מבוסס על פרמקולוגיה ברשת וניסויים בבעלי חיים כדי לחקור את ההשפעה של פנילתנואיד גליקוזיד של Cistanche Tubulosa על השפעת נפרופתיה סוכרתית

תקציר: מטרה לחקור את ההשפעה שלCistancheפנילתנול גליקוזידים(CPhGs) פועלמחלת כליות סוכרתית(DKD) מבוסס על פרמקולוגיה ברשת וניסויים בבעלי חיים. שיטות שיטת UHPLC-QE-MS שימשה לניתוחרכיבים כימיים של CPhGs. מסדי נתונים של TCMSP ו-Swiss Target Prediction שימשו למסך רכיבי ליבה. OMIM ו- GeneCards שימשו כדי להשיג יעדים הקשורים ל-DKD. לאחר השגת יעדים נפוצים, נעשה שימוש באתר STRING לבניית רשת אינטראקציה עם חלבון. מסד הנתונים של DAVID שימש לניתוח מסלולי GO, KEGG ותוכנת Cytoscape שימשה לבניית רשת "רכיבי ליבת CPhGs-נתיב יעד". עשר חולדות נבחרו באקראי כקבוצה הרגילה, והחולדות הנותרות הוזנו במזון עתיר סוכר ושומן וקיבלו זריקה תוך-צפקית אחת של STZ כדי לבסס מודל DKD. הם חולקו לקבוצת מודל, קבוצת דפאגליפלוזין (1 מ"ג/ק"ג) ו-CPhGs גבוה ומינון בינוני ונמוך (500, 25{{40}}, 125 קבוצות מ"ג/ק"ג), 10 בעלי חיים בכל קבוצה, התערבות תרופתית במשך 6 שבועות, נצפו מצבים כלליים, משקל הגוף נקבע ונבדק רמת הגלוקוז בדם מדי שבוע; 24 שעות נאסף שתן לאחר המנה האחרונה. זיהוי חלבון שתן בסך 24-שעה (24-UTP); לאסוף דם מאבי העורקים הבטן ולהקריב אותו, להפריד את הסרום ולזהות חנקן אוריאה (BUN), חומצת שתן (UA), כולסטרול כולל (TC), טריגליצרידים (TG) ולחץ דם גבוה. רמות ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) וליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה (LDL), צביעת HE וצביעת Masson שימשו כדי לצפות בשינויים פתולוגיים ברקמת הכליה, ELISA שימש לזיהוי IL-1 , IL{{17} }, ורמות TNF-, ו-Western blot שימש לזיהוי רקמת כליה. ביטוי חלבון JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, SOCS3. תוצאות סך של 699 רכיבים זוהו על ידי טכנולוגיית UHPLC-QE-MS. לאחר ההקרנה, הושגו 16 מרכיבי ליבה של CPhGs ו-323 יעדים קשורים. CPhGs ו-DKD חלקו 99 יעדים. המטרות העיקריות היו STAT3, SRC, EGFR וכו'. ניתוח מסלולי KEGG סנן 151 מסלולי איתות, והראה שמסלול האיתות IL-17, מסלול איתות PI3K/Akt, מסלול איתות TNF וכו' עשוי למלא תפקיד מפתח ב הטיפול ב-DKD על ידי CPhGs. CPhGs יכולים להעלות את משקל הגוף של חולדות DKD (P＜0.01), להפחית את צריכת המים (P＜0.01), לווסת את חילוף החומרים של גלוקוז ושומנים, להפחית את רמות 24-UTP ו-BUN (P＜0.01), ולשפר את רקמת הכליה . נזק פתולוגי הפחית את ביטוי החלבון של p-JAK2/JAK2 ו-p-STAT3/STAT3 ברקמת הכליה (P＜0.01) והגביר את ביטוי החלבון של SOCS3 (P＜0.01). מסקנה CPhGs מתערבים ב-DKD באמצעות רכיבים מרובים, מטרות מרובות ומסלולים מרובים, אולי על ידי עיכוב JAK2/

מסלול איתות STAT3.

מילות מפתח: Cistanche פנילטנול גליקוזיד; נפרופתיה סוכרתית; UHPLC-QE-MS; פרמקולוגיה ברשת; ניסוי בבעלי חיים; מסלול איתות JAK2 /STAT3

כמה זמן לוקח ל-CISTANCHE לעבוד עבור חולי כליות?

