מחיקת MiR-29b2/c מובילה להזדקנות מואצת והגנה עצבית בעכברי מחלת פרקינסון הנגרמת על ידי MPTP

תַקצִיר

מחקרים מגלים קשר בין miR-29 בהזדקנות לבין מחלת פרקינסון (PD). כאן אנו מראים שרמות הסרום של miR-29s ב-1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced PD עכברים הציגו שינויים דינמיים. התפקיד של miR-29b2/c בהזדקנות ו-PD נחקר תוך שימוש בעכברי נוקאאוט בגנים miR-29b2/c (miR-29b2/c KO). עכברי miR-29b2/c KO אופיינו במשקל קל יותר באופן ניכר, קיפוזיס, חולשת שרירים והליכה לא תקינה בהשוואה לעכברים מסוג פרא (WT). ה-WT פיתח גם עיבוי דרמיס לכאורה והפחתת רקמת שומן. עם זאת, מחסור ב-miR-29b2/c הקל על נזקים המושרים על ידי MPTP של המערכת הדופמינרגית והפעלת גליה במסלול הניגרוסטריאטלי וכתוצאה מכך שיפר את התפקוד המוטורי של עכברי KO שטופלו ב-MPTP. נוקאאוט של miR-29b2/c עיכב את הביטוי של גורמים דלקתיים בתרביות ראשוניות שטופלו ב1-מתיל-4-פניל פירידיניום (MPP plus ) של גליה מעורבת, אסטרוציטים ראשוניים או LPS שטופלו מיקרוגליה ראשונית. יתרה מכך, מחסור ב-miR-29b2/c הגביר את הפעילות של AMPK אך דיכא את האיתות NF-κB p65 בתאי גליה. התוצאות שלנו מראות שעכברי miR-29b2/c KO מציגים את הפנוטיפ דמוי הפרוגריה. פחות תאי גליה מופעלים ודלקת עצבית מדוכאת עשויים להביא להגנה עצבית דופמינרגית בעכברי miR- 29b2/c KO. לסיכום, miR-29b2/c מעורב בוויסות ההזדקנות וממלא תפקיד מזיק במחלת פרקינסון.

מילות מפתח

MiR-29b2/c; הגנה עצבית; מחלת פרקינסון הנגרמת על ידי MPTP;יתרונות Cistanche.

לחץ כאן כדי לקבלמהן ההשפעות של Cistanche

מבוא

מחלת פרקינסון (PD) היא המחלה הנוירודגנרטיבית השנייה בשכיחותה, המאופיינת באובדן מתקדם של נוירונים דופמינרגיים ב-substantia nigra par compacta (SNpc) של המוח האמצעי, ועלייה בהפעלת גליה ודלקת עצבית [1-3]. MicroRNAs הם מולקולות RNA קצרות שאינן מקודדות המווסתות את ביטוי הגנים ברמה שלאחר התעתוק [4, 5]. MicroRNAs מעורבים בוויסות התפתחות מערכת העצבים, פלסטיות עצבית ומחלות ניווניות. משפחת MicroRNA29 (miR- 29s) מורכבת משני צבירי גנים: miR-29a/b1 ו-miR-29b2/c, הממוקמים על כרומוזום 6 וכרומוזום1, בהתאמה, של הגנום של העכבר. ל-miR-29a ו-miR-29c יש רק הבדל נוקלאוטיד אחד, ואילו miR-29b1 ו-miR-29b2 זהים ברצף [6]. miR-29 מעורבים במספר תהליכים ביולוגיים. גני יעד רבים של miR-29 אומתו בניסוי, כולל גני הישרדות של Procell Bcl-2, Mcl-1, Cdc42 ו-p85- ; גנים פרואפופטוטיים Puma, Bim, Bak ו-Bmf; וציטוקינים פרו-דלקתיים IFN- ו-IL-12. במערכת ההיקפית, מחקרים הראו ש-miR-29s מעורבים בפיברוזיס רקמות [7-9], מטבוליזם וויסות חיסוני [10-13].

miR-29 מתבטאים באופן נרחב במערכת העצבים המרכזית, והתמלילים שלהם קיימים גם בנוירונים וגם בתאי גליה [14, 15]. הקשר בין miR-29 ומחלות נוירולוגיות הוכח יותר ויותר. miR-29s מעורבים בוויסות ייצור עמילואיד, והם מווסתים למטה במוח של חולי AD [16, 17]; רמות miR-29 יורדות גם בחולי מחלת הנטינגטון (HD) ובעכברי HD [18, 19], בעוד שהן עולות בחולים עם טרשת צדדית אמיוטרופית (ALS) ומודלים של עכברים ALS [16, 20]. גם עכברים עם מחסור ב-miR-29a/b-1- וגם עכברים המווסתים מטה של ​​miR מציגים פנוטיפ דמוי אטקסיה [6, 21]. לגבי ההשפעות של הביטוי של miR על הגנה עצבית וקידום מוות נוירוני במודלים של מכרסמים איסכמיים דווחו תוצאות מנוגדות [22, 23]. במחקרים קודמים, ראינו שרמות ה-miR-29 ירדו באופן ניכר בסרום של חולי PD עם מגמת ירידה הקשורה לפרקינסוניזם חמור יותר [24]. יתרה מכך, רמות ה-miR-29 מתואמות עם ביצועי הזיכרון בחולי PD [25]. הגענו למסקנה ש-miR-29b2/c קשור קשר הדוק ל-PD, אך התפקודים הפיזיולוגיים והמנגנונים הפתולוגיים המעורבים ב-PD אינם ידועים במידה רבה.

