Cistanche Deserticola Polysaccharide מעכב אובדן עצם המושרה על ידי OVX בעכברים ואוסטאוקלסטוגנזה המושרה על ידי RANKL

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

תַקצִיר

אוסטאופורוזיס היא מחלת עצמות חמורה הפוגעת באוכלוסייה המזדקנת. Cistanche deserticola (CD), מזון טוניק ומרפא בשימוש נרחב בסין, הוכח כמספק טיפול יעיל לאוסטאופורוזיס. Cistanche deserticola polysaccharide (CDP), המופק מ-CD, בעל תכונות פרמקולוגיות שונות, אך תפקידו באוסטאוקלסטיהיווצרות ותפקוד, כמו גם אוסטאופורוזיס, נותרו לא ידועים. מטרת מחקר זה הייתה לחלץ ולטהר CDP כדי להמשיך ולחקור את מנגנון הפעולה הפוטנציאלי שלו על אוסטיאופורוזיס. התוצאות הראו כי הטיפול ב-CDP מנע אוסטאופורוזיס הנגרמת על ידי OVX והשפר את אובדן העצם על ידי דיכוי הפעילות והתפקוד של אוסטאוקלסטים. יתר על כן, טיפול ב-CDP עיכב באופן משמעותי אוסטאוקלסטוגנזיס המושרה על ידי RANKL, ספיגת עצם וביטוי גנים ספציפיים לאוסטאוקלסטים. מבחינה מכאנית, CDP עיכב את הפעלת מסלולי איתות של NF-KB ו-MAPKs המושרה על ידי RANKL, וכתוצאה מכך השפיע על הפעלת NFATc1 במורד הזרם. הממצאים במחקר זה מצביעים על כך ש-CDP היא תרופה בטוחה בפוטנציה לטיפול באוסטיאופורוזיס. (10 יתרונות שה-Cistanche יכול לתת)

