גלוקוז מפעיל אפקט אנטי-מלנוגני על ידי השבתה עקיפה של טירוזינאז במלנוציטים ובעור אנושי.

תַקצִיר:

סוכרים נמצאים בכל מקום באורגניזמים והם מרכיבים קוסמטיים ידועים להענקת לחות לעור עם מינימום תופעות לוואי. גלוקוז, סוכר פשוט המשמש כמקור אנרגיה על ידי תאים חיים, משמש לעתים קרובות במוצרי טיפוח. מספר דיווחים הוכיחו שלסוכר ולתרכובות הקשורות לסוכר יש השפעות אנטי-מלנוגניות על מלנוציטים. עם זאת, המנגנון המולקולרי הבסיסי שבאמצעותו גלוקוז מעכב את סינתזת המלנין אינו ידוע, למרות שהגלוקוז משמש כהלבנה וכן כמרכיב לחות בקוסמטיקה. כאן, מצאנו שגלוקוז הפחית באופן משמעותי את תכולת המלנין של תאי B16 מעוררי -מלנוציטים (MSH) ומלנוציטים אנושיים רגילים בעלי פיגמנט כהה ללא סימנים של ציטוטוקסיות.

יתר על כן, טיפול מקומי בגלוקוז הוכיח את יעילות ההלבנה שלו באמצעות צילום, צביעת Fontana-Masson (F&M) ומיקרוסקופיה רב-פוטונים במודל עור אנושי תלת-ממדי, MelanoDerm. עם זאת, גלוקוז לא שינה את ביטוי הגנים או את רמות החלבון של חלבונים מלנוגניים עיקריים במלנוציטים. בעוד שגלוקוז הפחית בעוצמה את פעילות טירוזינאז התוך-תאית במלנוציטים, הוא לא הפחית את פעילות טירוזינאז פטריות במערכת ניסויית נטולת תאים. עם זאת, גלוקוז עבר חילוף חומרים לחומצה לקטית, שיכולה לדכא בעוצמה את פעילות טירוזינאז. לפיכך, הגענו למסקנה שגלוקוז מעכב בעקיפין את פעילות טירוזינאז באמצעות המרה לחומצה לקטית, מה שמסביר את ההשפעות האנטי-מלנוגניות שלו במלנוציטים.

טירוזינאז הוא אנזים שיכול לפרק את טירוזין בחלבון ולהמיר אותו למוצרי חמצון של טירוזין, כמו טירוזין פנול וחומרים נוספים. אנזים זה קיים באופן נרחב בגוף האדם, במיוחד במערכת המעיים, שם הוא מעורב בעיכול ובספיגה של מזון. יחד עם זאת, נמצא במחקר כי cistanche יכול להפחית את הפעילות של טירוזינאז ובכך להלבין את העור.

לחץ על מה זה cistanche

מילות מפתח:

מלנוגנזה; סוכר; גלוקוז; טירוזינאז; שווה ערך לעור אנושי

1. הקדמה

מלנוגנזה הוא תהליך ייצור המלנין וחיוני להגנה על העור. המלנין סופג אור אולטרה סגול (UV) ומגן על העור מפני ההשפעות המזיקות של אור UV ורדיקלים חופשיים [1]. עם זאת, מכיוון שייצור מוגזם של מלנין גורם להיפר-פיגמנטציה כמו נמשים ולנטיגו, שעלולים להיחשב לא אסתטיים, מחקר רב הוקדש למציאת מרכיבים יעילים לדה-פיגמנטציה לקוסמטיקה או לתרופות [2-4].

סוכר הוא חומר לחות רב עוצמה ללחות העור ומשמש כמרכיב קוסמטי להענקת לחות העור עם מינימום תופעות לוואי. בנוסף, סוכרים וחומרים הקשורים לסוכר משפיעים על מלנוגנזה [5,6]. גליקוזילציה של טירוזינאז, אנזים מרכזי המעורב בסינתזת המלנין, יכולה להשתנות, לעכב את הפעילות הקטליטית שלו ולהאיץ את פירוקו [7]. תפקידם של סוכרים במלנוגנזה הודגש על ידי מחקרים שחקרו את השפעת הגליקוזילציה על פנוטיפ הפיגמנטציה של מלנוציטים ותפקידים של שאריות סוכר על הפעילות הקטליטית של טירוזינאז [5-7]. כמה מחקרים דיווחו שנגזרות סוכר יכולות לעכב את הבשלת טירוזינאז, ומשפיעות על הגליקוזילציה שלו. לדוגמה, N-acetylglucosamine (NAG), הקסוז אמינו המיוצר באופן פיזיולוגי על ידי הוספת קבוצת אמינו לגלוקוז, משבש את הגלוקוזילציה של טירוזינאז, וכתוצאה מכך השפעות דה-פיגמנטציה בעור חזיר ניסיונות ובעור אנושי [8].

