או מעכבים את העורצִבעָנוּת[6]. תאי מלנומה B16F10 מעובדים, TNF- הפחית את הביטוי שלTYRופעילות TRP1 ו-TYR באופן תלוי מינון [44]. IL-17 ו-TNF- יכולים להפחית את הביטוי של גנים הקשורים למלנוגנזה במלנוציטים, ו-IL-17 יכול לשפר משמעותית את ההשפעה המעכבת של TNF- על מלנוגנזה. לאחר טיפול ב-etanercept(אנטי-TNF), גנים הקשורים למלנוגנזה היו מווסתים משמעותית בנגעי העור של חולים עם פסוריאזיס[45]. HIF-1, גורם שעתוק רב עוצמה המווסת את התגובה הדלקתית, דווח כמעורב בוויסות של גורמים כגון IL-17 ו-TNF- [46-48]. לכן, HIF-1 צפוי להשתתף בוויסות המלנוגנזה על ידי השפעה על דלקת. ציטוקינים אחרים כגון IL-18, IL-33, GM-CSF ו-IL-1 יכולים לקדם מלנוגנזה על ידי הפעלת ה-PKA, MAPK או מסלולי איתות אחרים, בעוד ש-IFN-, IL-1, IL-4 ו-IL-6 מפחיתים את המלנוגנזה על ידי עיכוב STAT1, NF-κB, ומסלולי איתות JAK2-STAT6 [6]. הממצאים שלנו מצביעים על כך שחמשת ה-TCMs המובילים (Fructus Ligustri Lucidi,Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ו-Paeoniae Radix Alba) עשויים להפעיל אפקט אנטי-פיגמנטציה בעיקר דרך מסלולים אנטי דלקתיים. ספרות קודמת גם הזכירה שלחמשת ה-TCMs המובילות הללו יש השפעות אנטי-דלקתיות ואנטי-הזדקנות חזקות [49, 50]. זה גם תומך בהשערה שלנו ש-TCMs עשוי למלא תפקיד לא מבוטל בפיגמנטציה פוסט-דלקתית.

תוך כדי עיון בספרות של 148 מרכיבים שנמצאו ב-14 TCMs, מצאנו גם שבין 35 מהמרכיבים המדווחים, אושרו כמעט 70 אחוז מהם כמפחיתים את תכולת המלנין או מעכבים את פעילות ה-TYR. זה לא רק מאשר שתיעוד של מרשמים להלבנת עור בספרים עתיקים אמינים במידה רבה, אלא גם מראה שהתייחסות לספרות עתיקה היא שיטה אמינה להשגת ידע על TCMs. יש עדיין 95 תרכובות שנותרו לא נחקרו, שיש להן פוטנציאל להתנגדצִבעָנוּת. באמצעות ניתוח של דיאגרמות Venn של חמשת ה-TCMs המובילים, הושגו 13 מרכיבים נפוצים. ביניהם, ניסויים במבחנה אישרו שדידזאין, רוטין ו-(פלוס)-קטצ'ין יכולים להפחית את תכולת המלנין [51-53]. סוכרוז מפריעה להבשלה תקינה של מלנוזום על ידי גרימת מתח אוסמוטי ועיכוב מסלול קינאז PI3, ובכך מפריע למלנוגנזה [54]. Quercetin מפחית מלנוגנזה הנגרמת על ידי מתח חמצוני [55]. בנוסף, שיטות כימיות ופיזיקליות כגון ספקטרוסקופיות וניתוחי מבנה-פעילות אישרו כי לופאולנד קאמפרול יכול לעכבTYRולהפחית מלנוגנזה [56, 57]. זה מצביע על כך שהפרמקולוגיה ברשת היא אולי שיטה אפשרית לחפורהַלבָּנָהרכיבים. ארבעה TCMs בחמשת ה-TCMs המובילים הכילו סיטוגלוזיד, ואין דיווחים אם סיטוגלוזיד מווסת את הפיגמנטציה או המנגנון הקשור אליו. לכן, בחרנו בסיטוגלוזיד למחקרים אלה.