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

מבוא

אוסטאופורוזיס - מחלה המאופיינת בירידה במסת עצם, מיקרו-מבנה לא תקין של רקמת העצם, עלייה בשבריריות העצם ושבר (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, & Ginaldi, 2006) - משפיעה כיום על יותר מ-200 מיליון אנשים ברחבי העולם ומציגה מצב רפואי משמעותי. נטל סוציו-אקונומי על החברה המודרנית (Strom et al., 2011). הטיפול הקליני באוסטיאופורוזיס מתמקד בעיקר בהחלפת הורמונים,ביספוספונט, או טיפול בדנוסומאב. שיטות אלו יעילות אך מהוות תופעות לוואי ארוכות טווח כגון הסיכון הפוטנציאלי לסרטן השד ושברים לא טיפוסיים של עצם הירך (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof Bauer, 2011). לפיכך, יש צורך דחוף לחקור תרופות שיכולות לא רק לעכב אוסטיאופורוזיס אלא גם להכיל פחות תופעות לוואי לא רצויות. Cistanche deserticola (CD), מזון טוניק ומרפא בשימוש נרחב בסין, המכונה "ג'ינסנג מדברי", הוא הגבעול העסיסי המיובש עם עלה הקשקשים של C. deserticola YC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) ויש לו מגוון ופעילויות תרופתיות יעילות, כגון ויסות חיסוני,אנטי חמצון, ותכונות נוגדות אוסטאופורוזיס (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). מחקרים קודמים על החומרים הפעילים של CD בטיפול באוסטיאופורוזיס התמקדו בעיקר בגליקוזידים של פנילאתנואידים (Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). עם זאת, התקליטור מכיל גם רכיבים יעילים אחרים כגון אירידואידים, ליגננים, פוליסכרידים (Wang, Zhang, & Xie, 2012). היישום הקליני של הרפואה הסינית המסורתית (TCM) הוא בעיקר מרתח מים. פוליסכרידים הם רכיבים מסיסים במים וסביר להניח שהם הרכיבים הפרמקודינמיים העיקריים של TCM. פוליסכרידים המופקים מ-TCM דווחו באופן פראי כבעלי השפעה נוגדת אוסטאופורוזיס וכמה תופעות לוואי לא רצויות, שנעשה בהן שימוש בדרך כלל במרפאות (למשל, פוליסכרידים המופקים מEpimedium brevicornum(Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018), ו-Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). לכן, שיערנו את זהפוליסכריד Cistanche deserticola(CDP) המופק מ-CD עשויה להיות תרופה בטוחה בפוטנציה לטיפול באוסטיאופורוזיס. בדרך כלל, ספיגת עצם ויצירת עצם שומרים על איזון דינמי במהלך שיפוץ עצם בתיאום עם מספר סוגי תאים, כולל אוסטאוקלסטים,אוסטאובלסטים, תאי רירית עצם ואוסטאוציטים (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). הפסקה באיזון זה עשויה לגרום למגוון מחלות מטבוליות בעצמות, כגון אוסטאופורוזיס (Zhu et al., 2018) ואוסטאוסקלרוזיס (Ihde et al., 2011). אוסטאוקלסטים, כתאים מובחנים קצה שמקורם בשושלת החד-גרעינית/מאקרופגית, הם התאים היחידים עם תפקוד ספיגת עצם (Teitelbaum, 20{{106}}0). ישנם שני ציטוקינים מרכזיים המשתתפים בהתמיינות והבשלה של אוסטאוקלסטים (Koga et al., 2004): גורם מגרה של מושבות מקרופאגים (M-CSF) ומפעיל קולטן של ליגנד גורם גרעיני κB (NF-κB) (RANKL). M-CSF מתווך את ההתמיינות של תאי גזע המטופואטיים לאבות אוסטאוקלסטים ומקדם את ההתמיינות של אוסטאוקלסטים על ידי הגברת הביטוי של הקולטן RANK (Takayanagi, 2007). הקישור של RANKL ו-RANK על פני תא האוסטאוקלסט מביא לתוצאות הבאות: (1) גיוס של מולקולות מתאם איתות כגון גורם 6 הקשור לקולטן TNF (TRAF6); (2) הפעלה של מטרות מרובות במורד הזרם, כולל NF- κB וחלבונים מופעלי מיטוגן (MAPKs); ו-(3) ויסות עלייה של רמות הביטוי של גורם גרעיני של תאי T משופעלים, ציטופלזמי 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). ההפעלה של מסלולי איתות אלה מווסתת ישירות את הביטוי של גנים אוסטאוקלסטים, כולל חומצה פוספטאז 5 (Acp5) [המקודדת חומצית פוספטאז עמידה לטרטרטים (TRAcP)], מטריקס מטלופרוטאינז 9 (MMP9), וקתפסין K (CTSK) (Boyle, Simonet) , & לייסי, 2003). לכן, העיכוב של מסלולי איתות הקשורים להתמיינות אוסטאוקלסטים המושרה על ידי RANKL היא שיטה טיפולית פוטנציאלית לאוסטאופורוזיס. במחקר זה, מטרתנו הייתה לקבוע את ההשפעות של טיפול CDP על מודל האוסטאופורוזיס המושרה על ידי שחלות (OVX) in vivo ועל פעילות אוסטאוקלסטים הנגרמת על ידי RANKL במבחנה, תוך התמקדות בביטוי של גנים ספציפיים לאוסטאוקלסטים וההפעלה של NFATc1 ומסלולי האיתות NF-κB ו-MAPKs. הממצאים שלנו עשויים לספק תובנות חדשות לגבי הפוטנציאל של CDP כתרופה בטוחה ויעילה לטיפול באוסטיאופורוזיס. 2. חומרים ושיטות 2.1. תקליטור איסוף כימיקלים ודגימות (מס' 180801) נרכש מחברת Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (אנהוי, סין) וזוהה על ידי פרופסור Haibo Huang מבית הספר למדעי התרופות, אוניברסיטת גואנגג'ואו לרפואה סינית, גואנגג'ואו, סין . טבליות Estradiol valerate נרכשו מבאייר (Leverkusen, North-Rhine Westphalia, גרמניה). מדיום חיוני מינימלי שעבר שינוי אלפא (-MEM) וסרום בקר עוברי (FBS) התקבלו מ- Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). פניצילין/סטרפטומיצין וערכת הצביעה TRAcP נרכשו מ-Solarbio (בייג'ינג, סין). עכבר רקומביננטי M-CSF ועכבר רקומביננטי RANKL נרכשו מ-R&D Systems (Minneapolis, MN, ארה"ב). צלחות מצופות Hydroxyapatite נרכשו מחברת Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, ארה"ב). הנוגדנים העיקריים עבור NFATc1 ו-CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK ו-P-JNK (טכנולוגיית איתות תאים, Dan vers, MA, ארה"ב); וכן -אקטין (CWBIO, בייג'ינג, סין) הושג גם כן. שאר הריאגנטים ששימשו במחקר זה היו בדרגה אנליטית, והמים טוהרו על ידי מערכת טיהור המים Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, ארה"ב). 2.2. מיצוי CDP ה-CD נטחן לאבקה דקה וערבב עם אתר נפט שלוש פעמים כדי להביס אותו. השאריות המוצקות נאספו על ידי סינון ולאחר מכן יובשו בטמפרטורת החדר. הפוליסכרידים חולצו מהדגימות שטופלו מראש שלוש פעמים עם מים למשך שעתיים, רוכזו, שוקעו על ידי הוספת אתנול נטול מים לריכוז סופי של 80 אחוז (v/v), ואוחסנו ב-4 ◦C למשך 24 שעות. המשקעים נאספו בצנטריפוגה ב-3000 סל"ד למשך 20 דקות, הומסו במים מזוקקים וטיהרו (הסרת חלבונים חופשיים) בשיטת Sevag (Zhao et al., 2019). הפוליסכרידים שהוחזרו עברו דיאליזה, ייבושו ואוחסנו עד לשימוש נוסף. יתר על כן, תוצאות ההרכב הכימי הראו כי תכולת הסוכר, החומצה האורונית, הסולפט והחלבון הכוללת של CDP הייתה 67.63 ± 0.98 אחוזים, 21.05 ± 0.49 אחוזים, 1.90 ± 0.24 אחוזים ו-8.81 ± 0.36 אחוזים. הרכב החד-סוכרים וניתוח אינפרא אדום של פורייה של CDP הוצגו באיור משלים. 1 ו-2. 2.3. מודל עכבר אוסטאופורוזיס המושרה על ידי OVX כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת גואנגג'ואו לרפואה סינית (אושרה SYXK 2019-0202). שלושים עכברי נקבות C57BL/6 בנות 6-שבוע סופקו על ידי מרכז החיות הניסויים של אוניברסיטת גואנגג'ואו לרפואה סינית. לאחר התאקלמות במשך שבוע, קבוצה אחת של עכברים ניתנה ניתוח דמה (קבוצת Sham), בעוד העכברים הנותרים עברו ניתוח כריתת שחלות (קבוצת OVX). לאחר הניתוח, העכברים הורשו להתאושש במשך 1-שבוע. לאחר מכן, עכברים שהודגמו בהצלחה חולקו באקראי ל-5 קבוצות, עם 6 עכברים לקבוצה: (1) קבוצת דמה: טופלה במים מזוקקים, (2) קבוצת OVX: טופלה במים מזוקקים, (3) קבוצת OVX בתוספת E2 (E2) : מטופל בטבליות 0.13 מ"ג/ק"ג אסטרדיול ולרט, (4) קבוצת מינון נמוך של OVX בתוספת CDP (CDP-L): מטופלת ב-300 מ"ג/ק"ג של CDP, (5) קבוצת מינון גבוה של OVX בתוספת CDP (CDP H): מטופלת עם 600 מ"ג/ק"ג של CDP. מים מזוקקים, E2 או CDP ניתנו במתן מתן פעם ביום. כל העכברים הוקרבו לאחר תקופת הטיפול של 12- שבוע (איור 1A). הרחמים נאספו ונשקלו, והשוק השמאלי נאספו לבדיקות הבאות. דגימות דם מלא נאספו וצנטריפוגה ב-5000 סל"ד למשך 15 דקות ב-4 ◦C. הסופרנטנטים בסרום נשאבו ואוחסנו ב-80 ◦C עד לניתוח נוסף. 2.4. ניתוח טומוגרפיה ממוחשבת (מיקרו-CT) והיסטומורפומטריה של העצם השוק השמאלי תוקן עם 4 אחוז פרפורמלדהיד למשך 48 שעות ולאחר מכן הונחו בצינורות צנטריפוגה המכילים תמיסת מלח רגילה. הדגימות הקבועות נסרקו באמצעות מכשיר Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, בלגיה) תוך שימוש בהגדרות הבאות: מתח, 80 קילו וולט; זרם מקור, 100 מיקרומטר; אל, מסנן 0.5 מ"מ; גודל פיקסל, 9.76 מיקרומטר; ושלב סיבוב, 0.6◦. מספר פרמטרים של העצם הטראבקולרית, כולל צפיפות מינרלים של העצם (BMD), שבר נפח עצם (BV/TV), משטח עצם לכל נפח כולל (BS/TV), מספר טרבקולרי (Tb. N) ומרווח טרבקולרי (Tb.Sp) ) נמדדו באמצעות תוכנת CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). תמונות תלת מימדיות נוצרו באמצעות תוכנת CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). לאחר ניתוח מיקרו-CT, השוקה השמאלית סולקה בתמיסת EDTA של 14 אחוז והוטמעה בפרפין לצורך חיתוך. הדגימות נחתכו למקטעים של 5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום לפני ניסויי הצביעה של המטוקסילין ואאוזין (H&E) ו-TRAcP. החתכים המוכתמים נבדקו ותועדו באמצעות מיקרוסקופ Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, טוקיו, יפן). 2.5. ניתוח נסיוב ריכוזי הסידן (Ca) והזרחן (P) נקבעו בהתאם להוראות הערכה שתוכננו על ידי המכון הביו-הנדסי של Nanjing Jiancheng (Nanjing, סין). רמות TRAcP-5b ו-RANKL בסרום נותחו באמצעות ערכת TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, ווהאן, סין) וערכת RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., ווהאן, סין), בהתאמה.

