ההשפעה של תמציות Cistanche Tubulosa על תפקוד הרבייה של זכר בחולדות סוכרתיות הנגרמות על ידי סטרפטוזוטוצין-ניקוטינאמיד-Ⅰ

1. הקדמה

סוכרת (DM) היא מצב בו יש מוגבררמות הגלוקוזבדם עקב חוסר היעילות של הלבלב בייצור מספיק אינסולין, או חוסר היכולת של הגוף להשתמש בו ביעילות. לפי ארגון הבריאות העולמי, מספר האנשים עם סוכרת עלה מ-108 מיליון ב-1980 ל-422 מיליון ב-2014 [1]. ישנן ארבע קטגוריות עיקריות: טרום סוכרת (שלב לפני סוכרת), סוג 1 (שבו הלבלב לא מצליח לייצר אינסולין), סוג 2 (הגוף אינו מצליח להשתמש באינסולין) וסוכרת הריונית (שמתרחשת במהלך ההריון). עקה חמצונית מתרחשת עקב חוסר האיזון בין ייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS) ונוגדי חמצון [2] המוביל לבסוף למצב הסוכרת. הסיבוכים של סוכרת כוללים אי ספיקת כליות, נזק עצבי, עיוורון, שבץ מוחי, התקף לב, מוות עובר ואי פוריות. [1]. מחקרים מראים שגרעיני זרע, חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) ומיטוכונדריה נפגעו באופן משמעותי בחולי סוכרת גברים [3]. לחץ חמצוני במהלך הובלת הזרע ישנה את תהליך מערכת הרבייה הגברית [4,5].

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%

תהליך ה-spermatogenesis נשלט על ידי ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-גונדאלי (HPG). ההורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH) המיוצר על ידי ההיפותלמוס ממריץ את הייצור של הורמון luteinizing (LH) והורמון מגרה זקיקים (FSH). תאי ליידיג נמצאים בסמוך לאבובית הזרע ולייצר טסטוסטרוןבשליטה של ​​LH. FSH מפעיל את הייצור של חלבון קושר אנטיגן (ABP) שעוזר להעביר את ההורמון הגברי. כך, בעיות פוריות ובעיות אחרות נוצרות בעיקר עקב ההפרעות המתרחשות בציר ה-HPG. מתן השילוב של סטרפטוזוטוצין-ניקוטינאמיד גורם לסוכרת בחולדות ניסוי. סטרפטוזוטוצין הוא תרכובת כימית רעילה לתאים מייצרי אינסולין בלבלב וניקוטינמיד הוא ויטמין מסיס במים המגן על התאים מפני נזק מוחלט [6].

Cistanche tubulosa הוא מין צמחי מדבר הידוע גם בשם "רו קונג-רונג" [7]. זהו צמח טפילי לא כלורופילי הגדל בעיקר על שורש עץ Calotropis procera ומופץ באופן נרחב בארץ הצחיחה של גאנסו, צ'ינגהאי, שינג'יאנג, מונגוליה, איראן והודו. השם הנפוץ של Cistanche tubulosa הוא "יקינתון מדברי". הוא מקובל ברפואה הסינית המסורתית וקיבל את השם "ג'ינסנג של המדבר". הוא נמצא בשימוש נרחב בתחום הרפואי לטיפול בלוקוריאה חולנית, מטרורגיה שופעת, מחלות כליות כרוניות, עצירות, אימפוטנציה ואי פוריות. מרכיבים כימיים שלCistanche tubulosa מורכב מגליקוזידים פנילתנואידים לא נדיפים(PHGs), אירידואידים, ליגנאנים, שמנים נדיפים, אלדיטולים, אוליגוסכרידים ופוליסכרידים [8]. מחקרים מראים זאתechinacosideמצמח זה מגן על הפיברובלסט הפגוע על ידי ויסות רמות ROS [9]. תרכובת זו מייצרת נוגדי חמצון, הרפיית כלי דם ואנטי דלקתיים יחד עם הגנה עצבית ומניעת אוסטאופורוזיס [10,11].

