Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides מעוררים אפופטוזיס בתאי קרצינומה כבדי H22 Hepatocellular Carcinoma באמצעות מסלולי איתות חיצוניים ופנימיים כאחד.
Mar 15, 2022
למידע נוסף:ali.ma@wecistanche.com
פנגפיי יואן1 et al
תַקצִיר
רקע כללי: Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight היא רפואה סינית מסורתית המטפילה את שורשי צמח התמריקס ושימשה לטיפול באימפוטנציה גברית, סטריליות, חולשת גוף וכטוניק. עם זאת, ההשפעה האנטי-גידולית שלו על קרצינומה כבדית עדיין חמקמקה. כאן, חקרנו את ההשפעה האנטי-גידולית שלCistanche tubulosa פנילתנואידים גליקוזידים(CTPG) על תאי קרצינומה hepatocellular H22 הן in vitro והן in vivo והמנגנונים שלה.
שיטות:המורפולוגיה, הכדאיות,אפופטוזיס, מחזור התא ופוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי (Δψm) של תאי H22 נותחו על ידי מיקרוסקופיה הפוכה, בדיקת MTT ו-flow cytometry, בהתאמה. הביטוי וההפעלה של חלבונים ב-אפופטוזיסנתיב זוהה על ידי Western blot. ההשפעה האנטי-גידולית in vivo הוערכה במודל עכבר גידול שהוקם באמצעות עכברי קונמינג זכרים.
תוצאות:טיפול CTPG דיכא באופן משמעותי את צמיחת תאי H22 באופן תלוי מינון וזמן, שהיה מתאם עם העלייהאפופטוזיסועצירת מחזור התא בשלבי G0/G1 ו-G2/M. יתרה מכך, התעבות כרומוזומלית נצפה בתאי H22 שטופלו ב-CTPG. טיפול ב-CTPG העלה משמעותית את יחס Bax/Bcl-2, הפחית את Δψm והגביר את השחרור של ציטוכרום c. הרמות של caspase מפוצלים-8 ו-caspase-9 הן בנתיבי איתות חיצוניים והן בנתיבי איתות פנימיים עלו באופן מובהק שהפעילו ברצף את caspase-7 ו-3 לפיתוח PARP. לבסוף, CTPG עיכב את הצמיחה של תאי H22 בעכברים ושיפר את שיעור ההישרדות של עכברי גידול.
מסקנות: תוצאות אלו הצביעו על כך ש-CTPG דיכא את צמיחת תאי H22 גם דרך החיצונית וגם הפנימיתאפופטוזיסשבילים.
מילות מפתח: Cistanche tubulosa, פנילתנואידים גליקוזידים, אפופטוזיס, מסלול איתות, דגם עכבר גידול
לחץ ל-Cistanche tubulosa phenylethanoid גליקוזידים אורגניים
רקע כללי
סרטן הכבד דורג במקום השישי עבור שכיחות הסרטן והרביעי עבור מקרי מוות מסרטן ברחבי העולם. יתרה מכך, הוא דורג במקום הרביעי עבור שכיחות סרטן וראשון עבור תמותה מסרטן במדינות עם אינדקס סוציו-דמוגרפי נמוך [1]. בסין, סרטן הכבד הוא הגורם השלישי למוות הקשור לסרטן בשנת 2015 [2]. יותר מ-90 אחוז ממקרי סרטן הכבד הראשוניים הם קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) בעולם [3]. נכון לעכשיו, כריתת כבד היא האפשרות העיקרית לטיפול ב-HCC. עם זאת, פחות מ-30 אחוז מהחולים עם HCC עמדו בקריטריונים של כריתת כבד מרפאת ושיעור ההישרדות הכולל של 5-שנה עדיין נמוך כמו 35-50 אחוזים בשל שיעור ההישנות הגבוה [4, 5] . הזמינות של אפשרויות טיפול עבור חולים עם HCC בינוני עד מתקדם מוגבלת מאוד. Sorafenib, תרופה ממוקדת מולקולרית, אושרה על ידי ה-FDA כקו הטיפול הראשון ב-HCC מתקדם. עם זאת, sorafenib מאריך רק כשלושה חודשי הישרדות ושיעור התגובה הוא פחות מ-4% [6, 7]. דחוף לפתח תרופות או אסטרטגיות חדשות נגד HCC.