מחלת כליות סוכרתית (DKD), כאחד הסיבוכים המיקרו-וסקולריים החשובים ביותר של סוכרת, הוא לא רק הגורם העיקרי המוביל אליומחלת כליות כרוניתאלא גם הגורם העיקרי למחלת כליות סופנית (ESRD) ברחבי העולם. סיבה [1-2]. טיפול קליני ב-DKD כולל בעיקר שליטה ברמת הסוכר בדם, לחץ הדם ושומני הדם, ושנית הגנה על תפקוד הכליות, הימנעות משימוש בתרופות נפרוטוקסיות ושיפור אורח החיים [3-4]. עם זאת, בשל הפתוגנזה המורכבת של DKD והיעדר יעדי התערבות ספציפיים, לאפשרויות הטיפול הנוכחיות יש מגבלות ואינן יעילות. השכיחות של DKD בשלב סופי עדיין עולה. לכן, ישנה משמעות רבה למצוא תרופות טבעיות יעילות.

Cistanche Deserticola Y. ג. אמא אוCistanche C.הגבעולים הבשרניים היבשים שלCistanche tubulosa (Schenk) Wightעם עלים קשקשים [5] תועדו לראשונה ב-"Shen Nong's Materia Medica" והיו רשומים כדרגה ראשונה. הם ידועים בשם "ג'ינסנג מדברי" [6]. הם מתוקים, מלוחים וחמים. , חוזר למרידיאנים של הכליות והמעי הגס, ויש לו השפעות של הזנת יאנג הכליות, מילוי תמצית ודם, הלחמת המעיים ומששל. מחקרים מראים שפנילתנואידים גליקוזידים (CPhGs) הם אחד המרכיבים הפעילים העיקריים שלו ואחראים להתפתחותו.

הבסיס החומרי להפעלת השפעות פרמקולוגיות; לתמצית Cistanche יש השפעות אנטי-סוכרתיות [7-8], אנטי-סרטן כבד [9], הגנה כלייתית [10-11], הגנה עצבית [12-13] והשפעות פרמקולוגיות אחרות, אך כיום, CPhGs אינם יעילים בטיפול ב-DKD. השפעותיו ומנגנוניו אינם ברורים.

מחקר זה השתמש בפרמקולוגיה רשתית ושיטות עגינה מולקולריות [14], תוך שימוש ב-CPhGs כאובייקט המחקר, חיזוי וניתוח המרכיבים הפעילים העיקריים שלו ויעדים פוטנציאליים לטיפול ב-DKD, ולאחר מכן ביסוס שילוב של סטרפטוזוצין (STZ) גבוה המושרה מודל חולדות DKD המוזן בהזנת שומנים שימש כנושא למחקר in vivo, כדי לספק התייחסות להתרחבות קלינית ויישום של טיפולים קשורים ומחקר נוסף על מנגנון הפעולה.

1 חומר

1.1 בעלי חיים

70-חולדות SD זכר בני שבוע עם רמת SPF, משקל גוף (240±20) גרם, נרכשו ממרכז הניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של שינג'יאנג [רישיון שימוש בבעלי חיים ניסויים מס' SYXK (חדש) {{4} }], ב החיות גודלו בצורה אדפטיבית במשך שבוע אחד בטמפרטורה של (22 ±2) מעלות, לחות יחסית של 50% עד 70%, ומחזור אור וחושך של 12 שעות/12 שעות לסירוגין. הניסוי אושר על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של המרכז הרפואי לבעלי חיים ניסויים של האוניברסיטה הרפואית של שינג'יאנג (מספר אתיקה IACUC-20220127-19).