במחקר זה, רמות הסרום של העכברים של miR-29 בתגובה למתן MPTP נמדדו עד 120 יום לאחר ההזרקה. ההשפעות של מחסור ב-miR-29b2/c על הרקמות ההיקפיות נחקרו תוך שימוש בעכברי miR-29b2/c KO. הנוירוטוקסין הדופמינרגי MPTP שימש עוד כדי לגרום למודל עכבר של PD. לאחר מכן נחקרו פציעות של המערכת הדופמינרגית הניגרוסטריאטלית, ביצועים התנהגותיים ומנגנונים פוטנציאליים. ראינו שרמות ה-miR-29 בסרום העכבר הציגו שינויים דינמיים לאחר מתן MPTP. עכברי miR- 29b2/c KO הציגו הזדקנות מואצת, המסומנת על ידי משקל הגוף הקל יותר, הפחתת רקמת השומן, קיפוזיס, עיבוי העור, חולשת שרירים וחוסר תקינות בהליכה. עם זאת, מחסור ב-miR-29b2/c הוביל להקלה על הנזק הדופמינרגי והפעלת גליה, וכתוצאה מכך לשיפור הביצועים ההתנהגותיים במודל של בעלי חיים דמוי PD.

כדורי Cistanche

תוֹצָאָה

1. הפנוטיפ דמוי הפרוגריה בעכברי miR-29b2/c KO

עכברי נוקאאוט miR-29b2/c (miR-29b2/c KO) נוצרו באמצעות טכניקת CRISPR-Cas9. האסטרטגיה של מיקוד גנים וגנוטיפ מוטנטי של עכברים הוצגה באיור משלים 1. לעכברי miR-29b2/c KO בני ארבעה ו-16- חודשים נרשמה ירידה במשקל הגוף (איור 1A). בגיל שלושה חודשים, התכונות של עכברי miR-29b2/c KO נותרו ללא שינוי, כפי שהוכח על ידי סריקת רנטגן מיקרו-ממוחשבת (מיקרו-CT) (איור משלים 2A). לא היו הבדלים בצפיפות מינרלים של העצם (BMD), טרבקולות ממוצעות BMD, הפרדה טרבקולרית, עובי טרבקולרי ואינדקס מודל מבני (SMI) בין עכברי miR-29b2/c KO לבין מקבילם WT בגיל 13 חודשים ( איור משלים 2B). על ידי צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E), מצאנו שעכברי miR-29b2/c KO בני חודש 13-גילו דרמיס מעובה עם קמטים מוגברים ומעמיקים (איור 1B, 1C). וקיפוזיס היה ניכר בעכברי miR-29b2/c KO בני חודש 16-(איור 1C). לעכברי miR-29b2/c KO בגיל צעיר (בני 3 חודשים) היו רקמות שומן תקינות (איור משלים 2C, 2D). עם זאת, רקמת השומן הבטן (שומן תת עורי ושומן קרביים בשילוב) ורקמת שומן חומה הופחתו באופן דרמטי בעכברי miR-29b2/c KO בהשוואה לעכברי WT בגיל 16 חודשים (איור 1D). בנוסף, נותחו רמות התעתיק של סמני ההזדקנות p21 ו-p53 במוח. הם עלו בצורה ניכרת בהיפוקמפוס, אך לא בקליפת המוח של עכברי miR-29b2/c KO בגיל שישה חודשים. רמות החלבון p53 ו-p16 בהיפוקמפוס החסר ב-miR-29b2/c לא היו שונות מבקרי ה-WT. בנוסף, פעילות -galactosidase, מאפיין ידוע של הזדקנות תאית, לא הייתה שונה בין המוח של עכברי WT ו-miR-29b2/c KO בני שלושה חודשים.

חולשת שרירים ואי-נורמליות בהליכה בעכברי miR- 29b2/c KO

הוערכו ההתנהגויות של עכברים עם מחסור ב-miR-29b2/c. חוזק השריר נמדד על ידי בדיקות תליית חוט ותליית רשת. עכברי ה-miR-29b2/c KO קיבלו ציון נמוך יותר מאשר עכברי הביקורת במבחן תליית החוט (איור 2A). וזמן האחזור לנפילה היה קצר יותר באופן דרמטי בעכברי miR-29b2/c KO בהשוואה לעמיתים מסוג פרא במבחן תליית הרשת (איור 2B), אך ביצועי בדיקת Rotarod של WT ו-miR{{10} }b2/c KO עכברים לא היו שונים באופן משמעותי (איור 2C). הליכת בעלי חיים זוהתה על ידי מערכת הניתוח Catwalk XT. באופן מפתיע, גם המהירות וגם אורך הצעד של עכברי miR-29b2/c KO היו גבוהים יותר מאלו של עמיתיהם, בעוד שמחזור הצעדים, העמידה וזמן התנופה היו קצרים יותר, ומחזור העבודה מופחת, ב-miR{ {15}} עכברים חסרי b2/c (איור 2D).

שינויים של miR-29 בסרום עכבר PD המושרה על ידי MPTP

רמות ה-miR-29 ירדו בסרום של חולים עם PD בהשוואה לאנשי ביקורת בריאים [24]. במחקר זה, רמות ה-miR-29 בסרום של עכברי PD נכומתו ב-3, 30 ו-120 ימים לאחר מתן משטר תת-חריף של MPTP. רמות miR-29a ו-miR-29b ירדו ב-3 ימים לאחר ההזרקה והתאוששו לערכי הבסיס לאחר 30 יום, וירדו שוב לאחר 120 יום. עם זאת, רמת miR-29c לא השתנתה באופן משמעותי (איור משלים 5).