בנוסף, מחקרים אחרונים הראו שתרכובות הקשורות לסוכר מעכבות ביטוי או הפעלה של טירוזינאז וכן משנות את הגליקוזילציה שלו. לדוגמה, הערכנו את יעילות ההלבנה של חומצה גלקטורונית (GA), חומצת סוכר שהיא צורה מחומצנת של גלקטוז והמרכיב העיקרי של פקטין. חומצה גלקטורונית מפעילה אפקט הלבנה באמצעות ויסות פעילות וביטוי טירוזינאז בתאי מלנומה עכברים B16 ומקביל לעור אנושי [9]. בדו"ח אחר, סוג חדש של אוליגוסכריד מחזורי, הידוע בשם Cyclic Nitrosyl nigerose (CNN), הראה השפעה מעכבת ישירה חלשה אך משמעותית על הפעילות האנזימטית של טירוזינאז, דבר המצביע על מנגנון אפשרי אחד של היפופיגמנטציה [10]. בדומה להבשלה של טירוזינאז על ידי גליקוזילציה נכונה, הביטוי או הפעילות של CNN יכולים להיות מטרה של חומרים אנטי-מלנוגניים [11]. עם זאת, למספר רב של חומרים אנטי-מלנוגניים יש תופעות לוואי חמורות, כגון ויטיליגו [12,13]. לכן יש עניין רב בתרכובות דה-פיגמנטריות בטוחות יותר.

כאן, חקרנו את ההשפעות האנטי-מלנוגניות של גלוקוז על תאי מלנומה עכברים B16 ומלנוציטים אנושיים נורמליים. בנוסף, בדקנו את צבע הרקמה ומצב האפידרמיס באמצעות צביעה של חתך רקמה של מקבילה לעור אנושי. בהתבסס על הממצאים שלנו, אנו מציעים שהשפעת ההלבנה של גלוקוז תלויה בייצור חומצת חלב, וכתוצאה מכך השבתת טירוזינאז.

2. תוצאות

2.1. יעילות אנטי-מלנוגנית של גלוקוז ב-B16 ו-NHM

כדי לחקור את ההשפעה האנטי-מלנוגנית של גלוקוז, השתמשנו בשני סוגים של מלנוציטים, תאי מלנומה B16 (קו תאי מלנומה עכברים) ומלנוציטים אנושיים רגילים (NHM). ראשית, קבענו אם גלוקוז רעיל לתאי B16. גלוקוז לא הראה שום ציטוטוקסיות בריכוזים של עד 100 mM בתאי B16, כפי שמוצג באיור 1A. בהתבסס על נתוני הציטוטוקסיות, תאי B16 טופלו בריכוזים שונים של גלוקוז במשך 72 שעות בנוכחות ההורמון -מלנוציטים מגרה (MSH), מעורר מלנוגנזה. כפי שמוצג באיור 1B, גלוקוז הווסת בצורה ברורה ומשמעותית את תכולת המלנין התוך תאי באופן תלוי מינון. חומצה קוג'ית (KA) שימשה כתרכובת ייחוס לאנטי-מלנוגנזה מכיוון שהיא משמשת לעתים קרובות כמרכיב קוסמטי להבהרת העור [1,3,4]. צבע הליסאטים בתאים שטופלו בגלוקוז היה בהיר יותר מהצבע של תאי בקרה (איור 1C).

בנוסף, אישרנו שכמות המלנין המופרשת לאמצעי התרבות ירדה וצבע המדיה התבהר (איור 1D). לאחר מכן, חקרנו את ההשפעה האנטי-מלנוגנית של גלוקוז על NHMs עם פיגמנט כהה. גלוקוז בריכוזים של עד 100 מ"מ לא היה ציטוטוקסי למשך עד ארבעה 4 ימים (איור 1E). כאשר תכולת המלנין נקבעה לאחר טיפול בגלוקוז ב-NHMs במשך 4 ימים, מצאנו שתכולת המלנין ירדה באופן תלוי מינון (איור 1F). יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שגלוקוז מדכא את סינתזת המלנין במלנוציטים.

2.2. השפעת ההלבנה של גלוקוז על עור אנושי תלת מימדי

כדי להגדיר עוד יותר את היכולת האנטי-מלנוגנית של גלוקוז, השתמשנו במודל עור אנושי תלת-ממדי פיגמנט, MelanoDerm. כמתואר בסעיף חומרים ושיטות, גלוקוז הוחל באופן מקומי על ה-MelanoDerm למשך 18 ימים, וכדאיות התא נקבעה על ידי בדיקת CCK-8. כפי שמוצג באיור 2A, לא נצפתה ציטוטוקסיות של רקמות לאחר טיפול בגלוקוז במשך 18 ימים. שינויים בצבע הרקמה הוערכו על ידי צילום. כפי שמוצג באיור 2B, רקמה שטופלה בגלוקוז הייתה בהירה יותר מאשר רקמה שטופלה בפוספט מלוחים (PBS). בנוסף, צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) גילתה שגלוקוז לא גרם לקריסת רקמות, בעוד שצביעת פונטנה-מאסון (F&M) הראתה שגלוקוז הפחית את מספר המלנוציטים היפר-פיגמנטים (כפי שמצוין בחצים) בשכבה הבסיסית (איור 2C) .

כדי לחקור עוד יותר את השינויים בתכולת המלנין, השווינו את אותות הקרינה האוטומטית של המלנין בשכבות המלנוציטים של רקמות שטופלו ב-PBS ובגלוקוז באמצעות מיקרוסקופיה של פלואורסצנטי עירור שני-פוטונים (TPEF), כפי שמוצג באיור 2D. ניתוח של תמונות אלו הראה שנפח המלנין ירד בכ-36 אחוז ועוצמת האות TPEF עבור מלנין באזור העשיר במלנוציטים ירדה בכ-38 אחוז ברקמות שטופלו בגלוקוז בהשוואה לרקמות שטופלו ב-PBS.

