תַקצִיר

העניין של הצרכנים במוצרי תעשיית הקוסמטיקה עם השפעות הבהרת העור הגביר את הביקוש לתכשירים המפחיתים מלנוגנזה. מספר תרופות אנטי-מלנוגניות ידועות בתופעות הלוואי שלהן, כגון דרמטיטיס מגע ורעילות גבוהה, וחדירה לקויה לעור. מחקר ניכר לאחרונה התמקד במוצרים שמקורם בצמחים כחלופות לתרופות כימותרפיות עם פחות השלכות לוואי.

במחקר המיידי, בחנו את הפעולה האנטי-מלנוגנית של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) המופקות מהעלווה והגבעולים של Dendropanax פתוגני. בעבודה עם שיטות ספקטרופוטומטריות וביוכימיות, מצאנו כי שלפוחיות חוץ-תאיות (LEVs) ושלפוחיות חוץ-תאיות (SEVs) שמקורן עלים הפחיתו את תכולת המלנין ואת פעילות טירוזינאז (TYR) באופן תלוי ריכוז בקו תאי מלנומה של עכבר B16BL6. ניתוח מיקרוסקופי אלקטרוני הראה עוד כי LEVs ו-SEVs גרמו לירידה תלוית ריכוז בתכולת המלנין בתאי מלנומה. בהשוואה לארבוטין כביקורת חיובית, LEVs ו-SEVs הראו אפקט הלבנה חזק יותר על תאי מלנומה, והשפעת ההלבנה של LEVs הייתה חזקה יותר. יש לציין, לא LEVs ולא SEVs גרמו לציטוטוקסיות משמעותית. כמו כן, בדקנו את ההשפעות של EVs שמקורם בצמחים על הביטוי של חלבונים הקשורים ל-tyrosinase (TRPs) בתאי מלנומה. LEVs עיכבו את הביטוי של גנים וחלבונים הקשורים למלנוגנזה, כולל גורם שעתוק הקשור למיקרופתלמיה (MITF), TYR, TRP-1 ו-TRP-2. במודל אפידרמיס אנושי, LEVs עיכבו את המלנוגנזה בצורה חזקה יותר מאשר ארבוטין. יחד, הנתונים שלנו מצביעים על כך ש-lev מ-D. pathogens עשוי להיות חומר טבעי מועמד חדש לשימוש כסוכן אנטי-מלנוגני בתכשירים פרמצבטיים.

מילות מפתח:EVs שמקורם בצמח; LEVs וSEVs; אנטי מלנוגני; TYRפעילות; תכולת מלנין ויתרונות תמצית Cistanche

לחץ כאן כדי לקבלהיתרונות של Cistanche להלבנת עורוההשפעות של תמצית Cistanche

מבוא

המלנין, חלק קריטי ממערכת הפיגמנטציה של השיער, העיניים והעור של האדם, מיוצר על ידי מלנוציטים באמצעות הליך הנקרא מלנוגנזה. הצטברות חריגה של מלנין עלולה לגרום להפרעות עור כגון נמשים, נמשי שמש ומלזמה, ועלולה גם לגרום לסרטן ווויטיליגו. הסדרת המלנוגנזה היא אסטרטגיה חיונית בטיפול בהפרעות היפרפיגמנטיות. לדוגמה, הידרוקינון, תרכובת הידרוקסיפניל המפריעה לפעילות TYR, משמש כחומר להלבנת עור בתעשיית הקוסמטיקה. עם זאת, הידרוקינון עלול לגרום לתופעות לוואי כגון דרמטיטיס מגע ומחלת השחמה אקסוגנית. Va-acid הוא חומר סינתטי נוסף המעכב את פעילות ה-TYR, אך השימוש בו קשור בתדירות גבוהה של בצקות או גירוי.

