תמצית Herba Cistanche משפרת את מצב הגלוטתיון המיטוכונדריאלי ואת הנשימה בלבבות חולדות, עם זירוז אפשרי של ניתוק חלבונים

מבוא

פרפוזיה חוזרת של שריר לב איסכמי בעבר גורם לסדרה של שינויים במיטוכונדריה, כולל ייצור מוגבר של מיני חמצן תגובתי (ROS), Ca.2+עומס יתר, וירידה בייצור אדנוזין טריפוספט (ATP), כל אלו עלולים להוביל לנמק ו/או מוות תאי בתיווך אפופטוזיס (Redegeld et al., 1992; Lemasters et al., 1998). שכן המיטוכונדריה ממלאות תפקיד מכריע בקביעהבהתחשב בגורלם של קרדיומיוציטים בעקבות אתגר איסכמיה/פרפוזיה (I/R), הגנה מפני פגיעת I/R שריר הלב צריכה להיות ממוקדת לשימור שלמות המבנית והתפקודית המיטוכונדריאלית. תחזוקה של מטבוליזם האנרגיה של המיטוכונדריה לאחר אתגר ה-I/R חשובה במיוחד מכיוון שתפקוד התכווצות הלב תלוי כמעט לחלוטין ב-ATP שנוצר במיטוכונדריה. קרדיומיוציטים חיים אך אינם מתכווצים מועילים מעט מאוד.

CISTANCHE TUBULOSA טבעי להגברת החיסונית PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, כל הצמח המיובש שלCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae), הוא צמח טפיל הגדל בעיקר באזורי המדבר של צפון וצפון מזרח סין. הרבה סיסטאנצ'ה, המסווגת כצמח "יאנג ממריץ" ברפואה הסינית, נרשם למחסור בכליות, סטריליות נשית ועצירות הנובעת מיובש המעי בחולים סניליים (Chen, 1998). מחקרים קודמים במעבדה שלנו הראו שמתנולתמצית של Herba Cistancheמגביר את יכולת יצירת ATP של שריר הלב (Leung & Ko, 2008) ומגן מפני פגיעה I/R שריר הלב בחולדות (Leung, 2006). בעוד שגירוי של כושר יצירת ATP היה במקביל לשיפור בהובלת אלקטרונים המיטוכונדריאלית (Leung & Ko, 2008), הגנת לב מפני פציעת I/R שהעניק טיפול ב-Herba Cistanche הייתה קשורה לירידה בדלדול ATP של שריר הלב (Leung, 2006). במחקר הנוכחי, כדי להגדיר את התפקיד של המיטוכונדריה בפעולת ההגנה הלבבית של Herba Cistanche, חקרנו את ההשפעה של טיפול ב-Herba Cistanche על מצב הגלוטתיון המיטוכונדריאלי, תכולת Ca2+, פוטנציאל הממברנה וקצב הנשימה, בלבבות של חולדות. .

חומרים ושיטות

חומר צמחי

Herba Cistanche נרכש מסוחר צמחי מרפא מקומי (מבוסס בהונג קונג) (Lee Hoong Kee). העשב אושר על ידי הספק ודגימת שובר (HKUST00301) הופקדה במחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה (HKUST). מיצוי מתנול של העשב בוצע, בהתבסס על מחקרים קודמים שהצביעו על כך שתמצית כזו שיפרה את יצירת ה-ATP של המיטוכונדריה והגנה מפני פגיעת I/R בלבבות של חולדה (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). בקצרה, Herba Cistanche (400 גרם) נחתך לחתיכות קטנות וחולץ על ידי חימום תחת ריפלוקס ב-300 מ"ל מתנול ב-60 מעלות למשך שעתיים, כפי שתואר קודם לכן (Leung & Ko, 2008). ההליך חזר על עצמו פעמיים. התמצית שנאגרה יובשה על ידי אידוי הממס בלחץ מופחת; התשואה הייתה 42% (משקל משקל) ביחס לכמות העשב הגולמי. התמצית אוחסנה ב-4 מעלות עד לשימוש. למרות שעשבי תיבול סיניים מופקים באופן מסורתי במים לצריכה דרך הפה, מתנול שימש במחקר הקודם שלנו לנוחות בעיבוד ואחסון של דגימות (Yim & Ko, 2002), ומצאנו מיצוי מתנול משביע רצון מכל הבחינות.