רפואה סינית מסורתית (TCM) לבדה או בשילוב עם אסטרטגיות אחרות שימשה לטיפול ב-HCC והראתה את היתרונות הקליניים לרבות זמן הישרדות ממושך, שיפור באיכות החיים, הפחתת תגובות שליליות, וכן הלאה [8, 9]. ל-Cistanche, סוג של TCM, יש פונקציות ביולוגיות שונות, כגון אנטי חמצון, אנטי דלקתיות, אנטי אייג'ינג והגנה עצבית [10, 11].פנילתנואידים גליקוזידיםנחשבו למרכיבים הפעילים העיקריים של Cistanche, שיש להם פעילויות מגוונות כולל נוגד חמצון, אנטי דלקתיות, הגנת הכבד והגנה עצבית [12-15]. הקבוצה שלנו דיווחה על כךCistanche tubulosa פנילתנואידים גליקוזידים(CTPG) יכול לגרוםאפופטוזיסבתאי מלנומה B16-F10 ומעכבים את הצמיחה של גידולים בעכברים [16]. במחקר זה, מדדנו את ההשפעה האנטי-גידולית של CTPG על תאי HCC H22 הן in vitro והן in vivo וחקרנו את המנגנונים שלו. מצאנו את ה-CTPG הזה(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)מושרהאפופטוזיסבתאי H22 דרך מסלולי איתות חיצוניים וגם פנימיים ודיכא את הצמיחה של גידולי H22 בעכברים.
שיטות
קו טלפון
תאי קרצינומה hepatocellular H22 של העכבר התקבלו ממעבדת המפתח של שינג'יאנג למשאבים ביולוגיים והנדסה גנטית, אוניברסיטת שינג'יאנג (Urumqi, Xinjiang, סין) ותופחו במדיום RPMI 1640 (Gibco) בתוספת 100 U/ml פניצילין ו-100 ug/ml סטרפטומיצין, וסרום בקר עוברי מושבת ב-10 אחוזים (Gibco) ב-37 מעלות באווירה לחה של 5 אחוז CO2.
בדיקת MTT
CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)נרכש מחברת Hetian Dichen Biotech Co., Ltd (Hetian, Xinjiang, סין), ומהתרכובות העיקריות של CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)הוסמכו וכומתו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים [16]. כדאיות התא הוערכה על ידי 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Sigma, St. Louis, MO , ארה"ב) בדיקה. תאי H22 חוסנו לתוך 96-צלחות באר בצפיפות של 2 × 104 תאים במדיום של 100 ul לכל באר והורכבו ב-37 מעלות. לאחר 24 שעות, התאים טופלו בריכוזים שונים של CTPG (0,100, 200, 300 ו-400 ug/ml) או 0.3 אחוז DMSO (שווה לזה ב-400 ug/ml CTPG) במשך 24, 48 ו-72 שעות, בהתאמה. לאחר צנטריפוגה ב-1000 סל"ד למשך 7 דקות, הסופרנטנט הושלך ונוספו 100 ul של תמיסת MTT (5 מ"ג/מ"ל ב-PBS) לכל באר. הצלחות הודגרו ב-37 מעלות למשך 4 שעות ונוספו 100 ul DMSO כדי להמיס את גבישי הפורמזן שנוצרו. ערכי OD490 זוהו על ידי 96-קורא microplate באר (Bio-Rad Laboratories, CA, ארה"ב). כדאיות התא חושבה לפי הנוסחה: כדאיות התא ( אחוז )=(ODtreated/ODuntreated) x 100 אחוז .
Cistanche tubulosa phenylethanoid גליקוזידים
זיהוי של אפופטוזיס
תאי H22 טופלו בריכוזים שונים של CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)({{0}}, 100, 200, 300 ו-400 ug/ml) או 0.3 אחוז DMSO למשך 24 שעות, ולאחר מכן נצבע ב-Annexin VFITC/Propidium iodide (PI)אפופטוזיסערכת איתור (YEASEN, סין) לפי הוראות היצרן. דגימות נותחו על ידי ציטומטריית זרימה (BD FACSCalibur, ארה"ב).
זיהוי פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית
תאי H22 טופלו בריכוזים שונים של CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)(0, 200 ו-400 ug/ml) למשך 24 שעות, ולאחר מכן נצבע בצבע JC-1 החדיר לממברנה (Beyotime, סין) למשך 20 דקות ב-37 מעלות. לאחר שטיפה פעמיים עם חיץ JC-1, הדגימות הושעו מחדש עם 300 ul של חיץ JC-1 ונותחו באמצעות ציטומטריית זרימה (BD FACSCalibur, ארה"ב).
