בשילובי תרופות סינרגטיים על בסיס סיליקו מתרופות צמחיות: מקרה באמצעות Cistanche Tubulosa-Ⅱ

מודול הגנה עצבית

הגנה עצבית היא המנגנונים והאסטרטגיות המשמשות להגנה מפני פגיעה נוירונית או ניוון במערכת העצבים המרכזית בעקבות הפרעות חריפות (כגון שבץ או פגיעה במערכת העצבים/טראומה) או כתוצאה ממחלות ניווניות כרוניות (כגון פרקינסון, אלצהיימר, טרשת נפוצה). מטרת ההגנה העצבית היא להגביל חוסר תפקוד/מוות של תפקוד עצבי לאחר פגיעה במערכת העצבים המרכזית ולנסות לשמור על הרמה הגבוהה ביותר

שלמות אפשרית של אינטראקציות סלולריות במוח וכתוצאה מכך לתפקוד עצבי בלתי מופרע. כפי שניתן לראות מאיור 4, כמה מטרות במסלול הסינפסה הסרוטונרגית מעורבות בתפקוד של הגנה עצבית. לדוגמה, ייצור פרוסטגלנדינים דרך PTGS1 ו-PTGS2 (הידוע גם כ-COX-1 ו-COX-2) הוא מתווך חיוני ביצירת מנגנונים אנטי-דלקתיים וחדשים לפתרון56. מחקר שנערך לאחרונה הראה שביטוי גנים של ADCY5, אנזים המזרז את היצירה של cAMP57, מופחת על ידי מתילציה פרומטור בקווי תאים HCC אנושיים המושרים על ידי COX{{10}58. בהתבסס על הניתוח שלמעלה, אנו משערים שהצטברות COX-2 עשויה להשפיע על הפרשת sAPP , ביקוע APP המבקע על ידי -secretase המווסת על ידי cAMP ומפעיל עוד יותר את האפקט הנוירו-הגן59,60. התוצאות שלנו מראות שההגנה העצבית ממלאת תפקיד חשוב בטיפול בדלקת עצבית.

TURAL CISTANCHE TUBULOSA למניעת מחלת פרקינסון תפקוד PHGS75% ECH 30% ACT 12%

אימות ניסוי

הכדאיות של תאי BV2 Microglia שטופלו על ידי התרכובות

תאי מיקרוגליה BV2 (8×104 תאים/מ"ל) מוזנים בריכוזים של 37.5 עד 300 מיקרומטר למיליליטר מדיית תרבות ללא סרום של ארבע התרכובות במשך 24 שעות. אנו רואים בכדאיות התא של קבוצת הביקורת שתורבתה בהיעדר סרום עם פחות מ-0.1% DMSO כ-100% (איור 5(א-ד)). לא נצפתה ציטוטוקסיות תאית משמעותית במינונים שנקבעו לקבוצות.

אימות של סינרגיה תרופתית והשפעה אנטי דלקתית פוטנציאלית במבחנה

כדי להעריך עוד יותר את התוצאות שהושגו בסיליקו, נבחרות ארבע תרכובות המכסות שלושה זוגות סינרגיסטים, כלומר isoacteoside, 2′-acetylacteoside, echinacoside, ו-verbascoside, כדי לבחון את ההשפעות הסינרגטיות של התרופות והאפקט האנטי דלקתי הפוטנציאלי שלהם באמצעות תאי BV2 שטופלו ב-LPS. בפרט, אנו עורכים ניתוח כתם מערבי עבור ביטוי חלבון iNOS ו-COX-2 כדי לאשר את הסינרגיה וההשפעות האנטי-דלקתיות של שילובי התרופות החזויים.

כפי שמוצג באיור 5(e-g), רמות חלבוני iNOS ו-COX-2 בפאנל של שורות תאים BV2 שנבדקו מדווחות. אנו רואים שבטיפול ב-isoacteoside או 2'-acetylacteoside, ביטויי החלבון של iNOS ו-COX-2 בתאי BV2 ירדו שניהם באופן משמעותי ברמות מינון שונות. עם זאת, טיפול בשילוב של isoacteoside ו-2′-acetylacteoside גורם לעלייה משמעותית בגורמי הדלקת iNOS ו-COX-2 (איור 5(ה)). איור 5(ו) ממחיש זאתטיפול echinacoside או verbascoside, כסוכן יחיד, גורם לירידה בביטוי iNOS ו-COX-2. יתרה מכך, כצפוי, טיפול באכינאקוסיד בשילוב עם verbascoside בריכוז של 150 מיקרומטר הביא לירידה בולטת יותר ב-