קיים עניין גובר בזיהוי תרופות חלופיות ממקורות טבעיים נגד מלנוגנזה, בהתחשב במגבלות של תרכובות כימיות קיימות, המשקף את העובדה שמוצרים קוסמטיים העשויים מצמחים ועשבי תיבול נוטים להיות מתונים יותר, מתכלים יותר, ולהפגין רעילות נמוכה יותר מאשר סינתטיים. תרכובות. תמציות עלים של מחלת דנדרוביום הוכחו כמעכבות את ייצור המלנין על ידי אינטראקציה ישירה עם הפעלת TYR תוך תאית וביטוי של אנזימים המעורבים בביוסינתזה של מלנין. באופן דומה, תמצית עלי Croton officinalis דיכאה את תכולת המלנין ואת פעילות ה-TYR הסלולרית על ידי עיכוב גורם שעתוק הקשור למלנוגנזה (MITF) ואנזימים מלנוגניים. בנוסף, לעלי התות הייתה השפעה מעכבת על פעילות TYR ויצירת מלנין בתאי מלן-A. חומצה P-קומרית מעלי ג'ינסנג זוהתה כמעכבת TYR העיקרית.

הרבה סיסטאנצ'ה

למרות העובדה שנעשה שימוש במגוון רחב של תרכובות בוטניות בתכשירים קוסמטיים רפואיים, המסיסות הנמוכה שלהן, זיקת היעד הנמוכה ופעולת הבהרת העור המתונה הפריעו להתקדמות בשיפור ההשפעות הטיפוליות של הקוסמטיקה הבוטנית. זה הניע את החיפוש אחר טכניקות חדשות ומתקדמות כדי לשפר את היעילות של תרכובות רפואיות וביו-אקטיביות ולשפר את יעילות המסירה שלהן לעור. לדוגמא, פותחו בהצלחה מספר טכנולוגיות ננו-מסירה, כולל ננו-מקסים לטיפול יעיל בעור, ננו-קוורצטין לעיכוב נזקי תאים הנגרמים מקרינה אולטרה סגולה (UV), ננו-פולרנים להתחדשות קולגן ומניעת הזדקנות העור , ננו-לוטאולין לשמירה על פעילות נוגדת חמצון וננו-רזברטרול להגנה על העור מקרינת UV.

במחקר הנוכחי, אנו מתרכזים בתפקיד שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בצמח. מחקרים עדכניים הראו שלמכוניות חשמליות שמקורן בצמחים יש מבנה דומה לזה של אקסוזומים מבודדים של יונקים והם פועלים כשליחים חוץ-תאיים המתווכים תקשורת בין-תאית. בנוסף, שלפוחיות אלו מסוגלות להעביר mRNA, מיקרו-RNA (miRNA), שומנים ביו-אקטיביים וחלבונים לתאי בעלי חיים.

בינתיים, חקרנו את ההשפעה המעכבת של EVs שמקורם מעלים וגבעולים של קטניות חולות על מלנוגנזה. אפיינו את הגודל והמאפיינים של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן עלים (LEVs) ושלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בגזע (SEVs) המופקים מעלים וגבעולים של קטניות חולות והראינו כי EVs אלו נקלטו בקלות על ידי תאי מלנומה ואינם ציטוטוקסיים. כדי להדגים את ההשפעות האנטי-מלנוגניות של רכבי LEV ורכבי שטח, בדקנו את תכולת המלנין ואת פעילות ה-TYR בתאי מלנומה. עוד הערכנו את ההשפעה של EVs על התהליך המורכב של סינתזת מלנין על ידי ניטור שינויים ברמות של חלבונים ואנזימים שונים.

