אקטאוזיד המופק מ- Cistanche משפר אוסטאופורוזיס הנגרמת על ידי גלוקוקורטיקואידים על ידי הפעלת PI3K/AKT/mTOR Pathway

תַקצִיר

מַטָרָה

גלוקוקורטיקואידים נמצאים בשימוש נרחב בפרקטיקה הקלינית; עם זאת, הם עלולים לגרום לתופעות לוואי, כגוןאוסטאופורוזיס. אקטאוזיד(ACT) מ-Cistanche שימש למאבק במגוון מחלות. המחקר נערך כדי להעריך את היעילות של ACT בהשראת גלוקוקורטיקואידיםאוסטאופורוזיס(GIOP) והמנגנון הפוטנציאלי שלו.

שיטות
Dexamethasone (Dex) הוזרק לשריר כדי לגרוםאוסטאופורוזיסבדגם חולדה, ו-ACT ניתן בעל פה. ACT הוסף in vivo ב-Dex-stimulatedאוסטאובלסטיMC3T3-תאי E1. RT-qPCR בוצע כדי להעריך את רמות ה-mRNA שלהיווצרות עצם(Runx2, CoL1A1), וספיגת עצם (OPG ו-RANKL). ערכת ELISA מסחרית הושמה להערכת רמות OC ו-CTX בסרום. כתם Western בוצע כדי להעריך את רמות החלבון במסלול האיתות PI3K/AKT/mTOR. מבחן CCK-8 וציטומטריית זרימה בוצעו כדי להעריך כדאיות אוסטאובלסט ואפופטוזיס.

לחץ כאן כדי לקבל Cistanche Acteoside לטיפול באוסטאובלסטיים מגורים Dex

תוצאות
ACT הפחית את הידרדרות מיקרו-מבנה העצם הנגרמת על ידי Dex, הגדילה את רמות הסרום של OC והפחיתה את רמות ה-CTX (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and מקדם אפופטוזיס; עם זאת, השפעה זו נחלשה מאוד על ידי ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

סיכום
ACT מCistancheעשוי להפעיל השפעות אוסטאופרוטקטיביות על ידי הפעלת מסלול האיתות PI3K/AKT/mTOR כדי להקל על אוסטאופורוזיס הנגרמת על ידי Dex.

מילות מפתח:אקטאוזיד Cistancheהמושרה על ידי גלוקוקורטיקואידיםאוסטאופורוזיס

מבוא
אוסטאופורוזיס (OP) היא מחלת שלד כללית המאופיינת במסת עצם נמוכה, הרס של מבנה המיקרו של רקמת העצם וחוסר איזון בהומאוסטזיס של העצם [1]. OP גורם ליותר מ-8.9 מיליון שברים בשנה ושברים אוסטאופורוטיים מתרחשים כמעט כל 3 שניות, ומובילים לנכות לכל החיים או למוות [2]. גלוקוקורטיקואידים (GCs) ניתנים בדרך כלל לטיפול במחלות דלקתיות לא זיהומיות (כגון אסטמה ומחלות מעי דלקתיות) וכן במצבים אוטואימוניים [3]. עם זאת, שימוש ארוך טווח ב-GC גורם ליותר מ-30% ממקרי ה-OP ולמעלה מ-10% ממקרי האוסטאונקרוזיס [4]. GCs מעכבים ישירות את התפשטות אוסטאובלסטים [5], מפחיתים את ההבשלה והפעילות, ומעוררים אפופטוזיס של אוסטאובלסטים, אשר בתורו מוביל להתפתחות אוסטאופורוזיס הנגרמת על ידי גלוקוקורטיקואידים (GIOP) [6]. יתרה מכך, עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שתפקוד לקוי של אוסטאובלסט הוא הגורם העיקרי לאובדן עצם. לכן, נראה כי עלייה במספר ובתפקוד של אוסטאובלסטים היא האסטרטגיה העיקרית למניעת OP, במיוחד GIOP.

תרופות צמחיות, בעיקר אלו המבוססות על תרכובות טבעיות, נהוגות כבר אלפי שנים לטיפול במחלות שונות [7]. Cistanche הוא עשב יקר שתועד בפרמקופיה הסינית הגדל באזור הדרומי של האזור האוטונומי שינג'יאנג אויג'ור וידוע כג'ינסנג מדברי [8]. ל- Cistanche הוכחה השפעות שונות, כגון שיפור מערכת החיסון, הגנה על הכליות, אנטי-אייג'ינג, נוגדי חמצון, אנטי דלקתיים והשפעות נוירו-פרוקטטיביות [9].אקטאוזיד(ACT) הוא גלוקוזיד פניל ​​אתנולי ב-Cistanche, בעל פעילויות ביולוגיות, כגון עיכוב של אפופטוזיס עצבי [10], הקלה על נזקי כבד [11], אנטי דלקתיות [12], נוגדי חמצון [13] , מניעת סוכרת [14], והשמנת יתר [15], כמו גם ניוון של הסחוס המפרקי [16]. יתר על כן, מספר מחקרים דיווחו על הפרמקוקינטיקה של ACT ואישרו שהאפקט הטיפולי קיים גם אם השימוש בפה הוא 0.12 אחוז בלבד. ACT נחשבת לתרופה פרו עם מטבוליטים פעילים in vivo [17].

