פעילות אסטרוגנית של גליקוזידים מ- Cistanche Deserticola כחומר אדג'ובנט לקולטני אסטרוגן במבחנה

מבוא

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" בסינית), רפואת עשבים סינית מסורתית שנרשמה לראשונה בShenNongBenCaoJing, שימשה לטיפול בחוסר כליות, אימפוטנציה, עצירות סנילי ומחסור בדם במשך אלפי שנים.[1] הוא מופץ בעיקר באזורים מדבריים של צפון מערב סין, כמו גאנסו ושינג'יאנג.[2]מחקר פרמקולוגי מודרני הראה ש-C. deserticola יכול לקדם תפקודים רפואיים רחבים, כגון ויסות הורמונים, אימונומודולטורי, נוגד חמצון, נוירו-פרוטקטיבי, אנטי דלקתי,פעילות אסטרוגנית.[3,4] גליקוזידים של ציסטאנצ'ים(GCs) נחשבו כאחד המרכיבים הפעילים העיקריים עם השפעות ביולוגיות שונות.

קולטני אסטרוגן (ERs) ו-ER הם תת-הסוגים של ה-ERs שיכולים לווסת תפקודים פיזיולוגיים.[7] חלבונים אלה יכולים לווסת את התעתוק של גני מטרה על ידי קישור לרצפי ויסות DNA הקשורים בגרעין התא. שני תת-הסוגים מתבטאים בצורה ניכרת במערכת הלב וכלי הדם ובמערכת העצבים המרכזית.[8,9] ER קיים בעיקר בבלוטת החלב, הרחם, השחלה, העצם, איבר הרבייה הגברי ובערמונית. ER קיים בעיקר בערמונית, בשחלה ובשלפוחית ​​השתן.[10,11] יתרה מכך, ישנם כמה תפקידים פיזיולוגיים משותפים לשני תת-הסוגים, כגון בהתפתחות ותפקוד השחלות והגנה על מערכת הלב וכלי הדם.[ 12,13] מחקר קודם בקבוצה שלנו חשף את המנגנון הדומה לאסטרוגני של GCs בשיטת הניתוח המטבולומי.[14] במחקר מתמשך, ניתחנו את מנגנון הפעילות האסטרוגנית של GCs על שורות תאים MCF-7 הקשורות ל-ERs.

TUBULOSA CISTANCHE טבעי לשיפורפעילות אסטרוגניתPHGS75% ECH 30% ACT 12%

חומרים ושיטות

כלים

חממת ECO-170P-230 הגיעה מ-New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., Bio-Rad 680 microplate קורא ומכשירי אלקטרופורזה היו מבית Bio-Rad Laboratories, Inc., CX21 המיקרוסקופ של Olympus Co., Ltd. מערכת הדמיית ג'ל GIS-2019 הייתה של Tanon Science and Technology Co., Ltd., הצלחת התחתונה השטוחה הייתה מ-Corning Inc., ציטומטריית הזרימה EPICS-XL הייתה של Beckman-Coulter Inc., ו- StepOnePlus Real-Time פולימראז תגובת שרשרת ( מערכת PCR) הייתה מבית Thermo Fisher Scientific.

כימיקלים וריאגנטים

GCs הוכנו במעבדה שלנו כפי שדווחה בעבר, [14] והטוהר של GCs נקבע ל-52% (אקטאוזיד שימש כסמן לקביעת GCs) על ידי ספקטרופוטומטריה אולטרה סגולה. אסטרדיול (E2) נרכש מחברת Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (שנחאי, סין). סרום בקר עוברי (FBS) ו-RPMI-1640 היו מבית Gibco Co., Ltd., צלחת תחתית שטוחה בעלת 96 בארים הייתה מ-Corning Inc., ודימתיל סולפוקסיד (DMSO) ו-3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl ]‑2,5‑diphenyltetrazolium bromide (MTT) נרכשו מ-Sigma-Aldrich Corporation. מגיב TRIzol, ערכת שעתוק לאחור (RT) וערכת TB Green™ RT-PCR נרכשו מ-TaKaRa Co., Ltd., Dalian, סין. נוגדני Anti-ER Rabbit pAb, Anti-ER Rabbit pAb ו-actin נרכשו מ-Wanlei Biotechnology Co., Ltd. כל שאר הכימיקלים הנפוצים נרכשו מספקים מסחריים סטנדרטיים.

הכנה לדוגמא

הכנת גליקוזידים של תמיסת מניות Cistanches

תמצית GC הומסה ב-DMSO כדי ליצור תמיסת מניות בריכוז של 0.1051 גרם/מ"ל ואוחסנה ב-4 מעלות. RPMI-1640 ללא פנול אדום שימש כדי לדלל את תמיסת המניות לריכוזים שונים לפני השימוש.