תקליטור איסוף כימיקלים ודוגמאות (מס' 180801) נרכש מ-Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, סין) וזוהה על ידי פרופסור Haibo Huang מבית הספר של מדעי התרופות, אוניברסיטת גואנגג'ואו לרפואה סינית, גואנגג'ואו, סין. טבליות Estradiol valerate נרכשו מבאייר (Leverkusen, North-Rhine Westphalia, גרמניה). מדיום חיוני מינימלי שעבר שינוי אלפא (-MEM) וסרום בקר עוברי (FBS) התקבלו מ- Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). פניצילין/סטרפטומיצין וערכת הצביעה TRAcP נרכשו מ-Solarbio (בייג'ינג, סין). עכבר רקומביננטי M-CSF ועכבר רקומביננטי RANKL נרכשו מ-R&D Systems (Minneapolis, MN, ארה"ב). צלחות מצופות Hydroxyapatite נרכשו מחברת Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, ארה"ב). הנוגדנים העיקריים עבור NFATc1 ו-CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK ו-P-JNK (טכנולוגיית איתות תאים, Dan vers, MA, ארה"ב); וכן -אקטין (CWBIO, בייג'ינג, סין) הושג גם כן. שאר הריאגנטים ששימשו במחקר זה היו בדרגה אנליטית, והמים טוהרו על ידי מערכת טיהור המים Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, ארה"ב). 2.2. מיצוי CDP ה-CD נטחן לאבקה דקה וערבב עם אתר נפט שלוש פעמים כדי להביס אותו. השאריות המוצקות נאספו על ידי סינון ולאחר מכן יובשו בטמפרטורת החדר. הפוליסכרידים חולצו מהדגימות שטופלו מראש שלוש פעמים עם מים במשך שעתיים, רוכזו, שוקעו על ידי הוספת אתנול נטול מים לריכוז סופי של 80 אחוזים (v/v), ואוחסנו ב-4 ◦C למשך 24 שעות. המשקעים נאספו בצנטריפוגה ב-3000 סל"ד למשך 20 דקות, הומסו במים מזוקקים וטיהרו (הסרת חלבונים חופשיים) בשיטת Sevag (Zhao et al., 2019). הפוליסכרידים שהוחזרו עברו דיאליזה, ייבושו ואוחסנו עד לשימוש נוסף. יתר על כן, תוצאות ההרכב הכימי הראו כי תכולת הסוכר, החומצה האורונית, הסולפט והחלבון הכוללת של CDP הייתה 67.63 ± 0.98 אחוזים, 21.05 ± 0.49 אחוזים, 1.90 ± 0.24 אחוזים ו-8.81 ± 0.36 אחוזים. הרכב החד-סוכרים וניתוח אינפרא אדום של פורייה של CDP הוצגו באיור משלים. 1 ו-2. 2.3. מודל עכבר אוסטאופורוזיס המושרה על ידי OVX כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת גואנגג'ואו לרפואה סינית (אושרה SYXK 2019-0202). שלושים עכברי נקבות C57BL/6 בנות 6-שבוע סופקו על ידי מרכז החיות הניסויים של אוניברסיטת גואנגג'ואו לרפואה סינית. לאחר התאקלמות במשך שבוע, קבוצה אחת של עכברים ניתנה ניתוח דמה (קבוצת Sham), בעוד העכברים הנותרים עברו ניתוח כריתת שחלות (קבוצת OVX). לאחר הניתוח, העכברים הורשו להתאושש במשך 1-שבוע. לאחר מכן, עכברים שהודגמו בהצלחה חולקו באקראי ל-5 קבוצות, עם 6 עכברים לקבוצה: (1) קבוצת דמה: טופלה במים מזוקקים, (2) קבוצת OVX: טופלה במים מזוקקים, (3) קבוצת OVX בתוספת E2 (E2) : מטופל בטבליות 0.13 מ"ג/ק"ג אסטרדיול ולרט, (4) קבוצת מינון נמוך של OVX בתוספת CDP (CDP-L): מטופלת ב-300 מ"ג/ק"ג של CDP, (5) קבוצת מינון גבוה של OVX בתוספת CDP (CDP H): מטופלת עם 600 מ"ג/ק"ג של CDP. מים מזוקקים, E2 או CDP ניתנו במתן מתן פעם ביום. כל העכברים הוקרבו לאחר תקופת הטיפול של 12- שבוע (איור 1A). הרחמים נאספו ונשקלו, והשוק השמאלי נאספו לבדיקות הבאות. דגימות דם מלא נאספו וצנטריפוגה ב-5000 סל"ד למשך 15 דקות ב-4 ◦C. הסופרנטנטים בסרום נשאבו ואוחסנו ב-80 ◦C עד לניתוח נוסף. 2.4. ניתוח טומוגרפיה ממוחשבת (מיקרו-CT) והיסטומורפומטריה של העצם השוק השמאלי תוקן עם 4 אחוז פרפורמלדהיד למשך 48 שעות ולאחר מכן הונחו בצינורות צנטריפוגה המכילים תמיסת מלח רגילה. הדגימות הקבועות נסרקו באמצעות מכשיר Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, בלגיה) תוך שימוש בהגדרות הבאות: מתח, 80 קילו וולט; זרם מקור, 100 מיקרומטר; אל, מסנן 0.5 מ"מ; גודל פיקסל, 9.76 מיקרומטר; ושלב סיבוב, 0.6◦. מספר פרמטרים של העצם הטראבקולרית, כולל צפיפות מינרלים של העצם (BMD), שבר נפח עצם (BV/TV), משטח עצם לכל נפח כולל (BS/TV), מספר טרבקולרי (Tb. N) ומרווח טרבקולרי (Tb. Sp. ) נמדדו באמצעות תוכנת CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). תמונות תלת מימדיות נוצרו באמצעות תוכנת CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). לאחר ניתוח מיקרו-CT, השוקה השמאלית סולקה בתמיסת EDTA של 14 אחוז והוטמעה בפרפין לצורך חיתוך. הדגימות נחתכו למקטעים של 5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום לפני ניסויי הצביעה של המטוקסילין ואאוזין (H&E) ו-TRAcP. החתכים המוכתמים נבדקו ותועדו באמצעות מיקרוסקופ Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, טוקיו, יפן). 2.5. ניתוח סרום ריכוזי הסידן (Ca) והזרחן (P) נקבעו בהתאם להוראות הערכה שתוכננה על ידי הנאנג'ינג