תוספי Cistanche

מחסור ב-miR-29b2/c מפחית פציעות ניגרוסטריאטליות הנגרמות על ידי MPTP וחסרים מוטוריים בעכברים

עכברי נוקאאוט miR-29b2/c והחברים ל-WT הוזרקו MPTP כדי לגרום למודל ה-PD. רמות הביטוי של p21, p53 ו-Pai1 בסטריאטום של שני עכברי miR-29b2/c KO ובקרה של WT לא השתנו לאחר מתן MPTP. חשיפה ל-MPTP גרמה להפחתה משמעותית של הנוירונים הדופמינרגיים החיוביים ל-TH ב-SNpc [F(1, 20)=5.441, P=0.0302], ובמסופי העצבים החיוביים ל-TH, חלבוני TH [F(1, 20)=10.5, P=0.0041] ורמות הדופמין, DOPAC ו-HVA בסטריאטום (איור 3A–3D). עם זאת, הפציעות הניגרוסטריאטליות בעכברי miR-29b2/c KO שטופלו ב-MPTP הוקלו באופן דרמטי בהשוואה לבקרות WT שטופלו ב-MPTP, כמספר הנוירונים הדופמינרגיים, הצפיפות של מסופי העצבים הדופמינרגיים ורמות החלבון TH הסטריאטלי. ריכוז הדופמין היה גבוה משמעותית; בנוסף, שינויים ביחסים של DOPAC ל-DA ו-HVA ל-DA [F(1, 19)=12.64, P=0.0021] הופחתו באופן ניכר (איור 3A-3D). בעכברי miR-29b2/c KO רגילים שהוזרקו בתמיסת מלח, הריכוזים הסטריאטליים של 5-HT והמטבוליט שלו 5-HIAA עלו בהשוואה לעמיתיהם ל-WT, וריכוזי NE היו קרובים בין עכברי מסוג wild-type ו-miR-29b2/c KO (איור 3D). בדיקות הגידול והקוטב שימשו להערכת פעילות אנכית ספונטנית [26, 27] ופעילות תנועתית של עכברים [28], בהתאמה. יומיים לאחר הזרקת MPTP האחרונה, תדירות הגידול ירדה בעכברי WT במהלך 2 הדקות האחרונות בהשוואה לביקורות WT רגילות שטופלו במלח. ניסויים דומים לא גילו השפעה של מחסור ב-miR- 29b2/c על שינויים הנגרמות על ידי MPTP בתדירות הגידול (איור 3E). באופן דומה, הזמן הכולל שהושקע בהסתובבות ובטיפוס מטה עלה בעכברי WT לאחר מתן MPTP במבחן הקוטב, בעוד שהזמן הכולל היה קרוב בין עכברי miR-29b2/c KO רגילים שטופלו ב-MPTP (איור 3F) .

מחסור ב-miR-29b2/c מחליש את הפעלת גליה הנגרמת על ידי MPTP בעכברים

הפעלת תאי גליה ודלקת עצבית בתיווך תאי גליה מעורבים בפתולוגיה של PD [29]. אסטרוציטים עלו בצורה ניכרת במסלול הניגרוסטריאטלי של עכברי WT, בעוד ש-GFAP בתוספת אסטרוציטים עלו בסטריאטום אך לא ב-SNpc [F(1, 8)=5.412, P=0.0484] של miR -29עכברי b2/c KO שלושה ימים לאחר הזרקת MPTP. יש לציין שצפיפות אסטרוציטית לא הייתה שונה בשני האזורים של עכברי WT ו-miR-29b2/c KO שטופלו ב-MPTP (איור 4A, 4B). Iba 1 plus microglia גדל ב-substantia nigra של עכברי WT, ובסטריאטום [F(1, 8)=12.74, P=0.0073] גם של WT וגם של miR{{21} }עכברי b2/c KO לאחר מתן MPTP. יתר על כן, בעכברי miR-29b2/c KO הזרקת MPTP הפחיתה את צפיפות המיקרוגליה באופן משמעותי (איור 4C, 4D).

2. ההשפעות של מחסור ב-miR-29b2/c באסטרוציטים בתרבית ראשונית

נעשה שימוש בבדיקת שריטות כדי לבדוק אם מחסור ב-miR-29b2/c השפיע על התפשטות והגירה של אסטרוציטים. אסטרוציטים של miR-29b2/c KO ראשוניים לא הראו הבדל ביכולת ההתפשטות והנדידה. כדאיות התא של אסטרוציטים WT ראשוניים ו-miR-29b2/c KO לא התבטאה בהבדל בקו הבסיס. לאחר MPP פלוס שיכרון, כדאיות התא של אסטרוציטים WT הייתה גבוהה יותר בהשוואה לבקרות, בעוד שכדאיותם של אסטרוציטים מוטנטים לא השתנתה [F(1, 18)=5.727, P=0.0278 ]. מוצר ROS משופר וספיגת גלוקוז נצפו באסטרוציטים WT ו-miR-29b2/c KO שטופלו ב-MPP plus.

