צימודי נוגדנים מעוררי מערכת החיסון מעוררים הפעלה מיאלואידית חזקה וחסינות אנטי-גידולית עמידה (חלק 1)

למידע נוסף אנא צור קשרdavid.wan@wecistanche.com

תַקצִיר

קולטני זיהוי דפוסים מולדים, כולל קולטנים דמויי אגרה (TLR), יכולים לשנות את המיקרו-סביבה של הגידול ולשפר חסינות אנטי-גידולית אדפטיבית.עם זאת, אגוניסטים של TLR לא נסבלו היטב עקב רעילות הקשורות להפעלה חיסונית נרחבת לאחר מתן מערכתי.לתכנן טיפול המתאים לאספקה ​​מערכתית והמסוגלים לעורר תגובה ממוקדת גידול, פיתחנו סוג חדש של מצומדי נוגדנים מעוררי חיסון (ISACs) הכוללים אגוניסט TLR7/8 המצומד לנוגדנים מכווני גידול.ISACs אנטי-HER2 שניתנו באופן סיסטמי נסבלו היטב in vivo ועוררו הפעלה חזקה של תאים מיאלואידים תוך-גידוליים, וכתוצאה מכך לפינוי הגידול וזיכרון אימונולוגי שלאחר מכן.עוצמה במבחנה ויעילות in vivo דרשו פעילות טנדם המונעת על ידי פונקציונליות Fc שלמה ואגוניזם TLR כדי לאפשר פגוציטוזיס וחסינות אנטי-גידולית בתיווך תאי T.זיכרון אימונולוגי בתיווך ISAC לא הוגבל ל-HER2, שכן עכברים שטופלו ב-ISAC היו מוגנים מפני התמודדות חוזרת עם גידול HER2-שלילי.תוצאות אלו מספקות רציונל חזק לפיתוח קליני של ISACs ומראות שסינרגיה בין איתות Fc R ו-TLR7/8 תורמת למנגנון של חסינות אנטי-גידולית בתיווך ISAC.

לחץ כאן כדי ללמוד עוד על Cistanche

מבוא

לפני סוף המאה ה-20, לחולי סרטן היו בדרך כלל שלושה שיטות טיפול זמינות: כריתה כירורגית, הקרנות וכימותרפיה. הופעתה של אימונותרפיה נגד סרטן הוסיפה אופציה רביעית רבת עוצמה שהרחיבה מאוד את הרפרטואר האונקולוגי החל באישור ה-rituximab עבור לימפומה שאינה הודג'קין והרחיב את האימוץ הנרחב של מעכבי מחסום 1,2. עם זאת, כל טיפול אחד, כולל אימונותרפיה, מוגבל באופן זמני אלא אם כן הוא יוצר תגובות ביולוגיות ואימונולוגיות עמידות המתגברות על הטרוגניות הגידול ועל עומס המוטציוני 3-5. מעכבי מחסום כגון נוגדנים נגד PD-1 ו-PD-L1 משפרים באופן דרמטי את התוצאות במספר אינדיקציות, כולל בחולים עם עומס מוטציה גבוה בגידול או חוסר יציבות מיקרו-לווין, ואחד הקובע של רגישות הגידול לאימונותרפיה מחסום הוא היקף הטרום חדירת תאי T קיימים. חולים עם גידולים "קרים" שיש להם חדירת תאי T דלילה מגיבים פחות לחסימה של נקודת ביקורת ובעלי תחזית גרועה יותר בהשוואה לחולים עם גידולים "חמים" שבהם קיימים תאי T מדוכאים לגידול חיסוני בתוך המיקרו-סביבה של הגידול (TME) 6,7 . ביופסיית גידול ואימונוהיסטוכימיה מצביעים על כך שתאים מקצועיים מציגי אנטיגן (APCs) כגון תאים דנדריטים (DCs) שכיחים יותר ב-TME מאשר תאי T, אם כי עדיין רגישים למנגנונים מדכאים חיסוניים 8,9. בהתחשב בנוכחותם של תאים מיאלואידים ב-TME ותפקידם בקידום הפעלת תאי T, יש מאמץ גובר לפתח טיפולים המפעילים APC הקשורים לגידול כדי לעורר חסינות נרחבת של תאי T ותגובה חיסונית אנטי-גידולית יעילה.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 תורמים. (ד) ריטוקסימאב הגיב עם SATA דרך שאריות ליזין כדי להמיר אמינים חופשיים לקבוצות sulfhydryl מוגנות לפני דה-אצטילציה עם הידרוקסילאמין ותגובה לאחר מכן עם T785-MCC כדי להניב את ה-rituximab-ISAC. (ה) ניתוח LC-MS של ה-rituximab-ISAC לאחר טיפול PNGase F. DAR חושב בהתבסס על תוספת מסה מקשר אגוניסט של 606 גרם/מול. (ו) Rituximab או Rituximab-ISAC עם תווית פלואורסצנטית הודגרה עם תאי גידול CD20 פלוס Toledo ב-4 מעלות למשך שעתיים לפני הניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה. הנתונים הם מניסוי אחד עם דגימות משולשות ומייצגים 2 ניסויים.(gh) APCs מיאלואידים אנושיים מבודדים טריים תורבו עם rituximab, T785, rituximab ו-T785 או ה-rituximab-ISAC בנוכחות תאי גידול CD20 עם CFSE פלוס Toledo ביחס של 3:1 גורם למטרה. ריכוז הריטוקסימאב מתואר על ציר ה-X כאשר הריכוז של T785 במבחנים אלה עולה בקנה אחד עם כמות ה-T785

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 תורמים (ממוצע ו-SEM); *פ<0.05,><0.01,><0.001,><>

