Isoxazoles על בסיס פלבונואיד טריפלואורומתיל כסוכרים אנטי-סוכרתיים ונוגדי השמנת יתר: סינתזה, פעילות מעכבת עמילאז במבחנה, עגינה מולקולרית וניתוח קשרי מבנה-פעילות

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלדעת יותר

פייסל ק' אלג'תמי 1,*, איליס סעידי 2, האני נאסר עבד אלחמיד 3, מוחמד ר' עלאמין 1, באביקר י' עבדולכאיר 1, אמאני חרודה 4 והיכם בן ג'נט 2,*

תַקצִיר:סוכרת היא בעיה בריאותית מרכזית ברחבי העולם. ניהול עיכול הפחמימות מספק טיפול חלופי.פלבנואידיםמהווים את הקבוצה הגדולה ביותר שלפוליפנוליתרכובות, המיוצרות על ידי צמחים הנצרכים באופן נרחב כמזון ו/או בשימוש למטרות טיפוליות. ככזה, איזוקסאזולים משכו את תשומת לבם של כימאים רפואיים בשל הפעילות הביולוגית הניכרת שלהם. לפיכך, המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה לגלות מולקולות היברידיות חדשות בעלות תכונות של פלבנואידים וגם של איזוקסאזולים על מנת לשלוט על עיכול הפחמימות. יתרה מכך, קבוצת הטריפלואורומתיל היא ישות מפתח בפיתוח תרופות, בשל הליפופיליות החזקה והיציבות המטבולית שלה. לכן, העבודה הנוכחית מתארת ​​את העיבוי של פלבונול טריפלואורומתילציה שסונתז בעבר עם תחמוצות ניטריל אריל שונות, המעניק 13 מולקולות היברידיות המצוינות כאיזוקסאזולים מבוססי פלבונואידים טריפלואורומתילציה. המבנים של התרכובות שהתקבלו נגזרו מניתוח 1H NMR, 13C NMR ו-HRMS. 15 התרכובות החדשות שסונתזו עיכבו את הפעילות של עמילאז ביעילות שנעה בין 64.5 ± 0.7 אחוזים ל-94.7 ± 1.2 אחוזים בריכוז של 50 µM, ועם ערכי IC50 של 12.6 ± 0.2 µM–27.6 ± 1.1 µM. התרכובות היעילות ביותר מבחינת יעילות ועוצמה היו 3b, 3h, 3j ו-3m. בין הטריפלואורו-מתילציה החדשהעל בסיס פלבנואידיםisoxazoles, התרכובת 3b הייתה המעכב היעיל ביותר של פעילות עמילאז (PI=94.7 ± 1.2 אחוז ב-50 µM), עם עוצמה (IC50=12.6 ± { {13}}.2 µM) דומה לזה של אקרבוז הביקורת החיובית (IC50=12.4 ± 0.1 µM). המחקר של קשר המבנה-פעילות המבוסס על ניתוח העגינה המולקולרית הראה אנרגיית קישור נמוכה, אופן אינטראקציה נכון בכיס הפעיל של אנזים המטרה ויכולת לקיים אינטראקציה עם שאריות המפתח של ביקוע גליקוזידי (GLU{{16 }} ו-ASP-206), המסבירים את ההשפעות המעכבות של -עמילאז שנוצרו על ידי מספר נגזרות.

מילות מפתח:-עיכוב עמילאז; נוגד סוכרת; נגד השמנת יתר; cycloaddition; פלבנואידים; איזוקסאזולים על בסיס פלבונואידים טריפלואורומתילציה; עגינה מולקולרית; ניתוח SAR