רמות של ביטוי חלבון (iNOS ו-COX-2), המצביעות על ההשפעות האנטי-דלקתיות הסינרגטיות של שילוב תרופות זה. באופן דומה, כפי שמצוין באיור 5(g), השילוב של echinacoside ו-2'-acetylacteoside מראה השפעה סינרגטית משמעותית על עיכוב COX-2 בריכוז של 75 מיקרומטר או 300 מיקרומטר. עם זאת, עבור iNOS, במינון של 300 מיקרומטר, השילוב מייצג דיכוי ניכר של החלבון. לעומת זאת, אנו מוצאים שאין השפעות עיכוב ברורות הן על iNOS והן על COX-2 לגבי השילוב של isoacteoside ו-2′-acetylacteoside או echinacoside ו-verbascoside בריכוז של 75μM (איור משלים 2), מלבד טיפול עם זוגות אחרים מראה השפעה חלשה הרבה יותר בהשוואה לסוכנים הבודדים במינון של 150 או 300μM שניתן לראות באיור 5 (e-g).

לסיכום, המחקר במבחנה מספק מידע נוסף לבדיקת שילובי תרופות בעלי השפעות אנטי דלקתיות פוטנציאליות ומדגים את האמינות של אסטרטגיית המסך בסיליקו.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לטיפול בנוירואינפלמציה PHGS75% ECH 30% ACT 12%

דִיוּן

דלקת עצבית מעורבת ברוב המחלות הנוירולוגיות, הפסיכיאטריות והנוירו-התפתחותיות, וזו לא רק תוצאה אלא יכולה להיות טריגר לפתולוגיה. עם זאת, הטיפולים הנוכחיים לנוירו-דלקתיים הם לרוב טיפולים מונותרפיים, המוגבלים על ידי תופעות לוואי ידועות כפי שאנו יודעים, מעכבי COX-2 עלולים להוביל למומים קרדיווסקולריים בתגובה לטיפול ארוך טווח, וטיפול ממוקד TNF עלול לגרום לזיהום באמצעות דיכוי חיסוני. גישות טיפוליות קומבינטוריות עשויות להיות הכרחיות כדי לשפר את הטיפול במחלות מורכבות עם היתרונות הבאים: חוסנה של הרשת ופיצוי עוקף, היעילות הקלינית המוגברת תוך שמירה על רעילות מינימלית של האדם, והמינון המופחת של כל תרכובת63. עם זאת, חקירת שילובי התרופות הסינרגטיים בין תרכובות המופקות מתרופות צמחיות המבוססות על פרמקולוגיה של המערכת מוגבלת על ידי הסיבה העיקרית האפשרית לכמויות גדולות של תרכובות.

בעבודה, אנו משיגים לראשונה 63 תרכובות ביו-אקטיביות פוטנציאליות מה-עשב Cistanche tubulosa, ממלא את הקריטריונים (DL גדול מ-{0}}.18 או שווה ל-0.18) לניתוח נוסף בעזרת החיזוי שהוא הכרחי כדי לסנן מולקולות מבטיחות יותר בעלות תכונות רצויות. לאחר מיפוי 133 המטרות של 63 התרכובות הביו-אקטיביות הפוטנציאליות למסד הנתונים, אנו מקבלים 43 יעדים הקשורים לדלקת עצבית, ואז ניתוח מקבצי GOBP של המטרות החזויות יכול כנראה לתרום לטיפול בדלקת עצבית. התוצאה האנליטית של רשת ה-CT הציגה תואר ממוצע לתרכובת של 11.209 ו-7.651 למטרה, בהתאמה, ו-38 מהם התאימו יותר מ-7 יעדים (גדולים מהדרגה הממוצעת). לדוגמה, אכינאקוסיד (mol41) שחזו עם 7 מטרות, verbascoside (mol33), עם 9 מטרות, או tableside B (mol57), עם 8 מטרות יכולים למלא תפקידי מפתח בהגנה עצבית בהתאם לספרות הגוברת.

אנו משיגים יעדים טיפוליים ישירים כגון APP, MAPT (הידוע גם בשם Tau), PPARG70, MMP9, MMP2 ו-HTR2A (הידוע גם בשם 5-HT2A), GRIN2B (יחידת משנה מסוג NMDA לקולטן יונוטרופי גלוטמט 2B), ו-GRIA1 (קולטן יונוטרופי גלוטמט תת-יחידה 1 מסוג AMPA) או מטרות פוטנציאליות במורד הזרם כגון PTGS274 או NOS275 הקשורים לדלקת עצבית או למחלות שונות של מערכת העצבים.