כעת מתועד היטב כי אספקה ​​מקומית של חומרים ממריצים אימוניים במודלים פרה-קליניים יכולה לתכנת מחדש APCs תושבי גידול מדוכאים לתאים מופעלים המסוגלים לעבד ולהציג אנטיגנים הקשורים לגידול, כולל ניאו-אנטיגנים, לתאי T המתווכים לאחר מכן חסינות אנטי-גידולית 10-13 . אסטרטגיה אחת כזו, שחלו על ידי כרמי וחב', הדגימה כי אספקה ​​תוך-גידולית של נוגדנים אלוגניים המכוונים לגידולים עם אגוניסט לקולטן מסוג Toll-like (TLR)-3 או עם TNF ו-CD40L שניצלו פונקציונליות APC הקשורות לגידולים המובילים לספיגת אנטיגן משופרת אינדוקציה לאחר מכן של חסינות תאי T נגד גידולים. אסטרטגיית שילוב זו, אשר מינפה את תפקוד אפקטור הנוגדנים עם אגוניסט TLR, הובילה למיגור גידולים ראשוניים ונגעים גרורתיים והגנה על המארח מפני הישנות הגידול 11,14. באופן דומה, נוגדן אנטי-OX40 אגוניסטי בשילוב עם אגוניסט TLR9, CpG, משופעלים APCs ותאי T בתוך הגידול, וכתוצאה מכך יעילות מרשימה נגד סוגי גידולים מרובים בעכברים 13. התרגום היעיל של אסטרטגיות הפעלת APC למרפאה מתבצע נחקר בהתוויות מרובות עם נתונים קליניים בחולים עם מלנומה המצביעים על כך שמתן תוך-גידולי של אגוניסטים TLR9 בשילוב עם נוגדן אנטי-PD-1 יכול להוביל להתכווצות הגידול ולתגובות אבסקופליות בנגעים שאינם מוזרקים 15. באופן דומה, מספר קבוצות רודפות אחר אגוניסטים של TLR7/8 עבור אימונותרפיה של גידולים שכן דפוס הביטוי של TLR7/8 ב-APCs אנושי משקף יותר את דפוס הביטוי של TLR7 ו-TLR9 ב-APCs16-18 של עכברים. בסופו של דבר, האימוץ של אסטרטגיות מסירה תוך-גידולית, אם יהיו יעילים, יוגבל על ידי נגישות הגידול, שכן מסירה מערכתית של אגוניסטים חיסוניים המכוונים ל-APC הוגבלה על ידי רעילות, זמן מחצית חיים קצר ומשלוח לא אופטימלי לאתרי היעד.המטרה שלנו הייתה לעצב מצומד נוגדן מגרה חיסוני (ISAC) הכולל נוגדן חד שבטי מכוון לגידול המצומד לאגוניסט חיסוני כגישה טיפולית חדשה ליצירת חסינות אנטי-גידולית עמידה. ניהול מערכתי של ה-ISAC העלה הפעלת APC מקומית ב-TME שהייתה תלויה ב-Fcתפקוד אפקטור והפעלת TLR תוך עקיפת רעילות אופיינית הקשורה לאספקה ​​מערכתית של אגוניסטים של TLR. יתרה מכך, מתן מערכתי של מצומדים אלה לעכברים נושאי גידול איפשר עיבוד והצגת אנטיגן לתאי T שהובילו לחסינות מתמשכת נגד גידולים במספר מודלים עמידים לנוגדן מכוון גידול לא מצומד.

תוצאות

עיצוב ואפיון ISAC כדי לאפשר צימוד של אגוניסט TLR לנוגדן, נעשה שימוש בכלי עגינה מולקולריים כדי לעצב אגוניסט TLR7/8 חדש (T785) עם בוטיל-אמין ששימש כנקודת התקשרות נגישה לממס לנוגדן ( איור 1A, איור משלים 1A-C). T785 הפעיל TLR7 אנושי עם EC50 של 0.643 מיקרומטר ו-TLR8 אנושי עם EC50 של 1.60 מיקרומטר בשורות תאים HEK293 המבטאות יחד NF-κB המופרש פוספטאז אלקליין מדווח ו-TLFigur T1BLR. ). הספציפיות של T785 עבור TLR7/8 אושרה על ידי חוסר היכולת של T785 לגרום לפעילות NF-κB בתאי כתב HEK293 שחסרים ביטוי TLR7/8 (איור משלים 2A). כדי לאשר פעילות אגוניסטית בתאים ראשוניים, מונוציטים ו-DCs מבודדים טריים, שנקראו APCs מיאלואידיים (~96 אחוז מונוציטים, 4 אחוז DC; איור משלים 3A), המבטאים גם TLR7 וגם TLR8, עוררו בן לילה עם 1 מיקרומטר T785 או R848, א. TLR7/8 אגוניסט מבוסס ומאופיין 19. T785 ו-R848 עוררו APCs מיאלואידים במידה דומה (איור 1C) 20,21. הפעילות של T785 אושרה גם ב-DCs (pDCs) של פלזמהציטואידים אנושיים טריים, המבטאים TLR7 אך לא TLR8 (איור משלים 2B). כדי לחקור את ההשפעות של ISACs על תרביות חוץ גופיות אנושיות, ISAC נוצר עם rituximab (איור 1D), נוגדן חד שבטי אנטי-CD20 מאומת קלינית המשמש לטיפול בממאירות של תאי B, על ידי צימוד ל-T785 בתגובה רב-שלבית עם crosslinkers הטרובי-פונקציונליים תואמים 22. יעילות צימוד T785-ISAC נמדדה על ידי LC-MS בעקבות דגליקוזילציה עם PNGase F, וכתוצאה מכך יחס ממוצע בין תרופה לנוגדן (DAR) של 1.71 (איור 1E). אישרנו שה-ISAC שמר על קישור דומה ל-CD20 בעקבות ניסויים של ציטומטריית זרימה עם CD20- המבטא קו תאי גידול של טולדו, שורת תאים מאופיינת היטב שמקורה בחולה עם לימפומה מפוזרת של תאים גדולים (איור 1F) 23. T. 785-קישור ISAC לקולטני Fc האנושיים (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) הוערך על ידי Biacore והיה דומה ל-rituximab (טבלה משלימה 1). ISACs מפעילים APCs מיאלואידים אנושיים הפוטנציאל האימונוסטימולטורי של ה-rituximab T{{77 }}ISAC הוערכה בעקבות תרבות משותפת של APCs מיאלואידיים אנושיים מבודדים טריים עם תאי גידול CD20 עם CFSE בתוספת טולדו למשך 18 שעות. APCs מיאלואידיים שהורכבו עם rituximab T785-ISAC עברו שינויים מורפולוגיים מהירים התואמים את המורפולוגיה של DCs, בעוד שמורפולוגיה DC לא הייתה נצפתה בתרבויות משותפות שהודגרו עם rituximab, T785 או תערובת אקוומולרית של rituximab ו-T785 (איור 1G). APCs מגורה עם rituximab T785-ISAC נותרו קיימא ודנדריטי במורפולוגיה עד שמונה ימים בעוד APCs מגורה עם התערובת היו לרוב לא קיימא עד היום השמיני (איור 1H). ניתוח ציטומטריית זרימה רב צבעיםלאחר 18 שעות הצביעו על כך ש-APC מגורה עם rituximab T785-ISAC הוריד את ה-CD14 ואת CD16 ובמקביל העלה את ה-CD123, סמן משטח התא הראהלהיות מווסת מעלה על DCs מיאלואידי פעיל 24. לעומת זאת, APCs מגורה עם rituximab,T785 או התערובת לא מווסת את הביטוי של סמנים אלה (איור 1I, איור משלים 4A, אסטרטגיית שער המתוארת באיורים משלימים 3BC).