לחץ כאן כדי לדעת יותר

1. הקדמה

הַשׁמָנָהוסוכרת מהווים בעיות בריאות אנושיות עיקריות ברחבי העולם [1,2]. אכן, סוכרת מאופיינת בעיקר בסוכר לא מבוקר בדם. עם זאת, סוכרת מסוג 1 נובעת מהפרעה בהפרשת האינסולין (תלוי באינסולין), בעוד שסוג 2 נובע בדרך כלל מתנגודת לאינסולין (שינויים במבנה הקולטן בתאי המטרה, המובילים להפחתה בזיקה להורמון-קולטן), שיבוש בהפרשת אינסולין, או שניהם [3,4]. באופן בלתי נמנע, עיכוב הפירוק של פוליסכרידים לחד סוכרים המתאימים לספיגה בתאים מיישם אסטרטגיות בסיסיות לשליטה בסוכרת ולסייע בניהול השמנת יתר [3]. האנזים -עמילאז (EC.3.2.1.1) הוא אנזים עיכול המיידר -1,4-קשרים גליקוזידיים של פחמימות, כגון עמילנים [5]. לכן, עיכוב עמילאז תורם בדרך זו או אחרת לשליטה בעיכול הפחמימות [6,7]; לפיכך, הוא מהווה מסלול חלקי לוויסות הפעילות האנזימטית של -עמילאז; לפיכך, זהו טיפול אידיאלי לוויסות השמנת יתר וסוכרת, כמו גם הסיבוכים הקשורים אליהם [4]. רוב מעכבי העמילאז המסחריים - כגון אקרבוז, מיליטול, פאזולמין ו-voglibose - נקשרו לתופעות לוואי במעיים, כגון גזים, כאבי בטן, שלשולים, אי ספיקת כבד, אלרגיות עוריות חמורות ודלקת מעיים של ציסטואיד פנאומטוזיס [6] ]. מעכבי העמילאז הטובים ביותר הם מה שנקרא מעכבים תחרותיים, המעכבים את האנזים באופן בלתי הפיך. מעכב תחרותי נקשר לאתר הפעיל של אנזים היעד ובכך מונע מהסובסטרט להיקשר. לכן, בעיכוב תחרותי, המעכב מתחרה עם המצע על האתר הפעיל. מצד שני, בעיכוב בלתי הפיך, המעכב מתנתק באיטיות רבה מאנזים המטרה, מכיוון שהוא נקשר בחוזקה לאנזים. בדרך כלל, מעכבים בלתי הפיכים נקשרים באופן קוולנטי לאתר הפעיל של האנזים על ידי שינוי השאריות או הקבוצות הפונקציונליות הנחוצות לפעילות אנזימטית, כך שהאנזים מעוכב באופן בלתי הפיך. לעיכוב טוב של עיכול פחמימות - שיכול לסייע בשליטה בהשמנה, ואפילו סוכרת מסוג 2 - אנו זקוקים לחומר לא סלקטיבי המסוגל לעכב את רוב אנזימי העיכול של סוכרים, כלומר עמילאז רוק, עמילאז בלבלב וגלוקוזידאז. [8,9]. מחקרים קודמים על פלבנואידים מסונתזים למחצה מצאו שנגזרות פלבנואידים על בסיס איזוקסזול הראו השפעות אנטי-סוכרתיות משמעותיות על ידי הגברת ספיגת הגלוקוז בתאי HepG2 עמידים לאינסולין [10]. יתר על כן, פלבנואידים הם הקבוצה הגדולה ביותר של מטבוליטים משניים פוליפנוליים, הנמצאים בדרך כלל בצמחים. מטבוליטים משניים אלו אחראים לצבעים האטרקטיביים של חסידים, פירות ועלים [11]. מבחינה מבנית, לפלבונואידים יש שלד פחמן C15 המורכב משתי טבעות ארומטיות (A) ו-(B), המקושרות זו לזו באמצעות שרשרת C3 היוצרות את ההטרוציקל (C) [12]. מאפיינים ביולוגיים רבים דווחו לסוג זה של תרכובות פוליפנוליות, כגון עיכוב עמילאז [7,13-15], אנטי-סוכרתי [16,17], אנטי סרטני [18,19] ונוגד חמצוןהשפעות [20], ופעילויות ביולוגיות אחרות [21-25]. עם זאת, פרופיל ביולוגי עשיר זה הניע מספר צוותי מחקר כימיים לסנתז פלבנואידים עם חלקים ותחליפים מיוחדים כדי למקד לפעילויות ביולוגיות מסוימות [26-30]. מצד שני, איזוקסזול הוא הטרומחזור בן חמישה איברים בעל חשיבות רבה בכימיה רפואית. יתר על כן, איזוקסאזולים המופיעים באופן טבעי - כגון חומצה איבוטנית (הזויה, נוירוטוקסין) ומוסצימול (אנטגוניסט הזיה, אנטגוניסט לקולטן GABAA) [31-34] - משכו תשומת לב גוברת מצד כימאים ופרמקולוגים בשל תכונותיהם הביולוגיות והפרמקולוגיות החזקות. יתר על כן, נגזרות איזוקסזול מתגלות כבעלות קשת רחבה של תכונות ביולוגיות, כגון פעילויות נוגדות סוכרת, משככי כאבים, אנטי דלקתיות, נוגדות HIV ואנטי סרטן [10,35-40]. טבעת האיזוקסזול הייתה בשימוש נרחב כאבן בניין מפתח לתרופות כגון זוניסמיד (נוגד פרכוסים) [41], valdecoxib, parecoxib (מעכבי COX-2) [42], ולפלונומיד (אנטיראומטי) [43]. בעשורים האחרונים, קבוצת הטריפלואורומתיל זכתה לביקוש הולך וגובר לפיתוח תרכובות ביו-אקטיביות, בשל אופייה החזק של נסיגת האלקטרונים, יציבותה המטבולית ואופייה הליפופילי, הנחשבים לתכונות פיסיקו-כימיות חשובות של מולקולות ביו-אקטיביות [44]. נמצא שהחלק המופלר הזה חיוני בתרופות חשובות רבות, כולל פלופנזין (אנטי פסיכוטי, אנטי סרטני) [45], לפלונומיד (אנטיראומטי) [43], celecoxib (מעכב סלקטיבי COX-2) [46], פלואוקסטין (נוגד דיכאון) [47], ופלואזין (קוטל פטריות) [48]. סקירה אחת של הספרות מזכירה ש-trifluoromethylation 5-חומצה אמינו-ניקוטין דווחה כמציגה פעילות מבטיחה של -עמילאז [49]. בנוסף, נמצאו מולקולות פיראזול-תיאזול ההיברידיות המוכלרות כמעכבות טובות של האנזים -עמילאז [50], מה שמעיד גם על חשיבותו של אטום הכלור במבנים מעכבי-עמילאז. נתוני הספרות הנ"ל המדווחים על המאפיינים הפיזיקליים הכימיים החשובים של קבוצת הטריפלואורומתיל - ותרומתה, לצד פלבנואידים ואיסוקסזולים, לעיכוב עמילאז ולהפעלת פעילויות אנטי-סוכרתיות - עודדו אותנו להכין סדרה חדשה של מולקולות היברידיות, שבהן בוצע פלבונואיד טריפלואורומתילציה. הקשורים לסדרה של aryl isoxazoles דרך מקשר מתילן, ולהעריך את כוחם המעכב של האנזים -עמילאז. קשר המבנה-פעילות (SAR) נחקר ואושר באמצעות ניתוח עגינה מולקולרית.

