Cistanche Tubulosa גורם לאפופטוזיס בתיווך מיני חמצן תגובתי של תאי סרטן המעי הגס אנושיים ראשוניים וגרורתיים

מבוא

סרטן המעי הגס הוא אחד מסוגי הסרטן הנפוצים ביותר בעולם (ברנרet al., 2014), ושכיחותו עולה ללא הרף עם הערכה של 2.4 מיליון מקרים בשנת 2035, עקב תזונה ואורח חיים מודרניים, יחד עם פעילות גופנית מופחתת. המאמצים הנוכחיים אינם מספיקים כדי להילחם במגיפה הנוכחית של סרטן המעי הגס ולכן נדרשות גישות חדשות למניעה וטיפול יעילים כולל שינויים באורח החיים בשילוב עם התערבויות אלטרנטיביות בטוחות יותר כגוןפיטותרפיה (וידנרet al., 2015). פיטותרפיה, השימוש בצמחי מרפא לטיפול במחלות, היה חלק בלתי נמנע מההיסטוריה האנושית העתיקה. צמחי מרפא שימשו זה מכבר כמקורות טיפול אלטרנטיביים לסרטן, המייצגים יותר משישים אחוז מהתרופות האנטי-סרטניות המשמשות ברפואה הקונבנציונלית (Balunas and Kinghorn, 2005; Saibuet al., 2015). כמה מהדוגמאות הידועות ביותר כוללות תמציות מCatharanthus roseusג. דון. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae), ו-Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg and Newman, 2005; da Rochaet al., 2001). מספר תמציות צמחי מרפא ופיטוכימיקלים הוכחו כבעלי השפעות נוגדות גידול בסרטן המעי הגס המיוחסות להשראת ייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS) ואפופטוזיס נלווה של תאים סרטניים, כמו במקרה של תמציות ממליסה אופיסינליס(וידנרet al., 2015)

בין המועמדים לפיתותרפיה,Cistanche tubulosa, צמח מדברי טפילי Orobanchaceae (Jiang et al., 2009) המופץ באופן נרחב באזורים צחיחים וצחיחים למחצה של אפריקה, אסיה ואזור הים התיכון, הוכח כבעל סגולות רפואיות יקרות ערך. נעשה שימוש נרחב ב-Cistanche tubulosa ברפואה המסורתית ויש לה השפעות מרפאות במחסור בכליות, דלקת חוליות חולנית, מטרורגיה, אי פוריות נשית ועצירות סנילית (Jiang et al., 2009). בנוסף לשימושים הרפואיים המסורתיים שלה, תרופות חשובות תכונותיה של Cistanche Tubulosa נחקרו באינטנסיביות במהלך העשור האחרון, כולל תרופות להרפיית כלי דם (Yoshikawa et al., 2006), השפעות מגן על הכבד (Morikawa et al, 2010), השפעות אנטי-היפרגליקמיות והיפוליפידמיות (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa הוצע גם כמשפר חזק של מערכת החיסון, מקדם של יצירת עצם, וסוכן אנטי-אייג'ינג ואנטי עייפות (Xu et al., 2014). יתר על כן, תמצית Cistanche tubulosa הוכחה חוסמת שקיעת עמילואיד במודל של מחלת אלצהיימר (Wu et al., 2015). למרות השימושים הטיפוליים השונים, ההשפעה של Cistanche Tubulosa כסוכן אנטי סרטני פוטנציאלי טרם נחקרה.

בעבודה הנוכחית, חקרנו את ההשפעה האנטי-סרטנית של Cistanche Tubulosa על שני קווי תאים ראשוניים ושני גרורתי של סרטן המעי הגס ואת המנגנונים הפוטנציאליים העומדים בבסיס ההשפעה הזו.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA לשיפור התפקוד המיני PHGS75% ECH 30% ACT 12%

חומרים ושיטות

איסוף והכנה של תמצית צמחים

הדגימות של Cistanche tubulosa נאספו מאזורי המדבר בקטאר בשנת 2014 ואותנטיות הצמח אושרה על ידי הרופא הצמחי. דגימות שוברים נשמרות במחלקה טוקסיקולוגיה ורב תכליתית ב-ADLQ. דגימות הצמחים המיובשות בשמש נטחנו עם Retsch Knife Mill Grindomix GM300 לאבקה דקה. עשרים גרם אבקה חולצו עם 200 מ"ל מים טהורים לילה ב-37 מעלות על שייקר סיבובי ב-200 סל"ד. הגולמיתמציות Cistanche tubulosa (CTE)עברו צנטריפוגה למשך 30 דקות ב-8000 סל"ד כדי לקטוף תרכובות לא מסיסות, הסופרנטנט נאסף ויובש בהקפאה באמצעות מייבש פריזון של Labconco 6 plus Freeze. התמצית המיובשת שוחזרה ב-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, SIGMA, גרמניה) לריכוז של 20 מ"ג/מ"ל וסונן סטרילי דרך מסנן ממברנה של 0.2-מיקרון.

