תכונות אנטי מלנוגנזה ואנטי טירוזינאז של Pistacia atlantica subsp. תמציות mutica על תאי מלנומה עכברים B16F10

איש קשר: ali.ma@wecistanche.com

סמירה אגבאלי-פריז1, אכרם טלג'אני2, האדי אלנג'אר3, סייד אחמד אמאמי1, חומה רחימי4, ג'וואד אסילי1, סמירה חסנזדה1, וזהרה טייאראני-נג'אראן5,*

תַקצִיר:Pistacia atlantica (P. atlantica) subsp. מוטיקה שימשה ברפואה המסורתית והיא מפורסמת בסגולותיה הרפואיות. מטרת מחקר זה הייתה להעריך את ההשפעה של מתנול (MeOH), n-hexane, dichloromethane (CH2Cl2), n-butanol (BuOH), אתיל אצטט (EtOAc), תמציות מים ושמן אתרי של P. atlantica subsp. mutica על סינתזת מלנין ולחץ חמצוני בקו תאי מלנומה B16F10. הכדאיות של תאי B16F10 לאחר טיפול בריכוזים הולכים וגדלים של תמציות שונות של הצמח (0.2-200 מיקרוגרם/מ"ל) נמדדה באמצעות resazurin. הרכב שמן אתרי זוהה על ידי ניתוח גז-כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה (GC-MS) והשפעה מעכבת על סינתזה של מלנין, פטריותטירוזינאזפעילות, טירוזינאז תאי ולחץ חמצוני הוערכו בשיטות הקולורימטריות והפלואורומטריות. הנתונים הראו תמציות בריכוזים 0.2-200 מיקרוגרם/מ"ל, לא הראו רעילות משמעותית על תאי מלנומה, אך לריכוזים של 200 מיקרוגרם/מ"ל של שמן אתרי הייתה השפעה ציטוטוקסית. Pistacia atlantica subsp. mutica יכול לעכב את הפטרייהטירוזינאזפעילות. כמו כן, כמות המלנין בתאי B16F10 ירדה. בנוסף, היכולת של P. atlantica subsp. תמציות mutica בהפחתת כמות מיני חמצן תגובתיים בתאי מלנומה חשפו מדהיםנוגד חמצוןפעילות. בנוסף, לכל הריכוזים של שמן אתרי לא הייתה השפעה משמעותית במחקר זה. המלנוגנזהמעכב ונוגד חמצוןהשפעות של P. atlantica subsp. mutica על תאי B16F10 עשויה להציע את פעילות ההלבנה הפוטנציאלית של הצמח לשימוש במוצרי טיפוח דרמטולוגיים ולמניעת הזדקנות העור בתעשיית הקוסמטיקה.מילות מפתח:אַנְטִי-טירוזינאז; מלנוגנזה; P. atlantica subsp. mutica.

לחץ כדייתרונות cistanche עבור נוגד חמצון

מבוא

המלנין הוא פיגמנט עור המסונתז במלנוזומים ומועבר לקרטינוציטים לאורך התהליך הפיזיולוגי הנקראמלנוגנזה. למלנין תפקיד חשוב בהגנה מפני נזקי UV וקובע את צבע העור, השיער והעיניים. ייצור עודף של מלנין מיוחס במלנומה ובפיגמנטציה חריגה של העור (1-3). האנזים המרכזי בביו-סינתזה של מלנין הוא טירוזינאז המזרז שתי תגובות נפרדות, חמצון של 3,4-דיהידרוקסי-פנילאלנין (DOPA) ל-Dopaquinone והידרוקסילציה של L-tyrosine ל-DOPA (4).טירוזינאזאו פוליפנול אוקסידאז הוא אנזים המכיל נחושת בתפקוד מעורב המצוי במיקרואורגניזמים, בעלי חיים וצמחים (5). טירוזינאז הוא הגורם המשפיע ביותר על השחמה של פירות וירקות. ייצור יתר והצטברות מלנין עלולים לגרום למספר רב של הפרעות עור כולל מלזמה, נמשים, מלנוזה סולארית וכתמי גיל (6). לָכֵן,טירוזינאזמעכבים משכו עניין רב בתעשיות המזון והקוסמטיקה. ביצורים חיים רבים, חמצון חיוני להפקת אנרגיה לדלק תהליכים ביולוגיים.