המכון הביו-הנדסי Jiancheng (נאנג'ינג, סין). רמות TRAcP{{0}}b ו-RANKL בסרום נותחו באמצעות ערכת TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, ווהאן, סין) וערכת RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., ווהאן, סין) , בהתאמה. 2.6. BMMs של בדיקת אוסטאוקלסטוגנזה במבחנה בודדו מהשוק והעצם של עכברי נקבות C57BL/6 6-בת שבוע. התאים המבודדים תורבו במדיום -MEM המכיל 25 ng/mL M-CSF, 10 אחוז FBS ו-1 אחוז פניצילין/סטרפטומיצין. כשהגיעו למפגש, ה-BMMs (1 × 104 תאים/באר) נזרעו ב96-צלחות באר וטופלו ב-CDP בנוכחות RANKL של 50 ng/mL. המדיום וה-CDP הוחלפו כל יומיים. לאחר 7 ימים, התאים נקבעו ב-4 אחוז פרפורמלדהיד והוצבעו על נוכחות עקבות. מספר האוסטאוקלסטים, המוגדרים כתאים חיוביים ל-TRAcP עם שלושה גרעינים או יותר, נספר ותועד באמצעות מיקרוסקופ אור. 2.7. בדיקת התפשטות תאים ה-BMMs (1 × 104 תאים/באר) נזרעו בצלחת 96-באר והודגרו למשך הלילה. לאחר מכן, התאים טופלו בריכוזים שונים של CDP (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ו-40 מיקרוגרם/מ"ל) במשך 48 שעות. מפגש התאים זוהה ונותח באמצעות IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, אן ארבור, MI, ארה"ב), מערכת הדמיה דינמית של תאים חיים ארוכי טווח בזמן אמת. 2.8. בדיקת ספיגת הידרוקסיאפטיט ה-BMMs (1 × 104 תאים/באר) נזרעו בצלחת מצופה הידרוקסיאפטיט, טופלו ב-CDP בריכוזים המצוינים (0, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל), ותופחו ב-MEM מלא המכיל 25 ng/ mL M-CSF ו-50 ng/mL RANKL. לאחר 7 ימים, התאים נשטפו בתמיסת אקונומיקה של 10 אחוזים כדי להסיר את מרכיבי התא. התמונות של אזורי ספיגת הידרוקסיאפטיט נלכדו באמצעות IncuCyte ZOOM® ונותחו באמצעות תוכנת ImageJ (NIH, Bethesda, MD, ארה"ב) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003). 2.9. בידוד RNA וניתוח PCR כמותי של שעתוק הפוך בזמן אמת (RT-qPCR) ה-BMMs (1 × 105 תאים/באר) נזרעו בצלחת 6-בבאר ועוררו עם RANKL ו-M-CSF בנוכחות של CDP בריכוזים שונים (0, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 5 ימים. RNA כולל בודד מהתאים או רקמת העצם של עכברים באמצעות ריאגנט TRIzol (Sigma Aldrich). DNA משלים סונתז מ-2 מיקרוגרם כולל של RNA באמצעות ערכת תמלול הפוך (TransGen Biotech, בייג'ינג, סין). תגובות RT-qPCR הוכנו באמצעות PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) וזוהו על ידי מערכת ABI 7500 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ארה"ב). פרמטרי הרכיבה עבור PCR נקבעו כדלקמן: 95 ◦C למשך 5 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של 95 ◦C למשך 15 שניות, ו-60 ◦C למשך 30 שניות. הפריימרים הספציפיים שבהם נעשה שימוש מוצגים בטבלה 1, והכמות של כל גן מטרה נורמלה ל-GAPDH (בקרה פנימית).