Cistanche tubulosa

נמדדו רמות הביטוי של גורמים נוירוטרופיים, מולקולות הקשורות לדלקת, סוג אסטרוציטי A1 וגנים מסוג A2 באסטרוציטים שטופלו ב-MPP פלוס. ב-12 שעות לאחר האתגר, הביטוי של BDNF היה מוגבר באסטרוציטים של WT ו-miR-29b2/c KO (איור 5A). רמת הביטוי TGF- 1 הייתה מווסתת משמעותית באסטרוציטים של WT לאחר החשיפה ל-MPP plus , בעוד שהיא בוטלה באסטרוציטים miR- 29b2/c KO בהשוואה לאסטרוציטים מסוג פרא הן בקו הבסיס והן לאחריו השיכרון (איור 5B). רמת הבסיס של תמליל TNF הייתה נמוכה יותר באסטרוציטים miR-29b2/c KO בהשוואה לאסטרוציטים WT. לאחר טיפול של 12 שעות, רמות הביטוי של IL-1, IL-6 ו-COX-2 עלו באופן משמעותי באסטרוציטים WT ו-miR-29b2/c, בעוד שתעתיק TNF היה מוגבר רק באסטרוציטים של WT, ותעתיקי IL-1, TNF ו-COX-2 ירדו בתאי אסטרוציטי miR-29b2/c KO בהשוואה לעמיתים מסוג פרא (איור 5C) . סמן A1 H2-T23 ו-A2 סמן CD14 היו נמוכים באופן ניכר באסטרוציטים של miR- 29b2/c KO שטופלו ב-PBS בהשוואה לבקרות WT. לאחר טיפול של 12 שעות, סמני A1 H2-D1, Ggta1 ו-C3, ו-A2 סמני Clcf1 ו-S100 10 עברו ויסות גבוה גם באסטרוציטים WT וגם miR-29b2/c KO; H2-T23 עלה רק באסטרוציטים של WT; Gbp2 ו-CD14 לא השתנו בשני הגנוטיפים של אסטרוציטים. יתרה מכך, התמלילים של H2-T23, H2-D1 ו-CD14 היו מווסתים ב-miR-29b2/c KO אסטרוציטים בהשוואה לבקרות WT (איור 5D, 5E). 12 שעות ו-24 שעות לאחר הטיפול, רמות חלבוני AMPK וחלבוני AMPK מפוספסים לא השתנו באסטרוציטים של WT, בעוד שב-24 שעות לאחר אתגר MPP plus, רמת החלבון AMPK ירדה ב-miR-29b2/ c KO אסטרוציטים, והיחס בין p-AMPK ל-AMPK באסטרוציטים מוטנטים גדל בהשוואה לאסטרוציטים WT ואסטרוציטים מוטנטיים שטופלו ב-PBS גם כן (איור 5F). בנוסף, המדיום המותנה מתאי BV2 שטופלו ב-PBS או LPS (שנקראים בקצרה CM ו-LCM) שימש לגירוי אסטרוציטים ראשוניים של עכברי WT ו-miR-29b2/c KO. למרות שהביטוי של חלבון p-AMPK לא השתנה לאחר טיפול של 12 שעות ב-LCM, הוא היה גבוה משמעותית באסטרוציטים miR-29b2/c KO בהשוואה לאסטרוציטים WT. ראינו שחלבוני pAMPK גדלו בשני הגנוטיפים של אסטרוציטים לאחר 24 טיפולים של LCM. גירוי LCM הגדיל באופן ניכר את הביטוי של חלבוני COX- 2 [F(2, 18)=10.29, P=0.0010], עם זאת, רמת החלבון COX-2 ב-miR-29b2/c KO אסטרוציטים ירדו בהשוואה לאסטרוציטים WT (איור 5G). ריכוז הניטריט באסטרוציטים של miR-29b2/c KO שטופלו ב-LCM היה גם נמוך משמעותית בהשוואה לאסטרוציטים WT שטופלו ב-LCM [F(2, 30)=17, P<0.0001] (Figure 5H). Further, the expression of senescence marker genes was evaluated. 12 h-treatment of MPP+ increased p53 transcript levels in both WT and miR- 29b2/c KO astrocytes. p19 and Pai1 transcripts were elevated only in WT astrocytes, and Pai1 expression levels in miR-29b2/c KO astrocytes were decreased compared to WT astrocytes after the treatment. Moreover, Bcl-2, Bax protein levels, and the ratio of Bcl-2 to Bax did not change in WT and miR-29b2/c KO astrocytes.

3. ההשפעות של מחסור ב-miR-29b2/c במיקרוגליה תרבותית ראשונית

כדי למדוד את התגובה של microglia חסרי miR-29b2/c לגירויים דלקתיים, נעשה שימוש ב-LPS. רמת ביטוי BDNF הייתה נמוכה יותר ב-miR-29b2/c KO microglia בקו הבסיס. ארבע ושמונה שעות לאחר טיפול ב-LPS, כמות התמלילים של IL-1, IL-6, TNF ו-COX-2 הוסרה למעלה, בעוד שביטוי ה-IGF-1 היה מורד ב-WT ותאי miR-29b2/c KO מיקרוגליה, הביטוי של BDNF ירד רק ב-WT microglia [F(2, 27)=41.5, P<0.0001]. IL-10 transcript increased in WT and miR-29b2/c KO microglia [F(2, 27) = 3.753, P=0.0365], and TGF-β1 transcript decreased in WT microglia at eight hours after the LPS challenge. BDNF and TGF-β1 transcripts were not changed in miR-29b2/c KO microglia. In addition, IL-6 transcripts were significantly reduced in miR-29b2/c KO microglia after the challenge compared to WT controls, IGF-1 and IL-10 transcripts were markedly higher in miR-29b2/c KO microglia after four and eight hours of intoxication, respectively (Figure 6A–6C). At baseline, the p-AMPK protein level and pAMPK to AMPK ratio were dramatically elevated in miR-29b2/c KO microglia when compared with WT microglia. 24 h after the treatment of LPS, p-AMPK level [F(1, 17) = 5.066, P=0.0379] and the ratio [F(1, 17) = 5.537, P=0.0309] were elevated only in WT microglia (Figure 6D). At one hour after the treatment, the phosphorylated-NF-κB p65 (p-p65) proteins and pp65 to p65 ratio, but not p65 proteins, increased in wildtype and miR-29b2/c KO microglial cells, yet the ratio decreased modestly in miR-29b2/c KO microglial cells when compared with WT microglia (p=0.071) (Figure 6E). The expression of COX-2 was enhanced in the two genotypes of microglial cells; whereas, the level of COX-2 in mutant microglia decreased when compared with WT controls after 24 h-treatment of LPS [F(1, 17) = 5.33, P=0.0338] (Figure 6D). Nitrite product was induced by the treatment of LPS in both genotypes of microglia, however, it was dramatically lower in miR- 29b2/c KO microglia at baseline and after the treatment of LPS [F(1, 20) = 14.03, P=0.0013] (Figure 6F).