עם זאת, מי חמצן (H2O2) ושאר מיני חמצן תגובתיים (ROS)- גורמים למוות של תאים ולנזק לרקמות בתופעות פיזיולוגיות ופתולוגיות רבות, כולל תוספת ROS בעקבות קרינת UV במהלך תהליך המלנוגנזה. כמו כן, ידוע היטב שייצור ROS המושרה על ידי UV מעורב בפתוגנזה של מספר מצבי עור כולל הזדקנות, קמטים, רגישות לאור וממאירות (7). לפיכך, מציאת מקורות טבעיים שלנוגדי חמצוןעם אנטיטירוזינאזפעילות עוזרת לשנות את נזקי העור הקשורים לעודףמלנוגנזה (4).

הסוג Pistacia הוא בן למשפחת Anacardiaceae הכוללת כ-9 מינים ומופץ בעיקר באזור הים התיכון, אירופה וחלקים מסוימים באסיה (8,9). Pistacia atlantica (P. atlantica)Desf. יש 3 תת-מינים כלומר: P. atlanticasubsp. kurdica (Zhary) Rech. f., P. atlanticasubsp. mutica (Fischer & CA Meyer) Rech. ו. ו-P. atlantica subsp. cabulica (Stocks) Rech. ו. שלושת תת-המינים המוזכרים של P. atlantica, P. khinjuk Stocks ו-P. vera L. גדלים באיראן (10). הפירות של P. atlanticasubsp. mutica כלומר Baneh הוא עגול עד סגלגל בקוטר 0.5-0.7 ס"מ. הפעילות נוגדת החמצון והאנטי סרטנית של גוף ה-P. atlantica קשורה לתכולת הפנולים הגבוהה של הצמח. P. atlantica שימש באופן מסורתי להקלה על אי נוחות וכאב בבטן העליונה, דיספפסיה וכיב פפטי (11-13). עם זאת, אין מחקרים על פעילות מעכבת מלנוגנזה של P. atlantica subsp. mutica. לכן, בפרויקט זה, אנו בוחרים בתאי מלנומה B16F10 לחקר התכונות נוגדות החמצון והאנטי-מלנוגניות של P. atlantica subsp. תמציות מוטיקה. מטרת מחקר זה הייתה לחקור את ההשפעה המעכבת של מתנול (MeOH), n-hexane, dichloromethane (CH2Cl2), n-butanol (BuOH), אתיל אצטט (EtOAc), תמציות מים (H2O) ושמן אתרי של P. atlanticasubsp. פרי mutica עלמלנוגנזהולהעריך את הפוטנציאלנוגד חמצוןקיבולת הצמח על תאי מלנומה B16F10.

חומרים ושיטות

כימיקלים

פטרייהטירוזינאזמ-Agaricus bisporus, קוג'ית, resazurin, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), dichloro dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), egtazic acid (EGTA), dimethyl sulfoxide (DMSO) ), phenylmethylsulfonyl fluoride, glycerophosphate, -mercaptoethanol, phosphate-buffered saline (PBS), sodium orthovanadate, tris-buffered saline tween 20 (TBST) שנרכשו מסיגמא (ארה"ב). סרום בקר עוברי (FBS), פניצילין, סטרפטומיצין וטריפסין-EDTA התקבלו מ-GibcoBRL (Grand Island, ארה"ב). קו תאי מלנומה (B16F10, Cat. No C540) נרכש ממכון פסטר של איראן (טהרן, IR איראן). כל שאר הכימיקלים והממיסים היו מבית Merck (גרמניה).

הכנת תמציות

P. atlantica subsp. mutica נאספה במאי 2014 מהרי ברדסקאן, מחוז חוראסאן רזאווי, צפון מזרחית לאיראן וזוהתה על ידי גברת מ. סוזאני. דגימת שובר (מס': 13069) הופקדה בעשב של בית הספר לרוקחות, אוניברסיטת משהד למדעי הרפואה, משהד, איראן. פרי בוסר של P. atlantica subsp. mutica (200 גרם) הורחקו על ידי בלנדר (Toos chekan Co, IR איראן) ולאחר מכן חלחלו עם MeOH בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לפי הפרוטוקול שדווח בעבר (14). לאחר המיצוי, הממס התאדה באמצעות מאייד סיבובי ולאחר מכן ייבוש בהקפאה. תמצית המתנול (94 גרם) חולקה עוד יותר על ידי חלוקת ממס-ממס כדי לתת חמישה חלקים שונים כולל MeOH, n-hexane, CH2Cl2, BuOH, EtOAc ו- H2O.