1.2 ריאגנטים ותרופות

CPhGs (batch number 201610, purity >80%) סופקו על ידי Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. Dapagliflozin (מספר אצווה NB2248) נרכש מ-AstraZeneca, בריטניה. מזון עתיר סוכר ושומן (Cat. No. Boaigang-B1135DM) ו-STZ (אצווה מס' 2021110307) נרכשו מ- Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.; מיקרואלבומין בשתן (אצווה מס' 20220611), חנקן אוריאה (אצווה מס' 20220626), חומצת שתן (אצווה מס' 20220613), כולסטרול כולל (מספר אצווה 20220615), טריגליצרידים (מספר אצווה 262201 צפיפות חלבון 2022-201) ), וליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה (מספר אצווה 20220615) נרכשו מהמכון הביו-הנדסי של Nanjing Jiancheng; אינטרלוקין-6 (IL-6, מספר מגרש JL20896), אינטרלוקין-1 (IL-1, מספר חבילה JL20884), וגורם נמק של גידול- (TNF-, מגרש מספר 13202 ) נרכשו משנגחאי Jianglai Biotechnology Co., Ltd.; נוגדן פוליקלונלי ארנב JAK2 (מספר חבילה 22v9316), נוגדן פוליקלונלי ארנב p-JAK2 (מספר חבילה 78g9360), נוגדן רב שבטי ארנב STAT3 (מספר חבילה 15x8824), נוגדן פוליקלונאלי ארנב מסוג p-STAT3 (נוגדן פוליקלונאלי פוליקלונאלי 1478m) (מספר 1478m polyclonal) מספר 31d4841) כולם נרכשו מ- Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.; נוגדן פוליקלונאלי מסוג IgG לעז נגד ארנבת עם תווית HRP (מספר אצווה 20000758) נרכש מ- Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.; נוגדן חד שבטי ארנב אקטין (מספר אצווה AC230205001), חיץ תמוגה RIPA (מספר אצווה 20220416), ערכות לקביעת ריכוז חלבון BCA (מספר אצווה 20230401) נרכשו מ- Beijing Solebao Technology Co., Ltd.

1. 3 מכשירים

Vanquish כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים במיוחד, ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה של Q Exactive Focus, צנטריפוגה Heraeus Fresco17, קורא צלחות אוטומטי FC (Thermo Fisher Scientific, ארה"ב); מטחנה JXFSTPRP-24 (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Mingche D24 UV מד מים טהורים (גרמניה Merck Millipore Company); עמודה ACQUITY UPLC BEH C18 (1. 7 מיקרומטר, 2. 1 מ"מ×100 מ"מ) (American Waters Company); מד סוכר בדם Accu Chek Performa (חברת רוש השוויצרית); קריוסטט CM1850UV, מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף DM300 (חברת לייקה, גרמניה); מד מערבולת GL-88B (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); מאזן אנליטי אלקטרוני (Bio-Rad Company, ארה"ב).

2 שיטות

2. 1 UHPLC-QE-MS ניתוח

2.1.1 הכנת תמיסת בדיקה

שקלו 100 מ"ג CPhGs, הוסף 500 μL 80% מתנול, מערבולת במשך 30 שניות, בצע אולטרסאונד באמבט מי קרח למשך שעה, תן לעמוד ב--40 מעלות למשך שעה, צנטריפוגה ב-4 מעלות , 12 000 r/min למשך 15 דקות, שאפו את הסופרנטנט, 0. סנן דרך ממברנה מיקרו-נקבית של 22μm ושמור במקרר של -80 מעלות.

2.1.2 תנאים כרומטוגרפיים

עמודה ACQUITY UPLC BEH C18 (1. 7 מיקרומטר, 2. 1 מ"מ × 100 מ"מ); אצטוטריל פאזה ניידת (A) -1% חומצה פורמית (B), פליטת שיפוע (0 ~ 11 דקות, 15% ~ 75% A; 11 עד 12 דקות, 75% עד 98% A; 12 עד 14 דקות, 98% A; 14 עד 14. 1 דקות, 98% עד 15% A 14. 1 עד 15 דקות; קצב זרימת נפח 0 . 5 מ"ל/דקה; טמפרטורת עמודה 35 מעלות; נפח הזרקה 5 μL.

2.1.3 תנאי ספקטרומטריית מסה

סריקה מלאה ddMS2 מצב סריקה מלאה; קצב זרימת נפח גז נדן 45 ארב; קצב זרימת נפח גז עזר 15 ארב; טמפרטורת נימי 400 מעלות; אנרגיית התנגשות במצב NCE 15% ~ 30% ~ 45% מחזור; מתח ריסוס ± 4. 0 קילו וולט.

