ACKR4a משרה אוטופגיה לחסום איתות NF-kB ואפופטוזיס כדי להקל על זיהום Vibrio Harveyi

סיכום

אוטופגיה ואפופטוזיס הם שני מנגנונים מוכרים של עמידות בפני פלישת חיידקים. עם זאת, גם חיידקים פיתחו את היכולת להתחמק מחסינות. במחקר זה, אנו מזהים את ACKR4a, בן למשפחת קולטני כימוקינים לא טיפוסיים, כמדכא של מסלול NF-kB, המשתף פעולה עם Beclin-1 כדי לגרום לאוטופגיה לעכב איתות NF-kB ולחסום אפופטוזיס, מה שמקל זיהום Vibrio harveyi. מבחינה מכאנית, Ap-1 המושרה על ידי V. harveyi מפעיל את השעתוק והביטוי ACKR4a. ACKR4a יוצר קומפלקס עם Beclin-1 ו-MyD88, בהתאמה, המעוררים אוטופגיה ומעבירים את MyD88 לתוך הליזוזום לצורך פירוק כדי לדכא ייצור ציטוקינים דלקתי. בינתיים, אוטופגיה הנגרמת על ידי ACKR4a חוסמת אפופטוזיס על ידי עיכוב קספאז8. מחקר זה מוכיח לראשונה כי V. harveyi משתמש הן באוטופגיה והן באפופטוזיס כדי להתחמק מחסינות מולדת, דבר המצביע על כך ש-V. harveyi פיתח את היכולת נגד חסינות דגים. 

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

מבוא

מערכת החיסון מחולקת בדרך כלל לחסינות מולדת ונרכשת, כאשר רוב האורגניזמים מסתמכים בעיקר על חסינות מולדת לצורך הישרדות.1 החסינות המולדת היא מנגנון הגנה שנוצר באורגניזמים. הוא מזהה את התבנית המולקולרית הקשורה לפתוגן (PAMP) דרך קולטני זיהוי הדפוסים (PRR), יוצר תגובה מהירה לזיהום פתוגני, ומגן על המארח מפני זיהום.2,3 כ-PRR חשוב, קולטנים דמויי אגרה (TLR) יכול ליזום מגוון רחב של תגובות מפגוציטוזיס לייצור ציטוקינים, ובכך לשפר עוד יותר את התגובות החיסוניות הדלקתיות והמולדות.4 ברוב המקרים, TLRs מאותתים בעיקר דרך מסלול תלוי MyD, אשר מעביר אותות דרך תגובות מפל להפעלת גרעין factor-kappa B (NF-kB).5 NF-kB הוא אחד מגורמי המפתח בהתחלת חסינות מולדת והוא חיוני לתיאום התגובה הדלקתית, חסינות מולדת, התמיינות תאים, שגשוג והישרדות, והוא נחשב ליוזם העיקרי של התגובה הדלקתית.6 כאשר חיידקים מדביקים את הפונדקאי, משפיעים במורד הזרם של התגובה החיסונית המולדת כגון ציטוקינים וכימוקינים, ובסופו של דבר מובילים לתגובה דלקתית לחסימת הצמיחה של חיידקים. עם זאת, באבולוציה משותפת עם המארחים שלהם, חיידקים פיתחו גם אסטרטגיות רגולטוריות שונות כדי להתחמק ולערער את ההגנה של המארח שלהם.

אוטופגיה ואפופטוזיס נחשבים לשני המסלולים החשובים נגד פלישת חיידקים.7 אוטופגיה היא תהליך שמרני המעביר חלבונים לא תקינים לליזוזומים לצורך פירוק וממלא תפקיד חשוב בחסינות המולדת של אאוקריוטים נגד פלישת חיידקים.8,9 עם זאת, כמה חיידקים מתחמקים מחסינות על ידי שימוש באוטופגיה ביונקים. בדרך כלל, תאים שואפים להסיר חיידקים חוץ-תאיים פולשים וחיידקים המתיישבים בציטופלזמה באמצעות אוטופגיה,10 אך חיידקים מסוימים יכולים 'לחטוף' אוטופגיה כדי להשלים צמיחה עצמית ורבייה.11–13 לדוגמה, Unc-51-כמו קינאז 1 (ULK1), Beclin1, שרשרת קלה של חלבון 3 (LC3) הקשורים למיקרו-צינוריות וחלבונים הקשורים לאוטופגיה (ATG) משתפים פעולה ליצירת אוטופגוזומים, אשר עוטפים מיקרואורגניזמים פולשים ומעבירים אותם לליזוזומים לפירוק.14-16 עם זאת, Mycobacterium tuberculosis למטה -מווסת את Beclin-1 כדי למנוע היווצרות אוטופאגוזומים, בסופו של דבר מעכב אוטופאגיה ומקדם זיהום.17 בניגוד לעיכוב של היווצרות אוטופגוזומים, חלק מהחיידקים משתמשים באוטופגוזומים כדי להשלים אתרים משכפלים עצמיים כדי לקדם ריבוי.11,18 בנוסף אוטופגיה, אפופטוזיס היא גם אמצעי להגנה מארח מפני פתוגנים פולשים.7 אפופטוזיס הוא דפוס מוות של תאים המשמש להסרת תאים פגומים כדי לשמור על יציבות הסביבה המערכתית.19 לאחר קבלת אות של פלישת חיידקים, המארח גורם לאפופטוזיס של נגועים תאים כדי לעכב זיהום חיידקי.20 לכן, התיישבות חיידקית מוצלחת תלויה ביכולתה למנוע אפופטוזיס ולהגן על שכפול חיידקים. לדוגמה, Edwardsiella tarda מבטיחה את הישרדותה על ידי עיכוב אפופטוזיס לאחר זיהום של תאי ZF4 של דג הזברה, 21Shigella משיגה קולוניזציה מוצלחת על ידי עיכוב אפופטוזיס,22 וחלבון S המיוצר על ידי סטרפטוקוק קבוצה A (GAS) נקשר לממברנת האריתרוציטים כדי להתחמק מזיהוי החיסון של המארח. מערכת.23 למרות שהוכח שחיידקים רבים פיתחו את היכולת להתחמק מחסינות, ישנם כמה דיווחים על פתוגנים ימיים. Vibrio harveyi שייך למשפחת ה-Vibrionaceae, המוכרת כגורם פתוגני מאוד של דגי ים; הוא גורם לדלקת גסטרואנטריטיס, נמק שרירים וכיבים בעור, והוא אחד הגורמים העיקריים לתמותה של דגים ימיים.24

מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche

למעט אוטופגיה ואפופטוזיס, חלק מהחיידקים (למשל, Staphylococcus aureus) יכולים אפילו להשתמש בקולטני הכימוקין של המארח שלהם כדי לחמוק מחסינות.25 קולטני כימוקין הם קולטנים מצמדים לחלבון G (GPCRs) המצויים בעיקר על פני השטח של לויקוציטים. הם מכילים שבעה מבנים טרנס-ממברניים, המעורבים בקישור ואיתת ליגנד, וממלאים תפקיד מפתח בהתחלה ותחזוקה של תגובות חיסון ודלקתיות.26 ככל שהתקדם מחקר הכימוקין, התגלו קולטני כימוקין לא טיפוסיים (ACKRs).27 למרות ש-ACKRs הם דומים מבחינה מבנית לקולטני כימוקין אחרים ויכולים להפנים ליגנדים, הם אינם יכולים להפעיל את מסלול העברת האותות בגלל היעדר תחום ה-DRYLAIV, הנקרא גם ''קולטן שקט''.28 תפקודם של ACKRs עשוי לבוא לידי ביטוי בדרכים הבאות : 1. הם יכולים להתחרות עם קולטנים טיפוסיים לקשור כימוקין, ובכך לווסת את העברת האותות של כימוטקסיס התא; 2. על ידי הפנמת הכימוקין לתאים, ריכוז הכימוקין בסביבה מופחת כדי להשפיע על גיוס התאים ולפעול כסורק כימוקין. 3. הם מסייעים לכימוקינים להשלים את ההובלה בין תאים דרך מחסום תאי הסטרומה.29 משפחת ACKR הכוללת בעיקר DARC,30 D6 31,32, CXCR7,33 ו-CCRL1,34 CCRL1 ידועה גם כקולטן כימוקינים לא טיפוסי 4 (ACKR4). נכון לעכשיו, כמה מחקרים הראו שנראה כי ACKR4 מממש העברת אותות דרך המסלול הבלתי תלוי בחלבון G,35-37 ויש לו תפקידים לא מיותרים בשליטה בדלקת ובתגובה חיסונית.38 תפקידו בחסינות הסתגלותית ידוע היטב, אך תפקוד בחסינות מולדת נחקר לעתים רחוקות.

בחסינות מולדת, העברת האותות של מסלול ה-TLR נשמרת מאוד מחסרי חוליות ליונקים. כחלבון ליבה של איתות TLR, MyD88 נחקר רבות בבעלי חוליות. בנוסף, בגלל המבנה השמור ביותר של MyD88, להומולוגים שלו בדגים עשויים להיות פונקציות דומות לאלו ביונקים.39,40 בדג הזברה, MyD88 מעורב בפינוי של זיהומים חיידקיים.41 מחקרים קודמים גם אישרו כי V. harveyi מתחמק מחסינות על ידי השמדת העברת האותות של MyD88.42 עם זאת, המנגנונים של האופן שבו V. harveyi מתחמק מחסינות נותרו לא מובנים בדגי טלאוסט. במחקר זה, ACKR4a היה מווסת במהירות ב-Miichthys muy מגורה של V. harveyi. ה-ACKR4a המווסת מעלה דיכא את החסינות המולדת על ידי גרימת אוטופגיה לחסימת מסלול ה-NF-kB בתיווך MyD88-והשראת אוטופגיה לחסימת אפופטוזיס, כדי לשפר זיהום V. harveyi. למיטב ידיעתנו, הדו"ח הזה הוא הראשון שמבהיר כי נמצא ש-V. harveyi משתמש גם באוטופגיה וגם באפופטוזיס כדי להתחמק מחסינות מולדת.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