APCs אנושיים מגורים עם rituximab T785-ISAC גם העלו את ה-CD של מולקולה קוסטימולטורית86 באופן תלוי מינון, עם מגמות דומות שנצפו עם וויסות מוגברת של CD40 ו-HLA-DR עקביות עם הפנוטיפ של APCs מופעלים (איור 1I) & איור משלים 4ב). שינויים תלויי מינון בביטוי סמן פני השטח היו עקביים בין אם הוערכו כעוצמת הקרינה החציונית (MFI, איור 1) או כאחוז מכלל אוכלוסיית התאים שהוא חיובי עבור הסמן המתאים (איור משלים 5). ניתוח שלאחר מכן של סופרנטנטות נטולות תאים הראה ש-rituximab T785-APCs מעוררי ISAC הפרישו כמויות גבוהות יותר של TNF ו-IL-1 (איור 2J ואיור משלים 4C). הפוטנציאל האימונוסטימולטורי של T785-ISACs לא הוגבל ל-rituximab, שכן T785-ISAC שנוצר עם trastuzumab עורר גם הפעלה מיאלואידית מוגברת (איור משלים 4D). היכולת של APCs מעוררי ISAC לעורר הצגת אנטיגן ותחול צולב של תאי CD8 פלוס T הוערכה באמצעות מערכת אנטיגן מודל ovalbumin (OVA) 25,26. CD11c בטחול פלוס DCs מבודדים מעכברים מסוג בר תורבו בן לילה עם קומפלקסים חיסוניים שנוצרו עם OVA או הנוגדן האנטי-OVA או ISAC. DCs טעוני OVA כמתו והודגרו עם תאי OT-I CD8 פלוס T הנושאים ספציפיות TCR עבור פפטיד OVA, SIINFEKL, מורכב עם MHC-I. הצגה צולבת מוגברת בתיווך אנטי-OVA באמצעות ISAC, כפי שנמדדה על ידי כמות MHC-I, פפטיד SIINFEKL קשור, ופרימינג צולב משופר כפי שנמדד על ידי ריבוי תאי CD8 פלוס T (איורים משלימים 6A ו-6B). ISACs מעוררים TLR מוגבר. איתות תוך תאיים הקשורים ל-Fc R ב-APCs מיאלואידי אנושי הפעלה של Fc Rs ו-TLRs גורמת למפל איתות פוספו מורכב, וגודל ומאפייני התגובות הללו שונים בין תת-קבוצות של תאי חיסון שונים 27. חקרנו את מסלולי האיתות התוך-תאיים במורד הזרם העוסקים במגוון סוגי תאים בתוך תרבויות משותף של גידולי PBMC שגוירו עם ה-rituximab T785-ISAC בהשוואה לבקרות תערובת אקווימולרית באמצעות ציטומטריית מסה (CyTOF) 28. תת-קבוצות לויקוציטים (כלומר מונוציטים, תאי CD4 פלוס T) זוהו באמצעות צבירת SPADE באמצעות סמני שושלת עם תאי מטרה המקיפים גם תאי גידול CD20 פלוס טולדו וגם תאי B בריאים. 29. אירועי זרחון הקשורים לאיתות TLR (pIRF7) ו-Fc R (pERK1/2) גדלו 15 דקות לאחר גירוי עם T785-ISAC במונוציטים ו-cDCs, בהשוואה לתערובת הרכיבים הבודדים 30,31. איתות תוך תאי הוגבל במידה רבה לתאים ממקור מיאלואידי (מונוציטים ו-cDCs) וכן ל-pDCs, אשרכולם מבטאים את ה-Fc Rs ו-TLR7 ו/או TLR8 הנדרשים. במונוציטים ו-cDCs, הגירוי המושרה על ידי ISAC הביא גם לזרחון גבוה יותר באופן משמעותי של MAPKAPK2, p38, CREB וחלבון ריבוזומלי S6 (RPS6), דרישה לתחילת סינתזת חלבון במורד הזרם (איור 2A-C ואיור משלים 7A). CD141 פלוס cDCs ו-CD1c פלוס cDCs הראו רמות דומות של pIRF7 בשתי תת-קבוצות ה-CDC, בעוד שרמות של RPS6 ו-pERK1/2 היו גבוהות יותר ב-CD141 פלוס cDCs, המצטיינים בתחול תאי CD8 פלוס T והצגה צולבת של אנטיגן, בהשוואה ל-CD1c בתוספת cDCs (איור משלים 7B).

הקינטיקה של גירוי T785-ISAC הייתה עקבית עם דינמיקת האיתות הצפויה: זרחון ERK1/2 הגיע לשיא לאחר 5 דקות, בעוד השותף שלו במורד הזרם RPS6 לא הגיע לשיא הזרחון עד לנקודת הזמן של 15-דקה (משלים איור 7C). קינטיקה זו תומכת בדינמיקה הצפויה כאשר האיתות מתפשט לאורך זמן, ומצביעה על כך שקיימת תגובת איתות מתמשכת ומוגברת לגירוי ISAC של APC. בהתחשב בתגובה המוגברת שנצפתה בעקבות גירוי ISAC הקשור לנתיבי איתות Fc R ו-TLR, השתמשנו בשלב הבא באלגוריתמים המותנה-צפיפות מחודשת של מידע הדדי (DREMI) ו-Condition-Density Rescaled Visualization (DREVI) כדי לכמת את החוזק של קשרים זוגיים בתוך מסלולי האיתות Fc R ו-TLR 32. אלגוריתמים אלה מייצרים עלילות DREVI להדמיה, כאשר השטח מתחת לעקומה (AUC) הוא אינדיקטור לעוצמת האות הכוללת, נקודת הפיתול (IP) היא מדד לסף ההפעלה, וה- ציון DREMI מכמת את התלות הזוגית של שני הפוספופרוטאינים המדוברים. ניתוח זה זיהה ציוני DREMI מוגברים המעידים על תלות זוגית מוגברת בין חלבונים הקשורים לנתיבי איתות Fc R ו-TLR בעקבות גירוי T785-ISAC בהשוואה לבקרות התערובת האקוומולרית (איור 2D). תלות הדדית חזקה בין pERK1/2 ו-pIRF7 נצפתה באופן ייחודי בעקבות גירוי עם T785-ISAC, אך לא תערובת, כפי שצוין על ידי ציון DREMI מוגבר, עוצמת אות מוגברת וסף הפעלה מופחת הנדרש לצורך זרחון IRF7 (איור 2D ). ניתוח זה גם הצביע על סף הפעלה מופחת הנדרש לתחילת תרגום חלבונים (זרחון RPS6) בעקבות גירוי ISAC כפי שמכומת על ידי ציוני DREMI מוגברים וכתובות IP מופחתות עבור השילובים הזוגיים של pERK1/2-pRPS6 ו-pIRF7-pRPS6 . יתר על כן, רמת הזרחון RPS6 הוגברה כתוצאה מזרחון ERK1/2 או IRF7 כפי שנקבע על ידי AUC מוגבר בזוגיות (איור 2D). תוצאות משולבות אלו לא רק מאשרות את האיתות של ה-ISAC דרך המסלולים הצפויים של Fc R ו-TLR אלא יתרה מכך, תומכות בסינרגיה בין שני המסלולים וכתוצאה מכך ספי הפעלה מופחתים ועוצמות האות מוגברות.