2.10. אנליזה של Western blot ה-BMMs (5 × 105 תאים/באר) נזרעו בצלחת 6-באר. עבור ניסויים קצרים, התאים הודגרו מראש עם הריכוזים השונים של CDP (0, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל) למשך שעה אחת, ולאחר מכן טופלו ב-5{{ 58}} ng/mL RANKL למשך 30 דקות. במשך זמן רב, התאים עוררו עם 50 ננוגרם/מ"ל RANKL בימים 3, 5 ו-7 בנוכחות CDP (0, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל). סך החלבונים חולצו באמצעות חיץ תמוגה RIPA (CWBIO). חלבונים הופרדו על ידי 10 אחוז SDS-PAGE והועברו לממברנות PVDF. הממברנות נחסמו עם 5 אחוז חלב דל שומן בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, הודגרו עם נוגדנים ראשוניים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן עם הנוגדנים המשניים המתאימים למשך 1.5 שעות. הממברנות פותחו באמצעות ריאגנטים ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, ארה"ב), ותמונות צולמו באמצעות Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, שנגחאי, סין). 2.11. זיהוי של טרנסלוקציה של NFATc1 באמצעות בדיקת אימונופלואורסצנטיות. ה-BMMs נזרעו על 12-משטחי כיסוי היטב, עוררו עם RANKL ו-M-CSF וטופלו ב-10 מיקרוגרם/מ"ל CDP למשך 5 ימים. התאים נקבעו עם 4 אחוז פרפורמלדהיד למשך 15 דקות, נשטפו שלוש פעמים עם PBS וחוללו עם 0.1 אחוז טריטון X-100 למשך 10 דקות. התאים עורבבו עם 10 אחוז סרום עיזים (CWBIO) והודגרו במשך שעתיים. לאחר מכן, התאים הודגרו עם הנוגדן הראשוני למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן עם נוגדן משני נגד עכברים Alexa Fluor 488 (Abcam, Cambridge, MA, ארה"ב) בחושך למשך שעה אחת. כיסויי הכיסוי נשטפו עם PBS, הותקנו ב-Prolong Gold Antifade Reagent עם 4′, 6-diamidino-2-פניל-in-dole (DAPI) (Solar), ונבדקו באמצעות Zeiss LSM 800 עם מיקרוסקופ קונפוקאלי של Airyscan ( Carl Zeiss, Oberkochen, גרמניה). 2.12. ניתוח סטטיסטי כל נתוני הניסוי נותחו באמצעות תוכנה סטטיסטית SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, ארה"ב). הנתונים עבור מחקרים בבעלי חיים ותאים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM וממוצע ± SD, בהתאמה. התוצאות משתמשות בניתוח חד-כיווני של שונות או במבחן t של הסטודנט. ערכים של p < 0.05="" נחשבו="" מובהקים="" סטטיסטית.="" 3.="" תוצאות="" 3.1.="" cdp="" מונע="" אובדן="" עצם="" המושרה="" על="" ידי="" ovx="" in="" vivo="" השתמשנו="" במודל="" עכבר="" אוסטאופורוזיס="" המושרה="" על="" ידי="" ovx="" כדי="" לחקור="" את="" ההשפעות="" של="" טיפול="" cdp="" על="" אוסטאופורוזיס="" in="" vivo.="" בהשוואה="" לקבוצת="" sham,="" משקל="" הגוף="" של="" עכברי="" ovx="" עלה="" באופן="" משמעותי="" ואילו="" אינדקס="" הרחם="" ירד,="" מה="" שמעיד="" על="" כך="" שמודל="" האוסטאופורוזיס="" נבנה="" בהצלחה="" (איור="" 1b="" ו-d).="" ניתוח="" מיקרו-ct="" של="" השוקה="" בקבוצת="" ovx="" הראה="" אובדן="" עצם="" נרחב.="" בהשוואה="" לקבוצת="" ovx,="" מספר="" טרבקולות="" העצמות="" גדל="" בקבוצת="" cdp-l,="" בעוד="" העלייה="" בקבוצות="" cdp-h="" ו-e2="" הייתה="" משמעותית="" יותר,="" והטרבקולות="" בשתי="" הקבוצות="" האחרונות="" הפכו="" גסות="" יותר="" והפער="" הלך="" וקטן="" (="" איור="" 1c).="" ניתוח="" כמותי="" אישר="" שמספר="" פרמטרים="" היסטומורפומטריים="" של="" העצם,="" כולל="" bmd,="" bv/tv,="" bs/tv="" ו-tb.="" ל-n="" היו="" ערכים="" מוגברים="" באופן="" משמעותי,="" ואילו="" ל-tb.="" sp="" הראה="" ערכים="" מופחתים="" בקבוצת="" cdp-h="" (איור="" 1e="" ו-f).="" הבדיקה="" הפתולוגית="" שלו="" באמצעות="" צביעת="" h&e="" העלתה="" שמספר="" הטראבקולות="" של="" העצם="" בקבוצות="" cdp-h="" ו-e2="" היה="" גבוה="" משמעותית="" מזה="" בקבוצת="" ovx="" בעוד="" שלא="" היה="" שיפור="" משמעותי="" בקבוצת="" cdp-l="" (איור="" 1g).="" בנוסף,="" צביעת="" tracp="" הראתה="" שמספר="" האוסטאוקלסטים="" עלה="" באופן="" ניכר="" בקבוצת="" ovx="" אך="" ירד="" בקבוצות="" cdp-h="" ו-e2="" (איור="" 1h).="" קבוצות="" cdp-l,="" cdp-h="" ו-e2="" הראו="" עיכבו="" את="" העלייה="" הנגרמת="" על="" ידי="" ovx="" של="" תכולת="" p="" אך="" הגדילו="" את="" תכולת="" ca="" בסרום="" הדם.="" סמני="" ספיגת="" העצם,="" rankl="" ו-tracp-5b="" הראו="" מגמת="" ירידה="">