קווי תאים ותחזוקת תאים

קווי תאים מסוג קרצינומה של המעי הגס CaCo2, SW620 ו-LoVo התקבלו מ- Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, גרמניה) בעוד שקו התאים HCT 116 היה מתנה חביבה מהמחלקה למדעי הביולוגיה והסביבה, המחלקה באוניברסיטת קטאר. CaCo2 ו-HCT11 נגזרו מהאתר הראשוני של קרצינומה של המעי הגס בעוד ש-SW620 ו-LoVo נגזרו מהאתר הגרורתי. תאי SW620, HCT116 ו-LoVo תורבו ונשמרו ב-DME Medium בעוד שתאי CaCo2 נשמרו ב-Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM, SIGMA, גרמניה). התאים גודלו כמונו-שכבתי בתרבית של 37 מעלות במדיום בהתאמה בתוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS, SIGMA, גרמניה) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (SIGMA, גרמניה) באווירה לחה המכילה 5% פחמן דו חמצני.

בדיקת כדאיות תאים

המבחן {{0}}[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) שימש להערכת הפעילות הציטוטוקסית של CTE באופן דומה כפי שתואר קודם לכן (Jaganjac et al., 2010). צפיפות הזריעה של תאי CaCo2, HCT116, SW620 ו-LoVo שהתרביתו ב96-צלחות באר הייתה 104 תאים לבאר. תאים צופו במדיום בהתאמה בתוספת 10% FBS 24 שעות לפני הטיפול. לאחר 24 שעות, המדיום הוסר והתאים טופלו ב-0, 0.25, 0.5, 1 ו-2 מ"ג/מ"ל של CTE במשך 24, 48 ו-72 שעות ב-37 מעלות באווירה לחה המכילה 5% CO2. לאחר טיפול ב-CTE, המדיום הוסר ונוספו 40 μL של תמיסת MTT (0.5 מ"ג/מ"ל) לכל באר.

לאחר 3 שעות של דגירה, תמיסת ה-MTT הוסרה, מוצר הפורמזן הומס בדימתיל סולפוקסיד (DMSO, SIGMA, גרמניה), והספיגה נמדדה ב-590 ננומטר עם קורא מיקרו-לוחיות (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, שוויץ) .

בדיקת אפופטוזיס

אפופטוזיס בתאי CaCo2, HCT116, SW620 ו-LoVo זוהה באמצעות PE Annexin V ערכת זיהוי אפופטוזיס I עם 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) כצבע חיוני (Becton Dickinson International, בלגיה) לפי הוראות היצרן. בקצרה, תאים נזרעו ב24-צלחות באר בצפיפות של 5×104 תאים/באר במדיה בהתאמה בתוספת 10% FBS למשך 24 שעות לפני הוספת CTE (0, 0.5 , או 1 מ"ג/מ"ל). לאחר דגירה של 24 CTE, תאים נקצרו, נשטפו פעמיים עם תמיסת מלח קרה עם חוסם פוספט, והוצבעו ב-Phycoerythrin (PE) Annexin V ו-7-AAD למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. תאים מוכתמים נותחו תוך שעה אחת על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות FACS. ציטומטר זרימה Aria III ותוכנת FACSDiva (Becton Dickinson) בקצב זרימה נמוך עם מינימום 104 תאים. טיפול בתאים במשך 4 שעות עם 6 µM camptothecin (SIGMA) שימש כביקורת חיובית עבור המבחן.

