זיהוי וניתוח פונקציונלי של ביפבון כמעכב חדש של תהליכים אתרוגניים תלויי ונילואיד 4 של קולטן חולף

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלדעת יותר

מאזן או.אלחרבי, בידישה דוטה, רישוב גוסואמי, שווטה שארמה, קיי. ליי & שייק או. רחמן

טרשת עורקים, מחלה דלקתית מתקדמת של עורקים גדולים, מהווה את התורמת העיקרית לנטל הגובר של תמותה ותחלואה הקשורים למחלות לב וכלי דם ברחבי העולם1. אירוע התחלה מרכזי שמוביל לטרשת עורקים כולל שמירה של חלקיקי ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (oxLDL) במרחבים האינטימיים של אבי העורקים התת-אנדותליים, בעיקר בנקודות הסתעפות עורקיות2. במהלך אטרוגנזה מוקדמת, בעקבות הפרעה בתפקוד האנדותל, מונוציטים בדם במחזור עוברים לאזורי האינטימה, ומתמיינים למקרופאגים של רקמות3. בחללים אינטימיים של אבי העורקים, קשירה וספיגה של oxLDL על ידי מקרופאגים בסיוע קולטני נבלות כמו SRA ו-CD36 יוצרת לולאה דלקתית של העורקים, וכתוצאה מכך התפתחות תאי קצף עמוסי שומנים, תהליך קריטי בטרשת עורקים2-8. אשדות האירועים הדלקתיים שמעוררים תאי קצף מובילים להיווצרות פס שומני מוקדם ובסופו של דבר להופעת נגעים מתקדמים של טרשת עורקים המאופיינים בנוכחות של כובע סיבי, רקמה מסויידת, תאי חיסון, חלבוני מטריקס ושומנים2-10. Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) מתת-משפחת TRPV, תעלת קטיון לא סלקטיבית ופולימודאלית החדירה ל-Ca2 פלוס מתבטאת בכל מקום בסוגי תאים שונים כולל מקרופאגים11-24. TRPV4, הידוע בעבר כ-osmosensor, ידוע כיום כמגיב לגירויים ביוכימיים וביו-מכאניים מגוונים, כולל חום, קשיחות מטריצה, אוסמולריות, גורמי גדילה, pH ו-4 אסטרים פורבולים 11-24. דווח כי TRPV4 מתווך מספר פונקציות פיזיולוגיות כמו תחושת כאב בדלקת ונוירופתיה18,22,23, התמיינות והגירה של מיופיברובלסטים 17,25,26 והתמיינות אוסטאוקלסטית בעצם27. מוטציות TRPV4 נקשרו למספר ערוצי 28-31. מחקרים אחרונים על ידי הקבוצה שלנו ואחרים הצביעו על תפקיד אפשרי של ערוץ זה באינספור מצבים פתולוגיים כמו פציעות ריאות22,32, היווצרות תאי קצף14,16, רקמה 17,33, תגובת גוף זר13 וסרטן34,35. בעבר, הוכח תפקיד מגן על העורקים של TRPV4, שבו הוכח כי תפקוד TRPV4 המושרה על ידי אגוניסט כימי בתאי אנדותל קשור להפעלה של eNOS ועיכוב היצמדות מונוציטים לתאי אנדותל36. לעומת זאת, חוסרים בתפקודים של TRPV4 נקשרו לתגובות אטרו-דלקתיות רבות כולל הפרעה בתפקוד האנדותל, הפחתת ייצור תאי קצף מקרופאגים ומחלות כלי דם14,16,37-39. המעבדה שלנו זיהתה לאחרונה תפקיד פרואטוגני של TRPV4 לפיו הוא מווסת את היווצרות תאי קצף מקרופאגים המושרים על ידי oxLDL. מבחינה מכאנית, הראינו ש-TRPV4 משפיע על הספיגה אך לא על הקישור של oxLDL במקרופאגים באופן בלתי תלוי בתקליטור36-14. במחקר אחר, דיווחנו על החמרה תלויה ב-TRPV4- של היווצרות תאי קצף המושרה על ידי oxLDL בנוכחות ליפופוליסכריד והגברת נוקשות המטריצה, ובכך סיפקנו קשר בין מכנו-סנסציה לסיכון לטרשת עורקים16. בהתחשב בכולם, ממצאים אלה מצביעים על TRPV4 כמטרה אטרקטיבית בטרשת עורקים ומחלות אחרות, ובכך מעודדים את הגילוי של מעכבי מולקולות קטנות של TRPV4 שניתן לתרגם לטיפולים יעילים קלינית. השימושים של תרכובות טבעיות בתרופות זכו לבולטות, בעיקר מונעים על ידי הצורך בתרכובות חסכוניות וביו-תאימות בהשוואה לתרופות הסינתטיות הקיימות כיום. תרכובות טבעיות כגוןפלבנואידים, אלקלואידים,פוליפנולים, וכורכומינואידים, משפיעים על מחלות לב וכלי דם באמצעות מנגנונים מגוונים כגון עיכוב שלמעודד דלקתאותות, רגישות לאינסולין ושיפור פרופילי שומנים בדם על ידי מיקוד למסלולי AMPK, COX1/2, eNOS ו- Nrf240-45. מחקרים אחרונים על ידי קבוצות מרובות זיהו שני פלבנואידים, ברברין ואפיג'נין, כמאפננים פוטנציאליים של פעילות TRPV446,47. פיתחנו והשתמשנו בשיטת סקר בתפוקה גבוהה למחצה כדי לזהות אנטגוניסטים פוטנציאליים של TRPV4 מספריית תרכובות טבעיות באמצעות בדיקת צלחות הדמיה פלואורומטרית (FLIPR) מבוססת Ca2 פלוס זרימה. כאן אנו מדווחים על הזיהוי והניתוח הפונקציונלי של Linkedin, פלבון, כמעכב חדש של תהליכים אתרוגניים התלויים ב-TRPV4-במקרופאגים, ובכך מניחים בסיס למחקרים נוספים של תרכובת טבעית זו כאנטי-טרשת עורקים טבעית. תרכובת מולקולה. דווח כי Linkedin מציג הגנה עצבית,אנטי מסרטן, ואנטי דלקתיתפקידים48,49. אנו מדווחים על מנגנון הפעולה של Linkedin נגד TRPV4 במסגרת היווצרות תאי קצף מקרופאגים באמצעות מבחני ביוכימיים ותאיים רבים.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