הניתוח של רשת Compound-Target-Pathway מציג 12 תרכובות מ-10 זוגות התרופות המובילים דרך אלגוריתם PEA, הקשורים ל-43 המטרות הפוטנציאליות ולמסלולים הקשורים לדלקת עצבית, למשל, מסלול איתות סידן, אינטראקציה של ליגנד-קולטן נוירואקטיבי או מסלול איתות TNF וכן הלאה. במערכת, תרכובות חזויות אלו יכולות לפעול לא רק על החלבונים של הזרמים, אלא גם על המסלולים במורד הזרם הקשורים לדלקת עצבית וסמנים ביולוגיים דלקתיים, בפרט. יתר על כן, מידע נוסף לבדיקת שילובי תרופות בעלי השפעות אנטי דלקתיות שעלולות להיות מסופק והאמינות של אסטרטגיית המסך בסיליקו מאומתת על ידי אימות ניסיוני. מסלול הדלקת העצבית מורכב ממסלול מחלת האלצהיימר, מסלול איתות סידן, מסלול איתות GnRH, מסלול איתות VEGF וסינפסה סרוטונרגית. התוצאות האנליטיות הסבירו לנו באופן מובהק שמודולים של מוות תאים, דלקת והגנה עצבית מודגמים כדי לפענח את המנגנון שלCistanche tubulosa לטיפול בדלקת עצבית.

דלקת עצבית מלווה מחלות ניווניות שונות אשר עשויות להיות לא רק תוצאה אלא גם טריגר לפתולוגיה, ולכן, טיפולים אנטי דלקתיים מוצעים כגישה טיפולית מבטיחה. לאכזבתנו, למרות שהבנו את המגבלות של הטיפולים המונותרפיים, ההערכה והמנגנונים הבסיסיים של טיפולים משולבים הם עדיין האתגרים העיקריים בפיתוח האסטרטגיה האלטרנטיבית החדשה. לכן, עבודה זו יכולה להציע הזדמנויות טיפוליות חדשות לדלקת עצבית ועשויה לפתוח דרך חדשה לגילוי שילובי תרופות ממוצרים טבעיים.

חומרים ושיטות

אוסף תרכובות

סך של 66 מרכיבים כימיים של Cistanche tubulosa נאספים באופן ידני מ-TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/)76, כולל 26 פנילתנואידים גליקוזידים, 22 אירידואידים, 4 ליגנים, 7 מונוטרפן גליקוזידים, 2 חומרים חנקן, 3 סוכרי בנזן אקרילויל, 1 סטרול, 1 קטול. בהתחשב בכך שגליקוזידים ב- Cistanche tubulosaבדרך כלל עוברים הידרוליזה לשחרור אגליקון אשר נספג לאחר מכן ברירית המעי, ולכן, אנו לוקחים בחשבון את המולקולות ללא גליקולית, אשר מתויגות כ-_qt. זה הוביל ליצירת 103 התרכובות. מולקולות אלה מסופקות בטבלה משלימה S1.

הערכת דמיון לתרופה

כדי להשיג את התרכובות הביו-אקטיביות הפוטנציאליות מ-Cistanche tubulosa, אנו מעריכים את דמיון התרופות של מרכיבים אלה על ידי חישוב הדמיון של Tanimoto בין תרכובות צמחיות והתכונות המולקולריות הממוצעות של כל הכימיקלים במסד הנתונים של Drugbank. בנוסף, מודל החיזוי DL יושם בהצלחה במחקרים רבים, לבחירת תרכובות ביו-אקטיביות. בעבודה, אינדקס DL גדול או שווה ל-0.18 של המועמדים מוגדר כערך הסף שיתאים יותר לניתוח שלאחר מכן.

חיזוי יעדי סמים

זיהוי יעדי היעילות של תרכובות מובילות נותר צעד מפתח להתקדמות תרכובות לפיתוח תרופות. כאן, שני כלים פנימיים: SysDT ו-WES מבוצעים כדי להפיק את מידע היעד המולקולרי ל-fshing סמים. SysDT הוא מודל סולו המבוצע בשילוב של מידע כימי, גנומי ותרופתי המבוסס על שני כלים מתמטיים רבי עוצמה: Random Forest (RF) ו- Support Vector Machine (SVM) כדי להתמודד עם נושא זיהוי היעדים ביעילות. המודל שהושג שימש כפלטפורמה חשובה לחיזוי אינטראקציות בין תרופה למטרה עם דיוק כולל של 97.3%, דיוק חיזוי פעיל של 87.7% ודיוק חיזוי מעוכב של 99.8%. כדי ללכוד רכיבים מבטיחים יותר, קריטריוני הסינון מוגדרים כערך RF גדול או שווה ל-0.7 או SVM גדול או שווה ל-0.8 במחקר זה.