2.2 מחקר פרמקולוגיה ברשת

2. 2. 1 CPhGs

בדיקת יעדי רכיבים: מיין את הרכיבים הכימיים שנותחו על ידי UHPLC-QE-MS לפי תוכן יחסי, ומחק את אלו שהמבנה הכימי שלהם טרם נקבע. הזן את המספר הסידורי של InChIKey של המרכיבים שנבדקו במסד הנתונים של TCMSP כדי לקבל את הפרמטרים הפרמקוקינטיים של כל מרכיב. בהתבסס על התנאים של זמינות ביולוגית דרך הפה (OB) > 30% ודמיון לתרופות (DL) > 0.18, מועמדים שיעמדו בדרישות ייבדקו. הזן את המספר SMILES של כל רכיב במסד הנתונים של חיזוי יעדים בשוויץ כדי לחזות את היעד, ולקבל את יעד הרכיב הכימי של CPhGs.

2. 2. 2 DKD

סקר יעדי מחלה השתמש ב"נפרופתיה סוכרתית" כמונח החיפוש לחיפוש יעדי מחלה במאגרי מידע של OMIM, GeneCards ו-NCBI.

2. 2. 3 בניית רשת רכיב-יעד-מחלה

המטרות הצולבות של רכיבים ומחלות CPhGs הושגו באמצעות מיפוי תוכנת R, ותוכנת Cytoscape 3.7.2 שימשה לבניית מערכת רשת רכיב-יעד, שבה ניתוח הפלאגין זיהה יעדי ליבה.

2. 2. 4 בניית רשת אינטראקציה חלבון-חלבון (PPI)

ייבא את חלבוני היעד לצומת של רכיבים ומחלות למסד הנתונים של STRING, בנה רשת אינטראקציה חלבון-חלבון (PPI), מחק חלבונים ללא צמתים מחוברים ברשת, וקבע את רמת הביטחון של ציון אינטראקציית חלבון הנמוך ביותר ל-{{1} }.700. בנה רשת PPI, הורד את תוצאות פורמט ה-TSV ​​שלה, ייבא אותן לתוכנת Cytoscape 3.7.2, והשתמש בתוסף הניתוח כדי להמשיך במסך יעדי ליבה.

2. 2. 5 GO, ניתוח KEGG

השתמש בקטע 'ביאור פונקציונלי' במסד הנתונים של DAVID כדי לבצע ניתוח העשרה על יעדי ההצטלבות של מחלות מרכיבות. תחילה הגדר את פרמטרי הניתוח, הזן את יעד ההצטלבות בתיבת רשימת הגנים, בחר סמל גן רשמי כמזהה היעד, בחר רשימת גנים כסוג הנתונים (סוג רשימה), ובחר "הומו סאפיינס (מינים)" בתור מקור יעד (מינים). Race)", התחל את הניתוח לאחר אישור פרמטרי הניתוח, השג את תוצאות הניתוח של GO ו-KEGG, ולאחר מכן השתמש בפלטפורמת הציור המקוונת ImageGP כדי לצייר את דיאגרמת הבועות של תוצאות הניתוח של KEGG ו-GO. תוכנת Cytoscape 3.7.2 בונה את הרכיב -תמונת רשת יעד-נתיב.

2. 2. 6 עגינה מולקולרית

תחילה הורד את דיאגרמת המבנה התלת-ממדית של החומר הפעיל בפורמט SDF ממסד הנתונים של PubChem, לאחר מכן הורד את דיאגרמת המבנה התלת-ממדית של יעד ההצטלבות בפורמט PDB ממאגר החלבונים העולמי האמריקאי (PDB), ולבסוף העלה אותו ל-CB-Dock אתר לעגינה מולקולרית. הסר את קונפורמציות העגינה הדומיננטיות ודמיין אותם עם Pymol.