טיפול בבעלי חיים וטיפול תרופתי

חולדות נקבות Sprague-Dawley בוגרות (גיל 8-10 שבועות; 200-230 גרם) אוחסנו בחדר מבוקר לחות, עם מחזור חושך/אור של 12 שעות, ב-22 מעלות בערך, ואפשרו מזון ומים באופן חופשי. בעלי חיים חולקו באופן אקראי לקבוצות שונות, עם חמש חיות בכל קבוצה. חולדות קיבלו אתתמצית Herba Cistancheתוך קיבה ({{0}}.2 גרם/מ"ל במים) ב-0.5g/kg או 1.0 g/kg במשך 3 ימים רצופים. חיות בקרה (לא מטופלות) קיבלו מים בלבד. 24 שעות לאחר המינון האחרון, רקמת חדרי הלב התקבלה מחיות מורדמות לניתוח ביוכימי. כל הפרוטוקולים הניסויים אושרו על ידי ועדת המחקר, HKUST.

הכנת שברים מיטוכונדריה

רקמות חדרי לב קצוצות (~{{0}}.6g) הומוגגו בעודף 10-(w/v) של חיץ סוכרוז קר כקרח [0.32M סוכרוז, 1mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), 50mM Tris/HCl; pH 7.4] באמצעות הומוגניזר טפלון-זכוכית, ב-4000 סל"ד, עם 25-30 פעימות. כדורי מיטוכונדריה הוכנו מהומוגניות של רקמות על ידי צנטריפוגה ב-800×g ב-4 מעלות למשך 30 דקות, והטוהר נקבע על ידי מדידה של הפעילויות הספציפיות היחסיות של succinate dehydrogenase ו-lactate dehydrogenase בסופרנטנט ובגלולה, בהתאמה, כפי שתואר קודם לכן (Evans, 1992). כדורי מיטוכונדריה הושעו ב-1 מ"ל של חיץ הומוגנית.

מדידה של מיטוכונדריה מופחתת רמות גלוטתיון וגלוטתיון מחומצן

רמות הגלוטתיון המופחתות במיטוכונדריה (GSH) נקבעו אנזימטית באמצעות 5,59-dithiobis(2- nitrobenzoic acid) (DTNB) וגלוטתיון רדוקטאז (GR), בפרוטוקול שונה מ-Griffith (198{{17} }). מנה (210 µL) של החלק המיטוכונדריאלי עורבב עם 90 µL של 10% (v/v) 5-סולפוסליצילית (SSA) וה- התערובת עברה צנטריפוגה ב-600×g למשך 10 דקות. כדי למדוד רמות גלוטתיון מחומצן (GSSG), כמויות של 100 µL של סופרנטנטים SSA מעורבבו עם 10 µL של 20% (w/v) 2-vinylpyridine ו-10 µL 60% (v/v) triethanolamine בצינורות מיקרופיוג'. כל צינור הורשה לעמוד בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות. תערובת תגובה המכילה 0.63mM DTNB ו-0.053mM NADPH (מופחת ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט) במאגר פוספטים (0.1M, עם 5mM Na2 EDTA; pH7.5) הודגרה מראש ב-30 מעלות למשך 2 דקות. מנה (30 μL) של סופרנטנט מדגימת SSA (גלוטתיון כולל) או דגימת GSSG נוספה לבאר של 96-צלחת מיקרוטיטר באר, ו-180 μL של תערובת תגובה שחוממת מראש, המכילה 0.525U/ מ"ל GR, נוסף לאחר מכן. שינויי ספיגה ב-412nm נוטרו בספקטרופוטומטריה למשך 5 דקות. הריכוזים של GSH ו-GSSG נאמדו מעקומות כיול באמצעות GSH ו-GSSG [מומס ב-3% (w/v) SSA] כסטנדרטים ומבוטאים כ-nmol/mg חלבון. רמות GSH נאמדו על ידי הפחתת כמות כפולה של GSSG מזו של GSH הכולל.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%