Cistanche לשיפור חסינות

2. תוצאות ודיון

2.1. כימיה הכנת פלבונול טריפלואורו-מתילציה (1) - שסונתז בעבר במעבדה שלנו והציגה פוטנציאל ציטוטוקסי מעניין - דווחה על פי הנוהל שאומץ על ידי Znati וחב'. (2019) [30]. 5-כלורו-2-הידרוקסי אצטופנון עובה עם 4-(טריפלואורומתיל)בנזלדהיד תחת ריפלוקס של מתנול ובנוכחות נתרן הידרוקסיד במשך 3 שעות כדי לייצר 5-כלורו{{10 }}(טריפלואורומתיל)-2-הידרוקסי צ'לקון; לאחר מכן, הטבעת הפיראנית (C) עברה מחזור והפחמן C-3 חומצן על ידי הוספה של (H2O2, NaOH) למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר (סכימה 1). מולקולה 1 התקבלה עם תשואה טובה (79 אחוזים), לאחר משקעים במי קרח. סכימה 1. מסלול סינתטי של פלבונול טריפלואורומתילציה (1). המבנה של פלבנול (1) אושר באמצעות ניתוח ספקטרוסקופי ובהשוואה לנתוני ספרות [30]. ה-1,3-ציקלואדיציה דו-קוטבית היא תגובה כימית בין 1,3-דיפול ודיפולארופיל ליצירת טבעת בעלת חמישה איברים. לפיכך, 1,3-ציקלואדיציה דיפולרית נחשבת לדרך החשובה ביותר לסינתזה של מגוון רחב של איזוקסאזולים. יתר על כן, הסינתזה האזורית של איזוקסאזולים המזרזים על ידי Cu(I) תחת קרינת מיקרוגל מבוססת על ציקלו-הוספה [3 פלוס 2] בין אלקינים סופניים (דיפולארופילים) ותחמוצות אריל ניטריל (דיפולים), המספקת אך ורק 3,5-לא חלופיות. אזוראיזומרים [39,51]. הגישה שלנו להתמקד ב-trifluoromethylation flavonoid isoxazoles (3a–m), החלה ראשית בהכנת הדיפולארופיל (2) באמצעות פרופרגילציה של קבוצת ההידרוקסיל בעמדה C-3 של הפלבונול (1) ב-DMF נטול מים עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר, בנוכחות K2CO3, כפי שמוצג בשיטה 2. הדיפולארופיל (2) הוכן עם תשואה מעולה (94 אחוז). סכימה 2. מסלול סינתטי של הדיפולארופיל (2).

מבנה מתחם 2 הוקם על פי הנתונים הספקטרליים שלו. ואכן, בנוסף לאותות התואמים לפרוטונים ולפחמנים שהוכנסו על ידי הפלבונול (1), התגלו אותות חדשים של קבוצת הפרופרגיל בספקטרום 1H ו-13C NMR. יתר על כן, ספקטרום 1H NMR של הדיפולארופיל (2), מתועד ב-CDCl3 ב-300 מגה-הרץ, הראה כפולה ב-δH 5.06 (2H, d, J=2.4 Hz) המקביל לפרוטון המתילן H{{13 }}" ושלישייה ב-δH 2.36 (1H, t, J=2.4 הרץ) המיוחסת לפרוטון של קבוצת האתיניל (H-3"). ספקטרום 13C NMR אישר את החדרת קבוצת הפרופרגיל על ידי תצפית של אותות חדשים ב-δC 78.4, 76.9 ו-59.6, המיוחסים ל-C-2", C-3", ו-C{{29} }", בהתאמה. Hydroximyl chlorides a–m הם המבשרים העיקריים לדורות באתרו של תחמוצות aryl nitrile - ריאגנטים המשתתפים בתגובה של 1,3- cycloaddition דו-קוטבי לסינתזה של isoxazoles. הפרקורסורים (a -m) הופקו מהאלדהידים המתאימים לפי הנוהל הכללי המתואר על ידי Himo וחב' (2005) [51]. ההידרוקסיל כלורידים הרצויים (a–m) התקבלו עם תפוקות טובות, שנעות בין 80 ל-98 אחוזים (טבלה 1). לפיכך, תחמוצות האריל ניטריל המקבילות נוצרו באתרן על ידי דה-הידרו-הלוגניציה של ההידרוקסיל כלורידים המקבילים תוך שימוש בטריאתילאמין כבסיס. טבלה 1. מבנים ותשואות של הידרוקסיל כלורידים (a–m) ואיזוקסאזולים מבוססי פלבונואידים טריפלואורומתילציה (3a) -M).