דִיוּן

הביטוי של בני משפחת miR-29 מווסת ברקמות מרובות כאשר אנשים מזדקנים [30-32]. עבודות מהמעבדה שלנו ואחרות הראו קשר בין miR-29 ומחלת פרקינסון [33]. במחקר הנוכחי נחקרו התפקידים של miR- 29b2/c בהזדקנות ובמחלת פרקינסון. mir-29 מפעילים השפעות פרו ואנטי-אייג'ינג בהתאם לרקמות, מינים ושלבי התפתחות. מצאנו שלעכברי miR-29b2/c KO 3-בני חודש יש שלד ורקמת שומן תקינים, ולעכברי miR- 29b2/c KO 4-בני חודש הראו משקל גוף קל יותר בהשוואה למקבילם ל-WT, דבר המתאים למחקרים אחרים [11, 34]. חולשת שרירים והליכה לא יציבה זוהו בעכברי miR- 29b2/c KO 3-בני חודש. עכברי miR-29b2/c KO בני 13 חודשים הראו עיבוי דרמיס. עם זאת, היה להם המבנה העדין הרגיל של עצם הירך. הירידה במשקל הגוף קיימת בעכברי miR-29b2/c KO בני חודש 16-. בגיל זה, לעכברי miR-29b2/c KO היו פחות שומן בטני ושומן חום והפגינו קיפוזיס לכאורה. miR-29 מעורבים ב-p53-מעצר מחזור תאים מתווך [35, 36] ובזדקנות תאית מונעת על ידי p16/Rb [37]. עם זאת, הזדקנות תאית לא הייתה ברורה במוח העכבר miR-29b2/c KO. לכן, למרות ש-miR-29b2/c תורם לוויסות ההזדקנות, תפקידיו ברקמות ההיקפיות ובמוח עשויים להיות שונים.

רמות הסרום של miR-29 היו מווסתות מטה בחולים עם PD בהשוואה לאנשי ביקורת בריאים [24]. כאן, מצאנו שביטוי miR-29 בסרום עכבר PD נע בין 3 ל-120 ימים לאחר מתן MPTP. miR-29 יש בשפע במוח [6, 30]. דרך מעבר על פרופיל ה-GEO, ביטוי miR-29c נמצא מווסת ב-substantia nigra של חולי PD (p=0.0059, על ידי בדיקת Mann-Whitney), יתר על כן, miR{{12 ביטוי }}c בג'ירוס הקדמי העליון לא היה שונה (p=0.47, לפי Student-T-test), בהשוואה לנבדקי הביקורת (איור משלים 10). כאן, עכברי miR-29b2/c KO אותגרו ב-MPTP כדי לגרום לפציעות דמויות PD. העכברים המוטנטים הראו פציעות פחות חמורות במערכת הדופמינרגית הניגרוסטריאטלית והפעלה קלה יותר של גליה, ולאחר מכן עמידות התנהגותית במידה מסוימת. לפיכך, ל-miR-29b2/c יש תפקיד מזיק בפתולוגיה של PD. ראינו שבמודל MPTPinduced PD של עכברים, הרמות הסטריאטליות של תעתיקי p21, p53 ו- Pai1 לא השתנו, מה שמרמז על הזדקנות תאית שלא תתרחש. ההזדקנות נחשבת לגורם בסיכון גבוה להתפתחות PD [38], עם זאת, שינויים הקשורים להזדקנות במוח, במיוחד המערכת הדופמינרגית עשויים להיות גורם רלוונטי יותר.