מדידה של תוכן Ca2+ במיטוכונדריה

תכולת Ca{{0}} המיטוכונדריאלית נמדדה באמצעות פרוב פלואורסצנטי רגיש Ca2+-, Fluo-5N AM ester (Molecular Probes, Eugene, OR) תוך שימוש במונה Victor2 Multi-Label (דגם 1420; PerkinElmer, Turku, פינלנד), כמתואר ב-Menze et al. (2005). קבועי ניתוק Ca2+ (ערכי Kd) נקבעו באמצעות ערכת כיול Ca2+ שתקפה בטווח הריכוזים 1-1000 µM; ערכי Kd המשוערים היו 90-100 מיקרומטר, עם אמינות גבוהה, על פי נתוני יצרן הערכה. מנה (25 µL) של החלק המיטוכונדריאלי (ריכוז סופי של 0.5 מ"ג חלבון/מ"ל) מעורבב עם חיץ דגירה של 25 µL {100mM KCl ו-30mM MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]; pH7.2} בצלחת מיקרוטיטר שחורה היטב 96-. התערובת הודגרה ב-25 מעלות למשך 15 דקות; לאחר מכן נוספו 25 μL דיגיטונין (50 µg/mL) ו-25 μL Fluo-5N AM (1 μM ב-0.005% (w/v) Pluronic F-127). על ידי הקלת חדירת ממברנה, דיגיטונין תיווך כניסה מיטוכונדריה של צבע ניאון. מצאנו שרמות Fluo-5N בתכשירים המיטוכונדריים של לב חולדה עלו פי 20- בנוכחות דיגיטונין. תערובות תגובה הודגרו ב-25 מעלות למשך 30 דקות, וקריאות הקרינה נמדדו באורך גל עירור של 488 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​532 ננומטר. תכולת Ca2+ במיטוכונדריאל הוערכה באמצעות עקומת כיול והובאה כ-µmol/mg חלבון.

מדידת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית

פוטנציאל הממברנה (ΔΨm) הוערך בשיטה ששונתה מזו של Bonavita et al. (2003), תוך שימוש בצבע פלואורסצנטי, הבדיקה הקטיונית הליפופילית 5,596,69- tetrachloro-1,193,39-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodide, המכונה בדרך כלל JC-1. מנות (50 μL) של חלקי מיטוכונדריה (מותאמים ל-1mg חלבון/mL) הודגרו ב-37 מעלות עם 50 μL של תמיסת מצע (המכילה 6mM פירובט ו-6mM malate), 25 μL של תמיסת אדנוזין דיפוספט שטופלה מראש) (30mM) ו-25 µL של 3 µM JC-1, בחושך. ערכי ΔΨm התקבלו על ידי מדידת הקרינה ב-535nm (FL1) לעומת 580nm (FL2), באמצעות מונה Victor2 MultiLabel. JC-1 יוצר אגרגטים במיטוכונדריה, וכתוצאה מכך ערכי פלואורסצנטי FL2 גבוהים ומצביעים על פוטנציאל מיטוכונדריאלי תקין. אובדן של ΔΨm מוביל להפחתת הקרינה של FL2 (מצטברות JC-1 במידה פחותה) ולעלייה נלווית של הקרינה של FL1 (ממונומרים של JC-1). הנתונים הובאו כיחסים של ערכי הקרינה FL1/FL2. קרבוניל ציאניד m-chlorophenylhydrazone (CCCP), חומר ממוטט ΔΨm, שימש לאימות המבחן.

מדידת נשימה מיטוכונדריאלית

קצב הנשימה המיטוכונדריאלי נמדד ב-37 מעלות באמצעות מכשיר Hansatech Oxygraph-Plus המצויד באלקטרודת חמצן מסוג Clark (Sarasota, FL, ארה"ב). חלקי מיטוכונדריה (0.6 מ"ג חלבון/מ"ל) הושעו במאגר נשימה המכיל 125 מ"מ KCl, 2 0 מ"מ MOPS, 10 מ"מ טריס, 0.5 מ"מ חומצה אתילן גליקול טטראצטית (EGTA) ו-2 מ"מ KH2 PO4; pH 7.2. לאחר דגירה ב-37 מעלות למשך 2 דקות, כל דגימה קיבלה תמיסת מצע של 50 µL (5 מ"מ פירובט ו-5 מ"מ מאלאט). קצבי הנשימה נמדדו בנוכחות (מצב 3) של 1mM ADP ולאחר זרחון של כל ADP ל-ATP (מצב 4). היחס בין שיעורי הנשימה State 3:State 4 הוא מדד בקרת הנשימה, המצביע על אטימות הצימוד בין נשימה לזרחון (Javadov et al., 2005; Kuwabara et al., 1997). לפני הוספת תמיסת המצע, קצב נשימה מצב 1 נמדד עד תחילת הנשימה מצב 2, וקצב נשימה מצב 2 נאמד לפני הוספת ADP.