תגובת הציקלואדיציה הדו-קוטבית 1,3- יושמה בגישה אזורית ספציפית תוך שימוש באלקין הטרמינל (2) וההידרוקסיל כלורידים השונים (a–m) שהוחלפו באופן שונה (שימה 3). התוצאות שהתקבלו מפורטות בטבלה 1. סכימה 3. מסלול סינתטי של ה-trifluoromethylation flavonoid isoxazoles 3a–m. כל התגובות נערכו תחת הקרנת מיקרוגל (250 W) ב-DMF בנוכחות טריאתילאמין ויוד קופרוס (CuI) למשך 5 דקות. התוצרים בודדו מתערובת התגובה על ידי טיהור פשוט על עמודת סיליקה ג'ל. ה-3,{{10}}האיזוקסאזולים הבלתי-מוחלפים החדשים שהוכנו לאחרונה (3a–m) התקבלו בתשואות שנעו בין 73 ל-96 אחוזים (טבלה 1). המבנים של האיזוקסאזולים (3a–m) המבוססים על טריפלואורו-מתילציה מסונתזים (טבלה 1) נקבעו באמצעות 1H, 13C NMR ו-DEPT 135. ספקטרום 1H NMR של תרכובות אלו הראו סינגל מהדהד ב-δH 6.3{{68 }}–6.60 המיוחסים לפרוטון המתין H-4" של טבעת האיזוקסזול, סינגל נוסף ב-δH 5.35–5.45 המיוחס לפרוטון המתילן H-6", ואותות אחרים ב אזור הפרוטונים הארומטי המתייחס לפרוטונים המוכנסים על ידי קבוצת האריל. יתר על כן, מבנים אלו אושרו על ידי ספקטרום 13C NMR ו-DEPT 135 שלהם, המציגים את כל אותות הפחמן הצפויים - במיוחד אלו הארומטיים שהוכנסו על ידי ההידרוקסיל כלורידים המשומשים, כמו גם הפחמן של המתין C-4" של טבעת האיזוקסזול מהדהדת ב-δC 1{{9{{1{{105}}0}}}}2.5–103.0, וכן זה שהאות שלו הפוך בספקטרום DEPT 135, מהדהד ב-δC 63.5-63.9, שניתן לייחס למתילן C-6". 2.2. הערכה של עיכוב-עמילאז כדי לשלוט בפעילות האנזים, עיכוב הוא אחד האמצעים הטיפוליים המוצלחים ביותר. לכן, עיכוב האנזים -עמילאז מהווה מסלול חלקי לניהול סוכרת ושליטה במשקל, על ידי פגיעה בעיכול הפחמימות. עד כה, תרופות כגון acarbose היוו חלק מארסנל התרופות המשמשות לטיפול ב-DM והשמנת יתר. עם זאת, אקרבוז אינו משמש כמונותרפיה, בגלל יעילותו ותופעות הלוואי; במקום זאת, אקרבוז משמש כטיפול נוסף ומשמש לעתים קרובות מאוד בשילוב עם תרופות היפוגליקמיות אחרות. יחד עם זה, תרופה זו משמשת בדרך כלל כתרכובת סטנדרטית במחקר של עיכוב עמילאז. במחקר זה, 15 התרכובות המסונתזות (1, 2 ו-3a–m) הוערכו עבור פעילות מעכבת -עמילאז שלהן. התוצאות באו לידי ביטוי בפרמטרים של עוצמה (IC50 ± SEM µM) ויעילות (PI ב-50 µM), והן מובאות בטבלה 2. לפי התוצאות, המולקולות המסונתזות (1, 2, ו-3a–m) בעלי פעילות אנטי-- -אמילאז משמעותית (p פחות או שווה ל-0.05), עם יעילות הנעה בין 64.5 ± {{177} }.7 עד 94.7 ± 1.2 אחוזים בריכוז של 50 µM, ועוצמה של ערכי IC5{{2{{207}}2}} בטווח של 12.6 ± {{219} }.2 עד 27.6 ± 1.1 מיקרומטר. מבין האיזוקסאזולים המבוססים על פלבונואידים טריפלואורומתילציה, 3b (R1=F, R2=H) נמצא הכי חזק (IC50=12.6 ± 0.2 µM) וה- התרכובת היעילה ביותר (PI=94.7 ± 1.2 אחוז ב-50 µM) לעיכוב הפעילות של האנזים -עמילאז. ערכים משמעותיים אלו נמצאו דומים לאלו של acarbose (PI=97.8 ± 0.5 אחוז ב-50 µM; IC50=12.4 ± 0.1 µM), המשמש כחומר סטנדרטי. כמו כן, תרכובות 3h, 3j ו-3m יכולות להיחשב כביו אקטיביות מבחינת יעילות ועוצמה (PI= 93.1 ± 0.9 אחוז -93.5 ± 1.1 אחוז ב-50 µM; IC50=13.3 ± 0.2 µM–13.8 ± 0.1 µM) בהשוואה ל-3b האנלוגי וה-acarbose שלהם. שאר התרכובות (1, 2, 3a, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 3i, 3k ו-3l) נמצאו גם כן מסוגלות לעכב את האנזים -עמילאז, אך נשארות פחות יעילות (PI{{ 140}}.5 ± 0.7 אחוזים -87.1 ± 0.7 אחוזים ב-50 µM; IC50=14.4 ± 0.2 µM עד 27.6 ± 1.1 µM) מאשר האנלוגים שהוזכרו לעיל. פעילות האנטי{157}}עמילאז שהושגה על ידי התרכובות המסונתזות עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים, ביניהם Nie et al. (2020) [10] דיווח כי איזוקסאזולים מבוססי פלבנואידים יכולים להציג פיגומים יקרי ערך לגילוי תרופות נגד סוכרת. על ידי השוואת המבנים והפעילויות של המולקולות המסונתזות, תרכובות 3bd, הלוגנות במיקום הפארא של קבוצת הפניל המחוברת לטבעת האיזוקסזול, הציגו יעילות משמעותית (PI= 85.4 ± 0.9 אחוז -94.7 ± 1.2 אחוז בשעה 50 µM) ועוצמה (IC50=12.6 ± 0.2 µM–14.6 ± 0.3 µM) בעיכוב האנזים -עמילאז. ממצא זה עולה בקנה אחד עם הספרות, המראה כי נוכחותם של אטומי הלוגן (F, Cl או Br) במבנה הייתה חיונית לעיכוב חזק של עמילאז [49,50]. בנוסף, מחקר קשרי המבנה-פעילות איפשר לנו להסיק שהשפעות יותר של מושך אינדוקטיבי (-I) ותורם מזומרי (בתוספת M) מגבירים את היעילות והעוצמה המעכבת -עמילאז (פעילות של הנגזרת המופלרת 3b (R{{186} } F, R2=H; PI=94.7 ± 1.2 אחוזים ב-50 µM; IC50=12.6 ± 0.2 µM) גבוה מזה של הנגזרת הכלורת 3c (R{ {198}} Cl, R2=H; PI=87.1 ± 0.7 אחוז ב-50 µM; IC50=14.4 ± 0.2 µM), ואחריו הנגזרת הברומאטית 3d (R 1=Br, R2=H; PI=85.4 ± 0.9 אחוז ב-50 µM; IC50=14.6 ± 0.3 µM)), בהתאם למחקרים קודמים [ 4,49]. ברור שעיכוב -עמילאז עולה עם השפעות המושך האינדוקטיבי (-I) והתורם המזומרי (בתוספת M) של אטומי הלוגן.