בידוד של השמן האתרי

הפרי הבוסר של P. atlantica subsp.mutica (150 גרם) היה נתון לזיקוק הידרו באמצעות מכשיר מסוג Clevenger למשך 3 שעות. השמן חסר הצבע התקבל עם תשואה של 0.8 אחוז (v/w). השמן האתרי שהתקבל יובש מעל נתרן סולפט נטול מים ואוחסן ב-4 מעלות בחושך עד לבדיקה נוספת.

גז-כרומטוגרפיה וגז-כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה

ניתוח כרומטוגרפיית הגז (GC) בוצע באמצעות Varian CP{{0}} מצויד בגלאי FID, הממומש עם עמודת סיליקה ממוזגת (CP-Sil 8CB, 50 מ' × 0.25 מ"מ, עובי הסרט 0.12 מיקרומטר) בתנאי הבא: טמפרטורת התנור 50-250 מעלות בקצב של 3 מעלות לדקה; טמפרטורת מזרק 260 מעלות, יחס פיצול 1:5, עם גז מוביל, קצב זרימת N2 2 מ"ל/דקה; טמפרטורת גלאי 280 מעלות.

ניתוחי גז-כרומטוגרפיה-מסה (GC-MS) בוצעו באמצעות מכשיר Agilent 5975 המצויד בעמודת HP-5 MS (30 m × 0.25 mm id, {{ 14}}.25 מיקרומטר עובי סרט) בממשק עם גלאי מסה מרובעת ומחשב המצויד בספריית Wiley 7n.L. טמפרטורת התנור 50-250 מעלות עם קצב של 3 מעלות/דקה, טמפרטורת מזרק 250 מעלות, נפח הזרקה: 0.1 µL, הזרקה מפוצלת עם יחס פיצול של 1:50, עם קצב זרימת הגז המוביל (הליום) 1 מ"ל/ דקות, מקור יונים: 70 eV, זרם יינון: 150 µA, וטווח סריקה: 35-465. זיהוי המרכיבים של השמן האתרי התבסס על כרומטוגרפיית גז שימור שהושגה בהתייחס לסדרת n-אלקנים (C6-C20) בעמודה HP-5MS, השוואה בין ספקטרום המסה ודפוסי הפיצול שלהם. בספרות, והתאמת מחשב עם ספריית Wiley 7n.L (15). כימות הכמות היחסית של הרכיבים הבודדים של פרי בוסר בוצע לפי שיטת אחוז השטח ללא התחשבות בגורם כיול.

תרבית תאים

קו תאי מלנומה, B16F10, נשמר ב-37 מעלות באווירה לחה (90 אחוז) המכילה 5 אחוז CO2. תאים תורבו ב-RPMI-1640 (Bioidea, איראן) עם 10 אחוז (v/v) FBS, 100 IU/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/mL סטרפטומיצין. תמיסת המניות של P. atlantica subsp. mutica הוכנה ב-50 מיקרוגרם/מ"ל ב-DMSO ונשמרה ב--40 מעלות. חומצה קוג'ית (2 ו-4 מ"מ) שימשה כביקורת חיובית בכל הניסויים. תאים תורבו ב96-צלחות באר בצפיפות של 105 תאים/מ"ל. פעילות התמצית בכל ניסוי חושבה באמצעות המשוואה הבאה:

🎁 אחוז הפעילות=ספיגת המדגם/ספיגת הבקרה*100

בדיקת כדאיות תאים

Resazurin הוא אינדיקטור לבריאות התא משתמש בכוח המפחית של תאים חיים והופך לרסורופין. Resazurin הוא תרכובת כחולה, לא רעילה, לא פלואורסצנטית וחדירה לתאים, ההופכת לצבע אדום ול-resorufin ניאון גבוה בתאים חיים (16). בערך 104 תאי מלנומה B16F10 נזרעו בכל באר של 96-צלחת microwell וטופלו בריכוזים שונים של תמציות ושמן אתרי של P. atlantica subsp. mutica (0.2-200 מיקרוגרם/מ"ל). לאחר דגירה של 4 שעות, הספיגה של resazurin ו-resorufin נמדדה ב-570 ננומטר ו-600 ננומטר באמצעות H4 Hybrid Multi-Mode microplate קורא (BioTek, Winooski, ארה"ב). כל ניסוי נעשה בשלושה עותקים. הריכוז המעכב החצי-מקסימלי (IC50) חושב באמצעות תוכנת GraphPad מעקומת הריכוז-אפקט: ריכוז לוג לעומת תגובה.