ג'אנג ואחרים. הדגימה השפעה מגנה פוטנציאלית של ACT על אובדן עצם כתוצאה מניתוח כריתת שחלות בחולדות [18]. ACT מווסת את מסלול האיתות IGF-1/PI3K/mTOR כדי למנוע איבוד עצם בחולדות סוכרתיות [19]. למסלול PI3K/AKT/mTOR דווח כי יש תפקידים רגולטוריים קריטיים במחלות שונות, כולל GIOP [20]. נרינגין מקל על GIOP על ידי ויסות מסלול האיתות PI3K/AKT/mTOR [21]. בנוסף, מסלול איתות זה מווסת התמיינות אוסטאובלסט [22], יצירת עצם [23] וריפוי שברים [24]. עם זאת, התפקיד הפוטנציאלי של ACT ב-GIOP והאם הוא מווסת על ידי אפנון של מסלול האיתות PI3K/AKT/mTOR אינו ידוע.

המחקר הנוכחי נועד להבין את השפעות ההגנה של ACT במודל חולדות GIOP ואוסטאובלסטים במבחנה ולהבהיר את המנגנונים המולקולריים הבסיסיים.

חומרים ושיטות
חיות ניסוי
ארבעים חולדות זכרים של ספראג-דאולי (SD) בני 8-שבוע, במשקל 280-340 גרם, התקבלו ממרכז החיות של Shanghai Laboratory (CAS, שנחאי, סין). נהלי הטיפול בחיות הניסוי בוצעו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה לאתיקה לבעלי חיים של בית החולים השלישי של האוניברסיטה הרפואית של צ'יקיהאר. והמחקר נערך בהסכמה להנחיות ARRIVE. בעלי חיים שוכנו במרכזי בעלי חיים ללא פתוגנים, 24 ± 2 מעלות, מחזורי אור וחושך של 12 שעות, 50 ± 5 אחוזי לחות, ועם גישה חופשית למזון ומים.

בניית דגם GIOP
לאחר 7 ימים של האכלה אדפטיבית חולקו חולדות באופן אקראי לקבוצות בקרה ומודלים בשיטת טבלת המספרים האקראיים, הוזרק Dexamethasone (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, ארה"ב) 5 מ"ג/ק"ג פעמיים בשבוע למשך 6 שבועות תוך שרירית כדי לגרום ל-OP בחולדות בקבוצת המודלים [25]. לחולדות בקבוצת הביקורת (n = 10) הוזרקה כמות שווה של תמיסת מלח. לא נצפו שינויים משמעותיים במשקל הגוף בחולדות בשתי הקבוצות לאחר 6 שבועות. לאחר מכן, החולדות בקבוצת המודל חולקו לקבוצת המודל, קבוצת המינון הנמוך של ACT (Model plus ACT-L) וקבוצת המינון הגבוה של ACT (Model plus ACT-H). ACT (HPLC 98 אחוז) הושג מ-Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, סין), וטופל עם תרחיף ממס מימי. מינון של 50 מ"ג/ק"ג/ד' ו-100 מ"ג/ק"ג/ד' ACT ניתנה דרך הפה לחולדות בקבוצות המינון הנמוך והגבוה (8 חולדות לקבוצה), בהתאמה, וכן נמשך במשך 8 שבועות. ביניהם, גודל המדגם חושב על סמך מחקר קודם [26]. בהתחשב ברמת מובהקות דו-צדדית של 0.05 [רווח בר סמך 95% (= 0.05)], 80 אחוז הספק וגודל אפקט של 0.5, ניתוח הספק העריך את גודל המדגם הדרוש של 6 בעלי חיים לקבוצה בהנחה של רמת ההשפעה הרלוונטית של 30 אחוז אוסטאופורוזיס. יתרה מכך, עם שיעור נשירה של 20 אחוזים, 8 בעלי חיים לקבוצה (סה"כ 32 חולדות) נחשבו לאידיאליים.