2.3. לימודי עגינה מולקולריתהאנזים -עמילאז (EC 3.2.1.1) - גליקוזיל הידרולאז - מייקר -1, 4-קשרים גליקוזידיים בעמילנים, כגון עמילוז. מבנה הגביש של האנזים -עמילאז (PDB: 7TAA) מורכב משרשרת A בעלת אורך רצף של 478 חומצות אמינו [52]. -עמילאז הוא אחד מאנזימי המפתח החשובים ביותר האחראים על עיכול פחמימות [5]; לפיכך, חסימת האנזים -עמילאז מציעה אסטרטגיה לשלוט בסוכרת ולעזור בניהול השמנת יתר [6,7]. ניתוח עגינה מולקולרי מקיף בוצע כדי לחקור את מצב הקישור, לקבוע את האינטראקציות הסבירות של מולקולות מסונתזות (1, 2 ו-3a–m) בתוך כיס הקישור ההידרופובי של ABC (משונה acarbose hexasaccharide) של מבנה גבישי החלבון של Aspergillus oryzae - אנזים עמילאז (PDB: 7TAA) [52] באמצעות תוכנת AutoDock Vina, ורציונליזציה של פעילות מעכבת עמילאז במבחנה של התרכובות החדשות שסונתזו. כל המולקולות המסונתזות (1, 2 ו-3a–m) - ו- acarbose, המשמשים כחומר סטנדרטי - נחקרו בסיליקו. אנרגיות מחייבות ופרטי אינטראקציה (מספר אינטראקציות, מספר חומצות אמינו באינטראקציה, חומצות אמינו באינטראקציה וקשרי מימן) של ליגנדים עם אנזים המטרה מוצגים בטבלה 2. מתוצאות העגינה בסיליקו (טבלה 2), זה נצפה שהתרכובות 1 ו-2 הציגו אנרגיות קישור טובות (-7.7 ו-7.8 קק"ל/מול, בהתאמה) בתוך אתר הקישור של האנזים -עמילאז (PDB: 7TAA). ערכים אלו דומים לאלו של החומר הסטנדרטי (אקרבוז, -7.9 קק"ל/מול), מה שמאפשר להם להשתלב בצורה חיובית באתר הפעיל של אנזים המטרה. מעניין לציין שהאיזוקסאזולים המבוססים על פלבונואידים טריפלואורומתילציה (3a–m) העניקו את התוצאות הצפויות; הם היו בתנוחת ההתקשרות כראוי והפגינו אנרגיות קשירה נהדרות שנעו בין -9.6 ל -8.2 קק"ל/מול (טבלה 2). זה יאפשר לכולם להשתלב בצורה חיובית באתר הפעיל של האנזים -עמילאז, טוב יותר מאקרבוז. אופן הקישור של שלוש התרכובות הפעילות ביותר (3b, 3h ו-3j) עם אנזים המטרה נדון להלן. תרכובת 3b - המעכב החזק והיעיל ביותר של האנזים -עמילאז בסדרה שנבדקה של איזוקסאזולים מבוססי פלבונואידים על בסיס טריפלואורומתילציה - הראתה אנרגיית קשירה מצוינת של -9.6 קק"ל/מול. בנוסף, אופן הקישור של 3b מצביע על כך שהוא מעורב ב-16 אינטראקציות לא קוולנטיות עם 10 חומצות אמינו (טבלה 2). באופן יסודי, החלק 3-(3-(4-fluorophenyl)isoxazole-5-yl)methoxyl יוצר שני קשרי הלוגנים (פלואור) עם ה-ASP-206, Pi -Pi בצורת T קשר עם ה-TYR-82, קשר Pi-kation עם HIS-80, מולקולות 2021, 26, 5214 8 של 18 שני קשרי מימן קונבנציונליים עם ARG{{71 }}, ו- Pi–anion וקשר פחמן-מימן עם שארית ASP-340. יתר על כן, קבוצת הטריפלואורומתיל המחוברת ל-C-40 של השלד הפלבנואיד מעורבת בקשירת מימן קונבנציונלית עם GLY-167 ושני קשרי אלקיל עם האמינו LEU-166 ו-LEU-173 חומצות. מצד שני, השלד הפלבונואיד יוצר אינטראקציה באמצעות קשר Pi-anion עם ASP-340, קשר מימן קונבנציונלי עם GLN-35, ו-Pi-alkyl ושני Pi-Pi קשרים מוערמים עם TYR{ {80}} (איור 1).

