תזונה משפיעה באופן משמעותי על האימונופתולוגיה וחומרת הפגיעה בכליות

איש קשר: emily.li@wecistanche.com

John E. Brus, et al

תַקצִיר: 

"דיאטה היא גורם סיכון סיבתי מוביל לתחלואה ותמותה ברחבי העולם, אך לעתים רחוקות היא נחשבת בתכנון של מחקרים פרה-קליניים בבעלי חיים. כמה מהליקויים התזונתיים שדווחו אצל אמריקאים הוכחו כמזיקיםכִּליָהבְּרִיאוּת; עם זאת, המנגנונים האחראים אינם ברורים ויוחסו במידה רבה להתפתחות סוכרת או יתר לחץ דם. כאן, יצאנו לקבוע אם התזונה משפיעה על הרגישות לפגיעה בכליות בעכברי C57Bl/6 זכרים. עכברים הוזנו מדיאטת צ'או סטנדרטית, דיאטה "מערבית" זמינה מסחרית (WD), או דיאטה אמריקנית חדשה (AD) במשך 12 שבועות לפני הזירוז שלכִּליָהפציעהשימוש במודלים של נפרופתיה חומצה פולית (FAN) או פגיעה חד-צדדית בכליות איסכמיה-רפרפוזיה (uIRI). ב-FAN, לעכברים שניזונו ב-WD וב-AD היו עדויות היסטולוגיות גרועות יותר לפגיעה ברקמות וביטוי כלייתי גדול יותר של גנים הקשורים לרעילות נפרוטה בהשוואה לעכברים שניזונו ב-chow. עכברים שניזונו עם AD פיתחו היפרטרופיה כלייתית חמורה יותר בעקבות FAN, ונתוני ביטוי גנים מראים שהמנגנון של FAN שונה בין הדיאטות. בינתיים, לעכברים שניזונו ב-WD היו ריכוזי האינטרלוקין-6 הגדולים ביותר במחזור. ב-uIRI, לא נצפה הבדל בפגיעה ברקמת הכליה בין הדיאטות; עם זאת, עכברים שניזונו ב-WD וב-AD הראו עדויות לתגובה דלקתית מדוכאת. יחד, הנתונים שלנו תומכים בהשערה שתזונה משפיעה ישירות על חומרת המחלה והפתופיזיולוגיה שלכִּליָהמַחֲלָהוהוא משתנה ניסיוני קריטי שצריך לקחת בחשבון במחקרים פרה-קליניים מכניסטיים בבעלי חיים.

מילות מפתח: דיאטה מערבית; עכבר; חַדכִּליָהפציעה; איכות תזונתית; תְזוּנָה

לחץ כאן כדי לקבל מידע נוסף על מוצרי Cistanche לשיפור הכליות

1. הקדמה

אורח החיים הוא תורם מוביל לבריאות הכללית ומשפיע באופן משמעותי על התוצאות של מחלות לב וכלי דם (CVD) ללא קשר לסיכון גנטי [1]. תזונה היא מרכיב מרכזי באורח החיים, ותזונה לקויה ומחלות הקשורות לתזונה מהוות יותר משמונה מתוך 30 גורמי הסיכון המובילים לתחלואה ותמותה ברחבי העולם [2]. עם זאת, המנגנונים המתארים כיצד תזונה לקויה משפיעה לרעה על הבריאות נותרו לא ברורים באופן מפתיע.

מחסום עיקרי בחקר התזונה היה הקושי ליצור מודל בלתי הולם של הטבע המורכב והרב-גוני של הרגלי התזונה האנושיים במחקרים פרה-קליניים מכאניסטיים בבעלי חיים. דיאטות צ'או הן מקור המזון הנפוץ ביותר במחקרי מכרסמים פרה-קליניים בשל איכותם התזונתית הגבוהה, יציבות האחסון ועלויות הייצור הנמוכות יחסית. מורכבות מתערובות מבוססות דגנים המושלמות בשמנים איכותיים ותערובות ויטמינים/מינרלים, דיאטות צ'או הן ייצוגים גרועים של האיכות התזונתית הנמוכה יחסית המדווחת בחברות מפותחות. זה הוביל ליצירת מגוון של דיאטות מעוררות מחלות, שרובן מתמקדות בצריכה קלורית גבוהה של מדינות מפותחות ומייצרות השמנה וחוסר תפקוד מטבולי בבעלי חיים מסוג בר. למרות שהשמנה והפרעות בתפקוד מטבולי נותרו דאגות בריאותיות מרכזיות ברחבי העולם, דיאטות עתירות קלוריות זמינות כיום מייצגות השקפה קיצונית וצרה מאוד של החסרים התזונתיים המורכבים המדווחים בחברות מערביות. ההשפעות הפיזיולוגיות של חומר תזונתי נתון תלויות לעתים קרובות בקיומם ובשפע של חומרים מזינים אחרים (כגון יחס נתרן-אשלגן [3,4]) ואינטראקציות אלו אינן נחשבות בתזונה הגורמת למחלות זמינות מסחרית. לכן, יתכן שהגישה הרדוקציונית המקובלת בחקר התזונה הפריעה ללא כוונה את התרגום המוצלח של נתונים מכניסטיים ממכרסמים לבני אדם.