ייצור ROS תוך תאי

ייצור ROS תוך תאי נבדק באמצעות 2,7- dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA, SIGMA, גרמניה). DCFH-DA הוא בדיקה לא פלואורסצנטית, אשר מחומצנת עם ROS תוך תאי לתרכובת הפלורסנטית 2,7- dichlorofluorescein (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). בדיקת DCFH DA בוצעה באופן דומה כפי שתיארנו בעבר (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). בקצרה, צפיפות הזריעה של תאי CaCo2, HCT116, SW620 ו-LoVo שהתרביתו בפלטות שחורות של 96-באר הייתה 104 תאים לבאר. תאים צופו במדיום בהתאמה בתוספת 10% FBS למשך 24 שעות. לפני הטיפול תאים הודגרו עם 10 מיקרומטר DCFH-DA ב-37 מעלות למשך 30 דקות ב-5% CO2 / 95% אוויר. לאחר מכן התאים נשטפו וטופלו ב-0, 0.5 ו-1 מ"ג/מ"ל של CTE במדיום ללא פנול אדום. היווצרות ה-ROS התוך-תאית נוטרה ברציפות לאורך 25 שעות ב-37 מעלות ו-5% CO2 באמצעות קורא מיקרו-לוחים עם מודול הקרינה העליון ובקרת גז (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, שוויץ). עוצמת הקרינה נמדדה עם אורך גל עירור של 500 ננומטר וזיהוי פליטה ב-529 ננומטר. היחידות השרירותיות, יחידות הקרינה היחסיות (RFU), התבססו ישירות על עוצמת הקרינה.

TUBULOSA CISTANCHE NATURAL לשיפור תפקוד הכליות PHGS75% ECH 30% ACT 12%

יצירת סופראוקסיד מיטוכונדריאלי

היכולת של CTE לעורר יצירת סופראוקסיד על ידי מיטוכונדריה הוערכה באמצעות בדיקת MitoSOX Red (Life Technologies) חדירה לתאים, ממוקדת למיטוכונדריה ו-Hoechst 33342 לצביעה גרעינית (Life Technologies). תאי CaCo2, HCT116, SW620 ו-LoVo נזרעו ב96-צלחות באר בצפיפות של 104 תאים לבאר במדיום בהתאמה בתוספת 10% FBS למשך 24 שעות . לאחר מכן הועמס התאים ב-4 מיקרומטר של MitoSOX ו-2 מיקרומטר של Hoechst 33342 למשך 20 דקות, עודף צבע נשטף, ובארות טופלו ב-0, 0.5 ו-1 מ"ג/מ"ל של CTE למשך 24 שעות ב-37 מעלות ו-5% CO2. עוצמת הקרינה נמדדה עם אורך גל עירור של 510 ננומטר וזיהוי פליטה ב-580 ננומטר עבור MitoSOX ואורך גל עירור של 350 ננומטר וזיהוי פליטה ב-461 ננומטר עבור Hoechst 33342 באמצעות קורא מיקרופלייטס 20 עם PRO In AG, שוויץ)

ניתוח סטטיסטי

סטטיסטיקה תיאורית הוצגה כממוצע +/− SD. המשמעות של ההבדלים בין הקבוצות הוערכה באמצעות מבחן t-student ומבחן צ'י ריבוע. כאשר הושוו יותר משתי קבוצות, השתמשנו ב-ANOVA חד צדדי עם בדיקות פוסט-הוק מתאימות. נעשה שימוש ב-SPSS 11.01 עבור Mircosoft Windows. הבדלים עם P פחות מ-0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית.

תוצאות

ההשפעה של CTE על שגשוג של שורות תאים סרטן המעי הגס אנושיות מוצגת באיור 1. כל ריכוזי ה-CTE שנבדקו הראו השפעה מעכבת חזקה על קו התאים CaCo2 באופן תלוי ריכוז וזמן (איור 1A). שבעים ושתיים שעות של טיפול ב-CTE עיכבו את הצמיחה של תאי CaCo2 ביותר מ-60% בהשוואה לבקרה (p < 0.05 עבור כל הריכוזים). השפעה משמעותית של טיפול ב-CTE על צמיחת תאי HCT116 זוהתה גם בנקודות של כל הזמנים בשני הריכוזים הגבוהים ביותר (1 מ"ג/מ"ל ו-2 מ"ג/מ"ל), והגיעה ליותר מ-70% הפחתה בריכוז האחרון (איור 1B, p < 0.05). למרות ששני ריכוזי ה-CTE הנמוכים יותר (0.25 ו-0.5 מ"ג/מ"ל) הפחיתו משמעותית את צמיחת התאים HCT116 לאחר 24 שעות (p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). עיכוב התפשטות תלוי זמן וריכוז עם CTE אושר עוד יותר בתאי LoVo ביותר מ-60% בריכוז הגבוה ביותר (p < 0.05) (איור 1C), וכל ארבעת ריכוזי ה-CTE שנבדקו הפחיתו את הצמיחה של תאי SW620 לאחר 48 שעות (איור 1D, p < 0.05 עבור כולם). לאחר 72 שעות של טיפול, אותה השפעה נצפתה רק עבור שני הריכוזים הגבוהים ביותר (p<0.05) בעוד שריכוזים של 0.25 ו-0.5 מ"ג/מ"ל לא הראו השפעה משמעותית בהשוואה לבקרה (p>0.05). ההשפעה של טיפול CTE של 0.5 ו-1 מ"ג/מ"ל על השראת אפופטוזיס נבדקה עוד יותר בכל ארבע שורות התאים (איור 2). מספר מוגבר של תאים באפופטוזיס מוקדם זוהה ב-HCT116 וב-LoVo לאחר טיפול של 24-שעה עם 0.5 מ"ג/מ"ל (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