גליה ראשונית מעכברי WT ו-miR-29b2/c KO תופחו כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים. טיפול ב-MPP plus הגביר את ביטוי ה-GDNF והפחית את ביטוי ה-IL-1 בגליה המעורבת החסרה ב-miR-29b2/c. MPP plus גם הגביר את הביטוי של גנים פרו-דלקתיים באסטרוציטים של WT אך לא באסטרוציטים חסרי miR- 29b2/c. באופן דומה, אסטרוציטים מוטנטים ייצרו פחות NO בהשוואה לאסטרוציטים WT לאחר שנחשפו למדיום המותנה של תאי BV2 שטופלו ב-LPS. בתרבית מיקרוגליה ראשונית, בהשוואה לבקרות WT שטופלו ב-LPS, התמלילים של הציטוקין האנטי-דלקתי IL-10 והגורם הנוירוטרופי IGF-1 היו גבוהים יותר באופן ניכר, והתמלילים של הציטוקין הפרו-דלקתי IL{ {15}} ירד ב-LPStreated miR-29b2/c KO microglia. רמות NO ירדו במיקרוגליה miR-29b2/c KO בקו הבסיס ולאחר שיכרון LPS. מחקרים הראו ש-miR-29 וגני יעד חזויים רבים מעורבים בתהליכים מטבוליים [34, 39-41]. כמווסת חיוני, AMPK הוכח כמגן ב-PD כאשר הוא מופעל [42]. הפעלה של AMPK מגרה את Sirtuin 1 ומעכבת את הפעלת NF-κB וגנים למטרה דלקתיים במורד הזרם באופן עקיף [43]. ראינו שרמת החלבון הפוספוריל-AMPK והיחס בין p-AMPK ל-AMPK היו מווסתים באסטרוציטים miR- 29b2/c KO שטופלו ב-LCM וב-MPP פלוס בהתאמה. רמת החלבון COX-2 ירדה באסטרוציטים מוטנטיים שטופלו ב-LCM בהשוואה לאסטרוציטים של WT. בתחילת המחקר, פעילות AMPK עלתה ב-miR-29b2/c KO microglia. כמות החלבון COX-2 הופחתה באופן משמעותי ב-miR-29b2/c KO microglia בהשוואה לביקורות WT לאחר הטיפול ב-LPS. בטיפול ב-LPS, היחס בין p-p65 ו-p65 היה מווסת מעט במיקרוגליה המוטנטית, מה שמרמז על מסלול איתות NF-KB מופחת. התוצאות שלנו מצביעות על כך שפעילות AMPK מוגברת ותגובה דלקתית מופחתת בגליה מגנים על המסלול הניגרוסטריאטלי בעכברי miR-29b2/c KO (איור 6G). לסיכום, miR-29b2/c ממלא תפקיד חשוב בהזדקנות ובנזק במערכת הדופמינרגית הניגרוסטריאטלית.

הפניות

1. Braak H, Del Tredici K. מאמר מוזמן: פתולוגיה של מערכת העצבים במחלת פרקינסון ספוראדית. נוירולוגיה. 2008; 70:1916–25.

2. Wang Q, Liu Y, Zhou J. Neuroinflammation במחלת פרקינסון והפוטנציאל שלה כמטרה טיפולית. טרנסל נוירודגנר. 2015; 4:19.

3. Wang Z, Dong H, Wang J, Huang Y, Zhang X, Tang Y, Li Q, Liu Z, Ma Y, Tong J, Huang L, Fei J, Yu M, et al. תפקידי הישרדות ואנטי דלקתיים של NF-κB c-Rel במודלים של מחלת פרקינסון. חיזור ביול. 2020; 30:101427.

4. Zhu S, Wu H, Wu F, Nie D, Sheng S, Mo YY. MicroRNA- 21 מתמקד בגנים מדכאי גידול בפלישה ובגרורות. Cell Res. 2008; 18:350–59.

5. Qiu L, Zhang W, Tan EK, Zeng L. פענוח התפקוד והוויסות של microRNAs במחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון. ACS Chem Neurosci. 2014; 5:884–94.

6. Papadopoulou AS, Serneels L, Achsel T, Mandemakers W, Callaerts-Vegh Z, Dooley J, Lau P, Ayoubi T, Radaelli E, Spinazzi M, Neumann M, Hébert SS, Silahtaroglu A, et al. מחסור בצביר miR-29a/b-1 מוביל לתכונות אטקסיות ושינויים במוח הקטן בעכברים. נוירוביול דיס. 2015; 73:275–88.

7. Hyun J, Choi SS, Diehl AM, Jung Y. תפקיד פוטנציאלי של איתות קיפוד ומיקרו-RNA-29 בפיברוזיס בכבד של עכבר חסר IKK. J Mol Histol. 2014; 45:103–12.

8. Qin W, Chung AC, Huang XR, Meng XM, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. איתות TGF- /Smad3 מעודד פיברוזיס בכליות על ידי עיכוב miR-29. J Am Soc Nephrol. 2011; 22:1462–74.

9. Xiao J, Meng XM, Huang XR, Chung AC, Feng YL, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. miR-29 מעכב פיברוזיס ריאתי המושרה על ידי בלומיצין בעכברים. מול ת'ר. 2012; 20:1251–60.

10. Steiner DF, Thomas MF, Hu JK, Yang Z, Babiarz JE, Allen CD, Matloubian M, Blelloch R, Ansel KM. MicroRNA-29 מווסת גורמי שעתוק T-box וייצור אינטרפרון בתאי T עוזרים. חֲסִינוּת. 2011; 35: 169–81.

11. Dooley J, Garcia-Perez JE, Sreenivasan J, Schlenner SM, Vangoitsenhoven R, Papadopoulou AS, Tian L, Schonefeldt S, Serneels L, Deroose C, Staats KA, Van der Schueren B, De Strooper B, et al. משפחת המיקרו-RNA-29 מכתיבה את האיזון בין טיפול הומיאוסטטי ופתולוגי בגלוקוז בסוכרת והשמנה. סוכרת. 2016; 65:53–61.

12. Adoro S, Cubillos-Ruiz JR, Chen X, Deruaz M, Vrbanac VD, Song M, Park S, Murooka TT, Dudek TE, Luster AD, Tager AM, Streeck H, Bowman B, et al. IL-21 משרה מיקרו-RNA-29 אנטי-ויראלי בתאי CD4 T כדי להגביל זיהום ב-HIV-1. נאט קומון. 2015; 6:7562.