איור 1. תרכובת 3b מתאימה לכיס הקישור ההידרופובי של ABC ב-PDB: 7TAA.

יתר על כן, תרכובת 3h הציגה אנרגיית קישור מעניינת של -9.3 קק"ל/מול. אופן הקישור שלו מראה שהוא מעורב ב-15 אינטראקציות לא קוולנטיות עם 10 שיירים (טבלה 2). בהתאם, תובנה מולקולרית מניתוח עגינה מציעה שהחלק 3-(3-(4- methoxyphenyl)isoxazole-5-yl)methoxyl יוצר שני קשרי פחמן-מימן עם GLU{{12 }}, קשר בצורת Pi–Pi T עם TYR-82, שני קשרי מימן קונבנציונליים עם ARG-344, קשר פחמן-מימן עם HIS-80 וקשר Pi–אניון עם שארית ה-ASP-340. יתרה מכך, קבוצת הטריפלואורומתיל מעורבת בקשר מימן קונבנציונלי עם GLY-167, ובשתי אינטראקציות אלקיל עם חומצות האמינו LEU-166 ו-LEU-173. בנוסף, השלד הפלבנואיד מעורב בקשר מימן רגיל עם GLN-35, קשר Pi-anion עם ASP-340, שני קשרים מוערמים Pi-Pi וקשר Pi-alkyl עם TYR{ {24}} (איור 2)

מצד שני, תרכובת 3j הציגה אנרגיית קישור משמעותית של -9.2 קק"ל/מול. אופן הקישור שלו מראה שהוא מעורב ב-16 אינטראקציות לא קוולנטיות עם 13 חומצות אמינו (טבלה 2). לכן, ניתוח מעמיק של עגינה מולקולרית מעלה שהחלק 3-(3-(4-butoxy-3-chlorophenyl)isoxazole-5-yl)methoxyl יוצר שניים קונבנציונליים קשרי מימן עם ARG-344, שלושה קשרי Pi-alkyl עם TYR-82, HIS-210 ו-HIS-296, אינטראקציה אלקיל עם LEU-232, א קשר פחמן-מימן עם שארית GLU-230, קשר Pi-anion עם ASP-340 וקשר Pi-cation עם HIS-80. בנוסף, קבוצת הטריפלואורומתיל המקושרת לטבעת הארומטית B של השלד הפלבנואיד מעורבת בקשר מימן קונבנציונלי עם GLY-167 ושתי אינטראקציות אלקיל עם שיירי LEU-166 ו-LEU-173. יתרה מכך, השלד הפלבנואיד מעורב בקשר מימן קונבנציונלי עם GLN-35 ו-Pi-alkyl ושני קשרים מוערמים Pi-Pi עם חומצת האמינו TYR-75 (איור 3). באנזים Aspergillus oryzae -עמילאז (PDB: 7TAA), הנוקלאופיל ושאריות החומצה/בסיס הקטליטי, האחראים על ביקוע הקשרים הגליקוזידיים, הם חומצות האמינו ASP-206 ו-GLU-230 , בהתאמה [5]. לכן, אינטראקציות בין חלבון לליגנד, בעיקר באמצעות שאריות GLU-230 ו-ASP-206, הן הדרך הטובה ביותר לחסום את הביקוע של קשרים גליקוזידיים. למעשה, אנרגיית הקישור הנמוכה, תנוחת הקישור הנכונה, היכולת ליצור אינטראקציה עם שאריות מפתח של מחשוף גליקוזידי (GLU-230 ו-ASP-206), ומספר רב של אינטראקציות בכיס הפעיל של אנזים המטרה (טבלה 2) יכול להסביר את יעילות העמילאז המעכבת החזקה שנקבעה על ידי רוב התרכובות.