הורמון מייצב אלפא-מלנוציטים (-MSH) נקשר לקולטן מלנוקורטין 1 (MC1R) על פני התא ומפעיל ציקלאז אדנילאט, מה שמוביל לעלייה ברמות התוך-תאיות של אדנוזין מונופוספט מחזורי (cAMP). cAMP מתווך באמצעות חלבון קינאז A תלוי-cAMP, מה שמוביל לזרחון של חלבון קשירת אלמנט cAMP (CREB). CREB מופעל משרה MITF, המתבטא במלנוציטים וממלא תפקיד מפתח בהתמיינות והתפתחות המלנוציטים. -TRP1 חיוני לטרנסלוקציה נכונה של TYR לסינתזת מלנין ו-TRP2 ממלא תפקיד חשוב בפעילות הקטליטית של TRP בשלבים המוקדמים של סינתזת המלנין. שלושת אלו מקיימים אינטראקציה בתאי מלנומה (איור משלים 1).

מצאנו ביטוי מופחת של MITF בתאי מלנומה שטופלו ב-LEV, ואחריו ביטוי מופחת של TYR, TRP-1 ו-TRP-2, ואישרנו במיקרוסקופ אלקטרוני שסינתזת המלנין הופחתה בתוך תאים אלה ב- רמה אולטרה מבנית. אישרנו עוד את ההשפעה האנטי-מלנוגנית של LEVs באמצעות מודל אפידרמיס אנושי משוחזר. כדי להעריך כמותית את ההשפעה המעכבת של LEVs על סינתזת המלנין הסלולרית, הכנו פתרונות סטנדרטיים מרקמות ומדדנו את תכולת המלנין באמצעות קולורימטר. כתמי מלנין הופחתו בחתכי רקמה מוכתמים של Fontana-Masson. ה-LEVs עיכבו את ייצור המלנין בצורה יעילה יותר מאשר מעכב TYR ארבוטין, ששימש כביקורת חיובית.

לסיכום, ממצאים אלו מצביעים על כך שהשימוש במכשירי חשמל שמקורם בחומר טבעי לניהול היפרפיגמנטציה היא גישה עתידית אפשרית לתעשיית התרופות. יתר על כן, עם היתרונות של גודל קטן, רעילות נמוכה, ספיגה גבוהה ובטיחות סביבתית, EVs שמקורם בצמח צפויים להיות הדור הבא של מערכות אספקה ​​טיפוליות לטיפול במחלות אחרות. יש לציין כי לרכבי רכב חשמליים שמקורם בצמחים יש השפעות אנטי-מלנוגניות טובות על רקמת עור אנושית משוחזרת (בדומה לאפידרמיס האנושי), מה שמכין את הבמה לניסויים קליניים עתידיים.

תוסף Cistanche

חומרים ושיטות

1. בידוד של D. morbifera LEV ורכבי שטח

עלים וגבעולים טריים נאספו מהאי פוגה, גואנדאו-גון ו-Jeollanam-do. EVs בודדו מ-50 גרם של עלים וגבעול, בהתאמה, על ידי טחינה באמצעות מחלץ והעברת המיץ שנוצר דרך נייר סינון, וצנטריפוגה ב-10,000 × g למשך 10 דקות. פסולת גדולה הוסרה על ידי סינון הסופרנטנט דרך ממברנה של 0.22 מיקרומטר, ולאחר מכן צנטריפוגה באמצעות מסנן צנטריפוגה של Amicon Ultra-4 PL 100 K (Merck Millipore. Darmstadt, גרמניה) כדי לרכז את EVs על ידי צנטריפוגה של הדגימות ב-5000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות. לאחר צנטריפוגה, ריכוז החלבון של EVs נקבע באמצעות ערכת בדיקת חלבון bis quinolinic acid (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב).