הקבוצה ללא הבדל סטטיסטי, בעוד שהם ירדו באופן מובהק בקבוצת CDP-H (איור 1I). יתר על כן, בדקנו את ההשפעה של CDP על ביטוי גנים של סמן אוסטאוקלסט ברקמות העצם על ידי RT-qPCR. רמות ה-mRNA של NFATc1, Acp5, Mmp9 ו-CTSK בקבוצת OVX היו גבוהות משמעותית מאלו בקבוצת Sham. קבוצות CDP-H הראו ירידה ברמת ה-mRNA של NFATc1, Acp5 ו-CTSK פי 1.74-, 1.70- ו-2.{14}}, בהשוואה לקבוצת OVX. (איור 1J). 3.2. CDP מדכא אוסטאוקלסטוגנזה המושרה על ידי RANKL במבחנה עקבנו אחר התפשטות התאים של BMMs שטופלו ב-CDP באמצעות מנתח דינמי דינמי של תאים חיים לטווח ארוך. בהשוואה לקבוצת הביקורת, מפגש התאים בקבוצות שטופלו ב-CDP לא השתנה במינון<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="" cdp="" on="" ranklinduced="" osteoclastogenesis,="" bmms="" were="" stimulated="" with="" rankl="" and="" mcsf="" in="" the="" presence="" of="" cdp="" for="" 7="" days.="" tracp,="" a="" characteristic="" enzyme="" of="" osteoclasts,="" is="" considered="" as="" an="" indicator="" of="" osteoclast="" function="" (minkin,="" 1982).="" tracp="" staining="" showed="" that="" the="" osteoclasts="" treated="" with="">1.25 מיקרוגרם/מ"ל CDP הראה גודל ומספר מופחתים באופן משמעותי (איור 2B ו-C). תוצאות אלו הראו ש-CDP עיכב ביעילות את האוסטאוקלסטוגנזה הצפויה של RANKL מבלי להשפיע על כדאיות התא. 3.3. CDP מעכב פעילות ספיגה אוסטאוקלסטית המושרה על ידי RANKL וביטוי גנים ספציפיים לאוסטאוקלסטים. עוד קבענו את ההשפעות של טיפול ב-CDP על פעילות ספיגת העצם של אוסטאוקלסטים באמצעות לוחות מצופות הידרוקסיאפטיט. ספיגת עצם היא התפקיד והסטנדרט העיקרי למדידת הפעילות והיכולת של אוסטאוקלסטים (Novack & Faccio, 2011). התוצאות הראו ש-CDP יכול להפחית באופן משמעותי את אזור ספיגת העצם של אוסטאוקלסטים באופן תלוי מינון, מה שמצביע על כך ש-CDP עיכב את פעילות ספיגת העצם המושרה על ידי RANKL (איור 3A ו-B). בפרט, אזור ספיגת העצם האוסטאוקלסטית ירד לכ-6.3 אחוזים לאחר טיפול ב-10 מיקרוגרם/מ"ל CDP. כדי להבין טוב יותר את ההפרעה של CDP על אוסטאוקלסטוגנזה, מדדנו את רמות השעתוק של גנים הקשורים לאוסטאוקלסט. ללא טיפול ב-CDP, אינדוקציה עם RANKL קידמה את הביטוי של הגנים NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 ו-Mmp9. להיפך, היישום הנלווה של CDP ו-RANKL הוריד משמעותית את חמשת הגנים הללו (איור 3C ו-D).

3.4. CDP מעכב RANKL-Induced Activation NFATc1 צביעת TRAcP גילתה שטיפול CDP הפחית משמעותית את העלייה הצפויה במספר האוסטאוקלסטים הבוגרים לאחר גירוי RANKL למשך 3-7 ימים (איור 4A ו-B). יתר על כן, חקרנו האם טיפול ב-CDP יכול לפגוע ביעילות בהבחנה בין אוסטאוקלסטים על ידי עיכוב ביטוי NFATc1. התוצאות הראו כי NFATc1 בא לידי ביטוי גבוה לאחר גירוי RANKL במשך 5 ימים, אשר עוכב באופן משמעותי לאחר טיפול ב-CDP (איור 4C ו-D). בנוסף, טיפול ב-CDP דיכא את רמות הביטוי של CTSK, חלבון הנדרש להיווצרות ותפקוד אוסטאוקלסטים תקינים (Bossard et al., 1996) (איור 4E ו-F). בחרנו ייצוג נקודת זמן של גירוי RANKL למשך 5 ימים כדי לחקור עוד יותר את ההשפעה של טיפול 10 מיקרוגרם/מ"ל CDP על טרנסלוקציה של NFATc1. כצפוי, טיפול ב-CDP עיכב באופן משמעותי את הטרנסלוקציה הגרעינית של NFATc1 המושרה על ידי RANKL (איור 4G ו-H).