תוצאות

זיהום V. harveyi משרה ביטוי ACKR4a כדי לקדם שגשוג עצמי

כדי לזהות גנים שעלולים להיות מעורבים בוויסות של זיהום V. harveyi, טיפלנו ב-miiuy croaker עם V. harveyi במשך 48 שעות, ולאחר מכן השתמשנו בניתוח RNA-seq כדי לסנן את גני הביטוי השונים (DEGs) בין V. harveyi שטופלו ללא טיפול. דגימות טחול. מנתוני הרצף העמוק, זיהינו 145 גנים מווסתים למעלה ו-28 0 גנים עם ויסות מטה (איור 1A). על בסיס זה, בחרנו את 10 הגדולות וה-10 הפחות DEG (log2 של שינוי הקפל היה 1.0) עבור מפת חום, והתוצאה הראתה שהדגימות המתאימות הן בדגימות שטופלו ב-V. harveyi והן בדגימות הלא מטופלות שוכפלו היטב (איור 1B) . ה-mRNA של ACKR4a נבדקו ומצאו שהם מתבטאים מאוד במוח מוזיקלי M לאחר זיהום V. harveyi (איור S1A). אז קו תאי המוח M. muiiy (MBrC) שימש לניסויים הבאים. יעילות ה-Nockdown של ACKR4a-si1 היא 46.1% ו-ACKR4a-si2 היא 63.7% ב-MBrC (איור S1B), כך ש-ACKR4a-si2 (ששמו ACKR4a-si) שימש לניסויים הבאים. לאחר מכן, התמקדנו בגן ACKR4a, שעשוי להיות לו תפקוד חיסוני, ותוצאות בדיקת יחידות יוצרות המושבות (CFU) גילו כי ACKR4a מקדם את התפשטות V. harveyi (איורים 1C, 1D ו-S1C). כדי להמשיך ולחקור את המנגנון שבאמצעותו ACKR4a מקדם את התפשטות V. harveyi, נותח דפוס הביטוי של ACKR4a. ACKR4a בתאי MBrC היה מווסת על ידי V. harveyi. התוצאות הראו אופן תלוי זמן עם זיהום V. harveyi הן ברמות mRNA והן ברמות החלבון (איורים 1E ו- 1F). בנוסף, השתקת ACKR4a דיכאה ביעילות את הביטוי של ACKR4a הן ברמות mRNA והן ברמות החלבון (איורים 1E ו- 1G). התוצאות לעיל הצביעו על כך שהוויסות העל של ACKR4a עשוי להקל על זיהום V. harveyi.

איור 1. ACKR4a המושרה על ידי V. harveyi מקל על ההפצה העצמית שלו

ACKR4a מעכב איתות NF-kB המופעל על ידי V. harveyi 

מצאנו שקצב התפשטות התאים הושפע כאשר MBrC היה נגוע ב-V. harveyi, וכדי לאמת ממצא זה ביצענו מבחני שגשוג תאים. התוצאות הראו שזיהום V. harveyi אכן הפחית את התפשטות MBrC (איור S1D). ניסויים שלאחר מכן אישרו כי ביטוי יתר של ACKR4a הפחית את התפשטות התאים, בעוד שהשתקת ACKR4a הגבירה את התפשטות התאים (איור 2A ו-S1E). מספר מחקרים הוכיחו שהפעלה של NF-kB מקדמת שגשוג תאים. נמצא כי BAY 11-7082, המעכב של NF-kB, יכול גם להפחית את התפשטות MBrC (איור 2A ו-S1E). בדומה לדיווחים קודמים,43 העלייה ב-NF-kB-luc הייתה קשורה לזיהום V. harveyi באופן תלוי זמן (איור S1F).