חומרים ושיטות תרבית בעלי חיים ותאים

רכשנו עכברים מסוג פרא C57BL/6 (WT) מבני צ'ארלס ריבר מעבדות (ווילמינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב). הנחיות הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מרילנד ננקטו עבור כל הניסויים בבעלי חיים והכותבים עמדו בהנחיות ARRIVE. לבידוד של מקרופאגים תושב עכברים (MRM) המושרה על ידי thioglycolate, שטיפת צפק נאספה לאחר 4 ימים של הזרקת thioglycolate תוך צפקית, והתאים נשמרו ב-10 אחוזים בסרום בקר עוברי (FBS) המכיל DMEM7,14,16. קו תאים מקרופאגים של עכברים (RAW264.7), ופיברובלסטים עוריים אנושיים (HDF) נרכשו מ-ATCC (מנאסס, וירג'יניה), ותורבבו, בהתאמה, עם DMEM או MEM (Gibco, Waltham, MA). מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDMs) נקצרו מעכברים בני 6- עד 7-שבוע, כפי שתואר קודם לכן14,50,51. בקצרה, עצם הירך מעכברי WT ו-TRPV4 KO נאספו, ומח עצם של עצם הירך נשטף החוצה עם מדיית DMEM מלאה עם 10 אחוז FBS. תאי מח העצם התלויים סוננו דרך מסננת בגודל 70 מיקרומטר (BD bioscience), עברו צנטריפוגה ונשמרו במדיום DMEM בתוספת M-CSF (25 ng/mL) במשך 7-8 ימים ב-37 מעלות כדי לאפשר התמיינות למקרופאגים.

ריאגנטים

Linkedin ו-GSK1016790A (GSK101) נרכשו מ-Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), וערכת הבדיקה FLIPR Calcium 6 התקבלה מ-Molecular Device (Sunnyvale, CA). LDL יליד אנושי (VLDL) נרכש מ-Stemcell Technologies (Vancouver, קנדה). הדגמנו LDL עם 5 מיקרומטר CuSO4 למשך 12 שעות ב-37 מעלות כדי להכין LDL מחומצן נחושת (oxLDL) 7,14,16. צבע ניאון מסומן, DiI-oxLDL, נרכש מ-Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה), ומ-MCSF ממחקר ופיתוח (מיניאפוליס, מ.נ.). נוגדנים לניתוח FACS היו: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 ו- TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). נוגדנים משניים מצומדים ל-PE היו ממחקר ופיתוח (Minneapolis, MN), ובקרות איזוטיפ מצומדות ל-PE היו מ-BD (פרנקלין לייק, ניו ג'רזי). לתגובת שרשרת פולימראז כמותית (qRT-PCR), השתמשנו בערכת RNeasy מ-QIAGEN (Redwood City, CA). כל הפריימרים נרכשו מ-Bio-Rad (Hercules, CA). מדיה לתרבית תאים, מוצרים הקשורים לתרבית תאים וריאגנטים מסוג Western blot התקבלו מ-Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).