ניתוח מחזור התא
תאי H22 חוסנו בכלי תרבית של 60 מ"מ וטופלו בריכוזים שונים של CTPG (0, 100,200, 300 ו-400 ug/ml) או 0.3 אחוז DMSO למשך 24 שעות . כל התאים נאספו ונשטפו פעמיים עם PBS. תאים נקבעו באתנול קר כקרח ב-70% ב-20 מעלות למשך שעתיים ונשטפו פעמיים עם PBS, ואז הושעו מחדש במאגר צביעה של 300 ul Propidium iodide/RNase (BD Biosciences). לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, דגימות נאספו באמצעות ציטומטריית זרימה (BD FACSCalibur, ארה"ב), והתפלגות מחזור התא נותחה עם תוכנת ModFit LT 3.0.
פנילתנואידים גליקוזידיםבCistanche tubulosa
מכתים Hoechst 33,258
השינויים המורפולוגיים של גרעיני תאי H22 נותחו על ידי צביעה חודרת ל-DNA חודרת ל-DNA Hoechst 33,258. תאי H22 נזרעו בצלחת 6-באר בריכוז של 1 × 105 תאים/באר במדיום של 2 מ"ל. לאחר מפגש של 60% ~ 70%, התאים טופלו ב-CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)(0, 100, 200, 300 ו-400 ug/ml) למשך 24 שעות. התאים נאספו וקבועים עם 4 אחוז פרפורמלדהיד קר כקרח ב-4 מעלות למשך 10 דקות. לאחר שטיפה עם PBS, התאים נצבעו עם Hoechst 33,258 (Beyotime, סין) ב-4 מעלות למשך 10 דקות. דגימות נצפו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (Nikon Eclipse Ti-E, יפן).
כתם מערבי
Anti-Caspase-3, Anti-Caspase-3, Anti-Bcl-2 ואנטי-Bax נרכשו מ-Beyotime Biotech Co., Ltd. (שנחאי, סין). אנטי-קספס-7, אנטי-קספאז-7, אנטי-קספס-8, אנטי-קספאז-8, אנטי-קספס-9, אנטי-קספס מ-Caved-caspase-9, אנטי-PARP, PARP אנטי-מבוקע, IgG-HRP נגד עכברים ו-IgG-HRP נגד ארנבים נרכשו מ- Cell Signaling Technology. אנטי- -אקטין נרכש מ-Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (בייג'ינג, סין).
תאי H22 טופלו בריכוזים שונים של CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)({{0}}, 100, 200, 300 ו-400 ug/ml) או 0.3 אחוז DMSO למשך 24 שעות. תאים נאספו והוסרו עם Cell Lysis Solution RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) למשך 30 דקות על קרח. דגימות נסחררו (12,000 גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות) כדי לאסוף את הסופרנטנטים וריכוזי החלבון נמדדו על ידי ערכת BCA (Thermo Fisher Scientific, ארה"ב). כמות שווה של חלבון בכל דגימה בודדה על ידי 12 אחוז SDS-PAGE והועברה לממברנות PVDF (Biosharp, סין). לאחר חסימה עם חיץ TBST הכיל 5 אחוז חלב ללא שומן, ממברנות הודגרו עם נוגדנים ראשוניים מתאימים ונוגדנים משניים מצומדים לפרוקסידאז חזרת (HRP), בהתאמה. לאחר שטיפה עם TBST, חלבוני המטרה זוהו על ידי ערכת בדיקת ECL (Beyotime, סין).
הצהרת בעלי חיים ואתיקה
עכברי קונמינג זכרים בני 6-8 שבועות נרכשו ממרכז המעבדה לבעלי חיים, האוניברסיטה הרפואית של Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, סין). עכברים הוחזקו במתקן לבעלי חיים סטנדרטיים מבוקר טמפרטורה עם מחזורי אור של אוניברסיטת שינג'יאנג. כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו על פי ההנחיות של ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת שינג'יאנג. הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של מעבדת מפתח של שינג'יאנג למשאבים ביולוגיים והנדסה גנטית (BRGE-AE001), אוניברסיטת שינג'יאנג.
מחקר עכבר גידול
לצורך אינדוקציה של מודל עכבר גידול, עכברי קונמינג זכרים הוזרקו תת עורית עם 1 × 1 06 תאי H22 ב-100 ul PBS לתוך האגף הימני. לאחר 3 ימים, עכברים חולקו באופן אקראי ל-3 קבוצות (7 עכברים/קבוצה). לקבוצת הביקורת הוזרק 0.1 מ"ל DMSO תת עורית סביב הגידול. קבוצות CTPG-200 ו-CTPG-400 הוזרקו תת עורית עם 200 או 400 מ"ג/ק"ג CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)ב-0.1 מ"ל DMSO סביב הגידול. עכברים טופלו כל יומיים למשך עד 21 ימים. גדלי הגידול נמדדו באמצעות קליפרים עד 25 יום ונפח הגידול חושב לפי הנוסחה: נפח הגידול (mm3)=(אורך×רוחב2)/2. לאחר 25 ימים, ההישרדות של עכברי הגידול נוטרה כל יום עד לסיום מחקר זה.