איור 2. ACKR4a מעכב איתות NF-kB המופעל על ידי V. harveyi

כדי לקבוע עוד יותר את ההשפעה של ACKR4a על איתות NF-kB המופעל על ידי V. harveyi, בוצע בדיקת luciferase reporter. ACKR4a עיכב באופן משמעותי את פעילות NF-kB לוציפראז המופעלת על ידי V. harveyi ו-LPS; פעילות IL-1b ו-TNFa luciferase שהופעלה על ידי V. harveyi עוכבה גם היא על ידי ACKR4a (איורים 2B-2D). ACKR4a אנדוגני הושתק כדי לאמת את תפקידו בחסינות מולדת. לאחר מכן זוהו עוד דפוסי הביטוי של p65 וציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-1b ו-TNFa), השתקת ACKR4a הגדילה באופן דרסטי את ה-p65 mRNAs, IL-1b mRNAs ו-TNFa mRNAs (איורים 2E-2G ). התוצאות ב-MLC וב-MKC גם הצביעו על כך ש-ACKR4a יכול לעכב איתות NF-kB (איורים S1G-S1J). גם תוצאות ה-ELISA היו דומות; השתקת ACKR4a הגדילה משמעותית את TNFa וביטוי יתר ACKR4a עיכב TNFa (איור 2H). כדי להעריך את ההפעלה של NF-kB, יש צורך יותר לנתח את הצורה המועתקת, כלומר NF-kB מזורחת, והיא מדד לפעילות NF-kB על גני מטרה. בגירוי של NF-kB, p65 עובר פוספורילציה ונכנס לגרעין כדי לווסת את השעתוק של ציטוקינים פרו-דלקתיים. כדי לחקור את הרגולציה של זרחון p65 על ידי ACKR4a, מדדנו את רמת הזרחון של p65 לאחר השתקת ACKR4a וביטוי יתר של ACKR4a על ידי אימונובלוט. זיהום V. harveyi הגביר את הזרחון של p65, מה שהוכיח כי V. harveyi הפעיל ביעילות את NF-kB. על בסיס זה, השתקת ACKR4a הגבירה את הזרחון של p65, בעוד שביטוי יתר של ACKR4a הפחית את הזרחון של p65, מה שמעיד על כך ש-ACKR4a הוא מעכב של איתות NF-kB (איורים 2I ו-2J). בדג הזברה, ההנפה של ACKR4a הגבירה את הזרחון של p65. בנוסף, בדיקת CFU הראתה ש-BAY 11-7082 הגדיל באופן משמעותי את התפשטות של MBrC (איור 2K). בסך הכל, נתונים אלה מצביעים על כך ש-ACKR4a מתפקד כמווסת שלילי של איתות NF-kB כדי לעכב חסינות מולדת במהלך זיהום V. harveyi.

איור 3. ACKR4a יוצר אינטראקציה עם MyD88 ומקדם את השפלת MyD88 באוטופגיה

ACKR4a מקיים אינטראקציה עם MyD88 ומקדם את MyD88 לפירוק אוטופגי

לאחר מכן, ביקשנו לקבוע איזה יעד באיתות NF-kB מתווך את הפונקציה המדכאת של ACKR4a0. מבחן הדיווח של NF-kB-luciferase גילה כי ביטוי יתר של ACKR4a גרם להפחתה בפעילות הלוציפראז, אשר נגרמה על ידי MyD88 באופן תלוי מינון (איור 3A). עם זאת, ביטוי יתר של ACKR4a לא הראה השפעה על פעילות לוציפראז המונעת על ידי TRAF6 או TAK1 (איורים 3B ו-3C). תוצאת immunoblot הייתה דומה ל-luciferase reporter assay; ביטוי יתר של ACKR4a עיכב את MyD88 באופן תלוי מינון, אך לא הייתה השפעה על TRAF6 ו-TAK1 (איור 3D). תוצאות אלו מצביעות על כך ש- ACKR4a מתפקד ברמת MyD88.

כל TLRs היונקים, למעט TLR3, תלויים לפחות בחלקם במתאם MyD88 להעברת אותות, מה שהופך את הרגולציה הישירה של MyD88 ליעילה יותר.44 לאחר מכן בדקנו את הביטוי של MyD88 בזמנים שונים של זיהום V. harveyi ומצאנו השתקה של ACKR4a הגביר את הביטוי של MyD88 (איור 3E), וביטוי יתר של ACKR4a עיכב את ביטוי MyD88 באופן תלוי זמן (איור 3F). נמצאה תוצאה מעניינת שלמרות שהשתקת ACKR4a הגבירה את ביטוי MyD88 שהופעל על ידי V. harveyi, שיפור זה לא היה קיים כאשר התאים נחו (איורים 3G ו-3H). כדי להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי העומד בבסיס הפעולה של ACKR4a באיתות NF-kB המתווך של MyD88-, ביצענו מבחני Co-immunoprecipitation (Co-IP) כדי לקבוע אם ACKR4a יוצר אינטראקציה עם MyD88. ה-Flag-ACKR4a יכול להתפרק עם Myc-MyD88 (איורים 3I ו-S1K). בהתאם לכך, מצאנו ש-Flag-MyD88 יכול לקיים אינטראקציה עם ACKR4a אנדוגני (איור 3J). ניסויי לוקליזציה תת-תאית שלאחר מכן הראו ל-ACKR4a לא היה לוקליזציה משותף משמעותית עם MyD88 (איור S1L). לפיכך, ממצאים אלה תומכים בתפיסה לפיה ACKR4a מקיים אינטראקציה פיזית עם MyD88, וסביר להניח שהאינטראקציה שלהם מתרחשת בציטופלזמה. לאחר מכן, חקרנו את המנגנון שבאמצעותו ACKR4a דיכא את ביטוי MyD88. או NH4Cl או 3-Methyladenine (3-MA), מעכבי מסלול הפירוק התלוי באוטופגיה-ליזוזום, הביאו להצטברות משמעותית של MyD88 בנוכחות ACKR4a, ו-MG132 לא השפיע על הפירוק של MyD88 (איור 3K). יתרה מכך, תוצאות דומות הראו ש3-MA ו-NH4Cl חסמו באופן משמעותי את פירוק MyD88 באופן תלוי מינון (איורים 3L ו-3M). נראה שממצאים אלו מרמזים שחסימת האוטופגיה מונעת ביעילות את השפלת MyD88 ממוקד ACKR4a. שטף אוטופגי מציין את התהליך הדינמי של אוטופגיה, שהוא אינדיקטור אמין לפעילות אוטופגית. מכיוון שקרינת ה-GFP מושבתת בליזוזום, ניתן לקבוע את שלב האוטופגיה על פי הקרינה של GFP ו-RFP.42 תצפית על הקרינה הצהובה בלוח המיזוג הראתה יותר פלואורסצנטיות אדומה בנוכחות ACKR4a, מה שמצביע על כך ש-ACKR4a קידמה את האיחוי של אוטופגוזומים וליזוזומים; ואילו מעכב האוטופגיה כלורוקין (CQ) מנע היתוך של אוטופגוזומים וליזוזומים, והראה יותר פלואורסצנטיות צהובות (איור 3N). כדי לאמת עוד יותר ש-ACKR4a מכוון ל-MyD88 לפירוק אוטופגי, בוצעה בדיקת לוקליזציה ליזוזומלית, MyD88 (ירוק) וליזוזומים (אדום) אותרו יחד בתא MBrC (איור 3O), מה שמרמז על כך ש-MyD88 הועבר לליזוזומים. ביחד, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-ACKR4a יוצר אינטראקציה עם MyD88 ומכוון ל-MyD88 לפירוק אוטופגי.