איור 2. השפעת גלוקוז על עור אנושי שווה ערך, MelanoDerm. (א) כדאיות של שוות עור אנושיות שטופלו בגלוקוז. (ב) שוות עור אנושיות (MelanoDerm; n=3) טופלו באופן מקומי בגלוקוז במשך 18 ימים, ולאחר מכן צולמו. ערך ∆L מציין את מידת הקלילות בהשוואה לרקמה שטופלה ב-PBS. (ג) צביעת H&E ו-F&M של קטעי רקמה. השקופיות היו קבועות בתמיסת פורמלדהיד והוטמעו בשעווה פרפין לצביעה (פס קנה מידה, 5{{10}} מיקרומטר). חיצים שחורים מציינים מלנוציטים פיגמנטיים. (ד) הדמיית מלנין (200 × 200 × 60 מיקרומטר) של עור אנושי שווה ערך בוצעה באמצעות מיקרוסקופיה TPEF. אותות פסאודו-צבעוניים (אדומים) מצביעים על מלנין (סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר). הגרפים מציינים את כימות נפח המלנין ואותות TPEF. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD של לפחות שלוש מדידות בלתי תלויות (*p <0.05, ***p <0.001).

2.3. השפעת הגלוקוז על ביטוי חלבונים מלנוגניים במלנוציטים

לאחר מכן, כדי להבהיר את מנגנון הדפיגמנטציה של גלוקוז במלנוציטים, הערכנו את השפעתו על הביטוי של אנזימים מלנוגניים כגון טירוזינאז ו-Tyrp-1 בתאי B16 ו-NHM. תאי B16 טופלו בגלוקוז במשך הזמנים המצוינים בנוכחות -MSH. לאחר מכן, רמות החלבון של טירוזינאז ושל Tyrp-1 נקבעו על ידי בדיקת Western blot (איור 3A). רמות הביטוי של טירוזינאז וטיירפ-1 לא ירדו על ידי גלוקוז בשום נקודת זמן. יתר על כן, רמות התמלול של טירוזינאז לא הושפעו מגלוקוז בתאי B16 מגורים -MSH (איור 3B). בדומה לתאי B16, רמות החלבון של טירוזינאז, Tyrp-1 ו-MITF לא עוכבו על ידי גלוקוז (איור 3C) בתאי NHM שטופלו בגלוקוז, וגם רמות mRNA של טירוזינאז ו-Tyrp-1 לא היו ירד, אך עלה מעט על ידי גלוקוז (איור 3D).

איור 3. השפעת גלוקוז על הביטוי של חלבונים מלנוגניים בתאי B16 ו-NHM. (A, B) תאי B16 טופלו ב-MSH למשך הזמן המצוין בנוכחות או היעדר 20 מ"מ גלוקוז. לאחר מכן בוצעו מבחני Western blot (A) ו-qRT-PCR (B). (ג) NHMs טופלו בריכוזים המצוינים של גלוקוז במשך 48 שעות. לאחר מכן, בוצע בדיקת Western blot. (ד) NHMs טופלו בזמן המצוין בנוכחות 50 מ"מ גלוקוז. לאחר מכן, בוצעו מבחני qRT-PCR. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD של לפחות שלוש מדידות עצמאיות.

2.4. השפעת הגלוקוז על פעילות טירוזינאז

כדי להגדיר עוד יותר את מנגנון הפעולה של גלוקוז, בדקנו אם יש לו השפעה מעכבת על פעילות טירוזינאז פטריות. כפי שמוצג באיור 4A, מצאנו שלגלוקוז לא הייתה השפעה מעכבת על פעילות טירוזינאז פטריות, מה שמעיד על כך שגלוקוז אינו משפיע ישירות על פעילות טירוזינאז. לאחר מכן ביצענו בדיקת פעילות תוך-תאית כוללת של טירוזינאז תוך שימוש ב-lysates של תאים שטופלו בגלוקוז הן מתאי B16 והן מתאי NHM. מעניין שפעילות טירוזינאז התוך תאית נבלמת באופן תלוי מינון בתאי B16 שטופלו בגלוקוז בנוכחות -MSH (איור 4B). ב-NHMs, גלוקוז גם עיכב פעילות טירוזינאז תוך תאית (איור 4C). נתונים אלה תומכים באפשרות שגלוקוז משבית בעקיפין את טירוזינאז במלנוציטים.

איור 4. השפעת הגלוקוז על פעילות טירוזינאז. (א) השפעת הגלוקוז על פעילות טירוזינאז הפטריות במערכת נטולת תאים. (ב, ג) בדיקת פעילות טירוזינאז תאית. (ב) תאי B16 טופלו בריכוזים המצוינים של גלוקוז במשך 24 שעות. לאחר מכן, בוצע בדיקת פעילות טירוזינאז התאית, כמתואר בסעיף השיטות. (ג) NHMs טופלו ב-50 mM גלוקוז למשך הזמן המצוין. לאחר מכן, בוצע בדיקת פעילות טירוזינאז התאית, כמתואר בסעיף השיטות. פעילות הטירוזינאז התאית נורמלה על ידי תכולת החלבון הכוללת. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD של לפחות שלוש מדידות עצמאיות (*p < 0.05, **p <0.01, ***p < 0.001).