ניתוח סטטיסטי
מובהקות סטטיסטית חושבה על ידי ניתוח חד כיווני של שונות בין קבוצות הטיפול והביקורת. כל הנתונים הובאו כממוצע ± סטיית תקן (SD). p < 0.05="" נחשב="" מובהק="">
תוצאות
CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)הפחית את הכדאיות של תאי H22 במבחנה
על מנת לחקור את ההשפעה האנטי-גידולית של CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)ב-HCC, תאי H22 טופלו בריכוזים שונים של CTPG (0, 100, 200, 300 ו-400 ug/ml) במבחנה. לאחר 24 שעות, המורפולוגיה של תאי H22 נצפתה באמצעות מיקרוסקופ הפוך. מצאנו שהמורפולוגיה של תאי H22 השתנתה באופן דרמטי על ידי טיפול CTPG. עם הגדלת ריכוז ה-CTPG, התאים הפכו לקטנים ועגולים וגם מספר התאים הצטמצם מאוד (איור 1א). מבחן MTT שימש לניתוח הכדאיות של תאי H22 לאחר טיפול CTPG במשך 24, 48 ו-72 שעות, בהתאמה. CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)הפחית משמעותית את כדאיות תאי H22 באופן תלוי מינון ותלוי זמן (איור 1b). CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)ב-300 ug/ml הגיע לשיעור המעכב הטוב ביותר (איור 1c). הערכים של IC50 של CTPG עבור תאי H22 הם 236 ug/ml ב-24 שעות ו-169.8 ug/ml ב-48 שעות.
CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)מושרה אפופטוזיס בתאי H22
כדי לחקור האם הירידה בכדאיות של תאי H22 מתווכת על ידי אינדוקציה שלאפופטוזיס, תאי H22 טופלו בריכוזים שונים של CTPG (0,100, 200, 300 ו-400 ug/ml) במשך 24 שעות והוצבעו ב-PI וב-Annexin V. תוצאות ציטומטריית הזרימה הראו ש-CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)מושרה באופן משמעותיאפופטוזיסשל תאי H22 (כולל מוקדם ומאוחראפופטוזיס) באופן תלוי מינון (איור 2א). למרות המינון הגבוה של CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)גם נמק מוגבר באופן משמעותי של תאי H22, לנמק יש תפקיד מינורי בעיכוב צמיחת תאי H22 בשל שיעורו הנמוך יותר (8.3 אחוזים) בהשוואה לזה שלאפופטוזיס(52.6 אחוזים). יתר על כן, סך החלבונים של תאי H22 בודדו לאחר CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)הטיפול והביטויים של לימפומה 2 של תאי B אנטי-אפופטוטיים (Bcl-2) ושל חלבון X הקשור ל-BCL-2-פרואפופטוטי (Bax) זוהו באמצעות Western blot. נתוני סריקה בגווני אפור הראו שרמות הביטוי של Bax ו-Bcl-2 עלו וירדו, בהתאמה. יחס Bax/Bcl-2 גדל באופן משמעותי (איור 2b). תוצאות אלו מצביעות על כך ש-CTPG מעורראפופטוזיסבתאי H22.
CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)גורם לעיבוי כרומוזומלי ולעצירת מחזור התא בתאי H22
דווח כי נזק ל-DNA ועצירת מחזור התא הנגרמים על ידי תרופות יכולים לעכב את צמיחת תאי הגידול ולגרום לכךאפופטוזיסבתאי גידול [17, 18]. כדי לזהות את המורפולוגיה של גרעינים בתאי H22 לאחר CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)טיפול במשך 24 שעות, תאי H22 נצבעו על ידי Hoechst 33,342 ונצפו באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנטית הפוכה. CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)תאים שטופלו הראו עלייה תלוית מינון של כרומטין מעובה בהיר של גרעינים, בעוד התאים הלא מטופלים הראו גרעינים מוכתמים בצורה הומוגנית (איור 3א). התפלגות מחזור התא בתאי H22 נותחה עוד יותר על ידי צביעת PI לאחר טיפול CTPG במשך 24 שעות. כפי שמוצג באיור 3b, CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)הטיפול הגדיל באופן משמעותי את השיעור של תאי שלב G0/G1- ו-G2/M והפחית באופן משמעותי את שיעור תאי שלב S, מה שמצביע על כך ש-CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)גרם לעצור פאזה G0/G1 ו-G2/M בתאי H22. המינון הגבוה של CTPG גם העלה משמעותית את שיעור תאי תת G1.
CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)ירידה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית והגברת שחרור ציטוכרום c
מסלול התלוי במיטוכונדריה ממלא תפקיד חשוב בהשראתאפופטוזיס[19, 20]. השינויים בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (Δψm) יכולים להיות
מנוטר על ידי צביעה JC-1 עקב צבר JC-1 (קרינה אדומה) יכול להתפרק למונומר (קרינה ירוקה) עם הפחתת Δψm [21]. אחרי CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)טיפול במשך 24 שעות, תאי H22 נצבעו על ידי צבע JC-1. נתוני הזרימה הציטומטרית הראו שהקרינה האדומה בערוץ FL-2 והקרינה הירוקה בערוץ FL-1 פחתו משמעותית ועלו ב-CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)יַחַס. שיעור התאים PE-FITC פלוס גדל באופן משמעותי (איור 4א), מה שמצביע על כך ש-CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)הפחית את Δψm בתאי H22. זה תואם את היחס המוגדל של Bax/Bcl-2. כתוצאה מכך, ראינו שהשחרור של ציטוכרום c גדל באופן משמעותי עם CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)טיפול (איור 4ב). תוצאות אלו הצביעו על כך ש-CTPG עשוי לגרום חלקיתאפופטוזיסבתאי H22 דרך מסלול תלוי מיטוכונדריאלי (מוטבע).
CTPG הפעיל את מסלול הקספאז ומנע תיקון DNA
לאחר מכן, ההפעלה של caspase המושרה על ידי CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)נותחו באמצעות מסלולי איתות חיצוניים ופנימיים כאחד. אחרי CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)טיפול במשך 24 שעות, סך החלבונים בודד מתאי H22 ורמות הפרו-ו-caspases מפוצלות זוהו באמצעות Western blot. בהשוואה לשליטה לא מטופלת או לבקרת DMSO, CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)הטיפול הווסת באופן משמעותי לא רק את רמת הקספס המפוצל-8 (מסלול חיצוני), אלא גם את רמת הקספס המפוצל-9 (מסלול פנימי) (איור 5). ברצף, קספאז מופעל-8 ו--9 קרעו את הפרו-קספסה במורד הזרם-3 ואת -7 שנצפו באיור. 5. קספאז מופעל-3 חיתקו את ה-DNA אנזים תיקון של פולי (ADP-ribose) פולימראז (PARP) כדי למנוע תיקון DNA ולצבור נזק ל-DNA כפי שנצפה באיור 3a. תוצאות אלו הצביעו על כך ש-CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)מושרהאפופטוזיסבתאי H22 דרך מסלולי איתות חיצוניים ופנימיים כאחד.
CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)מדכא את הצמיחה של H22 HCC in vivo ומשפר את שיעור ההישרדות של עכברי גידול
לבסוף, ההשפעה האנטי-גידולית של CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)על HCC הוערך במודל עכבר גידול, אשר הוקם על ידי הזרקה תת עורית של תאי H22. לאחר 3 ימים של הזרקת תאי H22, עכברי גידול טופלו ב-CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)8 פעמים. משקל הגוף של עכברים וגדלים של הגידול נוטר בנקודות הזמן המצוינות. כפי שמוצג באיור 6a, למשקל הגוף של עכברים בכל קבוצה אין הבדל משמעותי, מה שמצביע על כך שהמינונים הנבחרים של CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)אין תופעות לוואי ברורות. מעניין לציין שגידול הגידול בעכברים שטופלו ב-200 מ"ג/ק"ג וגם ב-400 מ"ג/ק"ג של CTPG עוכב באופן משמעותי (איור 6ב). יתר על כן, שתי המנות של CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)הטיפול שיפר מאוד את ההישרדות של עכברי גידול (3/7, 3/7) בהשוואה לקבוצת הביקורת (0/7) בסוף הניסוי (איור 6b). מצאנו גם ש-CTPG הגביר באופן משמעותי את התפשטות הספלנוציטים שבודדו מעכברי קונמינג זכרים באופן תלוי מינון (איור 6c), מה שמרמז על כך ש-CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)יש השפעה אימונוסטימולטורית.