הכנת תמיסת מניות אסטרדיול

תמצית E2 הומסה ב-DMSO כדי ליצור תמיסת מניות בריכוז של 0.27 מ"ג/מ"ל ואוחסנה ב-4 מעלות. RPMI-1640 ללא פנול אדום שימש כדי לדלל את תמיסת המניות לריכוזים שונים לפני השימוש.

הכנת סרום בקר עוברי שטופל בפחם בדקסטרן

מאה מיליליטר של FBS עורבבו עם 250 מ"ג אבקת פחם פעיל ו-25 מ"ג דקסטרן. לאחר דגירה של 45 דקות ב-55 מעלות, התערובת עברה צנטריפוגה ב-4 מעלות, 1000 סל"ד למשך 15 דקות. הסופרנטנט סונן באמצעות ממברנת Millipore Express PES כדי לקבל את הטיפול בפחם בדקסטראן (CDT)-FBS ואוחסן ב-20 מעלות.

תרבית תאים

שורות תאים מסוג MCF-7 של סרטן השד התקבלו מאוסף התרבות האמריקאי (ATCC). יתרה מכך, התאים תורבו עם מדיום RPMI-1640 המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין ב-37 מעלות תחת אווירה לחה של 5% CO2. תאים תורבו במדיום RPMI-1640 ללא פנול אדום המכיל 5% CDT-FBS 4 ימים לפני בדיקת MTT כך שניתן יהיה לנקות את האסטרוגן בתאים.

ניתוח התפשטות תאים של אסטרדיול בקווי תאים MCF-7

שגשוג תאים נמדד באמצעות מבחן MTT עבור תאי MCF-7.[15,16] E2 הומס במדיית תרבית RPMI-1640 המכילה 0.1% DMSO בריכוזים סופיים של {{27 }}.1, 1, 10, 100 ו-1000 ננומטר. שורות תאים MCF-7 תורבו במדיום RPMI-1640 ללא פנול אדום במשך 4 ימים. לאחר שטיפה עם מי מלח מבוצר פוספט (PBS) שלוש פעמים, נוספו 100 μL של מדיום RPMI-1640 ללא FBS לצלחות 96 בארות ב-1.5 × 104 לבאר והודגרו ב-37 מעלות למשך 24 שעות. לאחר מכן, התאים טופלו בריכוזים שונים של תמיסת E2 במשך 72 שעות. לאחר מכן, נוספו 100 μL של תמיסת MTT (0.5 מ"ג/מ"ל) לכל באר. תאים הודגרו במשך 4 שעות. לבסוף, נוספו 150 μL של DMSO כדי להמיס את גבישי הפורמזן. הספיגה נמדדה ב-570 ננומטר על ידי קורא microplate, וקצב ההתפשטות (PR) חושב.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ניתוח התפשטות תאים של גליקוזידים של Cistanches על שורות תאים MCF-7

שגשוג תאים נמדד באמצעות מבחן MTT עבור תאי MCF-7. GCs הומסו במדיית תרבית RPMI-1640 המכילה 0.1% DMSO בריכוזים סופיים של 0.0175, 0.175, 1.75, 17.5 ו-175 µg /ml. שורות תאים MCF-7 תורבו במדיום RPMI-1640 ללא פנול אדום המכיל 5% CDT-FBS למשך 4 ימים. לאחר שטיפה על ידי PBS שלוש פעמים, 100 μL של מדיום RPMI-1640 ללא FBS נוספו לצלחות 96 בארות ב-1.5 × 104 לבאר והודגרו ב-37 מעלות למשך 24 שעות. לאחר מכן, התאים טופלו בריכוזים שונים של תמיסת GCs במשך 24, 48 ו-72 שעות, בהתאמה. לאחר מכן, נוספו 100 μL של תמיסת MTT (0.5 מ"ג/מ"ל) לכל באר. תאים הודגרו במשך 4 שעות. לבסוף, נוספו 150 μL של DMSO כדי להמיס את גבישי הפורמזן. הספיגה נמדדה ב-570 ננומטר על ידי קורא microplate, וה-PR חושב. RPMI-1640 ללא פנול אדום ומדיום המכיל E2 (2.725 × 10-3 מיקרוגרם/מ"ל) היו הקבוצות השליליות והחיוביות, בהתאמה.