בניסיון לטפל בבעיה זו, אנו מפתחים דיאטה אמריקנית חדשה (AD) הכוללת כמה מהליקויים התזונתיים שדווחו אצל אמריקאים [5]. ה-AD היא דיאטה דו-כדורית המורכבת מגלולה המבוססת על דגנים וכדורית "מתוק ומלוח" סינתטית ופותחה מתוך עניין של לימוד העדפה תזונתית ועשויה לקזז את ההשפעות השליליות המדווחות של דיאטות מכרסמים מסורתיות עתירות קלוריות [6] ]. מעניין לציין שכמה מהשינויים התזונתיים שנעשו ב- AD הוצעו להשפיעכִּליָהבְּרִיאוּתבאופן ישיר או עקיף [7-10].כִּליָהתִפקוּד לָקוּימהווה גורם מוביל ל-CVD ותוצאה שכיחה במחלות הנגרמות על ידי תזונה כגוןסוכרתולַחַץ יֶתֶר. ניתוחים אחרונים הראו כי איכות תזונה ירודה מגבירה את השכיחות שלכִּליָהפציעהומַחֲלָה[11]; עם זאת, המנגנונים האחראים עדיין לא ברורים. לכן, יצאנו לקבוע אם הדיאטה משפיעה באופן משמעותי על התוצאות של שני מודלים שונים של עכברים של פגיעה בכליות.

2. חומרים ושיטות

2.1. בעלי חיים ודיאטות

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו לפי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת ליברטי ובהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה [12]. עכברי זכר C57Bl/6 נגמלים (3-בני שבוע) נרכשו ממעבדת ג'קסון ושוכנו בקבוצה (3-5 עכברים לכל כלוב) עם מצעי קלחי תירס, מאכל מכרסם סטנדרטי (Teklad Global 18 אחוז , # 2018), ומי ברז מסוננים בפחמן. לאחר 1-תקופת הסתגלות של שבוע, לעכברים ניתנה גישה חופשית לאחת משלוש דיאטות: chow (Teklad Global 18 אחוז , #2018, n=14), דיאטה מערבית זמינה מסחרית ("WD, " #TD.88137, n=13), או הרומן שלנו "AD" (n=14).

ה-AD מורכב משני כדורים, המכונה AD chow (TD.170651) ו-ADsyn thetic (TD.170698 ו-TD.170699). גלולת AD chow היא גלולה שונה על בסיס צ'או עם ויטמינים מופחתים מסיסי שומן (A, D ו-E) וסיבים בלתי מסיסים (סיבים דטרגנטים ניטרליים). התזונה הסינטטית נוסחה כך שתכלול עודף סוכרוז, פרוקטוז, שומנים רוויים, כולסטרול, חומצות שומן רב בלתי רוויות אומגה-6, חומצות שומן טראנס, נתרן וזרחן תוך הפחתת חומצות שומן רב בלתי רוויות אשלגן ואומגה-3 . חומצות שומן טראנס נכללו בפורמולה מכיוון שהן עדיין נצרכות ממקורות טבעיים (כגון בשר בקר), אך ההכללה בכדורית ADsynthetic הייתה נמוכה בהרבה מזו ששימשה במחקרים קודמים אחרים [13-16]. הכללת כל חומר תזונתי התבססה על התאמת ההפרש באחוז של צריכה בפועל ומומלצת בעכברים ובני אדם (מתואר בנספח א' טבלה A1) בהתבסס על דיווחים אחרונים של משרד החקלאות של ארצות הברית [5,12]. הרכב החומרים התזונתיים עבור כל גלולה התבסס על ההפרש האחוז המחושב של ערכי הצריכה המדווחים והמומלצים של כל חומר תזונתי באמריקאים, והפרש באחוזים זה יושם לאחר מכן על דרישות תזונת עכברים [13]. הניסוח הסופי של כל גלולה הותאם עוד יותר כדי לקחת בחשבון צריכה יומית ממוצעת של 2 ו-0.5 גרם של AD סינתטי ו-ADchow, בהתאמה. גלולה סינתטית נוספת, ADsythetic2, פותחה כדי להתאים לשינוי בהעדפת התזונה מעבר ל-8 שבועות, כאשר עכברים צרכו כמויות שוות בערך (1.5 גרם) של ADchow ו-ADsynthetic2 מדי יום. סיכום של הדיאטות ששימשו במחקר זה מובא בטבלה 1.

2.2. דגמי עכברים של פגיעה בכליות חריפה (AKI)

עכברים נשארו בתזונה הניסיונית שלהם במשך 12 שבועות לפני הזירוז שלכִּליָהפציעהעם מודלים של נפרופתיה הנגרמת על ידי חומצה פולית (FAN) או פציעה חד-צדדית של איסכמיה-רפרפוזיה (uIRI). מודלים אלה נבחרו מכיוון שהם נמצאים בשימוש שגרתי בספרות ומעוררים יציבותכִּליָהפציעהבאופן תלוי מינון [17]. מודל ה-FAN בוצע על סמך פרסומים קודמים [18-21] עם שינויים. בשל ההבדלים במשקל הגוף בין קבוצות התזונה, חישבנו את המינון של 250 מ"ג/ק"ג עבור העכבר הקטן ביותר במחקר שלנו (25 גרם) וניתנו לכולם את אותו המינון (6.25 מ"ג/500 מיקרוגל) עכברים בהרדמה קצרה של איזופלורן (3 אחוזים ב-100 אחוז חמצן, 600 מ"ל לדקה). עכברי בקרה (n=4 לכל דיאטה) קיבלו נפח שווה (500 µL) של 0.3 מ"מ נתרן ביקרבונט כמו עכברים שקיבלו את ה-FAN (n=4 עבור כל דיאטה). עבור מודל ה-uIRI, עכברים (n=5-6 לכל דיאטה) הורדמו עם איזופלורן ונעשה חתך צד והעורק והווריד של שמאלכִּליָהבודדו מרקמת החיבור והשומן שמסביב וחוסמו באמצעות מהדק מיקרו-וסקולרי. לאחר 45 דקות, המהדק הוסר ושיקום זרימת הדם אושר חזותית. השרירים נסגרו בתפר משי 4.0 וחתך העור נסגר בסיכות כירורגית. טמפרטורת הגוף של פני השטח נשמרה על 28-30 ◦C עם מנורת חום וכרית חימום (טמפרטורת גוף רגילה של פני השטח ~30 ◦C). Buprenorphine (0.1 מ"ג/מ"ל, הזרקה תת עורית של 100 μL) ניתן כמשכך כאבים ברגע שהחיה החלה לחזור להכרה.