איור 4. CDP מדכא את הפעלת NFATc1 המושרה על ידי RANKL. (א) ה-BMMs נזרעו בצלחת 6-באר ועוררו עם RANKL ו-M-CSF בנוכחות CDP (0, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל) עבור הימים המצוינים. תמונות מייצגות המציגות תאים מרובי גרעינים חיוביים ל-TRAcP. הגדלה, ×100. פסי קנה מידה {{10}} מיקרומטר. (ב) כימות של תאים מרובי גרעינים חיוביים ל-TRAcP (גרעינים גדולים מ-3 או שווה ל-3). (CF) אנליזה של Western blot של ביטויי חלבון NFATc1 ו-CTSK, ב-BMMs, מגורה עם M CSF ו-RANKL למשך 3-7 ימים בנוכחות CDP. (ז) ה-BMMs טופלו ב-10 ug/mL CDP ועוררו על ידי M-CSF ו-RANKL למשך 5 ימים, ולאחר מכן הוצבעו ב-NFATc1 (ירוק) ו-DAPI (כחול) ונצפו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי. הגדלה, ×200. פסי קנה מידה=20 מיקרומטר. (ח) עוצמת הקרינה נותחה באמצעות Image-Pro Plus. הערכים מבוטאים כאמצעים ± SD (n=3). *p < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" לעומת="" קבוצת="" ביקורת;="" #p="">< 0.05,="" ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001="" לעומת="" קבוצת="" rankl.="" 3.5.="" cdp="" מעכב="" הפעלה="" המושרה="" על="" ידי="" rankl="" של="" נתיבי="" איתות="" nf-kb="" ו-mapks="" כדי="" להבהיר="" את="" המנגנונים="" המעורבים="" בעיכוב="" המושרה="" על="" ידי="" cdp="" של="" התמיינות="" אוסטאוקלסטים,="" בחנו="" את="" ההשפעה="" של="" טיפול="" ב-cdp="" על="" מסלולי="" nf-kb="" ו-mapks.="" התוצאות="" גילו="" שלטיפול="" ב-cdp="" היו="" השפעות="" מדכאות="" על="" פירוק="" iκb-="" וזרחון="" p65="" באופן="" תלוי="" מינון="" (איור="" 5a="" ו-b).="" זרחון="" של="" שלושה="" מבני="" משפחת="" mapk,="" במיוחד="" קינאז="" מווסת="" אות="" חוץ-תאי="" (erk),="" c-jun="" n-terminal="" kinase="" (jnk)="" ו-p38="" היו="">