מחקר זה נועד לחקור את ההשפעה שלתמצית Cistanche tubulosaהמכיל ECH על חוסר תפקוד הרבייה של החולדה הסוכרתית הנגרמת על ידי סטרפטוזוטוצין-ניקוטיןמיד.

2. חומרים ושיטות

2.1. חומרים

ECH ו-CTE נרכשו מ-Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (ילאן, טייוואן). מוצרי קצה מתקדמים של גליקציה (AGEs) נרכשו מ-Biovision (סן פרנסיסקו, קליפורניה, ארה"ב). קווי תאים LC-540 ו-TM3 נרכשו מהמכון למחקר ופיתוח של תעשיית המזון (Hsinchu, טייוואן). חולדות זכר של ספראג-דאולי (SD) בנות חמישה שבועות נרכשו מהמרכז הלאומי למעבדה לחיות (טייפיי, טייוואן). Feed Lab Diet® נרכשה מ-PMI Nutrition International, Inc. (טייפיי, טייוואן). 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) הושג מסיגמא (St. Louis, MO, ארה"ב). מתנול ו-4-(2-hydroxyethyl)-1-חומצה פיפרזין-אתן-סולפוני (HEPES) נרכשו גם כן מ-Sigma. Dulbecco's Modified Eagle medium/F12 וטריפסין-EDTA התקבלו מ-GIBCO (ניו יורק, ניו יורק, ארה"ב). 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), דימתיל סולפוקסיד (DMSO), וניטרובלו טטרזוליום (NBT) נרכשו מסיגמא. ערכות אנזימטיות של גלוקוז התקבלו מ- Kyokutoseiyaku, טוקיו, יפן. ערכות אינסולין ELISA נרכשו מ-Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, שוודיה). מגיב למיצוי חלבון רקמות T-PER נרכש מ-Thermo Scientific (שיקגו, IL, ארה"ב). נוגדנים רב-שבטיים אנטי-אנושיים/עכבר/עכברושים-קאפה B NF-KB נרכשו מ-Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ארה"ב. קולטן אנטי-עכבר/עכברוש לנוגדנים רב-שבטיים (RAGE) מתקדמים glycation end products, נוגדנים רב-שבטיים אנטי-אנושיים/עכבר/עכברושים StAR, ונוגדנים חד-שבטיים נגד אדם/עכבר/עכברושים P450 17A1 נרכשו מ-Gene טקס (אירווין, קליפורניה, ארה"ב). נוגדנים רב-שבטיים CYP11A1 נגד אדם/עכבר/עכבר הושגו מ- Cell Signaling Technology (Beverly, PA, ארה"ב). ריאגנט Easy-Blue נרכש מ-Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, ארה"ב). Agarose וסמן DNA 100 bp התקבלו מ-Promega, Corporation (Madison, WI, ארה"ב). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit נרכשה מ-QIAGEN, Hilden, גרמניה.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. שיטות

2.2.1. ניתוח במבחנה

תרבית תאים LC{{0}} ו-TM3: שורות התאים LC-540 תורבו ב-37 ◦C במדיום של Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) בתוספת נתרן ביקרבונט (1.5 גרם/ליטר), L-גלוטמין (2 mM), חומצות אמינו לא חיוניות (0.1 mM), נתרן פירובט (1.0 mM), וסרום בקר עוברי (FBS) (10%) חממת CO2 5% (חממת CO2, Napco 5410, טייוואן). קו התאים TM3 תורבת במדיום נשר שונה (DMEM) של Dulbecco בתוספת גלוקוז (4.5 גרם/ליטר), נתרן פירובט (0.5 מ"מ), L-גלוטמין (2.5 מ"מ), נתרן ביקרבונט (1.2 גר'/ליטר), {{ 28}}(2-הידרוקסי-אתיל)-1-חומצה פיפרזין-אתן-סולפוני (HEPES, 15 מ"מ), וסרום עגל עוברי (FCS, 10%) או סרום סוס (5%) ב-37 ◦C ב-5% חממת CO2.