Cistanche יכול לטפל בפגיעה בכליות

2.3. המתת חסד בעלי חיים, ניתוח היסטולוגי ומדידות סרום של תפקוד הכליות

בעלי חיים הורדמו 24 (uIRI) או 48 שעות (FAN) מאוחר יותר על ידי נקע בצוואר הרחם בזמן הרדמה קצרה של איזופלורן. הלב הוסר ודם הגזע נאסף, הושאר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקה, ועבר צנטריפוגה למשך 10 דקה ב-2500 גרם. הסרום נאסף והוקפא ב-80 ◦C עד לניתוח עבור קריאטינין (Crystal Chem), חנקן אוריאה בדם (BUN, Arbor Assays), או אינטרלוקין -6 (IL6, Biolegend) באמצעות מבחני זמינים מסחרית. הכליות נותחו והורידו את הקפסולה, וחתך סגיטלי מרכזי נקבע בפורמלין מבוצר ב-10% פוספט, מוטבע בפרפין, וחתכים בגודל 5 מיקרומטר נחתכו והוצבעו ב-H&E או Picro Sirius Red (ABCAM). בקטעים מוכתמים ב-H&E, חומרת הנמק הצינורי החריף הוערכה על ידי אדם שסווור לתכנון ניסוי על בסיס סולם 0-4, כאשר (0) מתייחס ללא עדות לפציעה, (1) הוא<25% of="" the="" identifiable="" tissue="" area="" consists="" of="" injury,="" (2)="" 25–50%,="" (3)="" 50–75%,="" and="" (4)="">75 אחוז. בדומה לעבודה קודמת [22], "פגיעה בצינורית" כללה התרחבות צינורית, גבס חלבוני ושיפוץ צינורית לכאורה. מידת הפיברוזיס של tubulointerstitial הוערכה בחתכים מוכתמים של Picro Sirius.

2.4. מערך PCR של נפרוטוקסיות

כ-30-100 מ"ג חתיכות נטולות קפסולכִּליָהרִקמָהאוחסנו בתמיסת RNAlater™ (Thermo). נבחר מדגם מייצג יחיד מכל קבוצת דיאטה במחקר ה-FAN שדמה מאוד לממוצע הקבוצה עבור ציוני קריאטינין בסרום, BUN והיסטולוגיה בכל קבוצת טיפול. לאחר מכן הדגימה שנבחרה עובדה כדי לכמת את הביטוי של 84 גנים הקשורים לרעילות נפרו באמצעות RT2 ProfilerTM PCR Array—Mouse Nephrotoxicity(#PAMM-094Z) כפי שהומלץ על ידי היצרן (Qiagen). RNA כולל בודד באמצעות ערכת RNeasy®, DNA גנומי הוסר על ידי עיכול DNA, ו-0.5 ugs של RNA כולל שימש לסינתזת cDNA באמצעות ערכת RT2 First Strand Kit. תערובת ה-cDNA עורבבה עם theRT2 SYBR® Green Mastermix ומים נטולי נוקלאז ולאחר מכן הונחה על צלחת RT2 ונותחה כפי שהומלץ באמצעות מכשיר Lightcycler™ 96 (Roche). ערכי ∆Ct עבור כל קבוצת טיפול חושבו על סמך הביטוי של גנים למשק בית באמצעות המשוואה הבאה: 2ˆ (∆CT), כאשר ∆CT=(משק בית (GAPDH))-CT (גן מעניין)] . אחוז ההבדל בביטוי בהשוואה לעכברי בקרה (עכברים שניזונו ב-chow עם טיפול בכלי) חושב עבור כל גן. כדי לזהות גנים שעלולים להיות מושפעים מ-FAN ומתזונה, שינינו את הניתוח שסיפק היצרן (Qiagen). זוהו גנים עם הבדל גדול מ-2-מעכברי ביקורת ומרשימה זו, זיהינו גנים עם הבדל גדול או שווה ל-25 אחוזים בין עכברים שניזונו מ-WD ו-AD. שישה גנים זוהו באמצעות מתודולוגיה זו וביטוי ה-mRNA הכליות שלהם כמת באמצעות RT-PCR קונבנציונלי בזמן אמת.

2.5. RT-PCR עבור גנים הקשורים לרעילות נפרוטית, דלקת ושיפוץ רקמות

הכליות והטחול עובדו עבור RT-PCR באמצעות ערכות זמינות מסחרית (Qiagen ו-BioRad) בהתאם להמלצות היצרן. פריימרים פורשי אינטררון עבור גנים המעורבים ב-nephrotoxicity או בסמנים ספציפיים לויקוציטים נרכשו מ-BioRad או נוצרו באמצעות תוכנת Primer3 [23-25]. מידע ראשוני מסופק בנספח C טבלה A2. לאחר מכן, בוצעו תגובות RT-PCR של 10 µL באמצעות iTaq Universal SYBR Green Supermix (BioRad) וערכי ∆CT חושבו עבור כל גן. כל הנתונים מוצגים כמנורמלים לממוצע של קבוצות הביקורת עבור כל אחת מהןכִּליָהפציעהמודל (עכברים שניזונו ב-chow עם כלי רכב מוזרק עבור FAN או כליה נגדית של עכברים שניזונו בצ'או ב-IRI).