2.5. השבתת טירוזינאז על ידי ייצור חומצת חלב במלנוציטים שטופלו בגלוקוז

הגלוקוז הופך למטבוליט הסלולרי לקטט, שהוא חומצת החלב בתמיסה ואשר דווח כיעיל בטיפול בנגעים פיגמנטריים [14,15]. לכן, שיערנו שגלוקוז הופך לחומצה לקטית במלנוציטים ושרמות מוגברות של חומצה לקטית מעכבות מלנוגנזה באמצעות אי-אקטיבציה של טירוזינאז. כדי להעריך השערה זו, הערכנו תחילה את הייצור של חומצת חלב במדיה ממלנוציטים שטופלו בגלוקוז. כצפוי, הגלוקוז הגדיר באופן משמעותי את תכולת חומצת החלב במדיה בתרבית תאי B16 (איור 5A). בנוסף, מכיוון שידוע כי חומצה לקטית מעכבת ישירות את פעילות טירוזינאז [15], הערכנו אם חומצת חלב מדכאת את פעילות טירוזינאז פטריות. כפי שמוצג באיור 5B, חומצת חלב עיכבה באופן דרמטי את פעילות טירוזינאז פטריות, בניגוד לגלוקוז. תוצאות אלו מצביעות על כך שלהמרה של גלוקוז לחומצה לקטית יש השפעה אנטי-מלנוגנית באמצעות השבתת טירוזינאז על ידי חומצת החלב.

איור 5. ייצור לקטט על ידי גלוקוז והשפעה של חומצת חלב על פעילות טירוזינאז. (א) ייצור לקטט בתאי B16 שטופלו בגלוקוז. (א) תאי B16 טופלו בריכוזים המצוינים של גלוקוז במשך 3 ימים. לאחר מכן, בוצעה בדיקת לקטט באמצעות המדיה התרבותית, כמתואר בסעיף השיטות. (ב) השפעת חומצת חלב על פעילות טירוזינאז הפטריות במערכת נטולת תאים. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD של לפחות שלוש מדידות בלתי תלויות (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001) .

3. דיון

סוכרים או חומרים שמקורם בסוכר משמשים לעתים קרובות כמרכיבים קוסמטיים להגנה על העור ובקרה פיזיולוגית. לדוגמה, רפינוז מגביר אוטופגיה בלתי תלויה ב-mTOR ומפחית מוות תאים בקרטינוציטים מוקרנים ב-UVB, מה שמעיד על כך שלחומר הטבעי רפינוז יש ערך פוטנציאלי בהגבלת הפוטו-נזק [16]. טרהלוז וסוכרוז הם מפעילים חדשים של אוטופגיה בקרטינוציטים אנושיים דרך מסלול בלתי תלוי ב-mTOR [17]. ממצאים אלו מספקים תובנה חדשה לגבי הרגולציה המתווכת בסוכר של אוטופגיה בקרטינוציטים. במקרה של גלוקוז, גלוקוז מקומי הוכח כגורם לביטוי קלאודין-1 ופילאגרין במודל עכבר של אטופיק דרמטיטיס ותרבות קרטינוציטים, מה שמצביע על כך שיש לו השפעה אנטי דלקתית על ידי תיקון תפקוד מחסום העור [18]. בנוסף, גלוקוז מעכב שגשוג ומשפר את ההתמיינות של קרטינוציטים בעור [19]. לכן, גלוקוז מווסת היבטים שונים של הפיזיולוגיה של האפידרמיס, כגון תפקודי מחסום העור ורמות הידרציה של קרטינוציטים.

סוכרים יכולים לפעול כסוכנים דפיגמנטריים באמצעות מספר מנגנונים שונים הכוללים טירוזינאז. לדוגמה, גורמים מסוימים מעכבים את הבשלת טירוזינאז, בעוד שגורמים אחרים גורמים לעיכוב של ביטוי או פעילות גנים של טירוזינאז [5,8-10]. עם זאת, מעט מחקרים חקרו את המנגנונים העומדים בבסיס השפעות הדפיגמנטציה של גלוקוז.

כדי לקבוע את השפעת הגלוקוז על מלנוגנזה, התמקדנו בעבר בקולטני X של הכבד (LXRs), שהם קולטנים גרעיניים המופעלים על ידי ליגנד, הממלאים תפקידים מרכזיים במטבוליזם של שומנים והומאוסטזיס של כולסטרול [20]. מצאנו שהפעלת קולטן X בכבד מעכבת מלנוגנזה באמצעות האצה של פירוק גורם שעתוק הקשור למיקרופתלמיה (MITF) (MITF) (Microphthalmia-associated Kinase) מתווכת קינאז (ERK) [21]. יתר על כן, גלוקוז הוא ליגנד LXR אנדוגני [22]. לפיכך, שיערנו כי לגלוקוז יש השפעות אנטי-מלנוגניות עקב הפעלה של מסלול תלוי LXR. עם זאת, כפי שמוצג באיור 3C, גלוקוז לא שינה את רמות הביטוי של טירוזינאז או MITF, אם כי הפעלת LXR הפחיתה את רמות הביטוי של חלבונים אלה במלנוציטים.

לכן, הגענו למסקנה שלגלוקוז היו השפעות דה-פיגמנטציה על מלנוציטים ללא תלות בהפעלת LXR.

גלוקוז הוא המצע העיקרי לייצור אנרגיה, והוא עובר הידרוליזה באמצעות תגובות סדרתיות של מספר אנזימים, המכונה גליקוליזה. מחקרים רבים הראו כי לגליקוליזה יש רק תוצר סופי אחד, חומצה לקטית, בין אם בתנאים אירוביים ובין אם בתנאים אנאירוביים. בתנאים אירוביים (O2), לקטט משמש כמצע של דהידרוגנאז לקט מיטוכונדריאלי (MLD). LDHs ממירים אותו לפירובט שנכנס למחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA). בתנאים אנאירוביים (N2), לקטט מצטבר בציטוזול. לכן, מסלול הגליקוליזה מתחיל עם הגלוקוז כמצע שלו ומסתיים עם ייצור לקטט כתוצר הסופי העיקרי שלו [23]. בנוסף, דוד ואח'. מדד את חלק הגלוקוז שהומר לחומצה לקטית או לפירובט במלנוציט האנושי הרגיל [24]. רוב המטבוליטים של גלוקוז היו חומצה לקטית ולא פירובט.