איור 4. ACKR4a משתתף בוויסות האוטופגיה באמצעות Beclin-1

ACKR4a משתתף בוויסות האוטופגיה באמצעות Beclin-1

חלק מהחיידקים משתמשים באוטופגיה כדי לקדם את הצמיחה וההדבקה שלהם, השכפול שלהם יקטן כאשר אוטופגיה נעדרת.13 כדי לבדוק אם V. harveyi משתתף בוויסות האוטופגיה בתאי MBrC, תאים הודבקו ב-V. harveyi ולאחר מכן בדפוס הביטוי. של LC3 נבדק. בתאי MBrC, חשיפה ל-V. harveyi הגדילה את האוטופגיה כפי שצוין על ידי הצטברות של GFP-LC3 puncta, אשר לוותה בעלייה תלוית זמן של זיהום V. harveyi (איור 4A). ביטוי יתר של ACKR4a הגביר את האוטופגיה הנגרמת על ידי V. harveyi, כפי שמוצג על ידי עלייה יוצאת דופן בהצטברויות ה-puncta של RFP-LC3, בניגוד להשתקת ACKR4a שהפחיתה באופן משמעותי את האוטופגיה הנגרמת על ידי V. harveyi (איורים 4B ו-4C). בנוסף, השתקת ACKR4a הביאה להפחתה בביטוי LC3-II המושרה על ידי V. harveyi (איור 4D).

ULK1, Beclin-1 ו-ATG5 היו החלבונים הרגולטוריים העיקריים של אוטופגיה. תוצאות qPCR הראו כי ACKR4a הגביר באופן משמעותי את הביטוי של Beclin-1, אך לא ULK1 ו-ATG5 (איור 4E). בדיקת ה-luciferase reporter של ULK1, ATG5 ו-Beclin-1 גילתה שביטוי יתר של ACKR4a גרם רק לעלייה בפעילות לוציפראז של Beclin-1 (איור 4F). לאחר מכן, גילינו שביטוי יתר של ACKR4a הגביר את הביטוי של Beclin-1, אך לא ULK1 ו-ATG5 (איור 4G). כמו כן, אוטופגיה המושרה על ידי ACKR4a עוכבה על ידי Beclin-1-si, בעוד של-ATG5-si הייתה עיכוב חלקי בלבד (איור 4H). התוצאות שלעיל הצביעו על כך ש-ACKR4a ממוקד ב-Beclin-1. לכן, התפקוד והמנגנון של Beclin-1 בהשפלה אוטופגית בתיווך ACKR4a של MyD88 נחקרו. בדגי זברה הנגועים ב-V. harveyi, נפילה של ACKR4a לא הביאה לשינויים משמעותיים ב-ULK1 תוך הפחתה משמעותית של Beclin-1 ו-ATG5 (איורים S2B-S2D). Beclin-1 הגביר עוד יותר את השטף האוטופגי המושרה על ידי ACKR4a עם Baf1A ו-CQ שטופלו (איור 4I), ובקלין-1 שיפר את השפלה של MyD88 על ידי ACKR4a (איור 4J). לאחר מכן ביצענו את מבחני Co-IP כדי לקבוע אם ACKR4a יוצר אינטראקציה עם Beclin-1, ומצאנו ש-ACKR4a יוצר אינטראקציה עם Beclin-1, וזיהום V. harveyi שיפר את האינטראקציה בין ACKR4a ל-Beclin{{51 }} (איור 4K). בדיקת לוקליזציה ליזוזומלית הצביעה על כך ש-ACKR4a שיפר את ההיתוך האוטופגוזום עם הליזוזום (איור 4L). לאחר מכן, ACKR4a מגביר את ביטוי Beclin-1 אנדוגני (איור 4M) והשתקת ACKR4a מחלישה את ביטוי Beclin-1 המושרה על ידי V. harveyi (איור 4N). בנוסף, השתקת Beclin-1 הגבירה את הזרחון של p65 המופעל על ידי V. harveyi, מה שמציע עוד יותר ש-V. harveyi משרה אוטופגיה כדי לווסת שלילי את איתות NF-kB (איור 4O). לאחר מכן ביקשנו לקבוע את החשיבות הביולוגית של Beclin-1 בזיהום V. harveyi, במיוחד בשליטה על התפשטות V. harveyi. בדיקת CFU בוצעה ומצאה שתיקה של Beclin-1 וגם אוטופגיה חסימת CQ הפחיתו את התפשטות V. harveyi, מה שמוכיח כי V. harveyi משתמש באוטופגיה כדי לקדם את התפשטותו (איור 4P). התוצאות שלעיל יחד מגלות ש-ACKR4a גורם ויוצר קומפלקסים עם Beclin-1 כדי לקדם אוטופגיה, ולאחר מכן להקל על זיהום V. harveyi.