2.6. ניתוח סטטיסטי

כל המחקרים בוצעו באמצעות עיצוב אקראי לחלוטין. במחקר ה-FAN, "דיאטה" ו"טיפול" היו המשתנים הבלתי תלויים כאשר ל"דיאטה" יש את 3 הרמות (צ'או, WD ו-AD), ול"טיפול" יש 2 רמות (רכב או מאוורר). ניתוחים דומים שימשו במחקר uIRI, שבו "הטיפול" נקבע על ידי השוואת נתוני ביטוי הגנים בכליה האיסכמית לכליית הבקרה הלא-איסכמית, הנגדית. כל הנתונים נבדקו לפני ניתוח GLM וחריגים זוהו באמצעות הפונקציה Explore ונותחו באמצעות נהלי מודל ליניארי כללי ב-SPSS (IBM). ערכים נחשבו מובהקים עם p פחות או שווה ל-0.05 עם ניתוח Tukey Post Hoc, ונטייה הוגדרה כ-p פחות או שווה ל-0.1.

3. תוצאות

3.1. תזונה לקויה מחמירה את פציעת הרקמות ב-FAN

לעכברים שניזונו ב-WD היה משקל הגוף הכולל הגדול ביותר (37.4 ± 4.1 גרם) בהשוואה לעכברים שניזונו ב-AD (30.3 ± 1.0, p=0.{{ 17}}01) ועכברים שניזונו ב-chow (26.8 ± 1.1, p < {{20}}.001).="" מידת="" השומן="" הייתה="" שונה="" גם="" בין="" הקבוצות,="" שבהן="" לעכברים="" שניזונו="" מ-wd="" היה="" משקל="" כרית="" השומן="" האפידידימלי="" הגבוה="" ביותר="" (2.0="" ±="" {{30}}.6="" גרם,="" p="">< 0.="" 001)="" בהשוואה="" לעכברים="" שניזונו="" בצ'או="" (0.4="" ±="" 0.08,="" p="">< 0.001)="" וה-ad(0.7="" ±="" 0.3,="" p="">< 0.001).="" העלייה="" במשקל="" הגוף="" והשומני="" שנצפתה="" בעכברים="" שניזונו="" ב-ad="" הייתה="" גם="" גדולה="" יותר="" מאשר="" בעכברים="" שניזונו="" ב-chow="" (p="0.001" ו-p=""><0.001, בהתאמה).="" משקלי="" רקמת="" השומן="" לא="" היו="" שונים="" בין="" עכברים="" בכלי="" הרכב="" או="" בקבוצות="" שטופלו="" ב-fan="" (עמ'="">

מעניין לציין כי לעכברים שניזונו ב-AD היו משקל הכליות הגדול ביותר בהשוואה לעכברים שניזונו ב-chow (p < {{0}}.001)="" ו-wd="" (p="" {{2="" }}.01)="" (טבלה="" 2).="" משקלי="" הכליות="" לא="" היו="" שונים="" בין="" עכברים="" שניזונו="" ב-chow="" או="" wd="" (p="0.1)" ונתונים="" אלו="" היו="" עקביים="" כאשר="" משקל="" הגוף="" שימש="" כמשתנה="" משנה="" (p="0.52)." קריאטינין="" במחזור="" הדם="" (p="">< 0.001)="" ו-bun="" (p="">< 0.001)="" עלו="" באופן="" משמעותי="" בתגובה="" ל-fan,="" אך="" שניהם="" לא="" הושפעו="" באופן="" מובהק="" מהתזונה="" (p="0.74" ו-0.67,="" בהתאמה).="" עם="" זאת,="" דיאטה="" השפיעה="" באופן="" משמעותי="" על="" חומרת="" הפגיעה="" ברקמות="" שהוערכה="" במיקרוסקופיה="" עם="" עכברים="" שניזונו="" ב-wd="" (p="0.001)" ו-ad="" (p="0.004)" עם="" פגיעה="" חמורה="" יותר="" ברקמות="" בהשוואה="" ל="" עכברים="" שניזונו="" בצ'או="" (טבלה="" 2="" ואיור="" 1).="" המאפיינים="" ההיסטולוגיים="" השולטים="" של="" פגיעה="" בכליות="" היו="" התרחבות="" צינורית="" ונמק="" צינורי="" חריף,="" שהיו="" חמורים="" יותר="" ונפוצים="" יותר="" בכל="" קליפת="" המוח="" בעכברים="" שניזונו="" עם="" ad="" ו-wd.="" לא="" נצפה="" הבדל="" בפיברוזיס="" כלייתי="" בין="" קבוצות="" הדיאטה="" בחתכים="" מוכתמים="" של="" picro="" sirius="" (נספח="" c="" איור="" a1).="" fan="" גרם="" לעלייה="" משמעותית="" (p="0.005)" באינטרלוקין="" במחזור="" הדם-6="" (il6)="" שהוחמרה="" עוד="" יותר="" עם="" wd="" בהשוואה="" לעכברים="" שניזונו="" עם="" ad="" (עמ'="0.01)" ו="" chow="" (עמ'="0.006," טבלה="" 2).="" כמו="" כן,="" fan="" גרם="" לעלייה="" דרסטית="" בביטוי="" il6="" mrna="" הכלייתי="" (p="">< 0.001);="" עם="" זאת,="" לא="" היה="" הבדל="" משמעותי="" בין="" קבוצות="" הדיאטה="" (עמ'="">