Cistanche נגד עייפות

הקרנה חצי תפוקה גבוהה

ביצענו בדיקה בתפוקה גבוהה למחצה עבור אנטגוניסטים של Trpv4 מספרייה של 2000 תרכובות טבעיות (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) באמצעות מבחן זרימת סידן המבוסס על קורא לוחות הדמיה פלואורומטרי (FLIPR)14,17. זיהינו את הגינגטין (GGT), כאנטגוניסט חדש ל-TRPV4. הסקר הראשוני והמשני בוצע עם RAW264.7, HDF ו-BMDMs כדי להעריך את יכולתם של Linkedin ומועמדים אחרים לעכב TRPV{10}}עורר Ca2 פלוס infux14,17. כבקרות, השתמשנו ב-A23187, יונופור סידן, TRPV4 null BMDMs ו-GSK219, אנטגוניסט סלקטיבי של TRPV417. לאחר ההקרנה המשנית, זיהינו שש תרכובות המציגות יותר מפי שלושה עיכוב של זרימת Ca2 פלוס מתווך TRPV4- בהשוואה לבקרת כלי רכב. Linkedin זוהה כמעכב החזק ביותר של פעילות TRPV4. BMDMs (5×104 תאים/באר) נזרעו לצלחות שחורות תחתונות שקופות היטב (10 מיקרוגרם/מ"ל) מצופות קולגן (10 מיקרוגרם/מ"ל) והודגרו ב-37 מעלות, 5 אחוז CO2. ביום הניסוי, התאים הוטענו בצבע סידן 6 ב-HBSS, 20 מ"מ HEPES, 2.5 מ"מ פרובנציד והודגרו במשך 45 דקות ב-37 מעלות. לאחר הדגירה, תרכובות ספרייה נוספו לכל באר עד לריכוז סופי של 2 מיקרומטר. הצלחות הודגרו למשך 45 דקות נוספות ב-37 מעלות. זרימת Ca2 פלוס נגרמה על ידי הוספת 10 ננומטר של TRPV4 אגוניסט GSK1016790A בתאים שטופלו מראש ברכב או בתרכובת ונרשמה על ידי מדידת ΔF/F (Max-Min), כפי שתואר בעבר17. הנתונים מוצגים כיחידות פלואורסצנטי יחסי (RFU).

אימונובלוטים

מקרופאגים פריטוניאליים מעוררי תיוגליקולט נזרעו ב-10 אחוז FBS המכיל DMEM והודגרו למשך הלילה. תאים לא נדבקים נשטפו, ו-1% אלבומין בסרום בקר (BSA) המכיל DMEM הוסיפו לצלחת והודגרו במשך 3 שעות לפני טיפול Linkedin. כדי לקבוע את הביטוי של חלבוני CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 ו-GAPDH הוכנו ליזטים של תאים שלמים מתאי שטופלו לילה עם Linkedin (1 ו-5 μM) או כלי נוכחות או היעדר oxLDL (25 μg/ml) ). כדי לקבוע את רמות הביטוי של p-JNK ו-JNK המופעלים על ידי LPS, תאים טופלו מראש עם Linkedin (5 ו-10 מיקרומטר) למשך 3 שעות ולאחר מכן גירוי עם E. coli LPS למשך 30 דקות. ליזטים של תאים שלמים הוכנו מתאי שטיפה פעמיים (PBS קר כקרח) באמצעות חיץ RIPA עם תוספת קוקטייל מעכבי פרוטאז (Thermo Scientific, MA). כתמים נבדקו עם ארנב אנטי-TRPV4 (מעבדת Alomone, ירושלים, ישראל), נגד עכבר CD36 (מו"פ, מיניאפוליס, MN), ארנב אנטי-TLR4, ארנב אנטי-TLR6, ארנב נגד JNK ואנטי-p- ארנבת. נוגדנים ראשוניים של JNK (Cell Signaling, Danvers, MA) ואחריהם נוגדנים משניים מצומדים נגד ארנב ואנטי-עכבר (מו"פ, מיניאפוליס, MN). כתמים הופשטו ונבדקו מחדש עם IgG אנטי-GAPDH (1:2000; סנטה קרוז, דאלאס, טקסס) לצורך בקרת טעינה.

היווצרות תאי קצף.MRM שהופעל על ידי Thioglycolate הוזרעו על גבי כיסויי זכוכית בצלחת 12 בארים עם DMEM, 10 אחוז FBS והודגרו ב-37 מעלות, 5 אחוז CO2 למשך שעתיים. GGT (1 או 10 מיקרומטר) נוספה לתאים, ולאחר 3 שעות של דגירה, נוספה oxLDL (50 מיקרוגרם/מ"ל), והתרבויות הודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות. LDL מקורי (50 ug/ml) נוספה לבארות קבוצת הביקורת והודגרה למשך הלילה. תאים נקבעו ב-4 אחוז פרפורמלדהיד ואחריו צביעה Oil Red O כדי לכמת יצירת תאי קצף.