בדיקת פעילות טירוזינאז פטריות

פעילות הפטריותטירוזינאזבחמצון של L-DOPA נמדד ספקטרופוטומטרי כפי שתואר קודם (17), עם כמה שינויים. בקצרה, 160 μL של 5 mM L-DOPA (ב-100 mM נתרן פוספט חיץ pH 6.8) ו-20 μL מאותו חיץ עם ובלי P. atlanticasubsp. תמציות mutica ושמן אתרי (10-1000 מיקרוגרם/מ"ל) עורבבו עם 20 מיקרוגל של טירוזינאז פטריות (200 יחידות/מ"ל) ולאחר מכן הודגרו ב-37 מעלות למשך 30 דקות. הספיגה נמדדה ב-475 ננומטר עם Synergy H4 Hybrid Multi-Mode microplate קורא (BioTek, Winooski, ארה"ב).

קביעת תכולת המלנין בתאי מלנומה

תאי מלנומה, B16F10, נזרעו בצפיפות של 105 תאים לבאר ב96-צלחות תרבית באר והודגרו במשך 24 שעות. לאחר מכן הם הודגרו עם ריכוזים שונים (0.2-200 מיקרוגרם/מ"ל) של P. atlantica subsp. תמציות mutica ושמן אתרי למשך 24 שעות. תכולת המלנין נמדדה כפי שתואר קודם (18). לאחר הטיפול נאספו התאים באמצעות טריפסין. הם שטפו עם PBS. כדורי התא הומסו בתמיסת 50 μL של נתרן הידרוקסיד (2 M) למשך 60 דקות ב-60 מעלות. תכולת המלנין נמדדה על ידי מדידת הספיגה ב-405 ננומטר עם Synergy H4 Hybrid Multi-Mode microplate קורא (BioTek, Winooski, ארה"ב).

בדיקת פעילות טירוזינאז תאית

החמצון של DOPA לכרום DOPA נותח על ידי ספקטרופוטומטריה כאינדיקטור שלטירוזינאזפעילות (18). 106 תאים של מלנומה B16F10 צויינו בכל באר של 96-צלחת באר למשך הלילה. לאחר טיפול בתא עם ריכוזים שונים (0.2-200 מיקרוגרם/מ"ל) של P. atlantica subsp. תמציות mutica ושמן אתרי למשך 24 שעות, התאים נותקו באמצעות טריפסין; נשטף עם PBS, וסוהר עם חיץ נתרן פוספט 50 μL (pH 6.8, 100 mM) המכיל 1 אחוז טריטון X-100 ו-0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. הליסאטים עברו צנטריפוגה ב-10,000 סל"ד למשך 20 דקות ב-4 מעלות. 100 μL מכל lysate (כל אחד מכיל 100 מ"ג חלבון) עורבבו עם 30 μL של 5 mM DOPA בצלחת 96 בארים והודגרו ב-37 מעלות למשך שעתיים, הספיגה נמדדה ב-475 ננומטר עם קורא צלחות Multi-Mode Hybrid Synergy H4. (BioTek, Winooski, ארה"ב).

קביעת רמת מיני חמצן תגובתי תאי

רמת חמצן תגובתי נמדדה כפי שתואר קודם לכן עם שינויים קלים (19). תאי מלנומה, B16F10, (2 × 104) נזרעו ב96-צלחות באר למשך הלילה ולאחר מכן טופלו בריכוזים שונים (0.2-200 מיקרוגרם/מ"ל) של P. atlantica subsp . תמציות mutica ושמן אתרי למשך 24 שעות. לאחר מכן תאים מודגרים עם 50 μL H2O2 (24 מ"מ) ב-37 מעלות למשך 30 דקות. לאחר מכן נוספו 50 μL של DCFH-DA לתאים ועוצמת הקרינה של DCF נמדדה בפליטת 504 ננומטר ועירור של 524 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-צלחות Synergy H4 (BioTek, ארה"ב).