ניתוח התפשטות תאים של גליקוזידים של Cistanches עם fulvestrant על שורות תאים MCF-7

שגשוג תאים נמדד באמצעות מבחן MTT עבור תאי MCF-7. GCs הומסו במדיית תרבות RPMI-1640 המכילה 0.1% DMSO בריכוזים סופיים של 1.75, 17.5 ו-175 מיקרוגרם/מ"ל. שורות תאים MCF-7 תורבו במדיום RPMI-1640 ללא פנול אדום המכיל 5% CDT-FBS למשך 4 ימים. לאחר שטיפה על ידי PBS שלוש פעמים, 100 μL של מדיום RPMI-1640 ללא FBS נוספו לצלחות 96 בארות ב-1.5 × 104 לבאר והודגרו ב-37 מעלות למשך 24 שעות. לאחר מכן, התאים טופלו בריכוזים שונים של תמיסת GCs והודגרו עם fulvestrant (6.06 × 10-5 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 48 שעות. לאחר מכן, נוספו 100 μL של תמיסת MTT (0.5 מ"ג/מ"ל) לכל באר. תאים הודגרו במשך 4 שעות. לבסוף, נוספו 150 μL של DMSO כדי להמיס את גבישי הפורמזן. הספיגה נמדדה ב-570 ננומטר על ידי קורא microplate, וה-PR חושב. RPMI-1640 ללא פנול אדום ומדיום המכיל E2 (2.725 × 10-3 מיקרוגרם/מ"ל) היו הקבוצות השליליות והחיוביות, בהתאמה.

בדיקת מחזור התא

GCs הומסו במדיית תרבות RPMI-1640 המכילה 0.1% DMSO בריכוזים סופיים של 1.75, 17.5 ו-175 מיקרוגרם/מ"ל. שורות תאים MCF-7 תורבו במדיום RPMI-1640 ללא פנול אדום המכיל 5% CDT-FBS למשך 4 ימים. לאחר שטיפה על ידי PBS שלוש פעמים, 1 מ"ל של מדיום RPMI-1640 ללא FBS הוסיפו לצלחות 6-בארות ב-2.5 × 105 לבאר והודגרו ב-37 מעלות למשך 24 שעות. לאחר מכן, התאים טופלו בריכוזים שונים של תמיסת GCs והודגרו עם fulvestrant (6.06 × 10-5 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 48 שעות. לאחר מכן, התאים נאספו ונשטפו עם PBS שלוש פעמים, צנטריפוגה ב-4 מעלות, 1000 סל"ד למשך 10 דקות, ותוקנו עם 70% אתנול ב-20 מעלות, למשך הלילה. לאחר שטיפה עם PBS פעמיים, התאים נצבעו בתמיסת PI (50 מ"ג/מ"ל) המכילה 1 מ"ג/מ"ל של RNase A ו-0.1% Triton X-100 למשך 30 דקות בחושך ב-4 מעלות. מחזור התא זוהה באמצעות ציטומטריית זרימה, ואינדקס התפשטות (PI) חושב באופן הבא. RPMI-1640 ללא פנול אדום ומדיום המכיל E2 (2.725 × 10-3 מיקרוגרם/מ"ל) היו הקבוצות השליליות והחיוביות, בהתאמה.

PI {{0}} (S + G2 M)/(G0 /G1  + S + G2 M) × 100%

בידוד RNA וניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת

כדי למדוד את רמת ה-mRNA, נעשה שימוש ב-RT-quantitative PCR (qPCR). סך ה-RNA הסלולרי חולץ עם מגיב TRIzol. עבור qPCR, RNA הועתק לאחור ל-cDNA מ-4 מיקרוגרם של RNA כולל באמצעות ערכת RT. ניתוחי RT-PCR נערכו באמצעות ערכת TB Green™ RT-PCR. כל הפרוטוקולים בוצעו לפי הוראות היצרן. צמד הפריימרים ששימש להגברה של ER היה 5'-GGGAAGTATGCTATGGAATCTG-3' (קדימה) ו-5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (הפוך); צמד הפריימר ששימש להגברה של ER היה 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (קדימה) ו-5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (הפוך). תנאי ה-PCR עבור ER ו-ER היו 94 מעלות למשך 3 דקות ולאחר מכן 37 ו-40 מחזורים, בהתאמה, של 94 מעלות למשך 30 שניות, 58 מעלות למשך 2 דקות ו-72 מעלות למשך 2 דקות. צמד הפריימר ששימש להגברה של GAPDH היה 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (קדימה) ו-5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (הפוך). תנאי ה-PCR עבור GAPDH היו 94 מעלות למשך 3 דקות ולאחר מכן 30 מחזורים של 94 מעלות למשך 30 שניות, 58 מעלות למשך 2 דקות ו-72 מעלות למשך 2 דקות. בכל פעם ניסוי RT-qPCR חזר על עצמו יותר מפעמיים. לשם כך, GAPDH שימש כבקרה פנימית. ביטוי הגנים היחסי של ER /ER של טרנספקנטים על תאי בקרה חושב: 2−(∆∆Ct).