התמרה וקטורית של אדנוווירוס.אספנו מבני Adenovirus כדי לבטא AD(RGD)-עכבר TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml), ו-Adenovirus ריק וקטור, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), מ Vector Biolabs, Malvern, PA. השתמשנו ב-1×108 pfu/ml עבור כל הניסויים. למחקרי יצירת תאי קצף, מקרופאגים צפקיים של עכברים הודגרו עם Ade-TRPV4 או Ade-Vec במדיה DMEM למשך 72 שעות לפני הוספת oxLDL ליצירת תאי קצף מקרופאגים.

קשירה וקליטה של ​​ox-LDL.כדי להעריך את הקישור, מקרופאגים פריטוניאליים טופלו בשתי מנות (1 או 10 מיקרומטר) של Linkedin או כלי רכב למשך 3 שעות והודגרו עם DiI-oxLDL ב-4 מעלות למשך שעה אחת. לאחר טיפול מקדים עם Linkedin או כלי רכב, התאים הודגרו עם DiI-oxLDL ב-37 מעלות למשך 30 דקות כדי להעריך את הספיגה. התמונות נלכדו במיקרוסקופ פלואורסצנטי (63x), ותמונה J שימשה לכימות תוצאות.

ניתוח ציטומטריית זרימה.מקרופאגים פריטוניאליים מעוררי תיוגליקולט תורבו ב-DMEM, 10 אחוז FBS למשך 24 שעות. תאים לא נדבקים נשטפו, הוסף מדיום נטול סרום, והתאים הודגרו במשך שעתיים ולאחר מכן הוספת 5 מיקרומטר GGT או כלי רכב, והדגירה נמשכה במשך 3 שעות. תאים שטופלו נגרדו מהצלחת והורחבו מחדש ב-PBS, 2 אחוז BSA. תאים הודגרו עם נוגדנים ראשוניים למשך 45 דקות ולאחר מכן דגירה של 30 דקות עם נוגדן משני מצומד PE. ציטומטר זרימה FACSCantoII (BD Bioscience, אונטריו, קנדה) שימש לרכישת נתונים. כל הנתונים עובדו באמצעות תוכנת FlowJo.

qRT-PCR.מקרופאגים המושרים על ידי Thioglycolate טופלו ב-5 µM Linkedin או כלי רכב למשך 3 שעות; 25 מיקרוגרם/מ"ל של oxLDL נוספו לרכב או לתאים שטופלו בלינקדין, והדגירה נמשכה למשך הלילה. RNeasy Micro Kit (#74,004) מ-QIAGEN שימשה לחילוץ RNA כולל, וערכת יוניברסל SYBR Green One-Step מבית Bio-Rad שימשה לתמלול לאחור של ה-RNA. נעשה שימוש ב-C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) לרכישת נתונים. ביטוי של גן נקבע ככמות ה-mRNA הספציפי לגן ביחס ל-GAPDH mRNA בשיטת ה-CT ההשוואתית המתוארת בעלון המשתמש של מערכת Bio-Rad qRT-PCR.

ניתוח סטטיסטי.הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM של טריפליקות ביולוגיות. נעשה שימוש בתוכנת GraphPad Prism 7.0, וחישובים בוצעו באמצעות מבחן t של Student עבור שתי קבוצות או ANOVA חד כיווני עבור מספר קבוצות.

אישור אתי.כל הניסויים בעכברים נערכו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ואושרו על ידי ועדת סקירת הפארק של אוניברסיטת מרילנד-קולג'.

תוצאות in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>מְשּוּלָשׁ; ע<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

איור 1. זיהוי חצי-תפוקה גבוהה המבוסס על זיהוי של Linkedin כמעכב TRPV4 חדש מספרייה של תרכובות טבעיות. (א) תרשים זרימה המציג את זרימת העבודה שהביאה לזיהוי של גינגטין כמעכב TRPV4 פוטנציאלי מספרייה של 2000 תרכובות טבעיות. (ב) נציג FlexStation 3 הקלטה המראה את ההשפעה המעכבת של 6 תרכובות טבעיות על TRPV4 אגוניסט (GSK1016790A)-Ca2 המושרה בתוספת זרם BMDMs טעון סידן 6 צבע במהלך הקרנה משנית. טיפול מקדים עם כל 6 התרכובות הראה השפעות מעכבות על זרימת CA2 התלויה ב-TRPV4- בהשוואה לתאים שטופלו מראש עם כלי רכב (בקרה שלילית; רכב פלוס GSK1016790A (10 ננומטר)) או יונופור סידן (A23187, 2 מיקרומטר). השתמשנו באנטגוניסט TRPV4 סלקטיבי, GSK2193874 (10 ננומטר), כביקורת שלילית. כל הניסויים חזרו על עצמם שלוש פעמים בריבוע. RFU: יחידת הקרינה היחסית.