דמיון אנסמבל משוקלל (WES) הוא מודל חישובי רב עוצמה חדש לאיתור היעדים הישירים של התרופה למרכיבים הביו-אקטיביים בפועל. ככלי חדשני, המודל שהושג מתפקד היטב בחיזוי הקישור עם רגישות ממוצעת של 85% (SEN) והדפוסים הלא מחייבים עם 71% (SPE) עם השטחים הממוצעים מתחת לעקומות הפעולה של המקלט (ROC, AUC) של 85.2% וקונקורדנציה ממוצעת של 77.5%. המטרות שהושגו ממופים יותר ל- Uniprot כדי לנרמל את שמותיהם ואורגניזמים שלהם לאחר מכן. כאן, אנו בוחרים רק את המטרות של הומו סאפיינס לניתוח נוסף. יעדים מועמדים של התרכובות שנבחרו ממופים למסד הנתונים של ה-CTD כדי לקבל את המחלות הקשורות אליהם ואנו מסננים לבסוף מטרות פוטנציאליות הקשורות לדלקת עצבית.

GO העשרה וניתוח עבור יעדים

כדי לחקור את התהליכים הביולוגיים המעורבים של המטרות שהושגו, אנו ממפים את המטרות ל-DAVID והמונחים עם ערך P קטן מ-0.05 נבחרים בסעיף זה.

ניתוח שילוב תרופות

בעבודה הקודמת שלנו, נוצלה מסגרת פרמקולוגית מערכתית כדי לחזות שילובי תרופות במודל חדש, שנקרא Probability Ensemble Approach (PEA) כדי לנתח את היעילות הקלינית וההשפעות השליליות של שילובי תרופות. בפירוט, פותחה רשת בייסיאנית המשולבת עם אלגוריתם דמיון כדי ליצור מודל של השילובים מהשפעות מולקולריות ותרופתיות של תרכובות. לאחר מכן הוצגה ההערכה המשולבת שכיסתה את היעילות הקלינית וההשפעות השליליות עבור הזוגות החזויים. בקצרה, זה מראה ש-PEA יכול לחזות את היעילות של הזוגות עם ספציפיות ורגישות גבוהה (AUC=0.90) בעבודה שלנו. בעבודה זו, אנו בוחרים את עשרת שילובי התרופות המובילים בהתבסס על הסתברויות הסינרגיה שלהם, המייצגים את האפשרות לעורר סינרגיה בין שתי תרכובות.

בניית רשת/מסלול וניתוח

כדי לחקור את הקשרים בין המרכיבים הפעילים למחלות הדלקתיות, רשת תרכובת-מטרה (CT) ורשת תרכובת-מטרה-מסלול (CTP) נוצרות על ידי Cytoscape 2.8.1, חבילת ביואינפורמטיקה פופולרית להדמיית רשת ביולוגית ושילוב נתונים. המאפיינים הכמותיים של הרשת מנותחים על ידי שני התוספים הבאים Network Analyzer ו-CentiScaPe 1.2. ברשת הגרפית, צמתים מציינים תרכובות, מטרות או מסלולים בעוד קצוות מקודדים את האינטראקציה בין תרופה למטרה. כדי להמשיך ולחקור את ההשפעות הביולוגיות של אופן פעולתן של מטרות סלולריות באמצעות מווסת מסלולי חילוף חומרים מרובים, "מסלול" משולב מורכב על ידי המידע העדכני על פתולוגיה של דלקת עצבית. ראשית, באמצעות מיפוי שלהם על מסד הנתונים של KEGG, פרופילי היעד שהושגו מצטברים למספר מסלולים. לאחר נטישת הסעיפים העקיפים, מסלול מסונתז יחסית משולב באופן ידני על רקע הנתונים הפתולוגיים והקליניים.