איור 3: ISACs דורשים תפקוד אפקטור Fc ואגוניסט TLR כדי לתווך הפעלה מיאלואידית. APCs מיאלואידים אנושיים מבודדים טריים תורבו במשך 18 שעות בנוכחות תאי גידול CD20 פלוס טולדו ביחס של 3:1 אפקטור למטרה ו- (א) 80 ננומטר של rituximab-ISAC עם או בלי 1 מיקרומטר R406, (ב) rituximab-ISACs על איזוטיפ הנוגדנים המצוין, (c) rituximab-ISAC או rituximab-ISAC deglycosylated (ISAC-deglycosylated). (ac) תאים נותחו על ידי ציטומטריית זרימה והנתונים מדווחים כעוצמת הקרינה החציונית. (ד) תאי כתב HEK-Blue-TLR7 או TLR8 תופחו במשך 18 שעות בנוכחות T785 או TLRnull לפני הערכת פעילות SEAP המושרה על ידי NF-KB. הנתונים המוצגים הםמניסוי אחד ונציג של לפחות 3 ניסויים. (ה) APCs מיאלואידיים אנושיים מבודדים טריים תורבו במשך 18 שעות בנוכחות תאי גידול CD20 פלוס טולדו ותאי ה-rituximab-ISAC המצוינים ונותחו באמצעות ציטומטריית זרימה (הנתונים מוצגים כחציוןעוצמת הקרינה). (ae) הנתונים המוצגים מייצגים 1-4 ניסויים נוספים וגדולים או שווה ל-3 תורמים עבור כל ניסוי (ממוצע ו-SEM). מובהקות סטטיסטית מוגדרת כ*P<0.05,><0.01,><0.001,><>

ISACs דורשים תפקוד אפקטור Fc כדי לתווך הפעלה של APCs מיאלואידית התרומה של פעילות Fc לתפקוד ISAC נחקרה בעקבות אבלציה של איתות Fc R במורד הזרם עם R406, מעכב קינאז מולקולה קטנה של Syk המונע העברת אותות במורד ה-Fc Rs 33,34 המפעיל . התוספת של R406 ביטלה את ההפעלה המיאלואידית בתיווך T785-ISAC כפי שמעידה על היעדר ויסות-על של המולקולה הקוסטימולטורית CD86 אך לא שינתה את התגובה התאית להפעלת TLR7/8 על ידי T785 (איור 3A & איור משלים 8). עיכוב Syk עם R406 ביטלה גם את האיתות במונוציטים בעקבות גירוי T785-ISAC, עםרמות מופחתות באופן משמעותי של MAPKAPK-2, ERK1/2 ו-IRF7 מזורחן שנמדדו (איור משלים 7D).בהתחשב בנתונים אלו, T785-ISACs של rituximab נוסחו עם DARs דומים על כל אחד מארבעת האיזוטיפים המופיעים באופן טבעי כדי להגדיר את המידה שבה פעילות T785-ISAC משתנה עם זיקות קשירה ידועות של Fc R 35,36. ISACs Rituximab Aglycosylated ו- Fucosylated נחקרו גם הם, שכן גליקוזילציה מבטלת את קישור Fc R בעוד ש- Fucosylation מגבירה את זיקת הקישור ל-FCGR3A 37. היכולת האימונוסטימולטורית של ה-rituximab T785-ISAC נמצאת בקורלציה עם זיקת Fc R של הנוגדן (Figuro). 3B). לעומת זאת, ה-Fucosylated IgG1 (IgG1-AF), Wildtype IgG1, ו-IgG3 T785-ISACs עוררו הפעלה מיאלואידית, כאשר ה-IgG1-AF T785-ISAC גרם לרמה הגבוהה ביותר רמות של וויסות עלייה של CD86 (איור 3B). דה-גליקוזילציה של ה- Wildtype rituximab T785-ISAC עם PNGase F, אשר מפחיתה את זיקת הקישור של Fc-Fc R, הביאה לירידה בפעילות הגירוי החיסוני של ISAC במבחנה, התומכת בחשיבות של אזור Fc פעיל פונקציונלית (איור 3C).

ISACs דורשים TLR אגוניזם כדי לתווך הפעלה מיאלואידית התרומה של פעילות TLR על תפקוד ISAC נחקרה בעקבות אבלציה של TLR אגוניזם על ידי הסרת ה-2-אמינו פירידין מ-T785 שמאמינים שהוא יוצר גשר מלח עם שאריות אספרטאט קריטיות בקשירה כיסים של TLR7 ו-TLR8 38 (TLRnull, איור 3D). תרכובת TLRnull הייתה מצומדת ל-rituximab (TLRnull ISAC) ונבדקה לגבי פוטנציאל הפעלה מיאלואידית בנוכחות תאי גידול CD20 פלוס במבחנה. ה-TLRnull ISAC לא גרם לוויסות-על של מולקולה קוסטימולטורית CD86 או מווסת את הביטוי של CD14 או CD123, מה שמצביע על כך שדרוש אגוניזם TLR עבור פנוטיפ ההפעלה שנצפה עם T785-ISACs (איור 3E). יתר על כן, ה-TLRnull ISAC לא גרר זרחון של IRF-7 במונוציטים, בהתאם לחוסר יכולתו להתחבר ל-TLR7/8 (איור משלים 7E). Trastuzumab T785-ISAC במתן מערכתי מבטל גידולים בהעדר של פעילות תאי B, T או NK במודלים של גידולי xenograft אנושיים היכולת של ISACs לגרום להרס בתיווך מיאלואיד ונויטרופילים של גידולים מוצקים בהיעדר פעילות תאי B, T ו-NK הוערכה באמצעות מודלים של xenograft אנושיים 39,40. Trastuzumab, נוגדן מכוון קליני ל-HER2-, נבחר לחקירה כדי לקבוע אם ה-trastuzumab T785-ISAC יכול להתגבר על עמידות הגידול ל-trastuzumab במודלים של HER2 פלוס גידולים מוצקים (איור 4 ואיור משלים 9 ) 41,42. ראשית, הושווה מתן מערכתי של trastuzumab T785-ISAC למתן תוך-גידולי של תערובת של trastuzumab ו-T785. ה-trastuzumab T785-ISAC עורר רגרסיה ופינוי של הגידול, בעוד מתן תערובת אקוומולרית של רכיבים סיפק תועלת טיפולית מינימלית בהשוואה ל-trastuzumab בלבד (איור 4A). מחקרים עוקבים שהשוו ISACs ממוקדי גידול עם בקרות איזוטיפ המתאימים להם אישרו שפעילות אנטי-גידולית דרשה מיקוד לגידול (איור 4B ואיור משלים 10). חשוב לציין, מתן סיסטמי של ה-trastuzumab T785- ISAC ובקרת האיזוטיפים שלו נסבלו היטב, עם השפעה מינימלית על משקל הגוף (איור משלים 11).כדי לקבוע אם מנגנון הפעולה התורם ליעילות ISAC in vivo דומה לזה שתואר במבחנה, נבדקו Fc-בלתי-כשירות (trastuzumab N297A-ISAC) ו-trastuzumab TLRnull-ISACs באותו מודל xenograft של גידול שד ב-במקביל לסוג wildtype trastuzumab T785-ISAC.בעוד שה-trastuzumab T785-ISAC הוביל לרגרסיה וסילוק הגידול, הן ה-Fc-incompetent וה-TLNull ISACs לא הצליחו לעורר פעילות אנטי-גידולית (איור 4C).יחד נתונים אלו מצביעים על דרישה למיקוד גידול והן מעורבות Fc R ו-TLR עבור פעילות אנטי-גידולית של ISAC.