13. Ma F, Xu S, Liu X, Zhang Q, Xu X, Liu M, Hua M, Li N, Yao H, Cao X. המיקרו-RNA miR-29 שולט בתגובות חיסוניות מולדות וסתגלניות לזיהום חיידקי תוך תאי על ידי מיקוד לאינטרפרון. נאט אימונול. 2011; 12:861–69.

14. Jovičić A, Roshan R, Moisoi N, Pradervand S, Moser R, Pillai B, Luthi-Carter R. ניתוחי ביטוי מקיפים של miRNAs ספציפיים לסוג תא עצבי מזהים גורמים חדשים של מפרט ותחזוקה של פנוטיפים עצביים. J Neurosci. 2013; 33:5127–37.

15. Ouyang YB, Xu L, Lu Y, Sun X, Yue S, Xiong XX, Giffard RG. miR-29a מועשר באסטרוציטים מכוון ל-PUMA ומפחית את הפגיעות הנוירונית לאיסכמיה במוח הקדמי. גליה. 2013; 61:1784–94.

16. Shioya M, Obayashi S, Tabunoki H, Arima K, Saito Y, Ishida T, Satoh J. ביטוי חריג של מיקרו-RNA במוח של מחלות ניווניות: miR-29הפחתה במוחות של מחלת אלצהיימר מכוונת לנווט נוירונים 3. Neuropathol Appl Neurobiol. 2010; 36:320–30.

17. Hébert SS, Horré K, Nicolaï L, Papadopoulou AS, Mandemakers W, Silahtaroglu AN, Kauppinen S, Delacourte A, De Strooper B. Loss of microRNA cluster miR-29a/b-1 in sporadic מחלת אלצהיימר מתאמת עם ביטוי מוגבר של BACE1/בטא-סקרטאז. Proc Natl Acad Sci ארה"ב. 2008; 105:6415–20.

18. Johnson R, Zuccato C, Belyaev ND, DJ אורח, Cattaneo E, Buckley NJ. מסלול לחוסר ויסות גנים מבוסס מיקרו-RNA במחלת הנטינגטון. נוירוביול דיס. 2008; 29:438–45.

19. פקר AN, Xing Y, Harper SQ, Jones L, Davidson BL. המיקרו-RNA הדו-פונקציונלי miR-9/miR-9* מווסת את REST ו-CoREST ומווסתת ויסות במחלת הנטינגטון. J Neurosci. 2008; 28:14341–46.

20. Nolan K, Mitchem MR, Jimenez-Mateos EM, Henshall DC, Concannon CG, Prehn JH. ביטוי מוגבר של microRNA-29a בעכברי ALS: ניתוח פונקציונלי של העיכוב שלו. J Mol Neurosci. 2014; 53:231–41.

21. Roshan R, Shridhar S, Sarangdhar MA, Banik A, Chawla M, Garg M, Singh VP, Pillai B. נוק-דאון ספציפי למוח של miR-29 מביא למוות של תאי עצב ואטקסיה בעכברים. RNA. 2014; 20:1287–97.

22. Khanna S, Rink C, Ghoorkhanian R, Gnyawali S, Heigel M, Wijesinghe DS, Chalfant CE, Chan YC, Banerjee J, Huang Y, Roy S, Sen CK. אובדן של miR-29b בעקבות שבץ איסכמי חריף תורם למוות של תאים עצביים ולגודל האוטם. J Cereb Blood Flow Metab. 2013; 33:1197–206.

23. Shi G, Liu Y, Liu T, Yan W, Liu X, Wang Y, Shi J, Jia L. MiR-29b מווסת מעלה מקדם מוות של תאי עצב על ידי עיכוב Bcl2L2 לאחר פגיעה מוחית איסכמית. Exp Brain Res. 2012; 216:225–30.

24. Bai X, Tang Y, Yu M, Wu L, Liu F, Ni J, Wang Z, Wang J, Fei J, Wang W, Huang F, Wang J. הורדת ויסות של משפחת microRNA 29 בדם בחולים עם מחלת פרקינסון . Sci Rep. 2017; 7:5411.

25. Han L, Tang Y, Bai X, Liang X, Fan Y, Shen Y, Huang F, Wang J. Association of the Serum microRNA-29 family with ליקוי קוגניטיבי במחלת פרקינסון. הזדקנות (Albany NY). 2020; 12:13518–28.

26. Chinta SJ, Woods G, Demaria M, Rane A, Zou Y, McQuade A, Rajagopalan S, Limbad C, Madden DT, Campisi J, Andersen JK. הזדקנות תאית נגרמת על ידי הנוירוטוקסין הסביבתי Paraquat ותורמת לנוירופתולוגיה הקשורה למחלת פרקינסון. נציג תא 2018; 22:930–40.

27. Willard AM, Bouchard RS, Gittis AH. השפלה דיפרנציאלית של חוסרים מוטוריים במהלך דלדול הדרגתי של דופמין עם 6-הידרוקסי-דופמין בעכברים. מדעי המוח. 2015; 301:254–67.

28. Kam TI, Mao X, Park H, Chou SC, Karuppagounder SS, Umanah GE, Yun SP, Brahmachari S, Panicker N, Chen R, Andrabi SA, Qi C, Poirier GG, et al. פולי(ADP-ribose) מניע ניוון עצבי פתולוגי של סינוקאין במחלת פרקינסון. מַדָע. 2018; 362:eaat8407.

29. Huang D, Xu J, Wang J, Tong J, Bai X, Li H, Wang Z, Huang Y, Wu Y, Yu M, Huang F. שינויים דינמיים במסלול הניגרוסטריאטלי במודל עכבר MPTP של מחלת פרקינסון. פרקינסון דיס. 2017; 2017:9349487.