איור 3. תרכובת 3j מתאימה לכיס הקישור ההידרופובי של ABC ב-PDB: 7TAA

3. חומרים ושיטות

3.1. ניסוי כללינהלים כל הממיסים בשימוש זוקקו טרי לפני השימוש. כל התגובות הכימיות נוטרו באמצעות לוחות TLC מסחריים (סיליקה ג'ל 60, F254, SDS). מכשיר Büchi 510 שימש לקביעת נקודות התכה. כל הספקטרום של 1H NMR (300 מגה-הרץ), DEPT 135 ו-13C NMR (75 מגה-הרץ) תועדו ב-deuterated chloroform and dimethyl sulfoxide-d6 עם ספקטרומטר Bruker AC-300. כל השינויים הכימיים (δ) דווחו בחלקים למיליון (ppm), קבועי צימוד (J) ניתנו בהרץ (Hz), ותהודת ממס שיורית שאינה מנוהלת שימשה כהתייחסות פנימית. ספקטרום DCI-HRMS הופעלו ב-aWaters GCT 1er במצב יון חיובי. ספקטרום ESI-HRMS תועדו עם ESI-TOF (Waters LCT, Markham, Ontario, קנדה) במצב יונים חיוביים באמצעות מצב המשקף.

4. מסקנות

15 האיזוקסאזולים המבוססים על פלבונואידים טריפלואורו-מתילציה (3a–m) שסונתזו לאחרונה, הוערכו במבחנה עבור פעילות מעכבת-עמילאז שלהם, ונצפו תוצאות ניכרות. הציקלואדדוקטים 3b, 3h, 3j ו-3m הציגו יעילות ועוצמה דומים לאלו של acarbose המשמש כחומר סטנדרטי לעיכוב האנזים -עמילאז. בנוסף, ניתוח הקשר בין מבנה לפעילות גילה שנגזרות הלוגניות ואלקוקסילציות הן התרכובות הפעילות ביותר. על פי ניתוח הסיליקודוקינג, האיזוקסאזולים המבוססים על פלבונואידים טריפלואורומתילציה הראו אנרגיית קישור נמוכה, מספר רב של אינטראקציות, ומיקום הקישור הנכון בכיס הפעיל של אנזים המטרה. רובם יצרו אינטראקציה עם הנוקלאופיל ושאריות החומצה/בסיס הקטליטי (GLU-230 ו-ASP-206), מה שעשוי להסביר את היעילות והעוצמה שלהם בעיכוב הפעילות האנזימטית של -עמילאז. הפעילויות המבטיחות שמציגות התרכובות ההיברידיות המסונתזות מעודדות את מעורבותן כמועמדות לגילוי תרופות חדשות נגד סוכרת ונוגדי השמנת יתר. עם זאת, מחקרים מעמיקים מאוד וגורמי בטיחות חייבים לקחת בחשבון את הסיכונים הקשורים לחידוש של החומר הפעיל, רעילות, יציבות ומסיסות במדיום המימי, ומאפיינים פרמקודינמיים, כולל האמינות שבה ניתן לעקוב אחר תופעות הלוואי. בבני אדם לפני שמתפתחות השפעות חמורות/בלתי הפיכות פוטנציאליות. חומרים משלימים: הבאים זמינים באינטרנט, ספקטרום NMR של התרכובות המסונתזות (1, 2 ו-3a-m), טבלה S1: עקומות הריכוז-תגובה המשמשות לחישוב ערכי IC50. תרומות המחבר: מושגי FKA ו-IS; מתודולוגיה, HBJ; תוכנה, IS ו-H.NA; אימות, FKA ו-AC; ניתוח פורמלי, MRE; חקירה, FKA ו-IS; משאבים, BYA; אוצרות נתונים, FKA ו-IS; כתיבה-הכנת טיוטה מקורית, FKA ו-IS; כתיבה-סקירה ועריכה, HBJ; הדמיה, FKA ו-BYA; פיקוח, ח"ב; ניהול פרויקטים, FKA ו-HBJ; רכישת מימון, FKA כל המחברים קראו והסכימו לגרסה שפורסמה של כתב היד. מימון: מחקר זה לא קיבל מימון חיצוני. הצהרת מועצת הביקורת המוסדית: לא רלוונטית. הצהרת הסכמה מדעת: לא רלוונטית. הצהרת זמינות נתונים: לא רלוונטית. תודות: המחברים מביעים את הערכתם לדיקן של מחקר מדעי באימאם מוחמד אבן סעוד האיסלאמי האוניברסיטה למימון עבודה זו באמצעות קבוצת המחקר. RG-21-09-69. ניגודי אינטרסים: המחברים לא מצהירים על ניגוד עניינים. זמינות מדגם: דוגמאות של התרכובות אינן זמינות מהמחברים.