התרומה הדיפרנציאלית של נויטרופילים לעומת תאים מיאלואידים אחרים בתיווך השפעות אנטי-גידוליות הוערכה על ידי דלדול תאים ספציפי.הנויטרופילים התרוקנו באמצעות נוגדן Ly6G, תוך דלדול של שני נויטרופילים ושל APC לא בשלים (מונוציטים)הושג עם נוגדן אנטי-Gr1.תאים פגוציטים התרוקנו באמצעות ליפוזומים טעוני קלודרון.מצאנו כי תאים פגוציטים, ככל הנראה מקרופאגים, תרמו באופן משמעותי לתיווך פעילות אנטי-גידולית בעקבות טיפול ISAC (איור 4D).עם זאת, לדלדול נויטרופילים עם אנטי-Ly6G לא הייתה השפעה על יעילות ISAC.דלדול Gr1 לא השפיע באופן מיידי על היעילות בתיווך ISAC אלא הפחית את משך בקרת הגידול (איור 4D).לבחון את היכולת של T785-ISACs לשלוט בצמיחת הגידול במודלים עם נמוך יותרביטוי HER2, בשלב הבא דגמנו את היעילות במודל הגידול העמיד ל-trastuzumab, ה-HER2-מדיום, JIMT-1.קו תאי הסרטן JIMT-1 מוערך בכ-6.5 x105 עותקים של HER2 פני השטח והוא מבטא רמה מופחתת שלHER2 בהשוואה לקו תאי הגידול HCC1954 על ידי ציטומטריית זרימה 43.בזמן שtrastuzumab T785-ISAC האטה משמעותית את צמיחת הגידול בהשוואה לאיזוטיפ ISAC או הבקרות של trastuzumab, לא נצפתה נסיגה או פינוי של הגידול (איור 4E).שיערנו ש-pertuzumab, הקושר אפיטופ HER2 נבדל מאתר הקישור של trastuzumab, יגביר את ה-Fc-clustering, ובהמשך ישפר את ADCP ואת היעילות של ISAC במודל JIMT-1.השילוב של ה-trastuzumab T785-ISAC עם pertuzumab הוביל ליעילות משופרת משמעותית ולנסיגה משמעותית של הגידול (איור 4F).ללא הגירוי החיסוני של ה-trastuzumab T785-ISAC, השילוב של pertuzumab עם trastuzumab לא סיפק שום תועלת.

לאחר מכן חקרנו את האירועים המולקולריים והתאיים המופעלים על ידי trastuzumab T785-ISAC ובסופו של דבר מביאים ליעילות אנטי-גידולית.שינויים מוקדמים בביטוי גנים בגידוליםנמדדו עם פאנל הפרופיל החיסוני של עכבר pan-cancer של NanoString, וחשפו וויסות עלייה משמעותי של 13.7 אחוז מהגנים תוך 24 שעות מהטיפול, כולל גנים הקשורים לאיתות והפעלה של TLR7 (IRF-7, גנים הקשורים ל-NF-kB)בהשוואה ל-0-0.1 אחוז בעקבות טיפול ב-trastuzumab או איזוטיפ T785-ISAC (איור 4G) 44.ניתוח של נתיבי ביטוי גנים שהוערכו על ידי nSolver Advanced Analysis Pathway Score חשף שיפור ויסות משמעותי של חתימות גנים מרכזיות הקשורות למערכת החיסון (פונקציות מקרופאג'ים, פונקציות DC, עיבוד אנטיגן והצגה) שהיותואם את הממצאים in vitro ו-in vivo שאינטראקציות Fc-Fc R הן קריטיות לפעילות בתיווך ISAC (איור 4H ואיור משלים 12).ציוני חתימת הגנים הקשורים לכימוקינים וציטוקינים היו גבוהים מאוד בעקבות טיפול ב-Trastuzumab T785-ISAC, בהתאם לכימות חלבון שבוצע למדידת הפרשת ציטוקינים וכימוקינים בתוך הגידול 24 שעות לאחר המתן (איור 4Hואיור משלים 13).ממצאים אלה, בהתאמה לנתוני היעילות במבחנה ובנתוני היעילות, מצביעים על תגובה חזקה בתיווך TLR ו-Fc R המושרה על ידי ISAC.