ניתוח סופג מערבי

תאי מלנומה, B16F10, תורבו בצלוחיות בגודל 75 ס"מ עם וללא תמצית מתנול (0.5-100 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 24 שעות. לאחר מכן התאים עברו ליטוש במאגר (50 mM tris-HCl, pH 7.4, 2 mM EGTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 mM glycerophosphate, 10 mM -mercaptoethanol, 1 mM sodium orthovanadate, 0.1% acid deoxycholic acid. מלח נתרן). כמות שווה של חלבונים (50 מיקרוגרם) הועמסו על אלקטרופורזה של ג'ל של 12 אחוז נתרן דודציל (SDS)-polyacrylamide והועברו לממברנות פוליווינילידן דיפלואוריד. הממברנות נחסמו למשך שעתיים בחלב דל שומן ב-TBST (20 mM tris-HCl pH 7.4, 100 mM NaCl ו-0.1% tween 20) בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה עם חיץ TBST, הממברנה הודגרה למשך הלילה עם נוגדן ראשוני: 1:300 (אנטי ארנבטירוזינאזנוגדן (Santa Cruz Biotechnology, CA)). לאחר שטיפה 3 פעמים עם חיץ TBST, הממברנות הודגרו למשך שעתיים עם IgG נגד ארנב (1:2000) כנוגדן המשני (אותות תאים). שטיפה 3 פעמים עם חיץ TBST חזרה על עצמה ורצועות החלבון זוהו באמצעות מערכת זיהוי ה-Chemiluminescent המשופרת (ECL) העיקרית לזיהוי מערבי (BioRaD, ארה"ב) (20). נוגדן אנטי- -אקטין שימש כבקרת הטעינה.

ניתוח סטטיסטי

התוצאות היחסיות של הניסויים הוצגו כממוצע ± SD של שלוש המדידות העצמאיות. ניתוח השונות וחישוב IC50 בוצעו עם GraphPad Prism 6.0 באמצעות מבחן ANOVA חד כיווני והממוצעים הושוו על ידי מבחני Dunnett. P <0.05 מייצג="" הבדל="" מובהק="" סטטיסטית="" בין="" תאים="" שטופלו="" בתמצית="" ובקרה.="" נעשה="" שימוש="" בבדיקת="" anova="" דו-כיוונית="" והשוואת="" בונפרוני="" לאחר="" הבדיקה="" כדי="" להשוות="" את="" ההשפעה="" של="" תמציות="" שונות="" בכל="">

תוצאות

הרכב שמן אתרי

נעשה שימוש בכרומטוגרפיה של גז לכימות וב-Gc-Mass לזיהוי התרכובות. התוצאות של ניתוח GC וגם GC-MS מוצגות בטבלת הזיהוי הכמותית והאיכותית של התרכובות. במקרה של P. atlanticasubsp. mutica, 68 מרכיבים זוהו בשמן האתרי והיוו 99.8 אחוזים מכלל הרכב השמן (טבלה 1). התרכובות המקובצות של השמן האתרי נקבעו כמונוטרפן פחמימנים 86.5 אחוזים , מונוטרפנים מחומצנים 3.7 אחוזים , פחמימנים ססקוויטרפן 8.7 אחוזים , ססקוויטרפנים מחומצנים 0.1 אחוז , והשונות 0 .8 אחוז . המרכיבים העיקריים של השמן האתרי היו -E-ocimene 29.7 אחוזים, מירקן 17.1 אחוזים, -Z-ocimene 17.0 אחוזים, -pinene 10.2 אחוזים ו-E-caryophyllene 7.1 אחוזים.

השפעת תמציות על הישרדות תאים

הכדאיות של התאים נוטרה עם resazurin. תאי מלנומה, B16F10, נזרעו בצלחת 96-באר. לאחר 24 שעות התאים טופלו בריכוזים שונים (0.2-200 מיקרוגרם/מ"ל) של P. atlantica subsp. תמציות mutica, התוצאות הראו כי לתמציות לא הייתה השפעה ציטוטוקסית משמעותית על תאי B16F10 בריכוזים בהם נעשה שימוש במחקר זה (איור 1). Doxorubicin כביקורת חיובית גרמה באופן משמעותי למוות של תאים (P <>

השפעת תמציות על פעילות טירוזינאז פטריות

הוערכה ההשפעה של P. atlantica על עיכוב של טירוזינאז פטריות בחמצון של L-DOPA. התוצאות הצביעו על פטריהטירוזינאזהפעילות הייתה מעוכבת על ידי כל התמציות השונות, אך לריכוז של 1000 מיקרוגרם/מ"ל של תמצית n-hexane לא הייתה השפעה משמעותית בבדיקה זו. חומצה קוג'ית (2 ו-4 מ"מ) שימשה כביקורת חיובית (P <0.05) (איור="">

השפעת תמציות ושמן אתרי על סינתזה של מלנין

לחקור את ההשפעה של תמציות שונות ושמן אתרי של P. atlantica subsp. mutica על סינתזת מלנין, הוערכה תכולת המלנין של תאי מלנומה B16F10 שטופלו בתמצית. חומצה קוג'ית (2 ו-4 מ"מ) שימשה כביקורת חיובית.