חומצה לקטית היא חומצה אלפא הידרוקסית (AHA); חומצות אלו נמצאות בשימוש נרחב בתכשירים קוסמטיים כחומרי קילוף שטחיים [25]. בנוסף, חומצת חלב מדכאת את יצירת המלנין על ידי עיכוב ישיר של פעילות טירוזינאז, השפעה בלתי תלויה באופי החומצי שלה, מה שאומר שהשפעות חומצת החלב על נגעים פיגמנטריים נובעות לא רק מהאצת מחזור תאי האפידרמיס אלא גם מעיכוב ישיר של יצירת המלנין ב. מלנוציטים [15]. לפיכך, סברנו שגלוקוז עשוי להפעיל את השפעתו האנטי-מלנוגנית באמצעות ייצור חומצת חלב מכיוון שניתן להמיר גלוקוז לחומצה לקטית. כצפוי, מצאנו שטיפול בגלוקוז הביא לייצור חומצת חלב במלנוציטים (איור 5A).

בנוסף, אישרנו כי חומצת חלב מעכבת בעוצמה וישירה את פעילות טירוזינאז (איור 5B). Usuki et al. גילה גם כי חומצת חלב הפחיתה את פעילות טירוזינאז תוך תאית בתאי B16 ובתאי HM3KO אנושיים [15]. בדוח, רמות ה-mRNA והחלבון של טירוזינאז ו-Tyrp-1 לא הושפעו מחומצת חלב. יחד, נתונים אלו מצביעים על כך שגלוקוז מגביר את ייצור חומצת החלב ושחומצה לקטית זו מעכבת ישירות את פעילות טירוזינאז מבלי להשפיע על רמות הביטוי הגנים, מה שמצביע על כך שלגלוקוז יש השפעה אנטי-מלנוגנית במלנוציטים באמצעות השבתה עקיפה של טירוזינאז התלויה בייצור חומצת חלב. עם זאת, ניסויים נוספים נחוצים כדי לאמת את התפקיד של חומצת חלב וגלוקוז בדפיגמנטציה.

נתונים קולקטיביים ממחקר זה מספקים ראיות ראשוניות התומכות בתועלת של גלוקוז מקומי כהלבנה יעילה וכן כמגיב לחות שניתן להשתמש בו בבטחה בקוסמטיקה ובתכשירים רפואיים.

4. חומרים ושיטות

4.1. חומרים

D-גלוקוז, -MSH, חומצה קוג'ית (KA), L-tyrosine, L-DOPA וחומצה לקטית נרכשו מ-Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ארה"ב). נוגדנים נגד טירוזינאז ואקטין נרכשו מאבקם (קיימברידג', בריטניה). נוגדן נגד Tyrp-1 נרכש מסנטה קרוז ביוטכנולוגיה (CA, ארה"ב). נוגדן נגד MITF נרכש מחברת Proteintech (עיר, IL, ארה"ב).

4.2. בדיקת תרבות תאים וכדאיות

רכשנו תאי מלנומה עכברים B16, מדיום איגל שונה של Dulbecco (DMEM), וסרום בקר עוברי (FBS) מאוסף American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, ארה"ב). תאי B16 תורבו ב-DMEM המכילים 4500 מ"ג/ליטר גלוקוז גבוה (ATCC 30-2002) כפי שהומלץ על ידי היצרן (ATCC) בתוספת 5 אחוז FBS, והודגרו ב-37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 95 אחוז אוויר ו 10 אחוז CO2. NHMs ראשוניים בעלי פיגמנט כהה נרכשו מ-Thermo Fisher Scientific (#C2025C; Waltham, MA, ארה"ב). תאים תורבו ב-Medium 254 (#M254500) בתוספת תוסף צמיחת מלנוציטים אנושיים (#S0025) והודגרו ב-37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספרה של 5 אחוז CO2. עבור ניסויים, נעשה שימוש ב-NHMs ראשוני בין מעברים 4 ו-7. הכדאיות של תאים מתורבתים הוערכה באמצעות ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8) כמתואר על ידי היצרן (DOJINDO, טוקיו, יפן).

4.3. מדידת תוכן מלנין

תכולת המלנין נקבעה כמתואר בדוחות קודמים [2-4]. בקצרה, תאי B16 טופלו בריכוזים המצוינים של גלוקוז בנוכחות -MSH (200 ננומטר) במשך 72 שעות. NHMs טופלו בריכוזים המצוינים של גלוקוז במשך 4 ימים. לאחר מכן, כל התאים נשטפו עם מי מלח מבוצר פוספט (PBS) והומסו ב-1 N NaOH ב-60 ◦C למשך שעה. ליזטים של תאים הועברו לצלחת 96-באר, והספיגה נמדדה ב-405 ננומטר. הערכים נורמלו על סמך ריכוזי החלבון בכל באר מדגם.