ציטומטריית זרימה ו-IHC שימשו כדי להעריך האם הפעלה מוגברת בתיווך T785-ISAC וביטוי כימוקין הובילו בסופו של דבר לגיוס של תאי אפקטור חיסוני.תסתננות חיסונית מיאלואידית תועדה על ידי ציטומטריית זרימה 24 שעות ו-7 ימים לאחר מתן מנה בודדת של trastuzumab T785-ISAC או trastuzumab והשוואה לביקורות שלא טופלו.ניתוח של גידולים 24 שעות לאחר הטיפול גילהחדירת CD11b פלוס Ly6C פלוס מונוציטים ו-CD11b פלוס Ly6G פלוס גרנולוציטים בגידולים שטופלו ב-trastuzumab או trastuzumab T785-ISAC בהשוואה לביקורות שלא טופלו (איור 4I).שבעה ימים לאחר הטיפול, CD11b פלוס CD11c פלוס F4/80 פלוס APC מיאלואידים חיוביים עלו באופן משמעותי בקבוצה שטופלה ב-trastuzumab T785-ISAC בהשוואה ל-trastuzumab או בקרות לא מטופלות (איור 4I) 45,46.עלייה זו ב-APCs מיאלואידית עשויה להיותמיוחסת לעלייה המשמעותית בייצור של כימוקינים הקשורים למיאלואידים בעקבות טיפול ב-Trastuzumab T785-ISAC.אמנם לא הייתה עלייה משמעותית בתדירות של APCs מיאלואידיים בנקודת הזמן 24-שעה, תאים של פנוטיפ זה הופעלו לאחר טיפול ב-Trastuzumab T785-ISAC, כפי שנמדד על ידי וויסות עלייה של CD40 על פני התא , בהשוואה לאותה אוכלוסייה מ-trastuzumab או מבקרים לא מטופלים (איור 4I).ממצא זה, יחד עם נתוני NanoString, מדגים עוד יותר את יכולתו של ה-trastuzumab T785-ISAC לעסוק ולהפעיל תאים מיאלואידים במיקרו-סביבה של הגידול.בהתחשב בחיוביות ה-CD11b של ה-APCs המיאלואידיים שנצפתה שבוע לאחר הטיפול, ההסתננות המוקדמת של מונוציטים עשויה להיות מבשרי אוכלוסיית ה-APCs המיאלואידים אשר מבשילה בגידולים שטופלו ב-ISAC אך לא בגידולים שטופלו ב-trastuzumab.עם זאת, נותר לקבוע כיצד האירועים הפרוקסימליים הפרו-דלקתיים שנמדדו 24 שעות לאחר גירוי ISAC על ידי NanoString ו-MSD השפיעו בסופו של דבר על אירועים דיסטליים כגון הבשלה של תאים מיאלואידים במיקרו-סביבה של הגידול המשתנה בנקודת הזמן 6-היום מאוחרת יותר , ובסופו של דבר, השפיע על נסיגה ופינוי הגידול.
לבסוף, IHC בוצע כדי להעריך את הנוכחות והמיקום של אוכלוסיות מפתח של תאי חיסון בגידול בעקבות טיפול ב-trastuzumab T785-ISAC בהשוואה לביקורות שלו.תואם את ציטומטריית הזרימה של יום 7, F4/80 מבטא תאים פנימההגידול והאזור הפריטמורלי היו מוגברים ביום 9 לאחר טיפול יחיד עם trastuzumab T785-ISAC (איור 4J).יתר על כן, טיפול ISAC ממוקד הביא לעלייה דרמטית בתאי CD11c פלוס באזור הפריטמורלי שלא נראתה לאחר טיפול בנוגדנים rHER2 או טיפול עם איזוטיפ או איזוטיפ-ISAC (איור 4J).העלייה בתאי CD11c פלוס על ידי ציטומטריית זרימה ו-IHC הוכחה גם בנתוני NanoString, שבהם ביטוי ה-mRNA של ITGAX היה מוגבר באופן משמעותי בימים 6 ו-9 לאחר מתן Trastuzumab T785-ISAC (איור משלים 14).

איור 5: T785-ISACs מעוררים השפעות אנטי-גידול חזקות במודל גידול סינגני של MMC. (אה) לעכברי FVB/N-TgN (MMTV-Erbb2) הושתלו קו תאי הגידול MMC. (א) נקבות עכברים חולקו באקראי כאשר נפח הגידול הגיע לכ-500 מ"מ. לאחר מכן טופלו עכברים באמצעות הזרקה תוך-צפקית עם 5 מ"ג/ק"ג q5d x 2 של נוגדן HER2 נגד חולדות עכבר, HER2 T785-ISAC נגד חולדות עכבר, או איזוטיפ T785-ISAC (TA99) (n) =4-7 עכברים לכל זרוע). (ב, ג) עכברים זכרים חולקו באקראי כאשר נפח הגידול הגיע לכ-500 מ"מ וטופלו מראש החל יום אחד לפני תאריך הטיפול הראשוני בליפוזומים טעוני קלודרון או ביקורת לדלדול פגוציטים (6 מחזורים, עד יום 15) או אנטי. -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >60 ימים לאחר הטיפול האחרון שלהם אותגרו בקו תאי הגידול MMC. עכברים נאיביים לגידול שימשו כבקרות השתלה (n=5 עכברים לקבוצה). (מודעה) הנתונים מייצגים לפחות 2 ניסויים. עכברים הומתו באופן אנושי פעם אחת גידוליםהגיע ל-2,000 mm3. הנתונים מוצגים עבור אותן קבוצות שבהן לא הגיעו גידולים2,000 מ"מ. (ei) קבוצות של עכברים חולקו באקראי כאשר נפחי הגידול של גידולי MMC הגיעו לכ-500 מ"מ וטופלו ב-5 מ"ג/ק"ג ISAC או נוגדני ביקורת במינון ביום 0 וביום 5. גידולים עובדו למדידת ציטוקינים על ידי MSD , ניתוח ציטומטריית זרימה, כימות mRNA של NanoString, או מקובע פורמלין ומוטבע עבוראימונוהיסטוכימיה בזמנים המוצגים. (ה) חלקות הר געש מתארות שינוי פי 2 של ביטוי גנים בגידולים מטופלים לעומת בקרת איזוטיפ שנמדדו על ידי NanoString ב-24 שעות (n=5 עכברים לקבוצה). שינויים עם ערך p מותאם של < 0.05="" מוצגים="" באדום.="" (ו)="" ציוני="" חתימת="" גנים="" מכומדים="" על="" ידי="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" עבור="" גידולים="" שנותחו="" 24="" שעות="" לאחר="" הטיפול="" (n="5" עכברים="" לקבוצה).="" (ז,="" ח)="" ניתוח="" ציטומטריית="" זרימה="" של="" הרכב="" התא="" הגידולי="" ומצב="" ההפעלה="" 24="" שעות="" ו-6="" ימים="" לאחר="" התחלת="" הטיפול="" (n="4" עכברים="" לקבוצה).="" הנתונים="" מייצגים="" לפחות="" 2="" ניסויים.="">תמונות מייצגות כמו גם כימות של F4/80, CD11c ו-CD8 IHC של גידולים שנקטפו 6 ימים לאחר כל טיפול. פסי קנה מידה הם 50 מיקרומטר. (ai) הנתונים מדווחים כממוצע ו-SEM; *פ<0.05,><0.01,><0.001,><>

T785-ISAC ממוקדי גידול מעוררים רגרסיה של גידול במודל הגידול ה-MMC הסינגני
כדי להעריך את היכולת של ISACs לתווך יעילות אנטי-גידולית בנוכחות תאי B, T ו-NK, השתמשנו בקו תאי עכבר מסוג HER2 (rHER2) המביע עכבר סרטן שד (MMC) שמקורו בשד ספונטני. קרצינומה בעכברי FVB המבטאים rHER2-.כדי למזער את האימונוגניות בין המינים הקשורה לביטוי rHER2 ב-MMC, עכברים מהונדסים המבטאים באופן אנדוגני את Her2 של חולדה תחת השליטהשל מקדם ה-MMTV שימשו כמארח (איור משלים 15) 47. תוך מינוף נוכחות של מערכת חיסונית שלמה לחלוטין, שאפנו להעריך את יכולת ה- ISAC להילחם בגידולים עם עומס גידול גדול של 500 מ"מ, מכיוון שגידולים גדולים יותר הם בדרך כלל קשה יותר לטיפול במודלים פרה-קליניים 48. מתן מערכתי של כל הטיפולים, כולל rHER2 T785-ISAC, נסבל היטב, עם השפעה מינימלית על משקל הגוף (איור משלים 16A). עם זאת, רק ה-rHER2 T785-ISAC הצליח לרפא עכברים הנושאים גידולים גדולים ומבוססים (איור 5A). כפי שנראה במודל הקסנוגרפט, מחקרי דלדול תאים הראו שפעילות אנטי-גידולית משמעותית אבדה כאשר תאים פגוציטים התרוקנו עם ליפוזומים טעוני clodronate (איור 5B). בעוד שה-ISAC לא צפוי לפעול ישירות על תאי T, עכברים שטופלו מראש עם נוגדן CD8-הדלדל איבדו את היכולת לנקות גידולים לאחר שתי מנות של rHER2 T785-ISAC (איור 5C). זה מצביע על כך ש-ISAC ממוקדי גידול יכולים לפעול בעקיפין דרך תאי T, בעקבות הצגת אנטיגנים הקשורים לגידול. בהתאם לנוכחות של זיכרון אימונולוגי, עכבריםנרפא מגידולי MMC בעקבות טיפול rHER2 T785-ISAC היו מוגנים מפני אתגר חוזר של הגידול (איור 5D).