דִיוּן
TCM שימש לטיפול במחלות שונות כולל סרטן במשך היסטוריה ארוכה. דווח כי TCM יכול לגרוםאפופטוזיסבסוגים שונים של תאי גידול באמצעות מסלולי איתות חיצוניים (מתווך קולטן מוות) ואינטרינזיים (תלויים במיטוכונדריה) להפעלת השפעות אנטי-גידוליות [22-25]. שני המסלולים יכולים להפעיל את הקספאז-8 ו--9, בהתאמה [24, 26]. כאן, מצאנו את ה-CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)דיכא באופן משמעותי את צמיחת תאי H22 באמצעות אינדוקציה של אפופטוזיס ועצירת מחזור התא. רמות הקספס המפוצלים-8 ו--9 היו מווסתות באופן משמעותי על ידי CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)טיפול, מה שמצביע על כך שגם מסלולי איתות חיצוניים וגם מסלולים פנימיים היו מעורבים באינדוקציה שלאפופטוזיס. המחקר הקודם שלנו הראה ש-CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)גרם לאפופטוזיס בתאי מלנומה B16-F10 על ידי מסלול תלוי במיטוכונדריה שהעלה את רמת הקספאז המפוצל-9 אך לא הקספאז-8 [16]. CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)עשוי להפעיל מסלולי איתות ברורים בסוגים שונים של תאי גידול.
שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית מווסתת באופן הדוק על ידי חברי משפחת החלבונים BCL-2 כולל Bax ו-Bcl-2 [27, 28]. היחס בין Bax ל-Bcl-2 ממלא תפקיד קריטי בתלוי המיטוכונדריהאפופטוזיסמסלול [29]. בתאי H22 שטופלו על ידי CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים), יחס Bax/Bcl-2 היה מווסת באופן משמעותי, מה שעשוי לגרום להפחתה של Δψm ולשחרור ציטוכרום c שנצפה במחקר זה. כתוצאה מכך, pro-caspase-9 נבקע והופעל. לבסוף, היוזמים של caspase-8 ו--9 הפעילו את המוציא להורג של caspase-3 כדי לפצח PARP כדי למנוע תיקון DNA. יחד, תוצאות אלו הצביעו על כך ש-CTPG גרםאפופטוזיסבתאי H22 דרך מסלולי איתות חיצוניים ופנימיים כאחד. במודל של עכבר גידול, CTPG דיכא באופן משמעותי את הצמיחה של H22 HCC ושיפר מאוד את ההישרדות של עכברי הגידול. מעניין, CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)קידם באופן תלוי מינון את התפשטות הספלנוציטים מעכברי קונמינג, מה שעולה בקנה אחד עם המחקר הקודם שלנו [16]. תוצאות אלו הצביעו על כך ש-CTPG עשוי לדכא את הצמיחה של H22 HCC בעכברים הן באמצעות אפקט אנטי-גידול ישיר והן באמצעות שיפור חיסוני עקיף.
Cistanche tululosaמוצרים
מסקנות
CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)דיכא את הצמיחה של תאי H22 הן במבחנה והן במבחנה וגרםאפופטוזיסבתאי H22 דרך מסלולי איתות חיצוניים ופנימיים כאחד. נתונים אלה הצביעו על כך ש-CTPG(Cistanche tubulosa פנילתנואיד גליקוזידים)עשוי להיות מועמד פוטנציאלי לטיפול ב-HCC.
קיצורי מילים
Bax: חלבון X משויך ל-BCL-2-; Bcl-2: לימפומה של תאי B 2; CTPG:Cistanche tubulosa פנילתנואידים גליקוזידים; HCC: קרצינומה הפטוצלולרית; HRP: פרוקסידאז חזרת; MTT: 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide; PARP: אנזים לתיקון DNA של פולי (ADP-ribose) פולימראז; TCM: רפואה סינית מסורתית; Δψm: פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית
מימון
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט הצגת כשרונות ברמה גבוהה של האזור האוטונומי שינג'יאנג אויגור ל-JL, מענק הקרן הלאומית למדעי הטבע הסינית (31460241) ל-JL, וקרן הסטארט-אפ לדוקטורט של אוניברסיטת שינג'יאנג (BS160261 עד XW ו-BS150236 ל- YL).
זמינות נתונים וחומרים
הנתונים הגולמיים של מחקר זה זמינים על פי בקשה סבירה למחבר המקביל.
תרומות מחברים
JL ו-JL תכננו את הניסויים. PY, JL, AA ו-YY ביצעו את הניסויים. LX, XW ו-YL ניתחו את הנתונים. PY, JL ו-JL כתבו את כתב היד. כל המחברים תרמו ואישרו את כתב היד הסופי.
אישור אתיקה
המחקר בבעלי חיים אושר על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של מעבדת המפתח למשאבים ביולוגיים והנדסה גנטית של שינג'יאנג, אוניברסיטת שינג'יאנג
אינטרסים מתחרים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
הערת המוציא לאור
Springer Nature נשאר ניטרלי בכל הנוגע לתביעות שיפוט במפות שפורסמו ובשיוכים מוסדיים.