יתרונות cistanche לגברים - מחזקים את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ACKR4a גרמה לאטופגיה לאפופטוזיס חסומה

מוות תאים אוטופגי נחשב לחלופה סבירה לאפופטוזיס, ואפופטוזיס הוא גם מנגנון אנטיבקטריאלי מוכר; זיהומים חיידקיים מוצלחים משלימים שכפול עצמי על ידי עיכוב אפופטוזיס.22 כדי לקבוע את הקשר בין אוטופגיה הנגרמת על ידי V. harveyi לאפופטוזיס, נקבעה האפופטוזיס של תאי MBrC עם טיפולים שונים לפני ואחרי זיהום V. harveyi, והשתקת ACKR4a הגדילה את V. אפופטוזיס המושרה על ידי harveyi (איורים 5A ו-5B, הפאנל השמאלי). מכיוון ש-caspase3 ו-caspase7 חשובים בהתחלת אפופטוזיס, הם מקובלים באופן נרחב כאינדיקטורים אמינים לאפופטוזיס. בדיקת caspase Glo 3/7 הראתה שביטוי יתר של ACKR4a עיכב פעילות caspase3/7 המושרה על ידי V. harveyi, בעוד שהשתקת ACKR4a הגבירה את פעילות caspase3/7 המושרה על ידי V. harveyi (איור 5B, לוח ימין). V. harveyi ופעילות רקומביננטית פעילה של caspase8 שהושרה על ידי V. harveyi והוספה אקסוגנית של caspase3/7 עוכבה על ידי ACKR4a (איור 5C), מה שמצביע על כך ש-ACKR4a מסוגל לחסום ביעילות איתות אפופטוזיס. למרות שהוכחה אוטופגיה הנגרמת על ידי ACKR4a, יש צורך במחקרים נוספים כדי לחקור את תפקידה של אוטופגיה בחסימת אפופטוזיס. כפי שמוצג באיור 5D השתקה ACKR4a הגדילה משמעותית את הקספסות המשפיעות (caspase7) ואת ה-caspases היוזמים (caspase8). בנוסף, ביטוי יתר של ACKR4a עיכב mRNAs של caspase7 ו-caspase8 (איור 5E) ודפיקת ACKR4a הגדילה משמעותית את caspase7 ו-caspase8 בדגי הזברה (איורים S2E ו-S2F). מחקרים קודמים הראו שבקלין-1 הוא מתג מולקולרי שמתווך תהליכי אפופטוזיס ואוטופגיה,45 לכן נחקרה מעורבותו של בקלין-1 בוויסות האפופטוזיס. במחקר שלנו, ביטוי-יתר של Beclin-1 הסדיר את ה-Caspase8 המושרה על ידי V. harveyi, ואילו Beclin-1 משתיק את ה-Caspase8 המושרה על-ידי V. harveyi (איור 5F). תוצאה מעניינת נמצאה ש-caspase8 היה מווסת משמעותית לאחר 3 שעות של זיהום V. harveyi; זה שוב עוכב עם משך ההדבקה גדל, ו-LC3-II היה בקורלציה שלילית עם caspase8 (איור 5G). על פי התוצאות שלעיל, ACKR4a גרמה לאוטופגיה כדי לחסום איתות אפופטוטי ולהקל על זיהום V. harveyi, ו-Beclin-1 עשוי להיות יעד פוטנציאלי במפל האוטופגיה והאפופטוזיס.