התוצאות הראו שתמציות MeOH, CH2Cl2 ו-EtOAc (0.2-200 מיקרוגרם/מ"ל), n-הקסאן (2-200 מיקרוגרם/מ"ל), ותמצית H2O (2{{9 }} ו-200 מיקרוגרם/מ"ל) היו בעלי השפעה מעכבת על סינתזת המלנין (P <0.05) (איור="" 3).="" עם="" זאת,="" לכל="" הריכוזים="" של="" שמן="" אתרי="" ותמצית="" buoh="" לא="" הייתה="" השפעה="" מעכבת="" משמעותית="" על="" סינתזת="" המלנין.="" התוצאות="" של="" שמן="" אתרי="" אינן="" מוצגות="">

השפעת תמציות על פעילות טירוזינאז תאית

כדי להעריך את מנגנון ההשפעה המעכבת של P. atlantica subsp. תמצית mutica עלמלנוגנזהבפרט, הערכנו את התוך תאיטירוזינאזפעילות בתאי מלנומה B16F10. התוצאות הצביעו על תמציות MeOH, EtOAc ו-BuOH (0.2-200 מיקרוגרם/מ"ל), n-הקסאן (0.2 מיקרוגרם/מ"ל) ו-CH2Cl2 (20 ו-200 מיקרוגרם/מ"ל) תמציות של P. atlantica subsp. mutica יכלה לעכב באופן משמעותי את פעילות ה-tyrosinase הסלולרית (P <0.05) (איור="" 4)="" אך="" לתמצית="" מים="" לא="" הייתה="" השפעה="" מעכבת="" על="" פעילות="" ה-tyrosinase="">

השפעת תמציות על רמת מיני חמצן תגובתיים בתא

רמת ה-ROS התוך-תאית מעידה עלנוגד חמצוןהקיבולת של P. atlantica subsp.mutica נמדדה בתאים שטופלו ב-24 mM H2O2 לבד או עם תמציות שונות בתאי מלנומה B16F10. התוצאות הצביעו על כך שכל ריכוזי התמציות של P. atlanticasubsp. mutica למעט 0.2 מיקרוגרם/מ"ל של תמצית CH2Cl2 יכולה לדכא באופן משמעותי את הלחץ החמצוני המושרה על ידי H2O2 (P <0.05) (איור="">

השפעת תמציות על רמת חלבון טירוזינאז תאית

ההשפעה התוך תאית של P. atlanticasubsp. mutica על חלבונים הקשורים למלנוגניים כגון טירוזינאז כאינדיקטור שלמלנוגנזההוערך על ידי Western blot. כפי שמוצג באיור 6,טירוזינאזרמות החלבון ירדו באופן משמעותי על ידי P. atlantica subsp. טיפול בתמצית mutica בריכוז של {{0}}.5 ו-10 µg/mL (P < 0.05).="" -אקטין="" שימש="" כבקרה="">

השפעות של שמן אתרי על פרמטרים שונים

שמן אתרי ב-0.2-200 מיקרוגרם/מ"ל לא חשף השפעה משמעותית על כל הפרמטרים שהוזכרו לעיל, למעט בריכוז של 200 מיקרוגרם/מ"ל, שהפגין השפעה ציטוטוקסית על תאי מלנומה. לפיכך, התוצאות של שמן אתרי אינן נכללות בסעיף התוצאות מכיוון שלא נצפו השפעות מעכבות.

דִיוּן

מוצרי קוסמטיקה על בסיס טבעי מפורסמים באופן נרחב על ידי סוכנויות מסחריות בשל בטיחותם ופעילותם הרב-תכליתית. מציאת חומרים אנטי-מלנוגניים חדשים עםנוגד חמצוןפעילות ממקורות טבעיים היא אחד האינטרסים בניסוח המוצרים המשמשים להפרעות היפרפיגמנטציה. במוצרים רפואיים וקוסמטיים המשמשים כחומרי הלבנת עור, עיכוב יצירת המלנין, ניקוי רדיקלים חופשיים ועיכוב שלטירוזינאזפעילות שחשובה לטיפול בהפרעות עור קשורות (21).