4.4. בדיקת פעילות טירוזינאז פטריות

חקרנו את ההשפעות הישירות של הריכוזים המצוינים של גלוקוז על פעילות טירוזינאז פטריות. בקצרה, 100 µL של חיץ פוספט המכיל גלוקוז עורבבו עם טירוזינאז פטריות (10 יחידות/באר) ושולבו עם 50 µL של 0.03 אחוז L-tyrosine או L-DOPA במים מזוקקים. לאחר מכן, התערובת הודגרה יחד ב-37 ◦C למשך 10 דקות, והספיגה נמדדה ב-405 ננומטר. חומצה קוג'ית (KA), חומר נוגד טירוזינאז ידוע, שימשה כתרכובת ייחוס.

4.5. בדיקת פעילות טירוזינאז תוך תאית

בקצרה, תאי B16 או NHM טופלו בריכוזים המצוינים של גלוקוז עבור הזמנים המצוינים. לאחר מכן, התאים נשטפו עם PBS והוסרו על ידי דגירה במאגר פוספט 50 mM (pH 6.8) המכיל 1 אחוז Triton X-100 ו-0.1 mM phenylmethyl-sulfonyl fluoride. לאחר מכן בוצעה צנטריפוגה של lysates סלולריים ב-12,{10}} סל"ד ב-4 ◦C למשך 20 דקות. הסופרנטנט המכיל טירוזינאז תאי נאסף ותכולת החלבון נקבעה לנורמליזציה. התמצית הסלולרית הודגרה עם L-DOPA במאגר פוספט ויצירת דופאכרום נוטרה על ידי מדידת ספיגה ב-405 ננומטר תוך 30 דקות.

4.6. בידוד RNA ותגובת שרשרת של פולימראז (qRT-PCR) כמותית בזמן אמת.

כדי לקבוע את ביטוי ה-mRNA היחסי של גנים נבחרים, RNA הכולל בודד עם TRIzol (Invitrogen, CA, ארה"ב), לפי הוראות היצרן, ו-4 מיקרוגרם RNA הועברו לעלילה לאחור ל-cDNA באמצעות RT-premix (Bioneer, סיאול, דרום קוריאה). PCR כמותי בוצע באמצעות ABI 7500 Fast-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, ארה"ב). ערכות ה-primer qRT-PCR עבור טירוזינאז ו-Tyrp-1 נרכשו מ-Applied Biosystems, וערכות TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) שימשו להגברה. ביטוי גן היעד עבר נורמליזציה לזה של גן משק הבית המקודד לתת-יחידת גבעול צידי של חלבון ריבוזומלי P0 (RPLP0). הכימות היחסי בוצע בשיטת ∆∆Ct השוואתית לפי הוראות היצרן.

4.7. סוטה מערבית

תאים נשטפו פעמיים עם PBS קר ולאחר מכן הוסרו במאגר RIPA שונה כקרח (Cell Signaling Technology, MA, ארה"ב) המכיל מעכבי פרוטאז (Calbiochem, La Jolla, CA, ארה"ב). ריכוז החלבון הכולל נקבע, והחלבונים נפתרו על ידי SDS-PAGE על גבי ג'לים של Bis-Tris בשיעור של 4-12 אחוז (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב), שהועברו לממברנות ניטרוצלולוזה (Thermo Fisher Scientific). לאחר ההעברה נחסמו ממברנות בתמיסת חסימה של 5 אחוזים. הממברנות הודגרו עם נוגדנים ראשוניים ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, נשטפו עם מלוחים מלוחים טריס המכילים 0.1 אחוז Tween-20 (TBST), ונחשפו לנוגדנים משניים מצומדים לפרוקסידאז במשך שעה אחת. בטמפרטורת החדר. ממברנות נשטפו שלוש פעמים עם TBST. אות כימי-לומינסצנטי פותח באמצעות ריאגנט ECL מסוג Western blotting (GE Healthcare, Hatfield, בריטניה).

4.8. ערך תלת מימדי (3D) עור אנושי

השתמשנו ב- MelanoDerm (MEL-300-B; MatTek Corp., Ashland, MA, ארה"ב) כמודל רקמת עור אנושית. שווה ערך זה, המשוחזר, התלת-ממדי של עור אנושי נגזר מתורמים שחורים ומכיל מלנוציטים וקרטינוציטים נורמליים. MelanoDerm גדל בממשק אוויר-נוזל במדיום EPI-100-NMM-113 (MatTek Corp, Ashland, MA, ארה"ב). לפני הטיפול בגלוקוז, רקמות נשטפו עם 1 מ"ל PBS כדי להסיר תרכובות שאריות. גלוקוז הומס ב-PBS. הריכוז הסופי של גלוקוז היה 2 אחוזים. דגימת הביקורת טופלה רק עם PBS. גלוקוז נמרח על MelanoDerm בימים 1, 4, 6, 8, 11, 13 ו-15. לאחר 18 ימים, רקמות MelanoDerm קובעו בפורמלדהיד מבוצר של 4 אחוזים, הוטמעו בפרפין, נחתכו לעובי של 3 מיקרומטר, והועברו לצביעה של H&E ו-F&M. הכדאיות של דגימות הרקמה הוערכה באמצעות ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8) כמתואר על ידי היצרן (DOJINDO, טוקיו, יפן). הפיגמנטציה של ה- MelanoDerm הוערכה על ידי השוואת השינוי בערך L*.

4.9. הדמיית פלואורסצנציית עירור בשני פוטונים (TPEF).