איור 5. ACKR4a משרה אוטופגיה לחסימת אפופטוזיס

Ap-1 משפר את האוטופגיה הנגרמת על ידי ACKR4a בזיהום V. harveyi

לאחר מכן, נחקר המנגנון של ביטוי ACKR4a המושרה על ידי V. harveyi. ארבעה פלסמידים שונים של מקדם ACKR4a נבנו תחילה על פי רצפי חיזוי המקדם (איור 6A). בדיקת הלוציפראז הראתה שפעילות ACKR4a-p-3 הייתה הגבוהה ביותר (איור 6B). כדי לזהות את המפעיל במעלה הזרם של ביטוי ACKR4a במהלך זיהום V. harveyi, נותח אזור המקדם של ACKR4a, ומצא שלACKR4a יש אתרי קישור פוטנציאליים של Sp-1 ו-Ap-1 (איור 6C). מבחן ACKR4a-luc הראה ש-Sp-1 לא יכול לשפר את פעילות הלוציפראז ו-Ap-1 הגביר את פעילות הלוציפראז (איורים 6D ו-6E), מה שהעלה את האפשרות ש-ACKR4a יכול להיות יעד ישיר של Ap -1. כדי לבחון זאת, נבנו שני וקטורים לוציפראז המורכבים ממוטנטי ACKR4a (איור 6F). בדיקת הלוציפראז הראתה שמוטנטים חסרי אתרי קישור Ap-1 עיכבו את פעילות הלוציפראז בניגוד לסוג הבר (איור 6G). כדי לאשר ש-Ap-1 מקדם את ביטוי ACKR4a, השתקנו או שיפרנו את הביטוי של Ap-1 באמצעות ביטוי יתר או נוק-דאון, וביטוי ACKR4a הוערך בתאי MBrC שהועברו. השתקת Ap-1 הפחיתה באופן משמעותי את ביטוי ACKR4a המושרה על ידי V. harveyi (איור 6H), ואילו ביטוי יתר של Ap-1 שיפר משמעותית את ביטוי ACKR4a (איור 6I). תוצאות האימונובלוט היו עקביות עם תוצאות ה-qPCR, ביטוי יתר של Ap-1 הגביר את הביטוי של ACKR4a, ואילו השתקת Ap-1 הפחיתה את הביטוי של ACKR4a (איור 6J). ניתוח ChIP הראה ש-Ap-1 נקשר למקדם ACKR4a בתאי MBrC בתנאים פיזיולוגיים נורמליים, וגירוי V. harveyi הגביר את הקישור של Ap-1 למקדם ACKR4a (איור 6K). התוצאות שלעיל אישרו ש-ACKR4a הוא יעד תעתיק פוטנציאלי של Ap-1. לאחר מכן נחקרה הפונקציה של Ap-1 באוטופגיה; השתקת Ap-1 הפחיתה ביעילות את ההצטברות הנגרמת על ידי זיהום V. harveyi של GFP-LC3 (איור 6L), והיא גם החלישה את הרגולציה העלייה הנגרמת על ידי זיהום V. harveyi של LC3-II (איור 6M) ). בדיקת CFU בוצעה כדי לחקור את התפקיד של Ap-1 בזיהום V. harveyi ומצא ש-AP-1 מקל על התפשטות V. harveyi (איור 6N). ביחד, התוצאות שלעיל הצביעו על כך ש-Ap-1 מפעיל את השעתוק והביטוי ACKR4a ותורם לזיהום V. harveyi.

איור 6. Ap-1 משופרת ACKR4a המושרה אוטופגיה בזיהום V. harveyi

איור 7. מודל עבודה של האופן שבו ACKR4a מקל על זיהום V. harveyi

דִיוּן

הוכח כי ACKRs מעורבים במספר תהליכים ביולוגיים כגון ויסות מערכת הכימוקין, הפנמת ליגנד כימוקין, פירוק תוך תאי ותגובה דלקתית, 4,26 שחשובה לא רק לחסינות הסתגלותית אלא גם כמרכיב חשוב של מערכת החיסון המולדת. .33,34 עם זאת, תפקידם של ACKRs בתגובה הדלקתית לזיהום חיידקי בדגים לא נחקר. מחקר זה מדגים לראשונה כי ACKR4a, חבר במשפחת ACKR, מקדם את ההדבקה של V. harveyi לדגי טלאוסט באמצעות אוטופגיה ואפופטוזיס. מבחינה מכאנית, התעתוק של ACKR4a היה מווסת על ידי גורם התעתוק AP-1. לאחר מכן, ה-ACKR4a המווסת למעלה עבר סינרגיה עם Beclin-1 כדי לעורר אוטופגיה והעביר את MyD88 לליזוזומים לצורך פירוק. בינתיים, ACKR4a משרה אוטופגיה לחסימת אפופטוזיס ולאחר מכן מקל על זיהום V. harveyi (איור 7). חסינות מולדת ממלאת תפקיד מכריע בהגנה על אוקריוטים מפני פלישה פתוגנית אנדוגנית ואקסוגנית.46 כתוצאה מחשיפה ארוכת טווח למיקרואורגניזמים, דגים פיתחו חסינות מולדת אופטימלית יותר כדי להגן עליהם מפני זיהום.47 TLRs זיהו PAMP כאשר מתרחש זיהום חיידקי, ויזם תגובה חיסונית מולדת דרך מסלולים תלויים ובלתי תלויים ב-MyD88-, שגרמו לייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים כדי לחסל זיהום חיידקי. MyD88 הוא מתאם חיוני באיתות TLR, למעט TLR3, כל TLRs היונקים משתמשים ב-MyD88 כדי להפעיל איתות NF-kB.48 לכן, זה עשוי להיות היעיל ביותר לווסת ישירות את MyD88. לדוגמה, S-1-acetylcysteine ​​מעכב ייצור IL-6 על ידי גרימת הפירוק של MyD88. באופן דומה, בדגים, דווח כי IRF3 ו-eIF3k מעכבים איתות NF-kB על ידי מיקוד ל-MyD88.42,49 ראיות מצטברות הצביעו גם על כך ש-MyD88 היה חשוב לחיסול זיהומים חיידקיים. לדוגמה, עכברים חסרי MyD88- לא יכלו לזהות את מרכיבי החיידק והיו רגישים מאוד ל-S. aureus. 50 בנוסף, MyD88 הוכח כמעורב גם בחיסול זיהומים חיידקיים בדג הזברה.41 הפעלת מערכת החיסון המולדת מקדמת פינוי חיידקים, המהווה לחץ סלקטיבי עיקרי, המקדם אותם לפתח את היכולת לדכא חסינות מולדת .51,52 הוכח שסלמונלה יכולה לווסת תגובות חיסוניות ולתמרן תגובות דלקתיות לאחר הדבקת תאי מארח. נגיף הסלמונלה SpvC משחרר באופן בלתי הפיך את ה-ERK, p38 ו-MAPK, ובכך מעכב את השעתוק של ציטוקינים פרו-דלקתיים.53 במחקר זה, ה-ACKR4a המווסת מעלה ב-V. harveyi הנגוע ב-M. miiuy שולב עם MyD88 ל-inphospylation. ולחסום איתות NF-kB. זה מצביע על כך שחיידקים יכולים גם לדכא את החסינות המולדת של דגים על ידי הפרעה ליציבות המתאמים באיתות ה-TLR למטרת התחמקות חיסונית.