קביעת כדאיות התא שלEchinacoside (ECH): 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) שימש לבדיקת כדאיות התא. ריכוז התא הותאם ל-2 × 105 תאים/מ"ל בצלחת באר 96-. לאחר מכן, נוספו 20 μL של ECH (מדולל ב-2% ממדיום) והודגרו במשך 24 שעות ב-37 ◦C בחממה של 5% CO2. מאוחר יותר, נוספו 100 μL מגיב MTT והודגרו במשך 4 שעות ב-37 ◦C בתנאי חושך. הספיגה נמדדה ב-570 ננומטר (ELISA reader, Dynatech MR5000, Kloten, שוויץ).

כדאיות תאים יחסית (%)=[(Asample ב-570 ננומטר − Ablank ב-570 ננומטר)]/[(Acontrol ב-570 − Ablank ב-570)] × 100.

Nitroblue Tetrazolium (NBT) Assay Reduction ו-2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Assay: מספר התאים הותאם ל-1×1{{10}}6 תאים/ מ"ל. לאחר מכן, נוספו 50 מ"ג/מ"ל של ECH, רזברטרול (RES) ומוצרי קצה של גליקציה מתקדמים (AGEs) (ביקורת) ותופחו יחד במשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, 0.3 מ"ל של תמיסת NBT (0.1 מ"ג/מ"ל NBT, 5% FBS ו-3% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) מומס ב-10 מ"ל DMEM) נוספו והודגרו ב-37 ◦C ב-5% CO2 למשך שעה. לאחר צנטריפוגה (ב-800×g למשך 3 דקות) הוסר הסופרנטנט ונוספו 200 μL DMSO ונערו במשך 5 דקות במתנד קולי (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, טייוואן). הספיגה נמדדה ב-630 ננומטר. עבור בדיקת DPPH רדיקלית, Trolox (ב-95% אלכוהול) נלקח כסטנדרט. לאחר מכן, 75 μL של תמיסת DPPH של 0.5 מ"מ עורבבו עם 25 μL של דגימות והורשו להגיב בטמפרטורת החדר במקום חשוך למשך 30 דקות. התערובת נערה והספיגה נמדדה ב-517 ננומטר.

ניתוח תוכן של מיני חמצן תגובתי (ROS): מספר התא הותאם ל-2 × 105 תאים/מ"ל בצלחת 12-באר המכילה 2% FBS. לאחר מכן, 50 μL/mL של ECH, RES ו-AGEs נוספו לצלחת והודגרו ב-37 ◦C למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, 20,70 -דיchlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) נוספה והודגרה ב-37 ◦C למשך 30 דקות. לאחר צנטריפוגה (400× גרם, 5 דקות), הסופרנטנט הוסר והתאים נשטפו פעמיים עם מי מלח מבוצר בפוספט (PBS). לאחר מכן, התאים הושעו ב-1 מ"ל של PBS ורמות ה-ROS נקבעו באמצעות ציטומטר זרימה (Citometer Flow, Becton Dickinson, CA, ארה"ב).

זיהוי וניתוח כמותי של חלבון: חלבונים הופקו באמצעות ריאגנט למיצוי חלבון (T-PER). צפיפות התאים הותאמה ל-2 × 105 תאים/מ"ל בצלחת של 12-באר ו-50 µL/mL של ECH, RES וקולטן לאנטגוניסט המתקדם של glycation endproduct (RAGE), ו-AGEs נוספו והודגרו ב-37 ◦C בחממה של 5% CO2 למשך 24 שעות. לאחר מכן, נוספו 400 μL של T-PER, גרדו מהתאים ובוצעו בצנטריפוגה ב-125,000×g למשך 20 דקות (4 ◦C). הסופרנטנט נאסף ואוחסן ב-80 ◦C (-80 ◦C מקפיא, Nuaire, Plymouth, MN, ארה"ב) לניתוח נוסף. ערכת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) שימשה לכימות חלבון. לאחר מכן, 10 µL של תמיסת תאים סטנדרטית ו-200 µL של מגיב BCA נוספו לצלחות הבאר והודגרו ב-37 ◦C באינקובטור של 5% CO2 למשך 30 דקות. הספיגה נמדדה ב-562 ננומטר. ניתוח זיהוי חלבון בוצע על ידי אלקטרופורזה של סודיום דודציל סולפט (SDS)-polyacrylamide ג'ל (SDS-PAGE). דגימות הוכנו על ידי הוספת ליזאט חלבון למאגר טעינת חלבון ובוצע ניתוח Western blot כדי לזהות את החלבונים הספציפיים.