דִיוּן

אוסטאופורוזיס היא מחלת עצמות נפוצה וניוונית. כיום, ישנן תרופות סינתזה כימיות רבות המשמשות בטיפולים קליניים לאוסטאופורוזיס, כגון אסטרוגן וביספוספונט. עם זאת, שימוש ארוך טווח בתרופות אלו יחליש בהדרגה את היעילות הקלינית ואף יגרום לתופעות לוואי חמורות רבות, כולל סיכון מוגבר לסרטן השחלות, השד וסרטן רירית הרחם ואוסטאונקרוזיס של הלסת (ברל, 2003 ; Khan et al., 2009; Lacey et al., 2002). בעוד במחקר זה, בחרנו ב-CDP, רכיב יעיל המופק מ-CD, כסוכן הטיפולי והדגמנו של-CDP השפעה מגנה מפני אובדן עצם בעכברי OVX ועיכבה היווצרות ותפקוד אוסטאוקלסטים המושרים על ידי RANKL. בינתיים, על פי תיאוריית הרפואה הסינית המסורתית "הכליות שולטת בעצמות", אובדן עצם מיוחס למחסור בכליות. כמזון רפואי מחזק כליות, התקליטור הוכח כמספק טיפול יעיל לאוסטאופורוזיס (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li, & Zhang, 2016). לפיכך, CDP המופק מעשב טבעי זה הוא אפשרות תרופה טובה ובטוחה יותר. נכון לעכשיו, מודל העכבר OVX הוא מודל קלאסי של אובדן עצם לאחר גיל המעבר בנשים, חוקר את הסיבות לאובדן עצם וביצוע התערבות (Wehrle et al., 2015). בהתאם לכך, ביצענו כריתת שחלות דו-צדדית בעכברים נקבות C57BL/6J כדי לבנות מודל אוסטאופורוזיס. במחקרים קודמים, מינוני ה-CDP שניתנו לבעלי חיים היו 50-200 מ"ג/ק"ג (מינון נמוך) ו-1800 מ"ג/ק"ג (מינון גבוה) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). כאן, המינון הגבוה של CDP בעכברים היה 600 מ"ג/ק"ג, שהתבסס על המינון הקליני הגבוה של 30 גרם CD במרתח; לפיכך, זה דומה לפרקטיקה הקלינית הנוכחית. במחקר זה, טיפול ב-CDP עיכב באופן משמעותי עלייה במשקל גוף הנגרמת על ידי OVX, שהיא תופעה שכיחה שנצפתה בעכברי OVX (Davis et al., 2019). על ידי שימוש בסריקת מיקרו-CT ושחזור תלת מימד, מצאנו ש-OVX הוביל להפחתה ניכרת ב-BMD, BV/TV, BS/TV ו-Tb.N, ולעלייה ב-Tb.Sp, בעוד שטיפול ב-CDP הפך את כל השינויים הללו. . בפרט, בהשוואה לתרופה החיובית, CDP יכול לשפר משמעותית את ה-BMD של עכברי OVX, שהוא סמן חשוב לאיכות העצם המשמש לשקף את מידת האוסטאופורוזיס (Fuggle et al., 2019), מה שמעיד על כך של-CDP יש יתרון על התרופה החיובית בשיפור BMD. יתר על כן, התוצאות ההיסטולוגיות הצביעו על כך שטיפול ב-CDP יכול להפחית את הכמות המוגברת של אוסטאוקלסטים חיוביים ל-TRAcP המושרה על ידי OVX. תוצאות אלו מצביעות על כך שמתן CDP הפחית ביעילות את אובדן העצם באוסטיאופורוזיס המושרה על ידי OVX, אולי על ידי עיכוב היווצרות אוסטאוקלסטים. בהתאם לתוצאות שלעיל, מצאנו ש-CDP מעכב היווצרות ותפקוד אוסטאוקלסטיים המושרים על ידי CDP, בעוד של-CDP הייתה השפעה מועטה על שגשוג תאי מבשר אוסטאוקלסטים המושרה על ידי M-CSF בניסויים שלנו במבחנה. הקישור של RANKL ו-RANK יכול להוביל לגיוס של TRAF6 ולהפעלה שלאחר מכן של מספר מסלולי איתות במורד הזרם, כגון NF-κB ו-MAPKs (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). מסלול האיתות NF-κB ממלא תפקיד חשוב בוויסות ההתמיינות של אוסטאוקלסטים, והשתקה של גנים המקודדים לחלבוני מפתח במסלול זה עלולה להוביל להתפתחות עצם לא תקינה (Leibbrandt & Penninger, 2008). זה ידוע היטב ש-NF-κB קיים בציטופלזמה של תאים לא מגורים בקומפלקס עם IκB אך נכנס במהירות לגרעין לאחר גירוי RANKL (Boyle et al., 2003). לאחר מכן, ה-IκB המשוחרר מתפורר במהירות, בעוד ש-NF-κB מפעיל שעתוק גנים ספציפי, וכתוצאה מכך מקדם התמיינות אוסטאוקלסטית, הבשלה ואפופטוזיס (Abdelmagid et al., 2015). במחקר זה, התוצאות הראו שטיפול CDP דיכא את ההפעלה המושרה על ידי RANKL של מסלול האיתות NF-κB, כפי שהוכח על ידי עיכוב הפירוק של IκB וזרחון של p65 באופן תלוי מינון, אשר עשוי להיות כרוך בהשפעה האנטי-אוסטאוקלסטוגני שלו. . בנוסף, מסלול האיתות של MAPKs, כולל ERK, JNK ו-p38, מעורבים באופן הדוק באוסטאוקלסטוגנזה המושרה על ידי RANKL (Li et al., 2002). יתר על כן, המעכבים הדומיננטיים של p38 ו-JNK יכולים למנוע אוסטאוקלסטוגנזיס המושרה על ידי RANKL (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), בעוד ל-ERK יש תפקיד משמעותי בהישרדות אוסטאוקלסטים (Miyazaki et al., 2000). זה ידוע היטב כי RANKL מפעיל את מסלול האותות של MAPKs על ידי הגברת הזרחון של ERK, JNK ו-p38 (Mizukami et al., 2002). במחקר שלנו, הדגמנו ש-CDP דיכא זרחון המושרה על ידי RANKL של חלבוני מפתח במסלול האיתות של MAPKs. יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שעיכוב ההפעלה של מסלולי האיתות NF-KB ו-MAPKs תורם להשפעה המעכבת של CDP נגד אוסטאוקלסטוגנזה. הפעלה של מסלולי האיתות של NF-κB ו-MAPK מקדמת את הביטוי של מספר גורמי שעתוק מרכזיים, כגון oncogene fos תאי, חלבון אקטיבטור 1 ו-NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, חבר חשוב במשפחת NFAT, מעורב בהתמיינות אוסטאוקלסטית סופנית כמווסת תעתיק ראשי (Asagiri et al., 2005). דווח שתאי גזע עובריים חסרי NFATc1- אינם יכולים להתמיין לאוסטאוקלסטים תחת גירוי של RANKL והביטוי החוץ רחמי של NFATc1 גורם לתאי מבשר לעבור התמיינות עוקפת איתות RANKL, מה שמרמז של-NFATc1 יש תפקיד קריטי ב התמיינות אוסטאוקלסטית (Takayanagi et al., 2002). תוצאות המחקר שלנו הראו את ההשפעה המדכאת של CDP על ביטוי NFATc1 והחלבון הבא שלו CTSK. באופן מעניין, ראינו שרמת ביטוי החלבון של NFATc1 תחילה עלתה ואז ירדה, והגיעה לרמה הגבוהה ביותר ביום החמישי לאחר גירוי RANKL. זה היה עקבי עם התוצאות של Baek et al. (2014), שצפה ב-M-CSF שגרם לפירוק NFATc1 במהלך אוסטאוקלסטוגנזה בשלב מאוחר באמצעות Ubiquitination המושרה על ידי Cbl של NFATc1 באופן תלוי Src kinase. תוצאות בדיקת אימונופלואורסצנטי תמכו באופן עקבי בהשפעה המעכבת של CDP על הפעלת תעתוק NFATc1. יתר על כן, גנים ספציפיים לאוסטאוקלסטים, כולל CTSK, Acp5, Mmp9 ו-Atp6v0d2, כולם מוסדרים על ידי NFATc1 ישירות (Y. Kim et al., 2005), דוכאו על ידי CDP. ממצאים אלה ממחישים שה-NFATc1 הוא יעד להשפעה המעכבת של CDP על מסלולי האיתות NF-KB ו-MAPKs.

סיכום

לסיכום, חילצנו וטיהרו את הפוליסכריד הפעיל מ-CD והדגמנו ש-CDP הפגין השפעה מגנה על אוסטאופורוזיס הנגרמת על ידי OVX ושיפור אובדן עצם על ידי דיכוי פעילות ותפקוד האוסטאוקלסטים. יתר על כן, CDP יכול לעכב התמיינות ותפקוד אוסטאוקלסטים המושרה על ידי RANKL על ידי הפרעה למסלולי האיתות של NF-KB ו-MAPKs וכתוצאה מכך להשפיע על הפעלת NFATc1 במורד הזרם. לסיכום, הממצאים שלנו מספקים את הבסיס להרחבה ויישום של CDP בטיפול באוסטיאופורוזיס.

מאמר זה מגיע מרשימות תוכן הזמינות בדף הבית של כתב העת ScienceDirect Journal of Functional Foods: www.elsevier.com/locate/jff