כדי להמשיך ולבחון את המנגנון העומד בבסיס יעילות ISAC במודל הסינגני, לאחר מכן חקרנו את השינויים התאיים, התעתיקים והציטוקינים במיקרו-סביבת הגידול בעקבות מינון ISAC. שתי קבוצות של עכברים הנושאים גידולי MMC גדולים טופלו ב-rHER2 T785-ISAC או בבקרות. גידולים מהקבוצה הראשונה נקצרו 24 שעות לאחר המינון (יום 1) כאשר כל הגידולים היו בגודל דומה (איור משלים 16B). לקבוצה השנייה ניתנה מנה שנייה 5 ימים לאחר הראשונה, ולאחר מכן נקצרה 24 שעות לאחר מכן (יום 6), ובשלב זה גידולים בכל קבוצות הטיפול גדלו באופן מדיד מלבד אלו שטופלו ב-T785-ISAC (איור משלים 16B ). גידולים נותחו על ידי IHC, ביטוי mRNA והפרשת ציטוקינים בליזטים של חלבון. תמיכה נוספת בתצפיות שלנו במודלים של xenograft לפיהם מיקוד גידול נדרש לפעילות ISAC, ניתוח mRNA של גידולים 24 שעות לאחר טיפול rHER2 T785-ISAC הראה שיפור ויסות דרמטי של 34.1 אחוז מהגנים בחסינות הפאן-סרטן של עכבר NanoString פאנל פרופילים בהשוואה לגידולים שטופלו באיזוטיפים. לנוגדן האנטי-rHER2 לבדו הייתה השפעה קלה בלבד על ביטוי הגנים (3.5 אחוזים מהגנים שנותחו) בעוד שהאיזוטיפ הלא ממוקד T785-ISAC לא השפיע על ביטוי הגנים (איור 5E). כפי שניתן לראות במודל Xenograft HCC1954, גנים הקשורים לאיתות והפעלה בתיווך TLR7- היו מווסתים באופן משמעותי על ידי ה-rHER2 T{28}}ISAC המכוון לגידול, המעיד על תגובה חזקה בתיווך TLR (איור 5E). ניתוח נתיבי ביטוי גנים גילה שוב הרמה משמעותית של חתימות גנים עיקריות הקשורות למערכת החיסון, כולל חתימות לניתוח נתיבי ביטוי גנים, גילתה שיפור וויסות משמעותי של חתימות גנים עיקריות הקשורות למערכת החיסון בעקבות טיפול rHER2 T785-ISAC, כולל אלו הקשורים לכימוקינים וציטוקינים (איור 5F). כימות החלבון בוצע על אותם גידולים שנותחו על ידי NanoString, ובהתאמה לממצאי חתימת הגנים, נמדדו רמות מוגברות משמעותית של ציטוקינים פרו-דלקתיים וכימוקינים ב-24 שעות לאחר טיפול ב-rHER2 T785-ISAC (איור משלים 17 ). ציוני חתימת הגנים עלו משמעותית גם עבור עיבוד והצגה של אנטיגן, תפקוד תאים דנדריטים ותפקוד מקרופאג, ותומכים עוד יותר בתגובה מתווכת ומונעת פגוציטוזה ב-Fc-Fc R 24 שעות לאחר rHER2 T785-ISACטיפול (איור 5F ואיור משלים 18). בנוסף לציונים גבוהים משמעותית של חתימת גנים הקשורים לתגובה חזקה בתיווך TLR ו-Fc R, ציון חתימת הגנים עבור תפקוד תאי T עלה גם באופן משמעותי תוך 24 שעות מטיפול rHER2 T785-ISAC, מה שתומך עוד יותר ב מצא שתאי T נדרשים ליעילות בתיווך ISAC (איור 5F ואיור משלים 18).