דגימות סרום של חולדות
לאחר 8 שבועות, חולדות הורדמו עם 10 אחוז כלורלי הידרט (400 מ"ג/ק"ג, תוך-צפקי, Solarbio, בייג'ינג סין), דם נאסף מאבי העורקים הבטן, קרוש בטמפרטורת החדר, וצנטריפוגה ב-3500 סל"ד לדקה למשך 10 דקות. הסרום אוחסן בשפופרות צנטריפוגות של 1.5 מ"ל עד לשימוש נוסף.

הערכת צפיפות מינרלים בעצם
צפיפות מינרלים של עצם (BMD) הייתה בשימוש על ידי DAX צפיפות עצם של בעלי חיים קטנים (Ranzhe Instrument Equipment Co., שנחאי, סין). בקצרה, החולדות הונחו במצב שכיבה והגפיים האחוריות הוצבו כלפי חוץ. עצם הירך הימנית של החולדות נסרקה לפי הוראות היצרן, וערכי ה-BMD נרשמו [27].

ניתוח מורפולוגיה של העצם
בסוף הניסוי, החולדות הורדמו בהזרקה תוך-צפקית של עודף כלורלי הידרט, ועצם הירך מקובעת ב-70 אחוז אתנול. לאחר מכן, בוצעו סריקות במערכת VivaCT 40μCT כמתואר במחקר הקודם ונפח העצם/נפח הכולל (BV/TV), מספר העצם (Tb.N), עובי העצם (Tb.Tn) והפרדת העצם הטראבקולרית. (Tb.Sp) הוערכו [28]. עבור המתת חסד, חולדות SD הורדמו לאחר ניתוח מורפולוגיה של העצם על ידי הזרקה תוך צפקית של 10 אחוז כלורלי הידרט (350 מ"ג/ק"ג).

בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA)
ערכות ELISA מסחריות שימשו לזיהוי רמות אוסטאוקלצין (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) ו-C-terminal telopeptide (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) בסרום של חולדות. בקצרה, הריאגנטים הוסרו ב-18-25 מעלות כדי להתאזן ולהכין את התמיסה לכביסה ולעבודה רגילה. לוחות אנזים לוחות הוקמו עם בארות סטנדרטיות, ריקות ובארות מדגם. כ-100 μL תמיסת דילול מדגם נוספה לבארות, הודגרה למשך 90 דקות ב-37 מעלות, והוחלפה בנוגדן ביוטיניל למשך 60 דקות ב-37 מעלות. לאחר הכביסה, נוספה תמיסת העבודה קושרת האנזים והודגרה למשך 30 דקות. תמיסת המצע (90 μL) נוספה והודגרה למשך 15 דקות עם הגנה מפני אור. כאשר הופיע הגרדיאנט הכחול בבארות הסטנדרטיות, נוספו 50 μL מתמיסת הסיום והשינוי ב-OD450 נותח.

שיעתוק הפוך-PCR בזמן אמת כמותי (RT-qPCR)
מגיב TRlzol LS התווסף לסרום של חולדות ותאי MC3T3-E1 שטופלו ב-ACT, וה-RNA הכולל הוצא על ידי דגירה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הוספת כלורופורם. ריכוז וטוהר RNA אושרו על ידי מדידת ספיגת A260/280 בספקטרופוטומטר Nanodrop ND-1000. ערכת SuperScript II Reverse Transcriptase שימשה לתעתוק הפוך של RNA ל-cDNA. לאחר מכן, ה-cDNA הוחל כתבנית, הוסף פריימר, וערכת מיקס המאסטר SYBR-Green PCR עורבבה והוספה עם ddH2O ל-20 μL, ותגובת ההגברה של PCR בוצעה באמצעות ה-Applied biosystems AMI7500 Fast Real-Time PCR מערכת (ABI, קליפורניה, ארה"ב). GAPDH שימש כהתייחסות פנימית לנורמליזציה, ורמות הביטוי היחסיות חושבו בשיטת 2−ΔΔCt ובוצעו בשלושה עותקים. רצף ה-primer עבור גורם שעתוק קשור ל-Runt (Runx2), קולגן מסוג I 1 (CoL1A1), מפעיל קולטן של ליגנד גורם גרעיני-κB (RANKL), אוסטריקס ואוסטאופרוטגרין (OPG) מוצגים בטבלה 1.