פרטי מחבר
1מעבדת מפתח שינג'יאנג למשאבים ביולוגיים והנדסה גנטית, המכללה למדעי החיים והטכנולוגיה, אוניברסיטת שינג'יאנג, 666 Shengli Road, Urumqi, Xinjiang 830046, סין.2המכללה למדעי החיים, Xinjiang Normal University, 102 Xinyi Road, Urumqi 830054, Xinjiang, China.3בית החולים לגידולים מסונף של האוניברסיטה הרפואית של שינג'יאנג, Urumqi 830011, סין.
Cistanche tululosaמוצרים
מ: 'Cistanche tubulosa פנילתנואידים גליקוזידיםלְהַשְׁרוֹתאפופטוזיסבתאי קרצינומה hepatocellular H22 דרך מסלולי איתות חיצוניים וגם פנימיים' מאת Pengfei Yuan1 וחב'
---יואן ואחרים. BMC Complementary and Alternative Medicine (2018) 18:275 https://doi.org/10.1186/s12906-018-2201-1
הפניות
1. Global Burden of Disease Cancer Collaboration, Fitzmaurice C, Allen C, Barber RM, Barregard L, Bhutta ZA, Brenner H, Dicker DJ, Chimed-Orchir O, Dandona R, et al. שכיחות סרטן גלובלית, אזורית ולאומית, תמותה, שנות חיים אבודות, שנות חיים עם מוגבלות ושנות חיים מותאמות לנכות עבור 32 קבוצות סרטן, 1990 עד 2015: ניתוח שיטתי לחקר הנטל העולמי של מחלות. JAMA Oncol. 2017;3:524–48.
2. Chen W, Zheng R, Baade PD, Zhang S, Zeng H, Bray F, Jemal A, Yu XQ, He J.Cancer statistics in China, 2015. CA Cancer J Clin. 2016;66:115–32.3. האגודה האירופית לחקר הכבד, הארגון האירופי לחקר וטיפול בסרטן. הנחיות לתרגול קליני של EASL-EORTC: ניהול של קרצינומה הפטוצלולרית. JHepatol. 2012;56:908–43.
4. Roayaie S, Obeidat K, Sposito C, Mariani L, Bhoori S, Pellegrinelli A, Labow D, Llovet JM, Schwartz M, Mazzaferro V. כריתה של סרטן hepatocellular פחות או שווה ל-2 ס"מ: תוצאות משני מרכזים מערביים. הפטולוגיה. 2013;57:1426–35.
5. Ting CT, Cheng YY, Tsai TH. אינטראקציה של צמחי מרפא בין הנוסחה המסורתית להגנת הכבד וסוראפניב על רעילות הכבד, היסטופתולוגיה ופרמקוקינטיקה בחולדות. מולקולות. 2017;22:E1034.
6. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC,Santoro A, Raoul JL, Forner A, et al. Sorafenib בקרצינומה כבדית מתקדמת. N Engl J Med. 2008;359:378–90.
7. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS, et al. יעילות ובטיחות של sorafenib בחולים באזור אסיה-פסיפיק עם קרצינומה כבדית מתקדמת: ניסוי אקראי שלב III, כפול סמיות, מבוקר פלצבו. לנצט אונקול. 2009;10:25–34.
8. Shi Z, Song T, Wan Y, Xie J, Yan Y, Shi K, Du Y, Shang L. סקירה שיטתית ומטה-אנליזה של תרופות סיניות מסורתיות של חרקים בשילוב כימותרפיה לטיפול בקרצינומה הפטוצלולרית לא ניתוחית. Sci Rep.2017;7:4355.
9. Yang Z, Liao X, Lu Y, Xu Q, Tang B, Chen X, Yu Y. טיפול נוסף עם הרפואה הסינית המסורתית משפר את התוצאות ומפחית תופעות לוואי בקרצינומה הפטוצלולרית: מטה-אנליזה של מחקרים אקראיים מבוקרים. Evid Based Complement Alternat Med. 2017;2017:3428253.
10. Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CR. פעילות אנטי-נוציספטיבית ואנטי דלקתית הנגרמת על ידי Cistanche deserticola במכרסמים. J Etnopharmacol. 2002;83:177–82.
11. Wu CR, Lin HC, Su MH. היפוך על ידי תמציות מימיות שלCistanche tubulosaמחסרים התנהגותיים במודל חולדות דמוי מחלת אלצהיימר: רלוונטיות לתצהיר עמילואיד ותפקוד נוירוטרנסמיטר מרכזי. BMC משלים Altern Med. 2014;14:202.