2.2.2. In Vivo ניתוח

עיצוב מודל בעלי חיים: שישים {0}}חולדות זכר של ספראג-דאולי (SD) בנות שבוע נרכשו מהמרכז הלאומי למעבדה לחיות (טייפיי, טייוואן). כל חולדה אוכסנה בנפרד בכלובי נירוסטה מחטאים בטמפרטורה מבוקרת (23 ± 1 ◦C) ולחות (40-60%) עם מחזור אור/12 שעות כהה של 12 שעות. מזון ומים סופקו באופן חופשי. כל חולדה בוייתה בשבוע הראשון וקיבלה דיאטת מכרסמים מעבדתית 5001 כתזונה העיקרית. כל ההליכים פעלו לפי התקן של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (אישור IACUC מס' 101026) של אוניברסיטת טייוואן אוקיינוס ​​הלאומית, טייוואן. לאחר הביות חולקו חולדות לשתי קבוצות: קבוצת הביקורת (קון) שניזונה בדיאטה מעבדה 5001, וקבוצת הסוכרתיים שניזונה בדיאטה עתירת שומן (HFD, 40%) במשך כל הניסוי. לאחר שהוזנו ב-HFD במשך 4 שבועות, לחולדות מקבוצת הסוכרת הוזרק סטרפטוזוטוצין (65 מ"ג/ק"ג) (STZ) כדי לגרום לסוכרת (DM). תוך 15 דקות מהזרקת STZ, הוזרק ניקוטינאמיד (230 מ"ג/ק"ג משקל גוף). שבוע לאחר ההזרקה, נערכה בדיקת סבילות גלוקוז דרך הפה (OGTT) כדי לקבוע את ההשראה המוצלחת של סוכרת (DM). לאחר מכן, החיות חולקו לשש קבוצות: הביקורת (מוזנת בתזונה מעבדה 5001); קבוצת DM (DM + 45% HFD); קבוצת DMR (DM + rosiglitazone: 0.571 מ"ג/ק"ג BW) + 45% HFD; קבוצת DME1 (DM + CTE: 80 מ"ג/ק"ג BW) + 45% HFD; קבוצת DME2 (DM + CTE: 160 מ"ג/ק"ג BW) + 45% HFD; וקבוצת DME4 (DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45% HFD. Rosiglitazone (RSG) נלקח כביקורת חיובית. נעשה שימוש בשלוש מנות של CTE (80, 160 ו-320 מ"ג/ק"ג) בהתאם להמלצת מינהל המזון והתרופות של טייוואן (TFDA) להערכה תפקודית של מזון בריאות. הטיפולים ניתנו עד לסיום הניסוי. כל חולדות הניסוי הוקרבו לאחר 6 שבועות. הדם שנאסף מהחולדות עבר צנטריפוגה ב-3000 סל"ד למשך 15 דקות ב-4 ◦C. הסופרנטנט נבדק לצורך הניתוח הבא:

קביעת גלוקוז כולל, טריגליצרידים וכולסטרול: קביעת הגלוקוז בוצעה על ידי ערכות אנזימטיות של גלוקוז. לאחר מכן, 20 μL של דגימות פלזמה דם נוספו לראגנטים ונשמרו ב-37 ◦C למשך 5 דקות. סך הטריגליצרידים וריכוז הכולסטרול הכולל נקבעו באמצעות ערכות אנזימטיות של טריגליצרידים וכולסטרול. לאחר מכן, נוספו לריאגנטים 10 μL של פלזמה דם והניסוי נערך בהתאם להוראות היצרן. הספיגה נמדדה ב-510 ננומטר.