עיכוב TRPV4 על ידי GGT מבטל את היווצרות תאי קצף מקרופאגים המושרים על ידי oxLDL.מחקרים קודמים שלנו הראו ש-TRPV4-עורר זרימת Ca2 פלוס מעורב ביצירת תאי קצף בתיווך oxLDL 14,16. לכן, הערכנו את האפשרות שיצירת תאי קצף מעוכבת על ידי אנטגוניזציה בתיווך GGT של פעילות TRPV4. מקרופאגים פריטוניאליים של עכברים מסוג פראי הודגרו עם oxLDL כדי לגרום להיווצרות תאי קצף בנוכחות או בהיעדר GGT, ונותחו על ידי צביעת Oil Red O. כצפוי, מצאנו שיצירת תאי קצף גדלה פי חמישה במקרופאגים שטופלו ב-oxLDL בהשוואה ל-LDL מקורי (איור 2A, B). עם זאת, טיפול במקרופאגים עם GGT (1 או 10 מיקרומטר) לפני גירוי עם oxLDL הפחית משמעותית את אחוז תאי הקצף (איור 2A, B). ביחד, ממצאים אלה מצביעים על השפעה מעכבת של GGT על היווצרות תאי קצף מקרופאגים, שעשויה להתמקד ב-TRPV{12}} שעורר Ca2 פלוס זרימה. יתר על כן, הבענו יתר על המידה TRPV4 במקרופאגים אפסים של TRPV4 על ידי שימוש במבנה אדנוווירוס ולאחר מכן גררנו היווצרות תאי קצף באמצעות oxLDL בנוכחות GGT. מצאנו שביטוי יתר של TRPV4 הגביר את היווצרות תאי הקצף שנחסמה כאשר טיפלנו מראש בתא ב-GGT, מה שמצביע על כך שעיכוב היווצרות תאי הקצף הפרואטרוגניים על ידי GGT תלוי ב-TRPV4 (איור 2C, D).

GGT אינו חוסם את רמת הביטוי הבסיסית של TRPV4 ורצפטורים דלקתיים.קולטן לנקות CD36 ממלא תפקיד מרכזי בקליטה ובקישור של oxLDL, ויצירת תאי קצף, תהליכים קריטיים בטרשת עורקים4-7,54,55. לאחרונה, גוף הולך וגדל של עדויות מצביע על מעורבותם של קולטנים דמויי אגרה בטרשת עורקים2,4,56. כדי לחקור אם GGT חסם יצירת תאי קצף באמצעות השפעה על הביטוי של CD36, TLR4, TLR6 ו-TRPV4, ביצענו ניתוח אימונובלוט בשני ריכוזים של GGT (1 או 5 מיקרומטר). מצאנו רמות ביטוי דומות של CD36, TRPV4, TLR6 ו-TLR4 בהשוואה לבקרה הלא מטופלת (איור 3A-D). ניתוח ציטומטרי זרימה גם לא גילה הבדל משמעותי בביטוי פני התא של החלבונים עם או בלי טיפול GGT (איור 3E-H, I-L). בהתחשב בכולן, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-GGT חוסם יצירת תאי קצף מקרופאגים מבלי לעכב את הרמות הבסיסיות של ביטוי פני השטח של TRPV4, CD36, TLR4 ו-TLR6.

איור 2. עיכוב של TRPV4 על ידי Linkedin מבטל את היווצרות תאי קצף מקרופאגים המושרה על ידי oxLDL. (א) מקרופאגים צפקיים עכברים המושרים על ידי Thioglycolate טופלו במשך הלילה עם 50 מיקרוגרם/מ"ל oxLDL, ואחריו דגירה מוקדמת של 3 שעות עם כלי רכב או 1 או 10 מיקרומטר Linkedin. תאים טופלו עם 50 מיקרוגרם/מ"ל LDL טבעי (VLDL) כביקורת. הגדלה מקורית: פי 40. (ב) כימות התוצאות מוצג ב-(א). n=500 תאים/מצב. מבחן t של תלמיד; ***עמ'<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

ספיגת oxLDL, אך לא מחייב על ידי מקרופאגים מדוכא על ידי GGT. מכיוון ש-TRPV4 הוכח בעבר כבעל תפקיד בספיגת oxLDL ויצירת תאי קצף14,16, הערכנו האם טיפול ב-GGT גרם לפגיעה בקשירה של oxLDL על פני המקרופאגים. מקרופאגים צפקיים WT טופלו עם GGT לפני הדגירה עם DiI-oxLDL ב-4 מעלות, והקישור הוערך. התוצאות מצביעות על כך שהקישור של oxLDL על פני המקרופאג'ים לא נפגע באופן משמעותי על ידי טיפול GGT (1 או 10 מיקרומטר) בהשוואה לבקרת כלי הרכב (איור 5A-C). לאחר שקבענו ש-GGT אינו מעכב את הקישור של oxLDL, ביקשנו בשלב הבא לקבוע אם ספיגת oxLDL במקרופאגים נפגעה בטיפול ב-GGT. מעניין לציין שהתוצאות שלנו הצביעו על עיכוב משמעותי בספיגת oxLDL במקרופאגים בתאים שטופלו מראש ב-GGT בהשוואה לקבוצה שטופלה ברכב (איור 6A, B). בהתחשב בכל יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-GGT חוסם את הספיגה של oxLDL, אך לא מחייב, במקרופאגים.