12. Jiang Y, Tu PF. ניתוח של מרכיבים כימיים במינים של Cistanche. JChromatogr A. 2009;1216:1970–9.
13. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, Yoshikawa M, Yuan D, Muraoka O. Acylated phenylethanoid oligo glycosides עם פעילות הגנה על הכבד מצמח המדברCistanche tubulosa.Bioorg Med Chem. 2010; 18:1882–90.
14. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF.פנילתנואידים גליקוזידיםעם פעילות אנטי דלקתית מגבעולים של Cistanche deserticola מתורבתים במדבר טארים. Fitoterapia.2013;89:167–74.
15. Deng M, Zhao J, Tu P, Jiang Y, Li Z, Wang Y. Echinacoside מחזיר את התאים הנוירונים SHSY5Y מ-TNF המושרהאפופטוזיס. Eur J Pharmacol. 2004;505:11–8.
16. Li J, Li J, Aipire A, Gao L, Huo S, Luo J, Zhang F.פנילתנואידים גליקוזידיםמCistanche tubulosaמעכב את הצמיחה של תאי B16-F10 הן in vitro והן in vivo על ידי אינדוקציה שלאפופטוזיסדרך מסלול תלוי מיטוכונדריה. J סרטן. 2016;7:1877–87.
17. Shang HS, Chang CH, Chou YR, Yeh MY, Au MK, Lu HF, Chu YL, Chou HM, Chou HC, Shih YL, et al. כורכומין גורם נזק ל-DNA ומשפיע על ביטוי חלבון קשור בתאי סרטן צוואר הרחם האנושיים HeLa. Oncol Rep. 2016;36:2207–15.
18. Wang R, Zhang Q, Peng X, Zhou C, Zhong Y, Chen X, Qiu Y, Jin M, Gong M, Kong D. Stellettin B גורם למעצר G1,אפופטוזיס, ואוטופגיה בתאי A549 סרטן ריאות אנושיים לא קטנים באמצעות חסימת מסלול PI3K/Akt/mTOR. Sci Rep. 2016;6:27071.
19. Sinha K, Das J, Pal PB, Sil PC. מתח חמצוני: המסלולים תלויי המיטוכונדריה והמיטוכונדריה בלתי תלויים שלאפופטוזיס. קשת טוקסיקול. 2013; 87:1157–80.
20. Zhang YS, Shen Q, Li J. רפואה סינית מסורתית המכוונת למנגנונים אפופטוטיים לטיפול בסרטן הוושט. Acta Pharmacol Sin. 2016; 37:295–302.
21. Chong ZZ, Lin SH, Li F, Maiese K. מעכב ה-sirtuin nicotinamide משפר את הישרדות תאי העצב במהלך פגיעה אנוקסית חריפה באמצעות מסלולים "אנטי-אפופטוטיים" הקשורים ל-AKT, BAD, PARP ומיטוכונדריה. Curr Neurovasc Res. 2005;2:271–85.
22. Hu B, Wang SS, Du Q. רפואה סינית מסורתית למניעה וטיפול בהפטוקרצינומה: מהספסל למיטה. World J Hepatol. 2015;7:1209–32.
23. Hu B, An HM, Wang SS, Chen JJ, Xu L. השפעות מניעתיות וטיפוליות של תרכובות צמחיות סיניות נגד קרצינומה הפטוצלולרית. מולקולות. 2016;21:142.
24. Xu H, Zhao X, Liu X, Xu P, Zhang K, Lin X. השפעות אנטי-גידוליות של הרפואה הסינית המסורתית המכוונות למסלול האפופטוטי הסלולרי. Drug Des Devel Ther. 2015;9:2735–44.
25. Li-Weber M. Targetingאפופטוזיסמסלולים בסרטן על ידי הרפואה הסינית. סרטן Lett. 2013;332:304–12.
26. Xu G, Shi Y.אפופטוזיסמסלולי איתות והומאוסטזיס לימפוציטים. Cell Res. 2007;17:759–71.
27. Tait SW, Green DR. מיטוכונדריה ומוות תאים: חדירות קרום חיצוני ומעבר לכך. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11:621–32.
28. Galluzzi L, Kepp O, Kroemer G. Mitochondria: הרגולטורים הראשיים של איתות סכנה. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012;13:780–8.
29. Martinou JC, Youle RJ. מיטוכונדריה באפופטוזיס: Bcl-2 בני משפחה ודינמיקה מיטוכונדריה. Dev Cell. 2011;21:92–101.