סך גלוקוז/טריגליצרידים/כולסטרול בפלזמה (מ"ג/ד"ל)=(Asample - ABlank)/(Astandard - ABlank) × 200.

דוגמה: ספיגה של דגימות דם, ABlank: ערך ספיגה של ערכות ללא דגימה, א-סטנדרטי: ערך ספיגה של המגיב הסטנדרטי, 200: ריאגנטים סטנדרטיים בריכוז של 200 מ"ג/ד"ל.

הערכת מודל אינסולין, לפטין והומאוסטטי – קביעת עמידות לאינסולין (HOMA-IR):רמת האינסולין נקבעה על ידי ערכות אינסולין ELISA. הנה, 25µל-L של פלזמת דם נוספהריאגנטים, והספיגה נמדדה ב-450 ננומטר. תכולת הלפטין הכוללת נקבעה באמצעות אערכת בדיקה אימונומטרית של אנזים לפטין.ואז, 100µL של פלזמה נותחה והספיגהנמדד ב-450 ננומטר באמצעות קורא ELISA. כל הניסוי נערך על פיהוראות היצרן. ערך HOMA-IR נקבע ממודל ההומאוסטזיסמשוואת הערכה=ריכוז האינסולין בפלזמה בצום (מ"ג/מ"ל)× גלוקוז פלזמה בצוםריכוזים (ממול/ליטר)/22.5.

חמצון ליפידים בפלזמה: כאן, {{0}}.5 מ"ל של פלזמה בדם מעורבב עם 1 מ"ל של ריאגנט (15%, w/v חומצה טריכלורואצטית ב-0.25 N חומצה הידרוכלורית (HCl) ) ו-0.375%, w/v thiobarbituric acid ב-0.25 N HCl) והונחו באמבט מים (Water Bath, BUCHI 461, ציריך, שוויץ) ב-100 ◦C למשך 15 דקות. לאחר הקירור, נוספו 1 מ"ל של n-בוטנול, מזועזע במרץ, וצנטריפוגה ב-1500×g למשך 10 דקות. הסופרנטנט נאסף והספיגה נמדדה ב-532 ננומטר [12].

ריכוז מלונדאלדהיד (MDA) (nM/mL)=[(דגימה ב-532 ננומטר − ריק ב-532 ננומטר)/ (תקן ב-532 ננומטר − ריק ב-532 ננומטר)] × 5.

סטנדרטי ב-532 ננומטר − ריק ב-532 ננומטר)] × 5. קביעת רמות טסטוסטרון בפלזמה והורמון luteinizing (LH): ערכת הטסטוסטרון ELISA שימשה למדידת רמת הטסטוסטרון בפלסמת הדם. ערכת RIA שימשה לקביעת ריכוז LH. לאחר מכן, נוספו 50 µL של פלזמה והחישובים התבססו על ריכוז ההורמון LH-RP-3 (סטנדרטי). השלבים הנוספים בוצעו בהתאם להוראות היצרן.

קביעת ריכוז נמק הגידול (TNF)- ואינטרלוקין-6 (IL-6): הנוגדן שנלכד היה מדולל 250 פעמים במאגר ציפוי, נוסף ל-96- צלחת באר (100 μL/באר), ונשמרה ב-4 ◦C למשך הלילה. הסופרנטנט נשאב ונשטף חמש פעמים עם חיץ כביסה (פעם אחת PBS, 0.05% Tween 20). לאחר דגירה (שעה אחת) עם 200 מיקרוגרם של דילול בדיקה, התאים נשטפו 5 פעמים עם חיץ כביסה ו-100 μL של תמיסה סטנדרטית של TNF או דגימות בדיקה נוספו לכל באר והודגרו במשך שעתיים. לאחר הכביסה, נוספו 100 μL של נוגדנים שזוהו IL-6- והודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הסופרנטנט נשאב ונשטף 5 פעמים. לאחר מכן, נוספו 480 μL של אנזים אבידין-חזרת פרוקסידאז (HRP) והודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסופרנטנט נשאב ונשטף חמש פעמים עם חיץ כביסה. לאחר מכן, נוספו 100 μL של תמיסת מצע והודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מאוחר יותר, נוספו 50 μL של תמיסת עצור (1M חומצה זרחתית) לכל באר והספיגה נמדדה ב-450 ננומטר.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לתיקון תפקוד מיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ניתוח פרמטרים של זרע ואשך