30. Ugalde AP, Ramsay AJ, de la Rosa J, Varela I, Mariño G, Cadiñanos J, Lu J, Freije JM, López-Otín C. הזדקנות ותגובת נזק ל-DNA כרוני מפעילים מסלול רגולטורי הכולל miR{{2} } ו-p53. EMBO J. 2011; 30:2219–32.

31. Hu Z, Klein JD, Mitch WE, Zhang L, Martinez I, Wang XH. MicroRNA-29 משרה הזדקנות תאית בשריר המזדקן באמצעות מסלולי איתות מרובים. הזדקנות (Albany NY). 2014; 6:160–75.

32. Fenn AM, Smith KM, Lovett-Racke AE, Guerau-deArellano M, Whitacre CC, Godbout JP. גידול ב-microRNA 29b במוח המבוגר מתאם עם הפחתת גורם הגדילה דמוי אינסולין-1 והליגנד הפרקטלקין. הזדקנות נוירוביול. 2013; 34:2748–58.

33. Wang R, Yang Y, Wang H, He Y, Li C. MiR-29c מגן מפני דלקת ואפופטוזיס במודל של מחלת פרקינסון in vivo ו-in vitro על ידי מיקוד SP1. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2020; 47:372–82.

34. Caravia XM, Fanjul V, Oliver E, Roiz-Valle D, Morán- Álvarez A, Desdín-Micó G, Mittelbrunn M, Cabo R, Vega JA, Rodríguez F, Fueyo A, Gómez M, LoboGonzález M, et al. ציר הוויסות microRNA-29/PGC1 הוא קריטי לבקרה המטבולית של תפקוד הלב. PLoS Biol. 2018; 16:e2006247.

35. Varela I, Cadiñanos J, Pendás AM, Gutiérrez-Fernández A, Folgueras AR, Sánchez LM, Zhou Z, Rodríguez FJ, Stewart CL, Vega JA, Tryggvason K, Freije JM, LópezOtín C. Accelerated deficienting in Zmpste24 פרוטאז מקושר להפעלת איתות p53. טֶבַע. 2005; 437:564–68.

36. Park SY, Lee JH, Ha M, Nam JW, Kim VN. miR-29 miRNA מפעילים את p53 על ידי מיקוד ל-p85 alpha ו-CDC42. נאט מבנה מול ביול. 2009; 16:23–29.

37. Martinez I, Cazalla D, Almstead LL, Steitz JA, DiMaio D. miR-29 ו-miR-30 מסדירים את ביטוי B-Myb במהלך ההזדקנות הסלולרית. Proc Natl Acad Sci ארה"ב. 2011; 108:522–27.

38. Collier TJ, Kanaan NM, Kordower JH. הזדקנות ומחלת פרקינסון: צדדים שונים של אותו מטבע? Mov Disord. 2017; 32:983–90.

39. Massart J, Sjögren RJ, Lundell LS, Mudry JM, Franck N, O'Gorman DJ, Egan B, Zierath JR, Krook A. Altered miR- 29 ביטוי בסוכרת מסוג 2 משפיע על מטבוליזם של גלוקוז ושומנים בשלד שְׁרִיר. סוכרת. 2017; 66:1807–18.

40. Dooley J, Lagou V, Garcia-Perez JE, Himmelreich U, Liston A. miR-29a-deficiency אינו משנה את המהלך של קרצינומה של הלבלב האצינרי. Oncotarget. 2017; 8:26911–17.

41. Kwon JJ, Factora TD, Dey S, Kota J. A Systematic Review of miR-29 in Cancer. מול תר אונקוליטיקה. 2018; 12:173–94.

42. Lu M, Su C, Qiao C, Bian Y, Ding J, Hu G. Metformin מונע מוות של נוירונים דופאמינרגיים במודל עכברים המושרה על ידי MPTP/PI של מחלת פרקינסון באמצעות אוטופגיה וניקוי ROS מיטוכונדריאלי. Int J Neuropsychopharmacol. 2016; 19:pyw047.

43. Salminen A, Hyttinen JM, Kaarniranta K. חלבון קינאז המופעל על ידי AMP מעכב איתות ודלקת של NF-κB: השפעה על תוחלת הבריאות ותוחלת החיים. י מול מד (ברל). 2011; 89:667–76.

Xiaochen Bai 1,2, Xiaoshuang Zhang 1, Rong Fang 1, Jinghui Wang 1, Yuanyuan Ma 1, Zhaolin Liu 1, Hongtian Dong 1, Qing Li 1, Jingyu Ge 1, Mei Yu 1, Jian Fei 3,4, Ruilin Sun 4, פאנג הואנג 1

1. המחלקה למדעי המוח התרגום, בית החולים מרכז מחוז ג'ינג'אן בשנגחאי, מעבדת המפתח של המדינה לנוירוביולוגיה רפואית ומרכז MOE Frontiers למדעי המוח, מכונים למדעי המוח, אוניברסיטת פודן, שנגחאי 200032, סין

2. המחלקה לרפואה שיקומית, בית החולים השישי של אוניברסיטת שנגחאי ג'יאאו טונג, שנחאי 200233, סין

3. בית הספר למדעי החיים והטכנולוגיה, אוניברסיטת טונגג'י, שנחאי 200092, סין

4. מרכז המחקר ההנדסי של שנגחאי לדגמי אורגניזמים, מרכז מודלים של שנגחאי, INC, שנחאי 201203, סין