סופג מערבי

הביטוי של חלבוני ER ו-ER זוהה על ידי ניתוח כתם מערבי כשיטה המדווחת עם שינויים קלים. בקצרה, תאי MCF-7 גודלו בצלחות של 6 בארות ב-2.5 × 105 תאים לבאר וטופלו ב-GCs בריכוז סופי של 1.75, 17.5 ו-175 מיקרוגרם/מ"ל למשך 48 שעות, בהתאמה. לאחר הדגירה, תמציות התא השלמות הוכנו באמצעות חיץ RIPA המכיל 1 mM PMSF. חלבונים בתמציות התאים השלמים הופרדו על ידי אלקטרופורזה של ג'ל של 12% נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ולאחר מכן הועברו לממברנות פוליווינילידן דיפלואוריד. הממברנה נחסמה עם 5% (w/v) חלב רזה המומס במאגר TBST והודגרה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים בתורו. נצפו נוגדנים קשורים.

TUBULOSA CISTANCHE טבעי לשיפורפעילות אסטרוגניתPHGS75% ECH 30% ACT 12%

ניתוח סטטיסטי

התוצאות הובעו כממוצעים וסטיות תקן, ומובהקות סטטיסטית בוצעה באמצעות מבחן t-Test של Student עם תוכנת SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. America). פ<0.05 was considered statistically significant. 

תוצאות

לאחר 24 שעות של טיפול ב-E2, השגשוג של תאי MCF-7 הוגבר [איור 1a]. 10nM של תמיסת E2 יכול לעורר את צמיחת התאים כמובן (123.89%). עם זאת, עם העלייה בריכוז E2, נחלשה יכולת התפשטות התאים. לפיכך, 10nM היה הריכוז האופטימלי של E2 בניסוי זה. קבוצת GCs בריכוזים של 1.75, 17.5 ו-175 מיקרוגרם/מ"ג יכולה לשפר את התפשטותם של שורות תאים MCF-7 באופן תלוי זמן ומינון והציגה הבדל משמעותי עם קבוצה שלילית [איור 1b]. בהשוואה לקבוצה השלילית, קבוצת E2 הראתה ריבוי ברור (120.06%). קבוצת תרופות משולבות (CMG) (fulvestrant עם E2 או GCs) במדיום CDT-FBS הודגרה עם תאי MCF-4. לאחר 72 שעות של

דגירה, CMG יכול להוביל לנטייה של יחסי ציבור בהשוואה לקבוצת התרופות הפרטנית (IMG) (P< 0.01) [Figure 1c]. Flow cytometry analysis showed that GCs could slightly increase the PI value suggesting that GCs could advance G0/G1 phase cells to S and G2/M phase [Figure 2 and Table 1] and promote cell DNA synthesis. The result indicated that the mechanism of GCs on MCF‑7 was similar to that of E2. In CMG  (fulvestrant with GCs), the PI value of cell PI declined to that of IMG slightly (P < 0.05). RT‑PCR analysis indicated that the expressions of ERα and ERβ mRNA were increased compared with the control group  (P  <  0.01) in a dose‑dependent manner after being treated with different concentrations of GCs for 48 h [Figure 3a and b]. Western blot result indicating that after treatment with various concentrations of GCs for 48  h, contents of ERα and ERβ proteins in MCF‑7 increase with the GCs increased in a dosage‑dependent manner [Figure 3c‑e]. 

סיכום

במחקר זה, ההשפעה של GCs על התפשטות ומחזור התא של MCF-7 נבדקה בשיטת MTT ו-flow cytometry, בהתאמה.GCs יכולים להגביר את התפשטותם של תאי MCF-7בריכוז של 1.75, 17.5 ו-175 מיקרוגרם/מ"ל לאחר דגירה של 72 שעות. עם זאת, העלייה נוטה להאט כאשר משתמשים ב-CCs ו- fulvestrant יחד. GCs יכולים להגדיל את ערך ה-PI של תאי MCF-7, להקטין את התא של שלב G1 ולהגדיל את התאים של שלבי S ו-G2.

Fulvestrant הוא אנטגוניסט ספציפי ל-ER, אשר חוסם את הלוקליזציה הגרעינית של ER על ידי פגיעה בדימריזציה של קולטן ובהובלה גרעינית תלוית אנרגיה.[17] במחקר זה, מסקנה אישרה כי fulvestrant יכול להחליש את התפשטות ה-GCs על תאי MCF-7, וזה יכול להשפיע על השינוי במחזור התא. לפיכך, מחקר זה הצביע על הפעילות האסטרוגנית של GCs, וגם, ER הוא ה-

יעד של GCs. בניסוי RT-PCR ו-Western blot, ביטויי mRNA וחלבונים של ER ו-ER בתאי MCF-7 עלו עם העלייה בריכוז GC. לָכֵן,GCs יכולים למלא תפקיד בפעילות אסטרוגניתלפי mRNA מווסתים וחלבונים של ER ו-ER.

TUBULOSA CISTANCHE טבעי לשיפורפעילות אסטרוגניתPHGS75% ECH 30% ACT 12%