3.2. דיאטה משפיעה באופן משמעותי על ביטוי ה-mRNA הכלייתי של גנים ספציפיים לנפרוטוקסיים וללאוקוציטים ב-FAN

לאחר מכן יצאנו לזהות מנגנונים פוטנציאליים האחראים להחמרה של פגיעה ברקמות בעכברים שניזונו ב-WD וב-AD. דגימות מייצגות מכל דיאטה נבחרו והביטוי של 84 גנים הקשורים לרעילות נפרוטית נבדק באמצעות מערך PCR זמין מסחרית (נתונים גולמיים מוצגים בנספח E טבלה A3). בהשוואה לעכברים שניזונו באמצעות כלי רכב, 57 גנים נפרוטוקסיים זוהו כבעלי שינוי של יותר מ-50 אחוז בביטוי עם FAN, ושישה מהם זוהו כשונים על סמך תזונה (נספח F טבלה A4). מבין ששת הגנים שזוהו על ידי בדיקת הנפרוטוקסיות, ביטוי כליות של Btg2 (p=0.03), Cdkn1a (p=0.01) ו-Spp1 (p=0.001) היו מובהקות מושפע מהתזונה כפי שנקבע באמצעות RT-PCR קונבנציונלי. לעכברים שניזונו ב-WD היה ביטוי גדול יותר של Btg2 ו-Spp1 בהשוואה לעכברים שניזונו עם chow ו-AD, בעוד שלעכברים שניזונו מה-AD היה ביטוי גדול יותר של Cdkn1a בהשוואה לעכברים שניזונו עם chow ו-WD (נספח F טבלה A4 ואיור 2) . כמו כן, כימתנו את ביטוי ה-mRNA הכלייתי של 4 סמנים ספציפיים לויקוציטים (CD3e, CD19, CCR2 ו-Ly6G), שכולם הושפעו באופן מובהק מ-FAN (נספח F טבלה A4). עם זאת, לתזונה לא הייתה השפעה משמעותית על הביטוי של סמנים ספציפיים ללוקוציטים בכליה.

הראינו בעבר שהטחול משפיע באופן משמעותי על האימונופתולוגיה של פגיעה בכליות [26-28]. לכן, יצאנו לקבוע אם התזונה משנה את ביטוי ה-mRNA בטחול של אותם סמנים ספציפיים ללוקוציטים ב-FAN. FAN גרם לירידה משמעותית בביטוי mRNA בטחול של סמן תאי T Cd3e (p=0.001) וסמן תאי B Cd19 (p < 0.001)="" (איור="" 3)="" ונספח="" ו'="" טבלה="" א4).="" לגבי="" דיאטה,="" לעכברים="" שניזונו="" ב-ad="" היה="" ביטוי="" mrna="" בטחול="" נמוך="" יותר="" של="" cd3e="" (p="0.01)" ו-cd19="" (p="0.009)" בהשוואה="" לעכברים="" שניזונו="" עם="" chow="" אך="" לא="" לעכברים="" שניזונו="" ב-wd="" (p="" גדול="" או="" שווה="" ל-0.2).="" לא="" הייתה="" השפעה="" משמעותית="" של="" דיאטה="" (p="0.8)" או="" fan="" (p="0.1)" על="" ביטוי="" il6="" בטחול="" (נתונים="" לא="">

3.3. תזונה משפיעה באופן משמעותי על ביטוי גנים ספציפי ללוקוציטים ב-uIRI

חזרנו על מחקרי התזונה שלנו במודל uIRI כדי להעריך את יכולת ההכללה של נתוני ה-FAN. למרות ההבדל המשמעותי בשומן בין קבוצות טיפול תזונתיים, לא היו הבדלים משמעותיים בזמן הניתוח (~5 דקות) בין קבוצות הטיפול (p=0.5). לתזונה לא הייתה השפעה על חומרת הפגיעה ברקמות כפי שנקבעה על ידי כימות של H&E- (p=0.7, איור 4) או שקופיות מוכתמות ב-Picro Sirius (נספח D איור A2). בעוד שלעכברים שניזונו מ-AD היו משקלי כליות גבוהים יותר במחקר ה-FAN, הייתה רק נטייה לתזונה להשפיע על משקלי הכליות (עמ'=0.07) במחקר uIRI. בכליה הנגדית הלא-איסכמית, לעכברים שניזונו בצ'או היו משקלים מספריים נמוכים יותר (160 ± 22 מ"ג) בהשוואה לעכברים שניזונו עם AD (168 ± 14) ו-WD (186 ± 15). מגמות מספריות דומות נצפו בכליות איסכמיות שבהן לעכברים שניזונו עם chow (173 ± 24 מ"ג) או לעכברים שניזונו מ-AD (170 ± 12) היה משקל כליות מספרי נמוך יותר בהשוואה לעכברים שניזונו ב-WD (195 ± 32). נתונים אלו מצביעים על כך שהשפעת הדיאטה על משקל הכליות עם פגיעה תלויה במודל המשמש.