איסוף דגימות זרע: איסוף דגימת הזרע בוצע לפי השיטה שדווחה בעבר ב-[13]. הזרע נאספו מהסופרנטנט ושימשו לניתוח נוסף.

מספר הזרע, תנועתיות הזרע וזרע לא תקין: מספר הזרע חושב באמצעות ההמוציטומטר ותמיסת טריפן כחולה. לאחר מכן, 100 μL של נוזל זרע מעורבב עם תמיסה כחולה טריפן ומספר הזרע, תנועתיות וזרע לא תקינים חושבו באמצעות המוציטומטר ומיקרוסקופ [14].

הפחתת Nitro blue Tetrazolium NBT וחמצן שומנים של זרע ואשך: החמצן השומנים והפחתת ה-NBT נותחו לפי אותו הליך של ניתוח פלזמה.

קביעת פעילות Superoxide Dismutase (SOD) ו- Catalase: פעילות Superoxide Dismutase (SOD) נותחה באמצעות ערכת RANSEL. כאן, {{0}}.05 מ"ל של הומוגנטים של אשכים נוספו ל-1.7 מ"ל של תמיסת תגובה (0.05 מ"מ קסנטין, 0.025 מ"מ 2-({ {9}}iodophenyl)- 3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloride (INT)). לאחר הערבוב, נוספו 0.25 מ"ל קסנטין אוקסידאז (80 U/L) והגיבו בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. הספיגה נמדדה ב-505 ננומטר. ריכוז החלבון של הומוגנט האשכים נקבע על ידי ערכת בדיקת חלבון Bio-Rad DC וחושבה פעילותו הספציפית (U/mg חלבון). פעילות הקטלאז (CAT) נקבעה על פי שיטה שדווחה בעבר [15].

צביעת H&E (המטוקסילין ואאוזין).

האשך הושרה ב-10% פורמלין למשך 24 שעות ואוחסן ב-4 מעלות צלזיוס. הרקמות היו בגודל המיקרו ומוצמדות לשקופית. לאחר קיבוע (95% מתנול + 5% חומצה אצטית), השקופיות הוטבלו בהמטוקסילין למשך 3 דקות, נשטפו במים זורמים למשך 5 דקות, ולאחר מכן הושרו אותן ב-50%, 70% ו-90% אלכוהול למשך דקה אחת. לאחר מכן, השקופיות הוכתמו באאוזין למשך 10 שניות והושרו ב-100% אלכוהול למשך דקה אחת עד שהוא דהה. לבסוף, השקופית הושרה בקסילן למשך דקה. מאוחר יותר, המגלשה בוצעה יבשה באוויר ונאטמה. הצינור המוכתם הונח במיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, טוקיו, יפן) כדי לצפות במורפולוגיה.

ניתוח של ההיפותלמוס

רצפי הגנים של העכבר KISS1, G-protein-coupled receptor (GPR) 54, מדכא של איתות ציטוקינים 3 (SOCS-3), ורצפי הגנים sirtuin 1(SIRT1) זוהו ממסד הנתונים של הגנים של NCBI (המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה). ופריימר ספציפי תוכנן באמצעות פריימר 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, ארה"ב). הפריימרים ששימשו בניסוי מפורטים בטבלה 1.