במחקר זה הפעילות נוגדת החמצון של תמציות שונות של P. atlantica subsp. mutica הוערכה והשפעותיהם על פעילות הטירוזינאז וסינתזת המלנין נותחו. תמציות MeOH ו-EtOAc של P. atlantica subsp. mutica הראה משמעותינוגד חמצוןפעילות ב-2, 20 מיקרוגרם/מ"ל ו-20, 200 מיקרוגרם/מ"ל, אשר ניתן לייחס לפוליפנולים ולפלבנואידים הנמצאים באופן נרחב בצמח. התוצאות הראו שכל התמציות, במיוחד תמציות MeOH, EtOAc ו-H2O יכולות לעכב באופן משמעותי את הפטרייהטירוזינאזפעילות. כמו כן, תמציות MeOH, EtOAc ו-BuOH הצליחו להפחית את פעילות ה-tyrosians הסלולרית אשר הייתה בהתאם להפחתה בייצור המלנין בתאים. במחקר זה, לכל הריכוזים של שמן אתרי לא הייתה השפעה מעכבת משמעותית נגד טירוזין תאי, סינתזת מלנין ונוגד חמצוןפעילות. בשל הפעילות הרבה יותר של תמצית MeOH בניסויים שונים בהשוואה לתמציות אחרות, בחרנו בתמצית המוזכרת לניתוח כתם מערבי. לסיכום, ההשפעה האנטי-מלנוגנית של תמצית זו אושרה בכל המבחנים בתאי B16F10, בהשוואה לחומצה הקוג'ית החיובית (טבלה 2).

תמציות MeOH, CH2Cl2 ו-EtOAc ירדו בתאטירוזינאזפעילות, תכולת מלנין ו-ROS. חלקי טבע חצי קוטביים עשויים לחלץ פיטוכימיקלים שאחראים לפעילות אנטי-לנוגנית כגון פוליפנולים ופלבונואידים. חלק ה-n-hexane והשמן האתרי היו פחות פעילים, מה שמצביע על כך שלפיטוכימיקלים צמחיים בעלי אופי לא קוטבי ונדיף אין השפעה משמעותית עלמלנוגנזהתהליך (22,23).

פוליפנולים ופלבונואידים פועלים כמעכבים של ייצור ROS ויכולים להיות אחראים לתכונות האנטי-מלנוגניות של תמציות צמחים (24-27). התרכובות העיקריות בתמצית של P. atlantica subsp. mutica הם קוורצטין, לוטאולין, איזוקוורצטין, רוטין, לוטאולין 7-לקטט ותרכובות פנוליות כגון חומצה p-קומרית, חומצה קפאית וחומצה גאלית שאחראיות עלנוגד חמצוןפעילות (28). דווח כי רוטין מעכב את הפעילות של טירוזינאז והוא חומר אנטי-פיגמנט חזק בשל נוכחותן של קבוצות הידרוקסיל (29). מעניין לציין שלקוורצטין, לוטאולין ואיסוקוורצטין יש גם קבוצות הידרוקסיל רבות במבנה שלהם, מה שהופך אותם למתאימים לאינטראקציה עם טירוזינאז וכתוצאה מכך לפעילות האנטי-טירוזינאז (21,30). לאחרונה הוכח כי ההשפעות של פלבנואידים כמו לוטאולין וקוורצטין מתווכות בעיקר באמצעות אפנון של גורם התעתיק שלמלנוגנזהגורם שעתוק קשור (MITF) ו/או אנזימי המלנוגנזהטירוזינאז, DCT או חלבון הקשור ל-tyrosinase 1 (TYRP-1) (31). חומצה P-קומרית וחומצה קפאית עיכבו את פעילות טירוזינאז הפטריות והיו 10- ו3- חזקים יותר מחומצה קוג'ית (32).

חומצה גאלית מציגה פעילות מעכבת טירוזינאז ומפחיתה את הדופקינון בחזרה ל-L-DOPA באמצעות מחזור חיזור, בדומה לחומצה אסקורבית (33). באופן דומה, במחקר הנוכחי P. atlantica subsp. mutica הורידה את רמת החלבון טירוזינאז בתאים, אשר נמצא בקורלציה הדוק עם נוכחותם של קוורצטין, לוטאולין, איזוקוורצטין, רוטין ופוליפנולים אחרים בצמח.