כל הגנים הנפרוטוקסיים והספציפיים לויקוציטים שכומתו בכליות הושפעו באופן משמעותי מ-uIRI מלבד Cd3e (p=0.1, נספח G טבלה A5). עם זאת, אף אחד מהגנים הנפרוטוקסיים שזוהו במחקר FAN לא הושפע באופן מובהק מהתזונה. בהתייחס לביטוי של גנים ספציפיים לויקוציטים, ההשפעה של uIRI על ביטוי ה-Cd19 mRNA הכלייתי הייתה תלויה מאוד בתזונה (p=0.008), כאשר לעכברים שניזונו ב-WD וב-AD יש פי ארבעה בערך ביטוי Cd19 כלייתי גבוה יותר לאחר uIRI בהשוואה לעכברים שניזונו בצ'או (איור 5). הייתה גם נטייה שלעכברים שניזונו בצ'או יש ביטוי Ly6g כליות גדול יותר לאחר uIRI (עמ'=0.06, נספח G טבלה A5). מעניין לציין שלעכברים שניזונו WD (p=0.006) ו-AD (p=0.004) היו ריכוזי IL6 במחזור נמוכים משמעותית בהשוואה לעכברים שניזונו עם chow (איור 5).

התזונה השפיעה באופן משמעותי על ביטוי ה-mRNA בטחול של Cd19 (p = 0.008), Ccr2 (p =0.004) ו-Ly6g (p {{7} }.03) בעקבות uIRI (איור 6 ונספח G טבלה A5). לעכברים שניזונו chow היה הביטוי הטחול הגבוה ביותר של סמנים אלה, כאשר Ccr2 מאשר עכברים שניזונו ב-WD (p = 0.02) ו-AD (p = 0.005), ביטוי Cd19 היה גדול משמעותית מאשר עכברים שניזונו AD (p = 0.007), אך לא WD (p = 0.4), וביטוי Ly6g גדול יותר מאשר עכברים שהאכילו את AD (p = 0.04) ונטייה ל ביטוי גדול יותר בעכברים שניזונו ב-WD (עמ' = 0.07). לא היו הבדלים בביטוי של סמנים ספציפיים ללוקוציטים בין עכברים שניזונו ב-WD או AD (p = 0.9, 0.8 ו-0.1 עבור Ccr2, Cd19 או Ly6g, בהתאמה.

4. דיון

כאן אנו מציגים נתונים המראים את השפעת הדיאטה על חומרת ואימונופתולוגיה של מחלת כליות במודלים פרה-קליניים של עכברים. לעכברים שניזונו ב-WD וב-AD שניהם היו דרגות גבוהות של פגיעה ברקמות וביטוי דיפרנציאלי של גנים נפרוטוקסיים בעקבות FAN בהשוואה לעכברים שניזונו ב-chow. לעכברים שניזונו ב-WD, אך לא AD, היו גם רמות מחזוריות גבוהות משמעותית של IL6 בעקבות FAN. ב-uIRI, לא ראינו השפעה משמעותית של דיאטה על חומרת הפגיעה ברקמות או על הביטוי הכלייתי של גנים נפרוטוקסיים דומים. עם זאת, ראינו ירידה משמעותית ב-IL-6 במחזור הדם ובביטוי של גנים ספציפיים ללוקוציטים בכליות ובטחול של עכברים שניזונו ב-WD וב-AD. יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שתזונה משפיעה באופן משמעותי על האימונופתולוגיה של שני מודלים נפרדים של עכברים של פגיעה בכליות.

יש מעט מחקרים באופן מפתיע העוסקים בהשפעת התזונה על תוצאות של פגיעה בכליות. לעכברי C57Bl/6 שניזונו מתזונה עתירת שומן במשך 9 שבועות הייתה פגיעה כלייתית חמורה יותר על רקע ציספלטין בהשוואה לעכברים שניזונו ב-chow [29]. יש לציין כי המינון של cisplatin במחקר זה התבסס על משקל הגוף והביא לכך שהעכברים עתירי השומן קיבלו כמות מוחלטת גבוהה יותר של cisplatin. זהו סיבוך שכיח במחקרי תזונה והיה הרציונל למתן אותו נפח וכמות מוחלטת של FA לכל העכברים.

בעוד שקיים מספר מצומצם של מאמרים המתארים את השפעת התזונה על תוצאות מחלת כליות, קיימת ספרות ראויה להערכה המתארת ​​את השפעת הסוכרת על הרגישות וההתקדמות של פגיעה בכליות במכרסמים [30-33]. מחקרים מתמשכים (שלא פורסמו) במעבדה שלנו מצביעים על כך שלעכברים שניזונו מ-WD ו-AD יש צריכת קלוריות יומית גבוהה יותר (16 ו-15 קק"ל ליום, בהתאמה) בהשוואה לעכברים שניזונו בצ'או (12 קק"ל ליום). מעניין לציין שרק עכברים שניזונו ב-WD מציגים עדות לתנגודת לאינסולין, כאשר היפוגליקמיה בצום (120.3 מ"ג/ד"ל) נצפתה כבר 8 שבועות לאחר התחלת הדיאטה ופיתחו עלייה של פי ארבע באינסולין בצום ( 4.2 ng/mL) לאחר 24 שבועות. לעכברים שניזונו בצ'או וב-AD יש גלוקוז בצום כמעט זהים (166 ו-167 מ"ג/ד"ל, בהתאמה) ואינסולין (0.6 ו-1.0, בהתאמה) בנקודות זמן דומות. בהתחשב בקינטיקה של נתונים אלה, אנו מאמינים שה-AD מדגמן בהצלחה חוסרים תזונתיים מתונים ונטול תפקוד מטבולי במסגרת הזמן של המחקר הנוכחי, בעוד שעכברים שניזונו ב-WD פיתחו ככל הנראה עמידות לאינסולין.