GGT חוסם ביטוי המושרה על ידי oxLDL של TRPV4 במקרופאגים.

מכיוון שהמחקרים שפורסמו בעבר הראו ש-TRPV4-עורר Ca2 פלוס ממלא תפקיד ביצירת תאי קצף מקרופאגים בתיווך oxLDL14,16, ביקשנו לקבוע אם GGT חסם את היווצרות תאי קצף באמצעות דיכוי של ביטוי המושרה על ידי oxLDL של CD36, TLR2, TLR4, TLR6 או TRPV4. מצאנו שגירוי בן לילה של מקרופאגים עם oxLDL הביא לוויסות עלייה משמעותי של הביטוי של חלבוני TRPV4 בהשוואה ל-LDL, בעוד שביטוי של קולטנים אחרים (CD36, TLR2, TLR4 ו-TLR6) נותר ללא שינוי (איורים 4A-F). טיפול מקדים של תאים עם GGT לפני גירוי עם oxLDL הוריד באופן סלקטיבי את רמת הביטוי של חלבוני TRPV4 בהשוואה לטיפול בכלי הרכב (איור 4A-F). ביחד, ממצאים אלה מצביעים על השפעה מעכבת של GGT על ביטוי חלבון TRPV4, אשר עשוי להיות מעורב בחלקו בדיכוי היווצרות תאי קצף על ידי GGT.

איור 3. טיפול ב-Linkedin אינו משנה את סך החלבון או ביטוי פני השטח של TRPV4, CD36 ו-TLRs במקרופאגים. (א-ד) אימונובלוטים של ליזטים של תאים שלמים מקרופאגים לאחר טיפול בן לילה עם 1 או 5 מיקרומטר Linkedin או כלי רכב. אימונובלוטים מייצגים מראים ביטוי חלבון כולל של CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) ו-TLR4 (D) בתאים שטופלו בלינקדין ובתאים שלא טופלו. בוצעו שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים ו-3 חזרות ניסיוניות עבור כל סט של ניסויים. (E-H) ניתוח ציטומטרי זרימה של מקרופאגים שטופלו בן לילה עם 5 מיקרומטר Linkedin או לא מטופל המראה ביטוי פני השטח של TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) ו-TLR6 (G) בתאים לא מטופלים ומטופלים בלינקדין. נותחו שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים ו-30,000 תאים לכל מצב. (I–L) ניתוח כמותי של תוצאות מ-(E–H). נותח על ידי מבחן t דו-זנב עם רווח בר-סמך של 99 אחוז. תאים שנספרו לכל ניסוי, 30,000; שתי חזרות ניסיוניות.