2. אפיון גודל של EV מבודדים

הגודל ההידרודינמי של ה-EVs המבודדים נמדד על ידי פיזור אור דינמי (DLS), טכניקה המשמשת לקביעת חלוקת הגודל של חלקיקים קטנים בהשעיה, באמצעות מערכת Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, בריטניה). מכשירי החשמל שנאספו הונחו בתא בטמפרטורה קבועה של 20 מעלות. התפלגות גודל החלקיקים וה-Z-ממוצע ששימשו לקביעת התפלגות גודל החלקיקים ההידרודינמית נקבעו על ידי מדידת פונקציית הקורלציה האוטומטית של עוצמת הפיזור. EVs מבודדים דוללו על ידי מי בועות נטולי שלפוחית ​​ולאחר מכן הועברו לניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) (Nanosight; באמצעות לייזר 488 ננומטר ב-25 מעלות).

3. ניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני שידור של EVs

5 μL של תמיסה לדוגמה הועמסו על סרט פחמן מצופה רשת נחושת לניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM). לאחר ספיחה של דגימה במשך דקה אחת, הרשתות נשטפו עם טיפת מים טהורים ולאחר מכן נצבעו לרעה עם 1 אחוז אורניל אצטט למשך דקה אחת. כתם עודף הוסר עם נייר סינון והרשתות יובשו באוויר. דגימות צולמו בפוקוס בין 0.8 - 1.5 מיקרומטר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור של JEM- 1400 Plus (JEOL Ltd., טוקיו, יפן) מצויד ברובה Lab6 הפועל ב-120 קילו-וולט . התמונות תועדו באמצעות מצלמת UltraScan OneView CMOS (Gatan, Pleasanton, CA, ארה"ב).

Cistanche tubulosa

4. הכנת ליפוזומים

תערובות הליפוזומים הוכנו תוך שימוש ביחס 95:5 (מול/מול) של DMPC (1,2-stearoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, ארה"ב) עם DSPE-mPEG (1,2-stearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-[methoxy(polyethylene glycol)- 2000] (Avanti polar lipids) להכנת תערובות הליפוזומים כממברנות ליפידים. צבע פלואורסצנטי הידרופובי 1,1-dioctadecyl-3,3,3ʹ,3ʹ-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI, Invitrogen, Waltham, MA, ארה"ב) היה מעורבב עם EVs, 725.49 ug DMPE6.P EGDSPC, 151ugDS. ו-15 י"ג DiI. לאחר אידוי הממס האורגני, הממברנה המכילה את תערובת השומנים וה-DiI הולחמה ב-1 מ"ל של מי מלח מבוצר פוספט (PBS). לאחר מכן, ליפוזומים בגודל 100 ננומטר הוכנו באמצעות אקסטרודר (Avanti Polar) ליפידים).

5. מבחני תרבות תאים וכדאיות

תאי מלנומה B16BL6 תורבו במדיום חיוני אלפא מינימלי (alpha-MEM) המכיל 10 אחוז נסיוב בקר עוברי (Rocky Mountain Biologicals, Missoula, MT, ארה"ב) ו-1 אחוז פניצילין/סטרפטומיצין (לונזה, באזל, שוויץ) (Gibco, Thermo) פישר סיינטיפיק) בתרבות. תאים הודגרו ב-37 מעלות באווירת לחות של 5 אחוז CO2. 100 μL של תאי מלנומה B16BL6 חוסן ב96-צלחות באר (5 × 104 תאים/באר) לצורך מבחני כדאיות תאים. לאחר דגירה של 24 שעות, התאים טופלו עם LEVs ו- SEVs בריכוזים של 1, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה, במשך 24 שעות. ריכוזי הליפוזומים והארבוטין היו 10 מיקרוגרם/מ"ל ו-70 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה, עבור כל הניסויים. 10 μL של ריאגנט EZ-Cytox (Daeil Lab Service, סיאול, קוריאה) נוספו לאחר מכן לכל באר. הצלחות הודגרו במשך שעה אחת. הצלחות נעררו בעדינות והספיגה נמדדה לאחר מכן ב-450 ננומטר באמצעות סמן אנזים (BioTek, Winooski, VT, ארה"ב).

הפניות

[1] Meredith P, Sarna T. התכונות הפיזיקליות והכימיות של אומלנין. פיגמנט Cell Res. 2006;19(6):572–594.