ישנם דיווחים רבים על צמחים בעלי פעילות אנטי-מלנוגנית ונוגדת חמצון המפחיתה מתח חמצוני, אשר עשוי להיות בעל פוטנציאל גבוה לטיפול בהפרעות עור. לדוגמה, התמציות השונות של חלקים אוויריים של P. atlantica הפחיתו את הלחץ החמצוני, אשר ניתן לייחס לפוליפנולים, פלבנואידים ואנתוציאנין הנמצאים באופן נרחב בצמח (34). במחקר אחר, תמצית MeOH של P. vera הפחיתה את הפרשת המלנין שיוחסה לחלקםנוגד חמצוןתרכובות בצמח זה. מחקר זה הצביע על כך שחומצה קוג'ית, כביקורת חיובית, הראתה ערך IC50 של 0.05 מ"ג/מ"ל וריכוזים גבוהים יותר של P. vera יכולים לשמש כסוכן יעיל לטיפול בהפרעות עור כגון סרטן מלנומה (35 ). גורין, ועוד. הראה שלחלקים האוויריים של P. atlantica יש תכונות נוגדות חמצון חזקות (36). כמו כן, חלקי MeOH ו-CH2Cl2 של Nepeta satureioide הצביעו על השפעות פוטנציאליות נגד ייצור מלנין בתאי מלנומה B16F10 ועשויים לתרום לניסוחים קוסמטיים של מוצרי טיפוח (37). לנגזרות של חומצה קוג'ית הייתה פעילות מעכבתטירוזינאז. נראה שנוכחות של קבוצת הידרוקסיל חופשית ותחליף מתיל בתרכובת זו אישרה פעילות מעכבת. במחקר זה, חומצה קוג'ית (ביקורת חיובית) הצביעה על ערך IC50 של 0.28 mM (38). הגליקוזידים והפלבנואידים של פנילפרופנואידים שבודדו מ-Teucrium polium L. var. gnaphalodes הראו פעילות מעכבת נוגדי חמצון וטירוזינאז. המחברים הראו ש-jaranol הראה את הפעילות המעכבת טירוזינאז הגבוהה ביותר (IC50 0.041 mM) ופוליומיוזיד היה נוגד החמצון הטוב ביותר מבין התרכובות שנבדקו. חומצה Kojic הראתה ערך IC50 של 0.02 mM (39).

ירידה ברמת החלבון שלטירוזינאזמאת P. atlantica subsp. mutica ונוגד חמצוןתכונות ו-ROS מופחת אישרו את השימוש בחומר זה כחומר אנטי-מלנוגנזה. מחקר זה קבע לראשונה את ההשפעה המעכבת של P. atlanticasubsp. mutica עלמלנוגנזהבתאי מלנומה B16F10. על מנת למנוע הצטברות וייצור יתר של מלנין בעור, עיכוב שלטירוזינאזיש תפקיד חשוב. לפיכך, בהתייחס להשפעה נוגדת החמצון המדווחת של P. atlantica subsp.mutica, תרכובות פלבנואידים ותרכובות פנוליות הן מרכיבים חשובים של הצמח האחראים על פעילות אנטי-מלנוגנזה ואנטי-טירוזינאז של P. atlantica subsp. mutica. פעילות נוגדת חמצון וגם אנטי-מלנוגנית של P. atlantica subsp. mutica עשויה להציע חומר מתאים לתכשירים להלבנת עור ויכול להיכלל במוצרים קוסמטיים לתכשירים לטיפול בעור.

סיכום

לסיכום, מחקר זה הראה לראשונה שתמציות MeOH ו-EtOAc של P. atlantica subsp. למוטיקה יש חזקטירוזינאזפעילות מעכבת אשר בהתאם להפחתת המלנין. יתר על כן, P. atlanticasubsp. mutica גם הפגינה פעילות ניקוי גבוהה ונוגד חמצוןתכונות, אשר ניתן לייחס בעיקר לרמות הגבוהות של פלבנואידים וסך הפוליפנולים. התוצאות העלו כי היכולת של P. atlanticasubsp. mutica להפחתת ייצור המלנין עשויה להיות קשורה לדלדול של ROS הסלולרי ולפעולה המעכבת שלו על מסלול האותות המווסתטירוזינאזפעילות. מכיוון שבתמצית החצי-קוטבית היו אנטי טירוזינאז משמעותיים ואנטי-מלנוגניהשפעות, לכן, אנו מסיקים שהתרכובות האחראיות להשפעות אלו מצטברות בתמצית, לא בשמנים אתריים.