GGT חוסם הפעלה פרואטרוגנית של JNK2 ודלקת במקרופאגים. דיווחים שפורסמו מהמעבדה שלנו ואחרים הראו שהפעלה של JNK2 ממלאת תפקיד קריטי ביצירת תאי קצף וטרשת עורקים7,57. כדי לקבוע אם GGT יכול לעכב את ההפעלה של JNK1/2, מקרופאגים טופלו עם GGT ואחריו גירוי עם LPS או oxLDL. תוצאות מניתוח אימונובלוט הראו שטיפול ב-GGT דיכא באופן משמעותי זרחון המושרה על ידי oxLDL או LPS של JNK1/2 בהשוואה לביקורת הבלתי מטופלת או המקומית שטופלה ב-LDL (איור 7A-D). הוכח שהפעלת JNK במקרופאגים גורמת לשעתוק של מתווכים פרו-דלקתיים הקשורים לטרשת עורקים58-60. כדי לקבוע אם GGT יכול לחסום את הביטוי של מווסתים פרו-דלקתיים אלה במקרופאגים, תאים שטופלו מראש ב-GGT עוררו עם oxLDL, ורמות ביטוי mRNA של TNF, IL 6, IL12, IL1 ו-MCP1 כומתו על ידי ניתוח qRT-PCR. זיהינו ירידה משמעותית ברמות הביטוי המושרה על ידי oxLDL של TNF, IL12, IL1 ו-MCP1 mRNA בתאים שטופלו ב-GGT בהשוואה לבקרות שטופלו ברכב (איור 7E-I). יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-GGT חוסמת הפעלה פרואטרוגנית של JNK2 וביטוי גנים דלקתיים בתגובה לגירוי oxLDL במקרופאגים. דיון ידוע כי תרכובות טבעיות כגון פלבנואידים ופוליפנולים מווסתות תגובות קרדיווסקולריות באמצעות מנגנונים מגוונים, כגון עיכוב של אותות פרו-דלקתיים, רגישות לאינסולין, מצב חמצוני ושיפור רמות שומנים בדם40-45. כאן אנו מדווחים על הזיהוי המבוסס על תפוקה גבוהה למחצה ועל אפיון תפקודי של Linkedin, פלבון, כמעכב חדש של תהליכים גנטיים/דלקתיים תלויי TRPV4-במקרופאגים. הראינו באופן ספציפי ש-i) גינקטין חוסם TRPV4-תיווך זרימה של Ca2 בתוספת למקרופאגים, ii) חסימת גינקטין של תפקוד TRPV4 הפחיתה באופן ניכר את היווצרות תאי קצף המושרה על ידי oxLDL על ידי דיכוי הספיגה של oxLDL במקרופאגים, ו-iii) בלוקים של גינקטין זרחון המושרה על ידי LPS ו- oxLDL של JNK1/2, ביטוי של חלבוני TRPV4 וביטוי גנים דלקתי. במצטבר, תוצאות המחקר שלנו הראו שגינקטין מעכב תפקוד פרואטרוגני/דלקתי של מקרופאגים באופן תלוי TRPV. טרשת עורקים, מחלה של אבי העורקים, מונעת בתחילה על ידי דלקת והצטברות של מקרופאגים עם oxLDL, מה שגורם להיווצרות תאי קצף מקרופאגים, אשר מתקדמים לאחר מכן ליצירת atheroma2-10. מאחר ויצירת תאי קצף היא תהליך קריטי באטרוגנזה, הבנה ותפעול של יצירת תאי קצף יכולים להיות בעלי פוטנציאל טיפולי. ידוע כי מקרופאגים מבטאים מערך של תעלות ומשאבות יונים חודרות ממברנות, כולל TRPV4, תעלת יונים רגישות למכאנו-רגישות של Ca2 בתוספת תעלת יונים חדירה, המופעלת על ידי גירויים פיזיים וביוכימיים כאחד. מחקרים שפורסמו על ידי המעבדה שלנו ואחרים זיהו את התפקיד של TRPV4 בדלקת מקרופאגים ויצירת תאי קצף המושרה על ידי oxLDL14-16,26. TRPV4 יכול אפוא לשמש כיעד בר-קיימא להפחתת תהליכים פרואטרוגניים.