[2] Grimes PE. מלזמה: שיקולים אטיולוגיים וטיפוליים. קשת דרמטול. 1995;131(12):1453–1457.

[3] Todd MM, Ralis TM, Gerwels JW, et al. השוואה בין 3 לייזרים וחנקן נוזלי בטיפול בלנטיגין סולאריות: ניסוי אקראי, מבוקר, השוואתי. קשת דרמטול. 2000;136(7):841–846.

[4] Kawalek AZ, Spencer JM, Phelps RG. לייזר אקצימר משולב וטקרולימוס מקומי לטיפול בויטיליגו: מחקר פיילוט. Dermatol Surg. 2004;30(2):130–135.

[5] Bastiaens M, Ter Huurne J, Gruis N, et al. הגן לקולטן-1-מלנוקורטין הוא הגן העיקרי של נמש. הום ​​מול ג'נט. 2001;10(16):1701–1708.

[6] Pillaiyar T, Manickam M, Jung SH. ירידה בוויסות המלנוגנזה: גילוי תרופות ואפשרויות טיפוליות. Drug Discov היום. 2017;22(2):282–298.

[7] Hu ZM, Zhou Q, Lei TC, et al. השפעות של הידרוקינון ונגזרות הגלוקוזיד שלו על מלנוגנזה ואנטי חמצון: בטיחות ביולוגית כחומרי הלבנת עור. J Dermatol Sci. 2009;55(3):179–184.

[8] Westerhof W, Kooyers T. Hydroquinone והאנלוגים שלו בדרמטולוגיה - סיכון בריאותי פוטנציאלי. J Cosmet Dermatol. 2005;4(2):55–59.

[9] Picardo M, Carrera M. טיפולים חדשים וניסיוניים של כלואזמה והיפומלנוזה נוספת. דרמטול קלינ. 2007;25(3):353–362.

[10] Shin JW, Park KC. שימוש קליני נוכחי בחומרי דה-פיגמנטציה. Dermatol Sin. 2014;32(4):205–210.

[11] Chaita E, Lambrinidis G, Cheimonidi C, et al. תכונות אנטי-מלנוגניות של צמחים יווניים. חומר חדשני לדיפיגמנטציה מעץ Morus alba. מולקולות. 2017;22(4):1–14.

[12] Park SA, Park J, Park CI, et al. פעילות נוגדת חמצון תאית והשפעות הלבנה של תמציות עלי דנדרופאנקס מורביפרה. Microbiol Biotechnol Lett. 2013;41(4):407–415.

[13] Chatatikun M, Yamauchi T, Yamasaki K, et al. השפעה אנטי-מלנוגנית של עלי Croton roxburghii ו- Croton sublyratus בתאי B16F10 מגורים -MSH. J Tradit Complement Med. 2019;9(1):66–72.

[14] Lee SH, Choi SY, Kim H, et al. Mulberroside F מבודד מעלים של Morus alba מעכב ביוסינתזה של מלנין. ביול פארם בול. 2002;25(8):1045–1048.

[15] Lim JY, Ishiguro K, Kubo I. Tyrosinase inhibitory P-coumaric acid מעלי ג'ינסנג. Phytother Res. 1999;13(5):371–375.

[16] Chanchal D, Swarnlata S. Novel גישות בקוסמטיקה צמחית. J Cosmet Dermatol. 2008;7(2):89–95.

[17] Ganesan P, Choi DK. יישום נוכחי של ננו קוסמטיקה מבוססת תרכובות לטיפוח יופי ועור. Int J Nanomedicine. 2016;11 (11):1987–2007.

[18] Takahashi M, Kitamoto D, Asikin Y, et al. ליפוזומים העוטפים תמצית ג'ל עלי אלוורה משפרים באופן משמעותי את התפשטות וסינתזת הקולגן בקווי תאי עור אנושיים. J Oleo Sci. 2009;58(12):643–650.