ניתוח סטטיסטי

הנתונים נותחו על ידי ניתוח שונות של שונות (ANOVA) עבור השוואות קבוצות מרובות. ערכי הבדל מובהק פחות (LSD) שימשו לזיהוי הבדלים משמעותיים בין שתי הקבוצות כאשר ערכי p היו < 0.05.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%

תוצאות

כפי שמוצג באיורים 1 ו-2, טיפול עם מתנולתמצית של Herba Cistanche({{0}}.5 או 1.0 גרם/ק"ג/יום×3) שיפרו באופן משמעותי את מצב הגלוטתיון המיטוכונדריאלי בלבבות חולדות, כפי שהוכח על ידי עליות תלויות מינון ברמות GSH (11-30%) וירידה ב רמות GSSG (31%).

טיפול ב-Herba Cistanche הפחית את רמות Ca2+ המיטוכונדריאלי בלבבות חולדות בהשוואה לביקורות, בהתאם למינון; הדיכוי היה 41% במינון של 1.0 גרם/ק"ג (איור 3).

טיפול ב-Herba Cistanche העלה את המיטוכונדריאלי ΔΨm, כפי שמעידה על ירידה (14-16%) ביחס FL1/FL2. CCCP (100 µM) גרם לקריסת ΔΨm, כפי שמצוין על ידי עלייה ביחס FL1/FL2 (איור 4).

טיפול ב-Herba Cistancheנשימה מיטוכונדריאלית משופרת, כפי שמעידה שיעור גבוה משמעותית של נשימה במצב 3 (84%) בחיות ניסוי בהשוואה לבקרות (טבלה 1). רמות הנשימה מצב 2 ומצב 4 עלו ב-47 ו-80%, בהתאמה, אך הגירוי של נשימה מצב 4 דוכא לחלוטין על ידי 1mM guanosine-5'-diphosphate, מעכב של ניתוק חלבון 2/3. הטיפול ב-Herba Cistanche לא השפיע על מדד בקרת הנשימה, כפי שנאמד על פי היחס בין שיעורי הנשימה של מצב 3/מצב 4.

דִיוּן

מיטוכונדריה שבודדו מלבות חולדות שטופלו ב-Herba Cistanche הראו מצב גלוטתיון משופר, כפי שצוין על ידי עלייה ברמות GSH וירידה ברמות GSSG. שמירה על מצב חיזור הגלוטתיון המיטוכונדריאלי היא קריטית להגנה על הלב מפני פציעת I/R (Chiu & Ko, 2003). תכולת Ca2+ ציטוזולית עולה במהלך איסכמיה שריר הלב, באמצעות ספיגה על ידי הממברנה הפנימית Ca2+ uniporter (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990), מה שמוביל ל-Ca המיטוכונדריאלי{{6} } הצטברות. התוצאות שלנו מצביעות על כך שטיפול בתמצית Herba Cistanche הגביר את מצב חיזור הגלוטתיון המיטוכונדריאלי והפחית את רמת Ca2+ המיטוכונדריאלית, מה שעשוי להעניק הגנה מפני פגיעות I/R בשריר הלב (Leung, 2006). חוסר היכולת של טיפול ב-Herba Cistanche, במינון גבוה יותר של 1.0 גרם/ק"ג, להפחית עוד יותר את רמות ה-GSSG ו-Ca2+, עשוי להיות קשור לקיומו של מנגנון רגולטורי מגביל עצמי המשפיע על פוטנציאל חיזור הגלוטתיון ומצב הסידן במיטוכונדריה.

מיטוכונדריה מייצרות שיפוע פרוטונים אלקטרוכימי על פני הממברנה הפנימית, על ידי הובלת אלקטרונים. שיפוע זה משמש את סינתאז ATP כדי לזרחן ADP ל-ATP. ירידה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, כמו בהיפוקסיה/חמצן מחדש לאחר פציעה של קרדיומיוציטים מתורבתים (Chiu et al., 2008), מביאה להפחתה ביצירת ATP. טיפול ב-Herba Cistanche, שעשוי להגביר את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית של שריר הלב, עשוי לשפר את יצירת ATP, במיוחד במהלך רפרפוזיה פוסט-איסכמית. שוב, קיומו של מנגנון ויסות מגביל את עצמו עשוי להסביר מדוע השפעות הטיפול ב-Herba Cistanche על פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית אינן תלויות מינון.