Previous work has shown diabetic mice have altered renal hemodynamics [30], exacerbated inflflammatory response [31,32], and altered expression of cell-cycle regulators [33] following kidney injury. Interestingly, we also observed alterations in the immune response and cell-cycle regulators in both WD- and AD-fed mice. Regarding the immune response, mice fed the WD had greater circulating IL6 concentrations than mice fed chow and the AD. This suggests that the overt obesity and developing metabolic dysfunction that is likely developing in the WD-fed mice exacerbates the immune response in FAN. We did not observe a signifificant increase in renal or splenic mRNA expression of IL6 in either the FAN or uIRI model suggesting another tissue source (perhaps the liver [34]) is responsible. The spleen is a reservoir of deployable leukocytes [35,36] and we have previously shown the spleen to play a signifificant role in the pathophysiology of kidney injury with splenic size being inversely correlated with kidney injury [26–28]. Mice fed the WD and AD had a>ירידה של 30 אחוזים בביטוי של סמני לויקוציטים בטחול, מה שעלול להתפרש כשיש פריסה מוגברת של לויקוציטים מהטחול. זה יצביע על דלקת מוגברת בעכברים שניזונו מ-WD ו-AD; עם זאת, נתוני IL6 במחזור תומכים רק בהשערה זו בעכברים שניזונו מ-WD. דרושים מחקרים נוספים עם ציטומטריית זרימה ואפיון רחב יותר של כימוקינים וציטוקינים במחזור הדם כדי להבין טוב יותר כיצד תזונה משפיעה על האימונולוגיה והפתופיזיולוגיה של FAN.

לגבי מווסתים של התקדמות מחזור התא, התזונה גם השפיעה באופן משמעותי על ביטוי ה-mRNA של Btg2 ו-Cdkn1a (p21) בעקבות FAN. מחקרי נוק-אאוט מצביעים על תפקיד מגן ל-Cdkn1a במחלת כליות (שנסקרה ב-[37]) וביטוי Btg2 הוכח גם הוא מוגבר בכליה האיסכמית, אך לא בשליטה נגדית [38]. עם זאת, התפקוד והמשמעות של ה-upregulation של Btg2 בפגיעה בכליות ובמחלות לא נקבעו. Btg2 הוא אפקטור במורד הזרם של NFκB ומווסתי מחזור התא p53 ו-p19 הגורמים לחסימת מחזור התא באמצעות מנגנונים תאיים שונים (נסקרו ב- [39]). יחד, הספרות הנוכחית מציעה כי מעכבי מחזור התא מועילים בהפחתת הפגיעה הכלייתית הראשונית, אך עשויים גם לשפר, או אפילו להקל, את ההתקדמות שלאחר מכן לצורות כרוניות יותר של המחלה [37,38,40-43]. ההבדל בביטוי של Btg2 ו-Cdkn1a בעכברים שניזונו ב-WD וב-AD מצביעים על השמנת יתר חולנית וחוסרים תזונתיים משפיעים על הפתופיזיולוגיה של פגיעה בכליות באמצעות מנגנונים תאיים שונים ועשויות להיות להם תוצאות שונות לטווח ארוך. יתר על כן, ההבדלים בביטוי Btg2 ו-Cdkn1a עשויים לתרום להיפרטרופיה הכלייתית שנצפה במודל FAN. הוכח כי מודל ה-FAN גורם להיפרטרופיה כלייתית חריפה [20,21], ול-AD יש הרכב מינרלים תזונתיים שהוכח גם כגורם להיפרטרופיה כלייתית ופציעה בחולדות [44,45]. לכן, ייתכן שתכולת המינרלים המשתנה (במיוחד הסידן והזרחן) ב-AD אחראית להחמרת ההיפרטרופיה הכלייתית ב-FAN. יש צורך במחקרים עתידיים כדי לאמת ספקולציה זו ואם Btg2 ו- Cdkn1a מעורבים.

מצאנו גם שביטוי mRNA של כליות Spp1 מושפע באופן מובהק הן מ-FAN והן מהתזונה, עם ביטוי גבוה יותר בעכברים שניזונו ב-WD בהשוואה לעכברים שניזונו מ-chow, אך לא מ-AD. Spp1 (אוסטאופונטין) הוא גליקופרוטאין המופרש בדרך כלל בשתן ומתבטא מאוד בכליות, במיוחד בנפרון הקורטיקלי הדיסטלי. Spp1 ממלא תפקיד מפתח בוויסות היווצרות גבישי סידן ושקיעתו בתוך צינוריות הכליה [46-49], תהליך התלוי בתזונה, אסטרוגן ו-FGF23 [7,50,51]. זה בדרך כלל מווסת לאחר פגיעה כלייתית [52]; עם זאת, תפקידו של Spp1 בפגיעה בכליות איסכמית אינו ברור ויש צורך במחקרים נוספים כדי להבהיר את המשמעות הפיזיולוגית של הביטוי המוגבר שלו עם שומן ומחלות.