[19] Bose S, Du Y, Takhistov P, et al. אופטימיזציה של ניסוח ואספקה ​​מקומית של קוורצטין מננו-מערכות מבוססות שומנים מוצקים. אינט ג'יי פארם. 2013;441(30):56–66.

[20] Ngan CL, Basri M, Tripathy M, et al. התערבות עורית של ננו-אמולסיה משולבת פולרן בשיקום מבני וקולגן נגד הזדקנות העור. Eur J Pharm Sci. 2015;70(5):22–28.

[21] Mitri K, Shegokar R, Gohla S, et al. ננו-נשאי ליפידים למתן עורי של לוטאין: הכנה, אפיון, יציבות וביצועים. אינט ג'יי פארם. 2011;414 (1–2):267–275.

[22] Juškaitė V, Ramanauskienė K, Briedis V. עיצוב וניסוח של מיקרו-אמולציות אופטימליות לאספקה ​​עורית של רזברטרול. Evid Based Complement Alternat Med. 2015;2015:1–10.

[23] Zhang M, Viennois E, Xu C, et al. ננו-חלקיקים אכילים שמקורם בצמחים כגישה טיפולית חדשה נגד מחלות. מחסומי רקמות. 2016;4(2):1–9.

[24] Criton M, Le Mellay-Hamon V. אנלוגים של N-hydroxy-N'-phenylthiourea ו-N-hydroxy-N'- phenyl urea כמעכבים של יצירת טירוזינאז ומלנין. Bioorg Med Chem Lett. 2008;18 (12):3607–3610.

[25] Kobayashi T, Hearing VJ. אינטראקציה ישירה של טירוזינאז עם Tyrp1 ליצירת קומפלקסים הטרודימריים in vivo. J Cell Sci. 2007;120(24):4261–4268.

[26] D'Mello S, Finlay G, Baguley B, et al. מסלולי איתות במלנוגנזה. Int J Mol Sci. 2016;17(7):1–18.

[27] Fang D, Tsuji Y, Setaluri V. ויסות מטה סלקטיבי של הגן ממשפחת טירוזינאז TYRP1 על ידי עיכוב הפעילות של גורם שעתוק מלנוציטים, MITF. Nucleic Acids Res. 2002;30(14):3096–3106.

[28] Oh MJ, Hamid MA, Ngadiran S, et al. תמצית Ficus deltoidea (Mas cotek) הפעילה פעילות אנטי-מלנוגנית על ידי מניעת פעילות טירוזינאז במבחנה ועל ידי דיכוי ביטוי גן טירוזינאז בתאי מלנומה B16F1. Arch Dermatol Res. 2011;303(3):161–170.

[29] Jang EJ, Shin Y, Park HJ, et al. הפעילות האנטי-מלנוגנית של phytosphingosine באמצעות אפנון של מסלול איתות של גורם שעתוק הקשור למיקרופתלמיה. J Dermatol Sci. 2017;87(1):19–28.

[30] Toyofuku K, Wada I, Valencia JC, et al. לבקנות אוקולו-עורית מסוג 1 ו-3 הן מחלות שימור ER: מוטציה של טירוזינאז או Tyrp1 יכולה להשפיע על העיבוד של חלבונים מוטנטיים וגם חלבונים מסוג פרא. Faseb J. 2001;15:2149–2161.

[31] Xue L, Li Y, Zhao B, et al. TRP-2 מתווך פיגמנטציה של צבע הפרווה בעור כבש. Mol Med Rep. 2018;17:5869–5877.

[32] Mu J, Zhuang X, Wang Q, et al. תקשורת בין המינים בין תאי מעיים של צמחים ועכברים באמצעות ננו-חלקיקים דמויי אקסוזום שמקורם בצמח מאכל. Mol Nutr Food Res. 2014;58(7):1561–1573.