טיפול ב-Herba Cistanche העלה מאוד את קצב הנשימה State 3 במיטוכונדריה של לב חולדה, כפי שהוערך על ידי צריכת חמצן. ממצא זה עולה בקנה אחד עם תוצאות שהתקבלו ממדידות חוץ גופיות ובמקום של יכולת ייצור ATP במיטוכונדריה (Leung & Ko, 2008). באופן מסקרן, למרות שטיפול ב-Herba Cistanche הפחית את רמת היציבות של ATP שריר הלב (לא מוצגים), הטיפול שיפר את יצירת ה-ATP המיטוכונדריאלי. המעורבות של נשימה לא מקושרת עשויה להסביר את התצפיות השונות הללו. זרחון חמצוני לא צמוד מתרחש כאשר פרוטונים מועברים על פני הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה בחזרה לתוך המטריצה ​​המיטוכונדריאלית, ובכך מתפוגג פוטנציאל הממברנה שנוצר על ידי שרשרת הובלה אלקטרונים. זה מביא להפחתה של כוח המניע הפרוטון המניע את היווצרות ATP (Garvey, 2003). כתוצאה מכך, ריכוז Ca2+ וייצור ROS במיטוכונדריה מוחלשים באופן דרמטי (Teshima et al., 2003). הצעה זו תואמת את תוצאות המחקר הנוכחי, שהראה ירידה ברמות Ca2+ המיטוכונדריאלי בלבבות שטופלו ב-Herba Cistanche. בנוגע לנשימה בלתי-מצמודה, סינתזה של חלבוני ניתוק (UCPs) עשויה להיגרם על ידי טיפול ב-Herba Cistanche. UCPs ידועים כמנתקים זרחון חמצוני, והביטוי של UCP1 בלבבות עכברים מהונדסים מוגנים מפני נזק לשריר הלב המושרה על ידי I/R (Hoerter et al., 2004). אפקט הניתוק של UCPs עוכב על ידי פורין נוקלאוטיד דיפוספטים וטריפוספטים (כגון ADP, ATP, גואנוזין דיפוספט (GDP) ו-GTP) (Echtay et al., 2002). במחקר הנוכחי, נמדדו פרמטרים מיטוכונדריאליים כגון פוטנציאל הממברנה וקצב הנשימה בנוכחות ADP (כסובסטרט); לכן אפקט הניתוק של UCPs היה מעוכב. עם זאת, כאשר נמדד קצב הנשימה במצב מיטוכונדריה 4 בהיעדר ADP, שיעור זה היה גבוה יותר במיטוכונדריה שהוכנו מלבות שטופלו ב-Herba Cistanche מאשר בלבבות של ביקורת לא מטופלת. קצב הנשימה מצב 4 משקף את צריכת החמצן על ידי המיטוכונדריה כאשר פרוטונים דולפים בחזרה לתוך המטריצה ​​המיטוכונדריאלית באמצעות מנגנון שאינו כולל F1 F0 -ATPase (Garvey, 2003). המעורבות האפשרית של UCPs בעלייה הנגרמת על ידי Herba Cistanche בנשימה מצב 4 נתמכת על ידי הממצא שהשיפור הזה דוכא על ידי התמ"ג (Bento et al., 2007).

לסיכום, טיפול ב-Herba Cistanche עשוי לשפר את מצב הגלוטתיון המיטוכונדריאלי, להפחית את רמת Ca2+ המיטוכונדריאלית ולהגביר את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת קצב הנשימה בלבבות החולדות. השיפור במצב הגלוטתיון המיטוכונדריאלי וביכולת התפקודית, והאינדוקציה המשוערת של UCPs, עשויים להיות קשורים להגנת הלב הניתנת על ידיטיפול ב-Herba Cistancheלאחר פציעת I/R.

תמצית צמח CISTANCHE TUBULOSA טבעית PHGS75% ECH 30% ACT 12%