מיצוי חומצה ריבונוקלאית (RNA) מההיפותלמוס. מיצוי ה-RNA מההיפותלמוס של המוח בוצע באמצעות RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. ה-mRNA שהתקבלו נמדדו כמותית על ידי שעתוק הפוך (RT) ותגובת שרשרת פולימראז (PCR). ה-DNA המחמיא שהתקבל מניתוח RT אוחסן ב-20 ◦C לשימוש מאוחר יותר. ה-DNA שחולץ היה נתון לניתוח תגובת שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות Taq polymerase. לאחר מכן, 5 ~ 10 μL של מוצר PCR נלקחו ונותחו על ידי אלקטרופורזה על קולואיד אגר 1.5%. התמונה צולמה במערכת הדמיה UVP BioDoc-It. נלקחה חומצה דאוקסיריבונוקלאית משלימה (cDNA) המשלימה לאחור ו-PCR בוצעה באמצעות ערכת IQ SYBR Green Supermix. מאוחר יותר, הוא נותח עם תוכנת המערכת האופטית iQTM 5. חלבונים הופקו באמצעות ריאגנט למיצוי חלבון (T-PER). לאחר מכן, נוספו 20 מ"ג של הומוגנט אשכים ל-400 μL של T-PER ועברו צנטריפוגה (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, גרמניה) ב-4 ◦C (125,000× g ) למשך 20 דקות. השיטה הבאה הייתה דומה ל"ניתוח זיהוי וכימות של חלבון" בניתוח במבחנה.

2.3. ניתוח סטטיסטי

תוצאות הניסוי הובעו כממוצע ± סטיית התקן (ממוצע ± SD) והנתונים נותחו באמצעות פתרונות מוצר ושירות סטטיסטיים (SPSS) 11.0 תוכנה, IBM, Armonk, ניו יורק, ניו יורק, ארה"ב. ההבדלים בין הקבוצות נותחו על ידי ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA). השוואות מרובות של קבוצות שונות נותחו על ידי מבחן Duncan בערך של p < 0.05 כרמה המובהקת.

3. תוצאות

3.1. ניתוח במבחנה

3.1.1. השוואה של פעילויות נוגדות חמצון של ECH, CTE ו-RES

ח לטווח ארוךמתח חמצוני גבוה ודלקת כרונית הם הגורמים העיקריים לסוכרתייםסיבוכים [16]. CTEs מכילים שוניםphenylethanoid גליקוזידים כגון echinacoside(ECH) ואקטאוזיד, עם פוטנציאל לפעילות נוגדת חמצון [17]. DPPH ניקוי רדיקליבדיקה בוצעה כדי להעריך את פעילות נוגדת החמצון של ECH. טרולוקס ורזברטרול(3,5,4'-trihydroxystilbene, RES) נלקחו כביקורת סטנדרטית וחיובית בהתאמה. כפי שמוצגבאיור1, ECH הראה פעילות ניקוי רדיקלית טובה יותר והפעילות הייתה גבוהה יותר באופן משמעותימזו של הבקרה החיובית (RES).

3.1.2. כדאיות תאים של ECH בתאי LC-540 ו-TM3 Leydig

בדיקת MTT בוצעה כדי להעריך את כדאיות התא של ריכוזים שונים של ECH. תאי LC-540 Leydig ותאי TM3 Leydig הראו יותר מ-80% של כדאיות לאחר שטופלו ב-ECH (איור 2). בהשוואה לריכוזים האחרים, ריכוז 100-µM (דילולים של 100 µM ב-2% FBS) של ECH הראה כדאיות תאים טובה יותר בתאי TM3 Leydig. התוצאה הצביעה כי הריכוז המוגבר של ECH אינו תורם כל רעילות משמעותית לתאים.