איור 1:השפעה שלCistanche tubulosaעל הכדאיות של קווי תאי סרטן המעי הגס. כדאיות התא שנמדדה על ידי בדיקת MTT של (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo ו-(D) SW620 תאי מוצג כאחוז מקו תאי סרטן המעי הגס הבלתי מטופלים. ערכים ממוצעים (±SD) עבור 5 שכפולים של הניסוי המייצג ניתנים: (*) מובהקות p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

איור 2: תמצית מי Cistanche tubulosa משרה אפופטוזיס בתאי סרטן המעי הגס אנושיים. אנקסין-V-FITC ניתוח ציטומטריית זרימה של (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo ו-(D) SW620 תאי מוצגים כאחוז של קו תאי סרטן המעי הגס שלא טופלו. ערכים ממוצעים (±SD) עבור 3 עותקים של הניסוי המייצג ניתנים: (*) מובהקות p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

איור 3: תמצית מי Cistanche tubulosa מעוררת ייצור ROS תוך תאי בהתאם לזמן ולמינון. ייצור ROS שנמדד על ידי מבחן DCFH-DA בתאי (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo ו-(D) SW620 מוצג כערכי RFU ממוצעים (±SD) עבור 5-הכפילים המתאימים של ניסוי מייצג. (*) משמעות עמ'<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

איור 4: תמצית מי Cistanche tubulosa משרה ייצור סופראוקסיד מיטוכונדריאלי בתאי סרטן המעי הגס אנושיים. עוצמת הקרינה של MitoSOX Red Probe במיטוכונדריה ממוקדת בתאי A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo ו-(D) SW620 מוצגות כאחוז מקו תאי סרטן המעי הגס שלא טופלו. ערכים ממוצעים (±SD) עבור 5 שכפולים של הניסוי המייצג ניתנים: (*) מובהקות p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

דִיוּן

למרות שמחקרים מוקדמים יותר דיווחו על תכונות רפואיות רבות של Cistanche tubulosa, זהו הדיווח הראשון על השפעתה האנטי-שגשוגית בתאים ממאירים. תרכובות ביו-אקטיביות של Cistanche tubulosa שהופקו במים, ממס קוטבי ביותר, הראו ביולוגיות אנטי-סרטניות חזקה. השווינו בעבר את היעילות של Cistanche tubulosa הממוסס במים מול ממסים אחרים כגון מתנול ואתיל אצטט, אך תמציות מים הראו את הפעילויות האנטי סרטניות המבטיחות ביותר (נתונים לא מוצגים).