איור 5. Linkedin אינו מדכא את קישור DiI-oxLDL למקרופאגים. מקרופאגים טופלו מראש עם כלי רכב או Linkedin (1 או 10 מיקרומטר) למשך 3 שעות ולאחר מכן דגירה עם oxLDL המסומן DiI (2.5 מיקרוגרם/מ"ל) למשך שעה אחת ב-4 מעלות. (א) תמונות מיקרוסקופיות מייצגות קרינה (הגדלה מקורית, 63×) של DiI-oxLDL מחייב על פני ממברנת המקרופאג (n=20 תאים/מצב). (ב) תוצאות מניסוי א' מוצגות כפרופל עלילה באמצעות תוכנת NIH ImageJ. (ג) ניתוח כמותי של תוצאות מ-A. n=20 תאים/מצב. בשיפור טרשת עורקים על ידי הפחתת MMP-2 ו-MMP-9 והעלאת רמות NO ו-NOS באבי העורקים החזה של rat52. במחקר הנוכחי, הראינו שגינקגטין חוסם TRPV4- העלה זרימה של Ca2 פלוס במקרופאגים. מבחינה מכאנית, הראינו שגינקטין חוסם את הספיגה של oxLDL, אך אינו מחייב, במקרופאגים. מחקרים שנעשו in vivo ו-in vitro הציעו תפקיד קריטי של CD36 כקולטן השואב העיקרי בספיגת oxLDL ויצירת תאי קצף מקרופאגים2-7. הוכח כי עכברי CD36 null שחסרים ApoE או LDLR נוטים פחות לפתח נגעים טרשתיים5,6. מחקרים קודמים של הקבוצה שלנו זיהו תפקיד חיוני של מפל האיתות CD36-JNK ביצירת תאי קצף מקרופאגים7. קולטנים דמויי אגרה TLR2, TLR4 ו-TLR6 פועלים כקולטנים על ידי אינטראקציה עם CD36 והוכחו כמעורבים באתרוגזה2,56,63. בדקנו את האפשרות שחוסר היווצרות תאי קצף שנראה במקרופאגים שטופלו בלינקדין נובע מירידה בביטוי של חלבוני CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 או TLR6. מעניין לציין שטיפול Linkedin לא הפחית באופן משמעותי את הביטוי של חלבוני CD36, TLR2, TLR4 או TLR6 ברמות בסיסיות או בתנאים מגורים oxLDL. עם זאת, Linkedin חסם באופן ספציפי את הרגולציה המושרה על ידי oxLDL של הביטוי של חלבוני TRPV4, בעוד שהביטוי שלו ברמות הבסיסיות נשאר ללא שינוי. בהתחשב בכולן, תוצאות אלו מצביעות על כך שגינקטין חוסם יצירת תאי קצף המושרה על ידי oxLDL באמצעות מנגנון שאינו תלוי בביטוי CD36 ו-TLR, אך תלוי ב-TRPV4. מחקרים קודמים של הקבוצה שלנו ואחרים הראו שהפעלת JNK2 מעורבת ביצירת תאי קצף והתפתחות נגעים טרשתיים7,57. כמו כן, דווח ש-JNK מעורב באפנון של MMP-9 ו-MMP-13, אשר מתבטאים יתר על המידה בנגעים טרשתיים64–68. בהתחשב בקשר המוכר של JNK בתהליכים אתרוגניים, רצינו לקבוע אם גינקטין יכול לעכב את ההפעלה של JNK. בהתאם לדיווחים קודמים, התוצאות שלנו הראו גם שגינגטין חוסם זרחון הנגרמת על ידי גירוי דלקתי של JNK2 במקרופאגים. תוצאה זו מציעה מנגנון אפשרי שבאמצעותו Linkedin חוסם היווצרות תאי קצף. יתרה מזאת, מצאנו ירידה משמעותית בביטוי המושרה על ידי oxLDL של mRNA TNF, IL12, IL1 ו-MCP1 בתאים שטופלו בגינגטין בהשוואה לבקרת כלי הרכב, תוך הדגשת תפקידים אנטי דלקתיים פוטנציאליים של גינגטין בתגובה ל-oxLDL. לסיכום, התוצאות שלנו הראו שגינגטין מעכב תפקוד פרואטרוגני ודלקתי של מקרופאגים באופן תלוי TRPV. ממצאים אלה מחזקים אפוא את הרציונל לשימוש בתרכובות טבעיות בפיתוח תרופות פוטנציאליות ו/או ריאגנטים כימו-מונעים.

הפניות
1. Barquera, S. et al. סקירה גלובלית של האפידמיולוגיה של מחלת לב וכלי דם טרשת עורקים. קֶשֶׁת. Med. מילון 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Te ביולוגיה תאית של מקרופאגים בטרשת עורקים. תא 145, 341–355 (2011).
3. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. טבע 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP ציטוקינים, מטבוליזם של שומנים מקרופאגים ותאי קצף: השלכות על טיפול במחלות לב וכלי דם. פרוג. Lipid Res. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. et al. שיבוש ממוקד של הקולטן לסורר Class B CD36 מגן מפני התפתחות נגעים טרשתיים בעכברים. ג'יי קלין. להשקיע. 105, 1049–1056 (2000).
6. Kunjathoor, V. V. et al. Scavenger receptors class A-I/II and CD36 are the principal receptors responsible for the uptake of modifed low-density lipoprotein leading to lipid loading in macrophages. J. Biol. Chem. 277, 49982–49988 (2002).
7. Rahaman, SO et al. מפל איתות תלוי 36-תקליטור נחוץ ליצירת תאי קצף מקרופאגים. Cell Metab. 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Atherosclerosis-מחלה דלקתית. N Engl J Med. 340(2), 115–126 (1999).
9. Libby P. Te מנגנונים מולקולריים של סיבוכים פקקת של טרשת עורקים. ג'יי מתמחה. Med. 517–527, 2008.
10. לוסיס, AJ טרשת עורקים. טבע 407, 233–241 (2000).
11. Matthews, BD et al. הפעלה מהירה במיוחד של תעלות יונים TRPV4 על ידי כוחות מכניים המופעלים על פני התא בטא 1 אינטגרינים. מספר שלם. ביול. (קאמב). 2(9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-TAZ ציר איתות מכנוטרנסדוקציה במעבר אפיתל-מזנכימי המושרה על ידי קשיחות מטריצה ​​ו-TGF 1-. Cell Mol. Bioeng.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO נדרש פוטנציאל קולטן חולף ונילואיד 4 לתגובת גוף זר ויצירת תאים ענקיים. אמ. ג'יי פאתול. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. תעלה חדירת סידן TRPV4 היא מווסת חדש של היווצרות תאי קצף מקרופאגים מחומצנים של LDL. רדיק חופשי. ביול. Med. 110, 142–150 (2017).