הפניות
1. בוטייב, א.; Boutayeb, S. הנטל של מחלות לא מדבקות במדינות מתפתחות. Int. J. Equity Health 2005, 4, 1–8. [CrossRef]
2. וגנר, ק"ח; Brath, H. השקפה גלובלית על התפתחות מחלות לא מדבקות. הקודם Med. 2012, 54, S38–S41. [CrossRef]
3. Tseng, CH המנגנונים הביולוגיים הפוטנציאליים של סוכרת הנגרמת על ידי ארסן. טוקסיקול. יישום פרמקול. 2004, 197, 67–83. [CrossRef]
4. סלה, ד'; Zorzano, A. בקרה דיפרנציאלית של מסת שריר בסוכרת מסוג 1 וסוג 2. תָא. מול. Life Sci. 2015, 72, 3803–3817. [CrossRef]
5. Brzozowski, AM; Davies, GJ מבנה של aspergillus oryzae -עמילאז מורכב עם המעכב acarbose ברזולוציה של 2.0 Å. ביוכימיה 1997, 36, 10837–10845. [CrossRef]
6. ג'יאראג', ש.; סורש, ש; Kadeppagari, RK מעכבי עמילאז, והיישומים הביו-רפואיים שלהם. עמילן-שטרקה 2013, 65, 535–542. [CrossRef]
7. חאן, ש.; נזיר, מ.; רייז, נ.; סאלם, מ.; זנגין, ג.; פאזל, ג.; סאלם, ה.; מוכתר, מ.; Tousif, MI; טארין, RB; et al. פרופיל פיטוכימי, תכונות ביולוגיות במבחנה ובמחקרי סיליקו על מניות Caragana ambigua (Fabaceae): גישה מקיפה. Ind. Crops Prod. 2019, 131, 117–124. [CrossRef]
8. ברג, JM; Tymoczko, JL; Stryer, L. ניתן לעכב אנזימים על ידי מולקולות ספציפיות. בביוכימיה, מהדורה 5; WH Freeman: ניו יורק, ניו יורק, ארה"ב, 2002.
9. קם, א.; לי, קמ; רזמובסקי-נאומובסקי, ו. נמי, ש; שי, ג'; צ'אן, ק.; Li, GQ מחקר השוואתי על ההשפעות המעכבות של חלקים ומרכיבים כימיים שונים של רימון על -עמילאז ו-glucosidase. פיטוטר. מילון 2013, 27, 1614–1620. [CrossRef]
10. Nie, JP; Qu, ZN; חן, י.; חן, JH; ג'יאנג, י.; ג'ין, MN; יו, י.; Niu, WY; דואן, מטה; Qin, N. גילוי והשפעות אנטי-סוכרתיות של נגזרות פלבנואידים חדשניות מבוססות איזוקסאזול. Fitoterapia 2020, 142, 104499. [CrossRef]
11. Malešev, D.; Kunti´c, V. חקירה של צ'לטים מתכת-פלבנואידים וקביעת פלבנואידים באמצעות תגובות קומפלקס מתכת-פלבנואידים. ג'יי סרבי. Chem. Soc. 2007, 72, 921–939. [CrossRef]
12. Pinheiro, PF; Goncalon, CJ ניתוח מבני של פלבנואידים ותרכובות קשורות - סקירה של יישומים ספקטרוסקופיים. בפיטוכימיקלים - פרספקטיבה גלובלית של תפקידם בתזונה ובריאות; InTech: לונדון, בריטניה, 2012.
13. Lo Piparo, E.; שייב, ח.; פריי, נ.; ויליאמסון, ג'; גריגורוב, מ.; צ'ו, סי ג'ייפלבנואידים עבורשליטה בעיכול עמילן: דרישות מבניות לעיכוב עמילאז אנושי. J. Med. Chem. 2008, 51, 3555–3561. [CrossRef]
14. Xiao, J.; Ni, X.; קאי, ג.; Chen, X. סקירה על קשר מבנה-פעילות של תזונהמעכבי פוליפנולים-עמילאז. קריט. Rev. Food Sci. נוטר. 2013, 53, 497–506. [CrossRef] [PubMed]
15. הואה, פ.; ג'ואו, פ.; וו, HY; צ'ו, GX; Xie, ZW; Bao, GH עיכוב של גלוקוזידאז ו-עמילאז על ידי גליקוזידים פלבנואידים מתה Luan GuaPian: עגינה מולקולרית ומנגנון אינטראקציה. פונקציית אוכל. 2018, 9, 4173–4183. [CrossRef] [PubMed]
16. ויניאגם, ר.; Xu, B. תכונות אנטי-סוכרתיות של פלבנואידים תזונתיים: סקירת מנגנון תאי. נוטר. Metab. 2015, 12, 1–20. [CrossRef] [PubMed] 17. Ghorbani, A. מנגנונים של השפעות אנטי-סוכרתיות של רוטין פלבנואיד. ביומד. פרמקוטר. 2017, 96, 305–312. [CrossRef] [PubMed]