3.1.3. השפעת ECH על ייצור סופראוקסיד המושרה על ידי AGE על ידי NBT Assay בתאי LC-540 ו-TM3 Leydig

AGEs גורמים לנזק חמצוני בגוף עקב חמצון של גלוקוז ויצירת רדיקלים חופשיים כגון O2-, רדיקלים הידרוקסילים וקבוצות קרבוניל [18]. לאחר גירוי עם 50 ug/mL של AGEs, תאי LC-540 (איור 3a) ו-TM3 (איור 3b) טופלו ב-ECH ו-RES (5 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר כל אחד). התוצאות הראו שייצור של אניון סופראוקסיד גדל בקבוצת הביקורת (AGEs מעורר), אך ייצור אניון סופראוקסיד ירד לאחר קבוצת הביקורת (AGEs מעורר), אך ייצור אניון סופראוקסיד ירד לאחר ייצור סופראוקסיד ומוגן התאים מנזק חמצוני. במקרה של תאי LC-540, 10 µM ECH הראה פעילות כמעט דומה עם הקבוצה הרגילה. ייצור הסופראוקסיד בשני התאים ירד עם עלייה בריכוז של ECH ו-RES כאחד.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. השפעת ה-ECH על ייצור H2O2 בתאי LC-540 Leydig מעוררי AGE

בדיקת DCFH-DA בוצעה כדי לזהות נוכחות של מינים חמצוניים. לאחר הכניסה לתאים, הצבע הפלורסנטי DCFH-DA מתחמצן על ידי H2O2 תוך תאי ויוצר דיכלורופלואורסצין (DCF). כפי שמוצג באיור 4, הייתה עלייה משמעותית בייצור H2O2 התוך תאי בקבוצה המגורה AGE (ביקורת), בעוד שתוספת של 10 µM ECH ו-RES הפחיתה באופן משמעותי את ייצור H2O2 בתאים. מתן של 10 µM ECH הביא רק לכ-47.1% מייצור H2O2, נמוך משמעותית מאשר בקבוצת הביקורת.

3.1.5. השפעת ECH על רמות ביטוי חלבון RAGE ו-NF-κB בתאי LC-540 מעוררי AGE

ניתוח כתם Western בוצע כדי לאשר נוכחות של RAGE בתאי LC-540 Leydig. ההשפעה של ECH על רמות ביטוי חלבון RAGE (איור 5a) ו-NF-kB (איור 5b) בתאי Leydig מעוררי AGEs הוצגה באיור 5. התוצאות הראו שריכוז של 50 מיקרוגרם/מ"ל של AGEs גרר RAGE ו-NF- גבוהים יותר. ביטוי κB בתאי LC-540 Leydig וריכוז של 10 µM של ECH ו-RES הפחיתו באופן משמעותי את הביטוי של RAGE ו-NF-κB. הביטוי של NF-KB היה נמוך משמעותית ב-RES וב-ECH מאשר באנטגוניסטים של RAGE. לכן, התוצאות אישרו שה-ECH הפחית את רמת הדלקת על ידי הפחתת רמת ה-RAGE וה-NF-kB.

3.1.6. השפעת ECH על מסלול סינתזת הטסטוסטרון בתאי LC-540 מעוררי AGE.

תהליך של spermatogenesis ואי פוריות גבר תלוי בנוכחות של טסטוסטרון. כפי שמוצג באיור 6, הביטויים של חלבוני StAR (איור 6a), CYP11A1 (איור 6b), CYP17A1 (איור 6c) ו-HSD17 3 (איור 6d) ירדו באופן משמעותי ב-LC מגורה של AGE{{11 }} תאי ליידיג (קבוצת ביקורת). הביטויים של חלבוני StAR, CYP11A1, CYP17A1 ו-HSD17 3 גדלו באופן משמעותי כאשר נוספו האנטגוניסט RAGE, RES ו-ECH. הביטוי המוגבר של חלבוני StAR ו-CYP11A1 נראה גם בקבוצות שטופלו ב-ECH וגם ב-RES. רמת הביטוי של CYP17A1 הייתה כמעט דומה בקבוצות RES ו-ECH. הביטויים של חלבון HSD17 3 בתאי Leydig שטופלו ב-ECH היו גבוהים בהרבה מאלו של התאים שטופלו באנטגוניסטים של RES ו-RAGE. ביטוי מוגבר של חלבוני StAR, CYP11A1, CYP17A1 ו-HSD17 3 הצביע על ייצור תקין של טסטוסטרון.