הדגמנו את היכולת של CTE במינון 1 מ"ג/מ"ל ו-2 מ"ג/מ"ל לעכב 60% מהצמיחה של קווי תאי סרטן המעי הגס ראשוניים וגרורות כאחד, וחושפים תפקיד חשוב שלCistanche tubulosaכטיפול בסרטן המעי הגס. בהשוואה לתאים רגילים, תאים סרטניים מאופיינים בדרך כלל בהפרעה בהומאוסטזיס חיזור ואסטרטגיה נפוצה של טיפולים אנטי סרטניים נוכחיים היא להגביר את הלחץ החמצוני הסלולרי (Yang et al, 2013). למרות שלרמות נמוכות מבחינה פיזיולוגית של ROS יש תפקיד חשוב כמולקולות איתות, ייצור ROS מוגזם יכול לתרום לאי יציבות סרטן ולממאירות (Liou and Storz, 2010). באופן פרדוקסלי, חוסר איזון זה בהומאוסטזיס חיזור תאי הופך את התאים הסרטניים לפגיעים יותר למוות תאי המושרה על ידי ROS (Jaganjac et al., 2008; Nogueira and Hay, 2013). ההשפעה האנטי-פרוליפרטיבית של CTE שדווחה במחקר זה יכולה להיות מתווך על ידי מנגנונים חוץ-תוך-תאיים שונים של תרכובות ידועות ולא ידועות בתוך התמצית, המכוונות למסלולים מרובים הממלאים תפקידים חיוניים באפופטוזיס. כדי להבדיל בין אופנים שונים של מוות תאי, חקרנו את המנגנון הפוטנציאלי שאחראי לציטוטוקסיות הנגרמת על ידי CTE.

תמצית CISTANCHE TUBULOSA Anti Alzhermer's PHGS75% ECH 30% ACT 12%

הנתונים שלנו מצביעים על כך ש-CTE מגביר את ייצור ROS תוך תאי וכתוצאה מכך מוות תאי המושרה על ידי ROS. מצב החיזור של התא ממלא גם תפקיד מכריע בוויסות האפופטוזיס ושרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדריאלית היא אחד האתרים העיקריים של יצירת ROS תאי (Trachootham et al., 2008). יתר על כן, ה-ROS התוך תאי יכול לגרום לאפופטוזיס תאית דרך מסלולים תלויי מיטוכונדריה ובלתי תלויים (Sinha et al., 2013). ואכן, הנתונים שלנו מצביעים גם על כך שהחצנה הנגרמת על ידי CTE, היא השפעה שכיחה באפופטוזיס, הן בשורות תאים סרטניים ראשוניים והן בגרורות, מה שמצביע על כך שמנגנון המוות המושרה על ידי CTE מתווך על ידי אפופטוזיס ולא על ידי נמק. ההפעלה של אפופטוזיס בתאי סרטן היא אסטרטגיה מתקנת ותרופות אנטי סרטניות רבות עשויות להפעיל השפעות אפופטוזיות בתאי סרטן.

לכן, תרכובות או תמציות עם פעילות פרו-אפופטוטיות בתאים סרטניים עשויים להיות שימושיים במחקר תרופות נגד סרטן (Wong, 2011). כדי לקבוע אם האפקט הפרו-אפופטוטי המושרה על ידי CTE מתווך על ידי מנגנון ROS המושרה במיטוכונדריה, מדדנו ייצור סופראוקסיד באמצעות בדיקה ניאון ממוקדת למיטוכונדריה בתאים שטופלו ב-CTE. הנתונים שלנו מראים בבירור ש-CTE ממריץ ייצור סופראוקסיד מיטוכונדריאלי, דבר המצביע על כך שפעילות אנטי-סרטנית של Cistanche tubulosa מתווכת לפחות בחלקה באמצעות מנגנון ROS המושרה במיטוכונדריה.

מסקנות

לסיכום, הנתונים שלנו מצביעים על כך שתמצית המים של צמח המדבר Cistanche tubulosa עשויה לייצג מועמד מבטיח לגישה אנטי סרטנית בשילוב עם טיפולים קונבנציונליים אחרים למניעה וטיפול בסרטן המעי הגס. אנו גם מראים שהרעילות של תמצית הצמח כנגד תאים סרטניים מתווכת על ידי ייצור ROS תוך תאי מוגבר, ולפחות בחלקה, על ידי אפופטוזיס תלויה במיטוכונדריה. מחקרים נוספים נמשכים לבודד ולאפיין את המרכיבים הפעילים הבודדים ביולוגית האחראים לפעילות אנטי סרטנית.

יש צורך במחקר נוסף כדי להעריך את השימוש הפוטנציאלי בתמצית זו כחומר כימי-מונע יעיל וכדי להבין את מנגנוני הפעולה על תאי סרטן המעי הגס ברמה המולקולרית. נדרשים גם מחקרים פרה-קליניים וקליניים נוספים כדי לאשר את ההשפעות הבריאותיות המועילות שנצפו שלCistanche tubulosa למניעת סרטן.

 CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE COFFE משפר זיכרון אנטי עייפות PHGS75% ECH 30% ACT 12%