כדי לדמיין את התפלגות המלנין בעור האדם התלת-ממדי, ביצענו הדמיית TPEF, כפי שתואר בדוחות הקודמים שלנו [3,4]. בקצרה, כל תכשיר של MelanoDerm תוקן בפורמלין של 4 אחוזים למשך 24 שעות ב-4 ◦C ולאחר מכן נשטף עם PBS/0.1 אחוז BSA (אלבומין בסרום בקר, Merck, Branchburg, NJ, ארה"ב). תמונות ה-TPEF נרכשו מהשכבה הבסיסית כדי למדוד מלנין תוך תאי בשכבת המלנוציטים. עוצמות האות היחסיות של TPEF עבור מלנין בנפח המדידה נכומת באמצעות תוכנת Image-Pro Premier 3D (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, ארה"ב).

4.10. בדיקת L-lactate

תאי B16 נזרעו ב-1.0 × 105 תאים לבאר בצלחת 12-באר. לאחר טיפול בגלוקוז במשך 3 ימים, רמות הלקטאט החוץ-תאי כומתו באמצעות ערכת בדיקה קולורימטרית L-lactate (Abcam, ab65331, Cambridge, UK) לפי פרוטוקול היצרן.

4.11. ניתוח סטטיסטי

הנתונים מבוטאים כממוצעים ± SDs (סטיות תקן), ומובהקות סטטיסטית נקבעה על ידי מבחן t של הסטודנט. ערך p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

תרומות מחבר:

המשגה, H.-JK, JL ו-CSL; אוצרות נתונים, SHL; חקירה, ש.ח.ל; מתודולוגיה, SHL, I.-HB, and E.-SL; פיקוח, JL ו-CSL; כתיבה - טיוטה מקורית, SHL ו-CSL; כתיבה - סקירה ועריכה, JL כל המחברים קראו והסכימו לגרסה שפורסמה של כתב היד.

מימון:

מחקר זה מומן על ידי התוכנית למחקר מדעי בסיסי באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון משרד החינוך (מספר מענק: 2018R1D1A1B07049402).

ניגוד עניינים:

המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים.

קיצורי מילים

-MSH -הורמון מגרה מלנוציטים

חלבון הקשור לטירפ-1 לטירוזינאז 1

MITF גורם שעתוק הקשור למיקרופתלמיה

מלנוציטים אנושיים נורמליים של NHM

פלואורסצנטי של עירור שני פוטונים TPEF

קולטן LXR לכבד X

AHAs חומצות אלפא הידרוקסיות

H&E המטוקסילין ואאוזין

F&M פונטנה-מאסון

הפניות

1. סוואלוול, ה.; לטימר, ג'; הייווד, RM; Birch-Machin, MA חוקרת את תפקיד המלנין ב-UVA/UVB ומי חמצן המושרה בייצור ROS תאי ומיטוכונדריאלי ונזק ל-DNA המיטוכונדריאלי בתאי מלנומה אנושיים. רדיק חופשי. ביול. Med. 2012, 52, 626–634. [CrossRef]

2. לי, CS; ג'אנג, WH; פארק, מ.; יונג, ק.; Baek, HS; Joo, YH; פארק, י"ה; Lim, KM נגזרת חדשה של אדמנטיל בנזיל-בנזמיד, AP736, מדכאת מלנוגנזה באמצעות עיכוב של cAMP-PKA-CREB-Activated microphthalmia-Associated transcription factor וביטוי טירוזינאז. Exp. דרמטול. 2013, 22, 762–764. [CrossRef] [PubMed]

3. לי, JH; לי, ES; Bae, IH; Hwang, JA; קים, SH; קים, DY; Park, NH; רו, HS; קים, YJ; אה, SG; et al. יעילות אנטי-מלנוגנית של Melasolv (3,4,5-Trimethoxycinnamate Thymol Ester) במלנוציטים ובעור אנושי תלת-ממדי. עור פרמקול. פיזיול. 2017, 30, 190–196. [CrossRef] [PubMed]

4. Bae, IH; לי, ES; יו, JW; לי, ש; קו, JY; קים, YJ; לי, TR; קים, DY; Lee, CS ליפידים של Mannosylerythritol מעכבים מלנוגנזה באמצעות דיכוי איתות ERK-CREB-MITF-Tyrosinase במלנוציטים אנושיים רגילים ומקביל עור אנושי תלת מימדי. Exp. דרמטול. 2019, 28, 738–741. [CrossRef] [PubMed]

5. בין, ב"ה; קים, ST; בהין, ג'; לי, TR; Cho, EG פיתוח חומרים אנטי מלנוגניים מבוססי סוכר. Int. י.מול. Sci. 2016, 17, 583. [CrossRef]

6. קומארי, ש.; Tien Guan Thng, S.; קומאר ורמה, נ.; Gautam, HK מעכבי מלנוגנזה. אקטה. דרם. Venereol. 2018, 98, 924–931. [CrossRef]

7. אנדו, ה.; Kondoh, H.; איצ'יאשי, מ.; שמיעה, VJ גישות לזיהוי מעכבי ביוסינתזה של מלנין באמצעות בקרת האיכות של טירוזינאז. J. Invest Dermatol. 2007, 127, 751–761. [CrossRef]

8. Hwang, JS; לי, HY; לים, טי; קים, שלי; Yoon, TJ שיבוש של גליקוזילציה של טירוזינאז על ידי N-אצטיל גלוקוזאמין והשפעותיו דה-פיגמנטציה בעור חזיר ניסיונות ובעור אנושי. ג'יי דרמטול. Sci. 2011, 63, 199–201. [CrossRef]