TURAL CISTANCHE TUBULOSA לטיפול במחלת פרקינסון PHGS75% ECH 30% ACT 12%

אימות ניסוי

הכנת דוגמאות

Echinacoside, verbascoside, isoacteoside ו-2'-acetylacteosideנרכשים מ-Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, סין). דגימות בדיקה מומסות ב-Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma, ארה"ב) כדי לקבל 100 mM, כתמיסת מניות, ולאחר מכן מאוחסנות ב-4 מעלות. הדילולים הסופיים של DMSO שנוספו למדיום התרבות מעולם לא עלו על 0.1% מה שהבטיח שלא הייתה השפעה על כדאיות התא.

תרבית תאים

תאי מיקרוגליה של עכבר BV2 פותחו במקור על ידי האקדמיה הסינית למדעים של שנגחאי ותורבתו במשימות של 25 או 75 סמ"ר עם מדיום Eagle's שונה של Dulbecco (DMEM/25mM HEPES) (Gibco BRL, ארה"ב) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) (Gibco BRL, ארה"ב), פניצילין G (100 יחידות/מ"ל) וסטרפטומיצין (100 מ"ג/מ"ל) באינקובטור לח עם 5% CO2/95% O2 ב-37 מעלות.

בדיקת כדאיות תאים

תאי מיקרוגליה BV2 זורעים לצלחת 96-באר בצפיפות של 1×105 תאים/מ"ל, לאחר דגירה של 18 שעות, תאים מטופלים ב-100 ul של מדיום טרי עם או בלי ריכוזים שונים של דגימות בדיקה עבור 24 שעות נוספות. בדיקת CCK-8 (BestBio, שנחאי, סין) היא שיטה נוחה ואמינה לקביעת כדאיות התאים. כדי לבטל את הרקע של דגימות הבדיקה, אנו משליכים את כל מצע התרבות, ולאחר מכן מוסיפים 100 ul/well מדיה טריה המכילה 10% תמיסת CCK-8. ערכי ה-OD ב-450 ננומטר נקראים על גבי קורא צלחות (Molecular Devices, קליפורניה, ארה"ב) לאחר דגירה של 3 שעות ב-37 מעלות ו-5% CO2.

Western Blot Analysis

החלבון הסלולרי מופק מקווי תאים באמצעות ערכת הכנה לחלבון יונקים Qproteome™ (Qiagen, גרמניה) לאחר ההליכים המצוינים בפרוטוקול היצרן. ערכת בדיקת חלבון Quick Stari Bradford (Bio-Rad, ארה"ב) מיושמת לכימות חלבון. כמויות שוות של חלבון (50ug) עוברות דנטורציה על ידי רתיחה ב-100 מעלות למשך 10 דקות עם חיץ טעינת דגימות 2*laemmli (Bio-Rad, ארה"ב) בתוספת 5% -מרקפטואתנול ביחס של 1:1 ו נטען לכל נתיב על 12% SDS-PAGE (מיניג'לים של פולי-אקרילאמיד נתרן דודציל סולפט), מועבר אלקטרו על ממברנות פוליווינילידן פואוריד בנפח 0.45 מיקרומטר (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, ארה"ב) למשך 150 דקות ב-200 mA. לאחר מכן, הממברנות נחסמות ב-3% אלבומין בסרום בקר (BSA) בטמפרטורת החדר ומודגרות עם הנוגדנים הראשיים iNOS ו-COX-2 (Abcam) ב-4 מעלות למשך הלילה. לאחר שלוש שטיפות יסודיות ב-Tris-buffered Saline-Tween (TBST) כל אחת למשך 5 דקות, הממברנות נבדקות עם נוגדנים משניים מצומדים של חזרת פרוקסידאז (HRP) (1:10000 דילולים; Abcam) למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הרצועות האימונראקטיביות מומחשות על ידי שימוש בערכת זיהוי כימילומינסנציה ECL (Bio-Rad Laboratories, ריצ'מונד, קליפורניה, ארה"ב) לאחר כביסה פעמיים ב-TBST ופעם אחת ב-TBS, כל פעם למשך 5 דקות. ערכים דנסיטומטריים מנורמלים באמצעות -אקטין כשליטה פנימית בטעינה.

ניתוח סטטיסטי

הנתונים מוצגים כאמצעים ± שגיאה סטנדרטית, וניתוח הכתם המערבי חוזר על עצמו בשלושה ניסויים עצמאיים עם אותה תוצאה. ניתוח השונות בכיוון אחד משמש להשוואת הבדלי הממוצעים עבור שלוש קבוצות או יותר, מובהקות סטטיסטית מנותחת עם מבחן t של הסטודנט בין שתי קבוצות.

CISTANCHE TUBULOSA טבעי לטיפול במחלת פרקינסון ומחלת אלצהיימר PHGS75% ECH 30% ACT 12%