כדי לאפיין את תאי החיסון שעשויים לתרום לעלייה המוקדמת בייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים וכימוקינים, גידולים נותחו על ידי ציטומטריה זרימה 24 שעות לאחר המנה הראשונה של rHER2 T785-ISAC או הבקרות, ו-6 ימים לאחר התחלת טיפול, 24 שעות לאחר מנה שנייה. ניתוח של גידולים ביום 1 גילה חדירת CD11b פלוס Ly6C פלוס מונוציטים בגידולים שטופלו ב-rHER2 T785-ISAC, ו-CD11b פלוס Ly6G פלוס גרנולוציטים בגידולים שטופלו ב-rHER2 mAb או rHER2 T785-ISAC , אך לא איזוטיפ ISAC או בקרות נוגדנים איזוטיפ (איור 5G). רמות מונוציטים עלו עוד יותר בגידולים שטופלו ב-rHER2 T785-ISAC לאחר 6 ימים. בדומה למה שצפינו במודל Xenograft HCC1954, APCs מיאלואידיים (CD11b פלוס CD11c פלוס F4/80 פלוס ) עלו משמעותית ביום 6 לאחר טיפול rHER2 T785-ISAC בהשוואה לבקרות (איור 5G ואיור משלים 19 ). יתר על כן, נמצאו APCs מיאלואידיים מופעלים ספציפית בקבוצה שטופלה ב-rHER2 T785- ISAC בשתי נקודות הזמן, כפי שנמדד על ידי וויסות עלייה של CD40 על פני התא (איור 5H). חשוב לציין, עלייה ב-APCs מיאלואידיים גידוליים לא נמדדה בעקבות דלדול פגוציטים באמצעות ליפוזומים טעוני קלודרון (איור משלים 20). לבסוף, IHC בוצע כדי להעריך את הנוכחות והמיקום של אוכלוסיות מפתח של תאי חיסון במודל MMC בעקבות טיפול ב-rHER2 T785-ISAC. כפי שנראה במודל הקסנוגרפט HCC1954, טיפול ב-rHER2 T785-ISAC הביא לעלייה דרמטית בתאי CD11c פלוס ו-F4/80 פלוס באזור הפריטמורלי, שלא נראתה לאחר טיפול בנוגדנים rHER2 או טיפול עם איזוטיפ או איזוטיפ T785-ISAC (איור 5I). בהתאם לביטוי המוקדם של הכימוקינים של תאי T וציון חתימת הגנים המוגבר לתפקוד תאי T, חלה משמעותית של תאי CD8 פלוס נצפתה על ידי IHC בתוך הגידולים של עכברים שטופלו ב-rHER2 T785-ISAC ביום 6, בעוד צביעת CD8 בעכברים שטופלו בנוגדנים אנטי-rHER2 או בקרות איזוטיפ נותרה נמוכה (איור 5I). צביעה מוגברת של CD8 פלוס IHC, יחד עם ביטוי גנים מוגבר של גנים הקשורים לתפקוד תאי T ופינוי גידול תלוי 8- CD, תומכים בפוטנציאל של ה-T785-ISAC להפוך גידול קר לחם.CL{ {58}}ISACs מעוררים רגרסיה של גידול במודל גידול xenograft המביע HER2-בינוני כדי להדגים ש-ISACs הם פלטפורמה חזקה על פני מטענים מרובים מעוררי מערכת החיסון, פיתחנו ISAC באמצעות אגוניסט TLR7 ידוע, CL264 עם DAR דומה ל-trastuzumab T785-ISAC (איור 6A ואיור משלים 21). היכולת של ISACs Trastuzumab המיוצרים עם CL264 או T785 לתווך הפעלה מיאלואידית תוך-גידולית הוערכה במודל הקסנוגרפט HCC1954 24 שעות לאחר מתן יחיד של trastuzumab, trastuzumab CL264-ISAC או trastuzumab T{{73}ISAC . הפעלה מוגברת של מיאלואיד נצפתה עם trastuzumab CL 264-ISAC כפי שהוכח על ידי ביטוי CD40 מוגבר ב-CD11b חודר גידול בתוספת CD11c פלוס F4/80 פלוס APCs מיאלואיד בהשוואה ל-trastuzumab או trastuzumab T785-ISAC (איור 6B ).כדי לקבוע אם יכולת ההפעלה המיאלואידית המוגברת של ה-CL264-ISAC מתורגמת לפעילות אנטי-גידולית גבוהה יותר in vivo, ה-trastuzumab CL264-ISAC הושווה ל-T785-ISAC בדגמי הגידול HER2High HCC1954 ו- HER2Med JIMT-1. בעוד שניהםISACs של trastuzumab תיווכו רגרסיה מלאה של הגידול במודל HCC1954 HER2High, ה-CL264-ISAC הדגימה פעילות אנטי-גידולית מוגברת במודל ה-JIMT-1 HER2Med, דבר המצביע על כך שעוצמת ISAC והיכולת לכוון לגידולים בצפיפות אנטיגן נמוכה יותר. להיות מקושר (איור 6ג-ד).

שני ה-ISACs היו נסבלים היטב, אך ראינו ירידה חולפת במשקל גוף של 5-10 אחוזים בבעלי חיים שטופלו ב-trastuzumab CL264-ISAC או rituximab CL264-ISAC, כאשר משקל הגוף התאושש ל- או מעל קו הבסיס במנה השלישית (איור משלים 16A). הפרשת ציטוקינים מערכתית נמדדה בעקבות טיפול ב-T785-ISAC או CL264-ISAC. רמות נמוכות של TNF נמדדו בסרום של בעלי חיים ארבע שעות לאחר מתן ה-T785-ISAC, בעוד שגם ה-ISAC הממוקדים וגם האיזוטיפ CL264- הוציאו רמות גבוהות יותר של הפרשת TNF באופן מערכתי (איור משלים 11) . אין זה סביר שהשפעות אלו בין T785 ו-CL264 ISACs נבעו מהשפעה ישירה של ISAC על צמיחת תאי הגידול, מכיוון שה-ISAC לא עיכב שגשוג תאי סרטן במבחנה (איור משלים 9).

CL264-ISACs מעוררים פינוי גידולים וזיכרון אימונולוגי במודלים של גידולים סינגניים לאור העוצמה והיעילות המוגברות שנצפו עם ה-CL264-ISAC במודלים של קסנושתלים של גידולים אנושיים עם צפיפות אנטיגן HER2 מגוונת, בשלב הבא אפיינו את הפעילות של CL 264-ISACs במודלים של גידולים סינגניים. בדומה ל-T785-ISAC במודל MMC, ה-CL264-ISAC הוביל לרגרסיה ופינוי של הגידול באופן תלוי תאי T, מה שהוביל לזיכרון אימונולוגי עמיד (איור משלים 22A). כדי להעריך את יעילות ISAC במודל גידול סינגני עם ביטוי אנטיגן מופחת, פיתחנו קו תאים CT26 המבטא ביציבות את HER2 של חולדה (CT26-rHER2). חשוב לציין, כ-8.5 אחוז מתאי CT26 אינם מבטאים rHER2 לאחר השתלת גידול (איור 6E). עכברי Wildtype Balb/c שטופלו ב-rHER2 CL264-ISAC הראו חסינות משמעותית נגד גידולים בכך ש-75 אחוז (6 מתוך 8) מהעכברים פיקו את הגידולים שלהם ונשארו נקיים מגידולים למשך הניסוי, ואילו לאף אחד מהעכברים שטופלו בנוגדן האנטי-rHER2 לא הייתה רגרסיה מלאה (איור 6F). נצפתה ירידה חולפת במשקל של כ-10 אחוז ממשקל הגוף בעקבות טיפול rHER2 CL264-ISAC, כאשר משקל הגוף התאושש עד שמונה ימים לאחר תחילת המחקר (איור משלים 22B). הערכנו האם ה-rHER2 CL264-ISAC תיווך זיכרון אימונולוגי נגד גידול חסר ביטוי של האנטיגן הממוקד, rHER2, על ידי אתגר עכברים שנרפאו בעבר מגידולי CT26-rHER2 עם שורת התאים CT26 ההורית שחסרה rHER2 ביטוי. עכברים שנרפאו בעבר מגידולי CT26-rHER2 עם rHER2 ISAC היו מוגנים לחלוטין מפני אתגר עם קו תאים CT26 של ההורים (איור 6I). דלדול תאי T CD4 ו-CD8 לפני האתגר המחודש של הגידול הראה שתאי T נדרשים להגנה. לבסוף, בדקנו האם הזיכרון האימונולוגי שפותח בעכברים שנרפאו בעבר עם ISAC היה ספציפי לאנטיגנים הקשורים לגידול של הגידול הראשוני שטופל. במהלך האתגר מחדש של הגידול CT26 של ההורים, עכברים אותגרו בו זמנית עם גידול אחר, 4T1, שהושתל בצד הנגד. הנתונים מראים כי התפתחות הזיכרון האימונולוגי היהספציפית לאנטיגנים הקשורים לגידולים CT26, שונים מ-rHER2, מכיוון שגידול הגידול של גידולי 4T1 לא הושפע (איור 6G).