דווח כי Sitogluside, סטרול גליקוזיד הקיים באופן נרחב בצמחים, מפעיל השפעות נוגדות גידולים, נוגדי חמצון ונוירו-הגנה [58-60]. במחקר זה, גילינו שסיטוגלוזיד הפחית ביעילות את תכולת המלנין במבחנה ובאינבו. ניסויים שלאחר מכן הוכיחו שזה יכול להפחית באופן משמעותי את הביטוי של TYR. חומצה קוג'ית שימשה כבקרה חיובית, והיא יכולה גם לעכב את רמות החלבון של גנים הקשורים למלנוגנזה כגון TYR,MITF ו-TYRP1 תחת גירוי -MSH, אשר דווח על ידי Jeon וחב'. [61]. בהתחשב בהיעדר גירוי אקסוגני, לחומצה קוג'ית 200 מיקרומטר היו השפעות מעכבות מתונות בלבד על ביטוי גנים במחקר שלנו, אך מכיוון שלקוג'יקאציד פעילות מעכבת טירוזינאז מצוינת, אנו עדיין משתמשים בה כביקורת חיובית במחקר זה. דווח כי ביטוי TYR מוסדר באופן ישיר או עקיף על ידי מסלולי MAPKor PKA, בהתאמה. מספר הולך וגדל של מרכיבים אושרו כבעלי השפעת הלבנה על העור על ידי עיכוב מסלול האותות MAPK. לדוגמה, צבעסין מפחית את הביטוי שלTYRעל ידי עיכוב מסלול P38/MAPK [62]. Ganoderma lucidum polysaccharides יכולים להתנגד למלנוגנזה הנגרמת על ידי UVB על ידי הורדת וויסות מסלול MAPK [63]. המחקר שלנו מצא שלסיטוגלוזיד, בריכוז של 200 מיקרומטר, היה הפוטנציאל להפחית את ביטוי TYR על ידי עיכוב מסלולי איתות ERK/-MAPK ו-P38/MAPK. זה דווח דרך העגינה המולקולרית בין קולטני הממברנה במעלה הזרם של מסלולי MAPK [64] וסיטוגלוסיד. מצאנו שסיטוגלוזיד נקשר חזק לקולטנים של אופיואידים u, מלנוקורטין 1 וגורמי גדילה של תאי גזע. לכן, אנו משערים שסיטוגלוזיד עשוי לקיים אינטראקציה עם קולטני הממברנה הללו, לעכב את מסלולי האיתות ERK/MAPK ו- P38/MAPK ולהפחית את הביטוי של TYR.

מכיוון ש-TYR הוא האנזים המרכזי בסינתזה של חלקיקי מלנין במלנוציטים, עיכוב הפעילות של האתר הקטליטי של TYR חיוני להפחתת העורצִבעָנוּת[65]. חומרים רבים להבהרת העור בשוק הם מעכבי TYRactivity, כגון HQ, arbutin וחומצה קוג'ית. במחקר זה, השתמשנו בעגינה מולקולרית כדי לחקור את ההשפעות המחייבות של סיטוגלוזיד וחמישה נפוציםהלבנת עורמרכיבים פעילים (ארבוטין, ניקוטינאמיד, חומצה קוג'ית, HQ, חומצה אנדאסקורבית) [66] עםTYR. התוצאות הראו של-sitogluside יש זיקה חזקה של קישור ל-TYR, thanarbutin חלש יותר, אך חזקה יותר מחומצה kojic, nicotinamide, HQ, andascorbic acid. ארבוטין הוא פרו-תרופה של HQ ומוצר טבעי שיכול להפחית או לעכב את הסינתזה של מלנין על ידי עיכוב TYR. עם זאת, הצורה הטבעית של ארבוטין לא יציבה מבחינה איסכמית ויכולה להפוך ל-HQ, אשר עובר קטליזציה וחילוף חומרים למטבוליטים בנזן עם רעילות פוטנציאלית למח העצם [67]. השימוש בתכשירי אי-קוסמטיקה של חומצה קוג'ית מוגבלת בגלל מסרטנותה וחוסר היציבות שלה במהלך האחסון [68]. לכן, סיטוגלוסיד, תרכובת סטרול טבעית המופקת ממגוון צמחים, צפויה לפעול כחומר חזק להבהרת העור. עם זאת, המסיסות של סיטוגלוזיד ב-DMSO נמוכה, וזה גם חסרון של מרכיב טבעי זה. אימות ניסוי שלאחר מכן גילה שסיטוגלוזיד בטוח בשורות תאים MNT1 ו-B16F0, ולקבוצת הריכוז הנמוך הייתה השפעה מעכבת טובה על פעילות TYR, בעוד שלקבוצת הריכוז הגבוה הייתה השפעה זהה לאותו ריכוז של חומצה קוג'ית. לכן, סיטוגלוזיד עשוי לשמש טיפולית כמווסת הלבנת עור, אשר לא רק מפחית את הביטוי של TYR אלא גם מעכב את פעילותו (איור 6).

5. מסקנות

פרמקולוגיה של הרשת היא אולי כלי יעיל לגילוי של חומרים פעילים טבעיים המפחיתים פיגמנטציה של העור והמנגנונים האפשריים שלהם. ל- Fructus LigustriLucidi, Hedysarum multijugum maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones ו-PaeoniaeRadix Alba יש פוטנציאלהלבנת עורתכונות ועשויות לעכבצִבעָנוּתעל ידי ויסות דלקת. Sitogluside הוא רומןהלבנת עורמרכיב פעיל עם השפעות כפולות רגולטוריות, כלומר. מעכבTYRביטוי ופעילות.

טבליות cistanche