2.3 ניסויים בבעלי חיים

2.3.1 דוגמנות, קיבוץ ומתן תרופות

10 חולדות נבחרו באופן אקראי כקבוצה הרגילה והוזנו בהזנה רגילה, והחולדות הנותרות הוזנו במזון עתיר סוכר ושומן. לאחר 6 שבועות, ניתנה להם הזרקה חד-פעמית תוך צפקית של 30 מ"ג/ק"ג STZ (0.1 mmol/L STZ מומס במאגר נתרן ציטראט pH 4.5), ו-72 שעות לאחר מכן, דם נלקח מוריד הזנב. כדי לזהות גלוקוז בדם בצום (FBG). אם FBG גדול או שווה ל-16. 7mmol/L, מודל הסוכרת הוקם בהצלחה [15]; להמשיך הם הוזנו במזון עתיר סוכר ושומן במשך שבועיים. מודל DKD נקבע כמוצלח בהתבסס על חיוביות גלוקוז בשתן ו-24-חלבון בשתן הכולל של 24-שעה (24-UTP) גדול או שווה ל-20 מ"ג. מתוכם, 3 מתו במהלך תהליך הדוגמנות ו-7 לא הצליחו. , בסך הכל 50 הצליחו. החולדות שעוצבו בהצלחה חולקו באופן אקראי לקבוצת המודל, קבוצת ה-dapagliflozin (1 מ"ג/ק"ג) ו-CPhGs במינון גבוה, בינוני ונמוך (500, 250, 125 מ"ג/ק"ג). כל קבוצת מתן ניתנה תוך קיבה. החולדות בקבוצה הרגילה ובקבוצת המודל קיבלו תרופות תואמות, ולחולדות בקבוצה הרגילה ובקבוצת המודל ניתנה אותה כמות של תמיסת מלח רגילה באמצעות מתן מתן, פעם ביום למשך 6 שבועות בסך הכל. במהלך תקופת המתן, חולדות בכל קבוצה מלבד הקבוצה הרגילה המשיכו לקבל מזון עתיר שומן.

2.3.2 זיהוי אינדיקטור ביוכימי

לאחר 6 שבועות של התערבות CPhG, נאסף שתן של 24-שעה מהחולדות, ונמדד חלבון שתן בסך 24-שעה (24-UTP); דם נאסף מוריד הזנב בצום כדי לזהות רמות FBG; דם נאסף מאבי העורקים הבטן, 4 מעלות, 1500 r/min. צנטריפוגה במשך 10 דקות כדי להפריד את הסרום ולגלות חנקן אוריאה בסרום.

BUN), חומצת שתן (UA), כולסטרול כולל (TC), טריגליצרידים (TG), ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL), רמות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה LDL).

2.3.3 התבוננות במורפולוגיה פתולוגית של רקמת הכליה

החולדות הורדמו עם נתרן פנטוברביטל והוקרבו. הכליות קולפו, נשקלו, קבועות עם 4% פרפורמלדהיד, התייבשו, שקופות, טבלו בשעווה, הוטמעו ונחלקו לצביעה של המטוקסילין-אאוזין (HE).

לאחר צביעת מאסון, נצפתה מורפולוגיה של הרקמה תחת מיקרוסקופ, ותוכנת Image-Pro Plus 6.0 שימשה כדי לנתח את הצפיפות האופטית המשולבת ולכמת את שטח סיבי הקולגן היחסי.

2. 3. 4 אליסה

השיטה שימשה לאיתור רמות הגורמים הדלקתיים בסרום בחולדות. הרמות של IL-6, IL-1 ו-TNF- זוהו בהתאם להוראות הערכה.

2. 3. 5 שיטה Western blot לאיתור ביטוי חלבון קשור

נלקחה רקמת כליה של חולדה, נוספה RIPA lysate למיצוי סך החלבון, והריכוז נקבע בשיטת BCA.

לאחר אלקטרופורזה של סודיום דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל, העבר לממברנת PVDF, ולאחר חסימה, JAK2 (1: 2000), p-JAK2 (1: 1000), STAT3 (1: 2000), p -STAT3 (1:2000), SOCS3 (1:2000), -אקטין (1:2000) נוגדנים, דגירה ב-4 מעלות למשך הלילה, הוסף נוגדן משני מסוג IgG עם התווית HRP (1:5000), ודגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה, שפותחה עם ערכת אלקטרו-אור, חשופה באמצעות תמונת ג'ל חלבון, באמצעות תוכנת Image J

ניתוח כמותי של חלקים. שימוש ב-actin בתור ההתייחסות הפנימית, היחס בין הערך האפור של פס המטרה לבין פס ההתייחסות הפנימי הוא ביטוי החלבון היחסי.

2.4 ניתוח סטטיסטי

הנתונים עובדו על ידי תוכנת SPSS 25.0, והנתונים הובאו כ-(x±s). נעשה שימוש בניתוח שונות בכיוון אחד לצורך השוואה בין קבוצות. פ<0.05 indicates that the difference is statistically significant.