9. לי, CS; Baek, HS; Bae, IH; צ'וי, SJ; קים, YJ; לי, JH; Kim, JW יעילות דפיגמנטציה של חומצה גלקטורונית באמצעות ויסות טירוזינאז בתאי מלנומה עכברים B16 ומקבילה תלת מימדית לעור אנושי. קלינ. Exp. דרמטול. 2018, 43, 708–712. [CrossRef]

10. Nakamura, S.; קוניקטה, ט.; מטסומוטו, י.; חניא, ט; חרשימה, א; נישימוטו, ט.; Ushio, S. השפעות של פחמימה מחזורית שאינה Cyclodextrin על תאי מלנומה של עכברים: אפיון של סוג חדש של סוכר היפופיגמנטציה. PLoS ONE 2017, 12, e0186640. [CrossRef]

11. Khan, MT מעכבי טירוזינאז חדשים ממשאבי טבע - מחקריהם החישוביים. Curr. Med. Chem. 2012, 19, 2262–2272. [CrossRef] [PubMed]

12. סולאנו, פ.; בריגנטי, ש.; פיקרדו, מ.; Ghanem, G. Hypopigmentingagents: סקירה מעודכנת על היבטים ביולוגיים, כימיים וקליניים. פִּיגמֶנט. תָא. מילון 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

13. לי, CS; Joo, YH; Baek, HS; פארק, מ.; קים, JH; שין, ח"י; Park, NH; לי, JH; פארק, י"ה; שין, ס"ס; et al. השפעות שונות של חמש תרכובות דה-פיגמנטריות, רודודנדרון, קטון פטל, מונובנזון, רוצינול ו-AP736 על המלנוגנזה והכדאיות של מלנוציטים אפידרמיס אנושיים. Exp. דרמטול. 2016, 25, 44–49. [CrossRef] [PubMed]

14. מולקוטלה, לפני הספירה; חאן, ש.; לאנג, א.; Hu, WS מטבוליזם של גלוקוז בתרבית תאי יונקים: תובנות חדשות לשינוי מסלולי וינטג'. טרנדים. ביוטכנולוגיה. 2010, 28, 476–484. [CrossRef]

15. אוסוקי, א.; אוהשי, א.; סאטו, ה.; אוצ'איי, י. איצ'יאשי, מ.; Funasaka, Y. ההשפעה המעכבת של חומצה גליקולית וחומצה לקטית על סינתזת המלנין בתאי מלנומה. Exp. דרמטול. 2003, 12, 43–50. [CrossRef]

16. לין, ש.; לי, ל.; לי, מ.; גו, ה.; Chen, X. Raffinose מגביר אוטופגיה ומפחית מוות תאים בקרטינוציטים מוקרנים ב-UVB. J. Photochem. Photobiol. B 2019, 201, 111653. [Cross Ref]

17. חן, X.; לי, מ.; לי, ל.; שו, ש; הואנג, ד.; יו, מ.; הואנג, ג'; חן, ק.; Gu, H. Trehalose, סוכרוז ורפינוז הם מפעילים חדשים של אוטופגיה בקרטינוציטים אנושיים דרך מסלול עצמאי של mTOR. Sci. Rep. 2016, 6, 28423. [CrossRef]

18. ימאדה, ק.; מאצושיטא, ק.; וואנג, ג'; Kanekura, T. גלוקוז מקומי גורם לביטוי קלודין-1 ופילאגרין במודל עכבר של אטופיק דרמטיטיס ובתרבות קרטינוציטים, מפעיל השפעות אנטי דלקתיות על ידי תיקון תפקוד מחסום העור. אקטה. דרם. Venereol. 2018, 98, 19–25. [CrossRef]

19. ספרבצ'יקוב, נ.; סיזיקוב, ג.; גרטסביין, מ.; אצילי, ד.; טננבאום, ט.; ורטהיימר, E. השפעות גלוקוז על קרטינוציטים בעור: השלכות על סיבוכי עור של סוכרת. סוכרת 2001, 50, 1627–1635. [CrossRef]

20. קסטרילו, א.; Tontonoz, P. קולטנים גרעיניים בביולוגיה של מקרופאגים: בצומת של מטבוליזם שומנים ודלקת. אננו. כומר תא. Dev. ביול. 2004, 20, 455–480. [CrossRef]

21. לי, CS; פארק, מ.; האן, ג'; לי, JH; Bae, IH; צ'וי, ה.; בן, ED; פארק, י"ה; Lim, KM הפעלת קולטן לכבד X מעכבת מלנוגנזה באמצעות האצה של פירוק MITF בתיווך ERK. J. Invest. דרמטול. 2013, 133, 1063–1071. [CrossRef] [PubMed]

22. מיטרו, נ.; מק, פ"א; ורגאס, ל. גודיו, סי; המפטון, E.; Molteni, V.; קרוש, א.; Saez, E. הקולטן הגרעיני LXR הוא חיישן גלוקוז. טבע 2007, 445, 219–223. [CrossRef] [PubMed]

23. Schurr, A. Carbohydrate; IntechOpen: לונדון, בריטניה, 2017; עמ' 21–35.

24. סקוט, ד'; ריצ'רדסון, א.; פיליפ, פ.; Knutzen, C.; צ'יאנג, ג'; רונאי, ז; אוסטרמן, א.; Smith, J. פרופיל שטף מטבולי השוואתי של קווי תאים מלנומה: מעבר לאפקט ורבורג. ג'יי ביול. Chem. 2011, 286, 42626–42634. [CrossRef] [PubMed]

25. טאנג, SC; Yang, JH השפעות כפולות של חומצות אלפא-הידרוקסיות על העור. מולקולות 2018, 23, 863. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com