כמו כן, הערכנו את התוצאות במודל של פציעת איסכמיה-רפרפוזיה חד-צדדית. לא צפינו בשינויים בהיסטולוגיה או בביטוי ה-mRNA של הגנים הקשורים לנפרוטוקסיות שזוהו במחקר FAN במודל uIRI שלנו. היעדר ההבדל בביטוי Btg2 ו-Cdkn1a הכלייתי במחקר uIRI עשוי להסביר מדוע לא נצפתה היפרטרופיה של הכליות בעכברים שניזונו ב-AD במחקר ה-FAN. עם זאת, היו השפעות של תזונה על הביטוי של סמנים חיסוניים בכליות ובטחול. הביטוי הכלייתי של סמן תאי B CD19 הוכפל ביותר בעכברים שניזונו ב-WD ו-AD בהשוואה לעכברים שניזונו ב-chow. המשמעות של ממצא זה אינה ברורה, שכן תפקידם של תאי B במודלים של עכברים של AKI איסכמי הוא מורכב והתוצאות תלויות במספר גורמים (תת-סוג, סוג נוגדנים וכו') [53-56]. הדיאטה גם השפיעה באופן משמעותי על ביטוי ה-mRNA של סמנים חיסוניים בטחול (Ccr2, Cd19 ו-Ly6g), כאשר לעכברים שניזונו מ-WD ו-AD היה ביטוי נמוך יותר בהשוואה לעכברים שניזונו ב-chow. כפי שהוזכר לעיל, זה יכול להתפרש כפריסה מוגברת של לויקוציטים מהטחול והחמרה של התגובה החיסונית המערכתית בעכברים שניזונו מ-WD ו-AD. עם זאת, ה-IL6 המדוכא במחזור בעכברים שניזונו מ-WD ו-AD יצביע על השפעה מדכאת חיסונית של דיאטות אלו במודל uIRI. מנגנונים מולקולריים שונים של פגיעה תאית במודלים של מחלות כליה תוארו [57-59], והמחקר שלנו מציע שתזונה עשויה לשנות מנגנונים אלה. דרושים מחקרים נוספים כדי לאמת ספקולציה זו ולקבוע כיצד התזונה משנה באופן משמעותי את התגובה הדלקתית ואת מסלולי המוות של התאים הכרוכים בפגיעה בכליות

ישנן מגבלות שיש לקחת בחשבון כאשר משווים את הנתונים שלנו לאחרים בספרות, במיוחד במחקרי uIRI. בחרנו במודל חד צדדי להפחתת הסיבוכים בהם נתקלנו תוך בידוד כלי הדם הכלייתיים מרקמת השומן העודפת בעכברים שניזונו מ-WD ו-AD. לכן, מדדי נסיוב של תפקוד הכליות לא כומתו במחקרי ה-uIRI בהתחשב בנוכחות של כליה נגדית בריאה, לא איסכמית. השתמשנו גם בהרדמת איזופלורן שכן עכברים שמנים לא סבלו את תערובת ההרדמה של קטמין/קסילזין שנמצאת בשימוש נפוץ במודל זה [60]. הוכח כי איזופלורן מפחית פגיעה בכליות ב-IRI [61] ודרש שנגדיל את הזמן האיסכמי שלנו מ-30 ל-45 דקות כדי להשיג את הנזק שנצפה. חוויות אלו עוררו דאגה לגבי התוצאות של מחקרי ה-uIRI שלנו והיוו את הרציונל להתמקדות שלנו במודל ה-FAN. חשוב גם להדגיש ששינויים בביטוי הגנים אינם משתווים לשינויים בייצור חלבון, ויש צורך במחקרים נוספים כדי לאמת שינויים בשפע החלבון ובעקבותיו שינויים בבריאות התא ובתפקוד.

Cistanche יכול לטפל בפגיעה בכליות

5. מסקנות

לסיכום, אנו מציגים נתונים התומכים במשמעות התזונה על הרגישות לפגיעה בכליות. הממצאים שלנו מצביעים על כך שדיאטה שנוצרה כדי להדגים את האחוזון ה-50 של צריכת חומרים מזינים אצל אמריקאים מספיקה כדי להחמיר את הפגיעה בכליות במכרסמים במידה דומה כפי שנצפתה ב-WD זמין מסחרית. הנתונים שלנו מצביעים גם על קשר מכניסטי בין תזונה, דלקת וויסות מחזור התא באימונופתולוגיה של פגיעה בכליות שמשנה באופן משמעותי את תוצאות המחלה. יחד, המחקר שלנו מדגיש את הצורך להגביר את ההערכה וההתחשבות בתזונה במחקרים פרה-קליניים מכאניסטיים בבעלי חיים.

תרומות מחבר:

המשגה, JCG; מתודולוגיה, JCG, JFH, JEB, RL; ניתוח פורמלי, JCG; חקירה, JEB, DLQ, KJW, BB, HTH, RL, JFH; משאבים, JCG, JFH; אוצרות נתונים, JCG, JFH; כתיבה-הכנת טיוטה מקורית, JCG, JFH; כתיבה- סקירה ועריכה, JEB, DLQ, KJW, BB, HTH, RL, JFH; פיקוח, JCG, JFH; ניהול פרויקטים, JCG, JFH; רכישת מימון, JCG כל המחברים קראו והסכימו לגרסה שפורסמה של כתב היד.

מימון:

מחקר זה נתמך על ידי מענקים פנימיים מאוניברסיטת ליברטי ומ-Liberty University College of Osteopathic Medicine, מענק מהאגודה האמריקאית לאוסטאופתיה (מענק מס' 19133749), ומענק מהמכון הלאומי לבריאות (1R01DK113632-01A1) .

הצהרת ועדת הביקורת המוסדית:

המחקר נערך על פי המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה [8] ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של Liberty University (#49.190710, 11 ביולי 2019).

תודות:

ברצוננו להודות לג'סיקה פלורס, ב-Teklad Diets (Envigo) על סיועה ביצירת מתקן הליבה ההיסטולוגי של AD ושל אוניברסיטת וירג'יניה עבור שירותי ההיסטולוגיה שלהם.

ניגוד עניינים:

המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים.

מתוך: 'תזונה משפיעה באופן משמעותי על האימונופתולוגיה וחומרת הפגיעה בכליות' מאתJohn E. Brus, et al

---נוטריאנטים 2021, 13, 1521