ניתוח כתם מערבי
לתאים נוספו ליסט RIPA המכיל 1 אחוז מעכב פרוטאז, וכל החלבון מכל קבוצה נאסף לאחר תמוגה של התאים על ידי ניעור במשך 5 דקות ב-4 מעלות. ערכת בדיקת BCA הופעלה כדי לכמת את ריכוז החלבונים בכל קבוצה. לאחר מכן, דגימות החלבון עורבבו עם חיץ 10 אחוז סודיום דודציל סולפט (SDS) בנפח שווה והורתחו באמבט מים ב-95 מעלות למשך 5 דקות לצורך דנטורציה של חלבון. הוכן ג'ל אנכי של 12 אחוז SDS-polyacrylamide, ולאחר שהג'ל התמצק, נדגמו 30 אג' של חלבון עבור הפרדת אלקטרופורזה בג'ל של 120 mA 90 דקות. לאחר מכן החלבון הועבר לממברנת PVDF ב-90 V למשך 120 דקות. לאחר איטום עם 5 אחוז אלבומין בסרום בקר, קרום PVDF נחתך על סמך המשקל המולקולרי של הסמן ורצועת חלבון המטרה והודגרה עם הנוגדן הראשוני המתאים למשך הלילה ב-4 מעלות. נוגדנים רב-שבטיים של ארנב נגד p-AKT, p-mTOR ו-p-PI3K דוללו ליחס של 1:1000 (Proteintech, Wuhan, סין). TBST נשטף למשך 30 דקות והודגר עם הנוגדן המשני המתאים שסומן חזרת פרוקסידאז בטמפרטורת החדר למשך שעה. הכתם הוצג באמצעות ריאגנטים chemiluminescence משופרים. הצפיפות של להקות חלבון כמתה באמצעות תמונה J. GAPDH שימש כבקרה לחישוב רמות חלבון יחסיות.

תרבות תאים וקיבוץ
פרה-אוסטאובלסטים של עכברים MC3T3-E1 נרכשו מאוסף הרקמות הסיני (CTCC, סין) ותופחו ב-MEM המכיל 10 אחוז סרום בקר עוברי ו-100 יחידות למ"ל פניצילין, ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין אינקובטור לח ב-37 מעלות ו-5 אחוז CO2. לתרבית התמיינות עצם, מדיום אינדוקציה אוסטאוגני נוצר על ידי ערבוב של 10 מ"מ- -גליצרופוספט ו-50 מ"ג/מ"ל של חומצה אסקורבית (Sigma-Aldrich) עם -MEM והוסף לתאי MC3T3-E1 כדי לגרום הבידול שלהם. המדיום הוחלף לאחר 3 ימים. תרביות במשך 14 ימים שימשו לכדאיות אלקליין פוספטאז (ALP). יתר על כן, תאים טופלו מראש עם מעכב PI3K LY294002 (10 מיקרומטר) למשך 30 דקות, ולאחר מכן טיפול עם Dex ו-ACT.

בדיקת כדאיות תאים
בדיקת ערכת ספירת התא-8 (CCK-8) בוצעה כדי להעריך את כדאיותם של אוסטאובלסטים שטופלו ב-ACT. תאי MC3T3-E1 חוסן לתוך צלחות של 96 בארות ב-5 × 103 תאים/באר. כמות של 1 מיקרומטר של Dex נשקללה בהתבסס על מחקרים קודמים [29] והודגרה יחד עם ריכוזי גרדיאנט של ACT (10-8, 10-7, 10-6 ו-10-5 M). מצע התרבות בפלטות הבאר 96-הוחלף לאחר הוספת מדיום ערבוב ומגיב CCK-8 ביחס של 10:1. לאחר המשך הדגירה למשך שעה אחת ב-37 מעלות, הוערך השינוי ב-OD450.

זיהוי מספר אפופטוזיס אוסטאובלסט
תאי MC3T3-E1 שהיו נתונים לטיפולים שונים עוכלו באמצעות טריפסין נטול EDTA ונאספו באמצעות צנטריפוגה. לאחר כביסה עם חיץ מקשר של 1 ×, נוספו 5 μL Annexin V-FITC והודגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, בתוספת 5 μL PI והועבר דרך רשת ניילון 200-. הדגימות נותחו באמצעות מערכת ציטומטריית זרימה FACScan.

בדיקת פעילות ALP
תאי MC3T3-E1 חוסן לתוך 24-צלחות באר, ו-ACT ו-Dex נוספו לאחר הטיח. המדיום לתרבית התא הוחלף במדיום התמיינות אוסטאוגני לתרבית. לאחר שימוש בתמוגה של תאים על ידי תמיסת תמוגה של תאים (P0012J, Beyotime Biotechnology), הסופרנטנט נאסף על ידי צנטריפוגה, והעקומה הסטנדרטית שורטטה. ערכת ALP (P0132S, Beyotime Biotechnology) שימשה להערכת פעילות ALP ו-OD450 חושב.

ניתוח סטטיסטי
לאחר ביצוע שלושה ניסויים עצמאיים בשלושה עותקים, הנתונים נותחו באמצעות תוכנת GraphPad Prism 6.0 והובאו כממוצע ± סטיית תקן. ANOVA הופעל כדי להשוות הבדלים סטטיסטיים בין מספר קבוצות. ערך P < 0.05 נחשב שונה סטטיסטית.