אוטופגיה ואפופטוזיס הם שני מנגנונים מוכרים של עמידות בפני פלישת חיידקים, כאשר אוטופגיה אנטי-מיקרוביאלית מהווה מחסום בפני מיקרואורגניזמים פולשים. PRRs יכולים לעורר אוטופגיה בשלבים שונים של מגע מארח-חיידק, ולעכב את הצמיחה התוך-תאית של חיידקים.54 לעומת זאת, חיידקים פיתחו גם מנגנונים יעילים למנוע, להילחם או לפקח על אוטופגיה. מנגנונים אלו כוללים לרוב מיקוד של Beclin-1 לחסימת אוטופאגיה,55 מניעת הבשלה של אוטופאגוזומים56 ואף הפעלת אוטופאגיה במקרים מסוימים כדי לספק תזונה לצמיחת חיידקים.57 אחרת, מצאנו ש-V. harveyi גרמה ל-Beclin{{6} }מופעל אוטופגיה באמצעות ACKR4a, המכוון ל-MyD88 לפירוק אוטופגי, ובכך חוסם איתות NF-kB ומקדם שכפול עצמי. אסטרטגיית הגנה נוספת היא מוות תאי מתוכנת (אפופטוזיס), המופעל כאשר פתוגנים משתמשים בתאי מארח לצורך הישרדות ושכפול. לדוגמה, זיהום של מקרופאגים ב-mycobacterium גורם לאפופטוזיס, אשר תורם לחיסול חיידקים מהתאים.58 בנוסף, אפופטוזיס של מקרופאגים בתיווך TNF-a הורס את הסביבה התוך-תאית עבור משכפול של mycobacterium ומפחית את קצב הגדילה של mycobacterium נגוע.59 כדי להילחם. לחץ ההישרדות של אפופטוזיס, פתוגנים מוצלחים רבים מקודדים לגנים שתוצריהם מעכבים אפופטוזיס בתאי מארח, ובכך שומרים על הכדאיות לשכפול הפתוגנים.60 למרות שמנגנונים אלו נחקרו היטב ביונקים, מעט ידוע על עיכוב חיידקים של אפופטוזיס בדגים. במחקר שלנו, אוטופגיה הנגרמת על ידי V. harveyi משחקת תפקיד בשלבים אפופטוטיים וחוסמת איתות אפופטוטי. אפופטוזיס ואוטופגיה שניהם מקדמים ומתנגדים זה לזה. בשלבים פרה-אפופטוטיים, תאים חוסמים את המסלול האפופטוטי ומפחיתים את רמת האפופטוזיס באמצעות אוטופגיה, ובכך שומרים על היתרון. אוטופגיה אינה מעוררת מוות תאים בשלבים המוקדמים של אפופטוזיס, אלא גם מקדמת את הישרדות התאים.61 אוטופגיה בשלב המאוחר של האפופטוזיס עשויה לקדם אפופטוזיס, ואז האפופטוזיס המוגבר מעכב את התרחשות האוטופגיה באמצעות הגירה של מסלולי p53 ו-BH3.62 התהליך הביולוגי מווסת באופן הדוק, כולל האינטראקציה של אוטופגיה ואפופטוזיס. גנים מווסתים רבים מעורבים במנגנון התגובה האינטראקטיבית של אפופטוזיס ואוטופגיה, Beclin-1 הוא אחד מהם.63 בנוסף לוויסות של התחלת אוטופגיה, Beclin-1 מעורב גם בוויסות אפופטוזיס.45 ,64 מחקרים הראו שבקלין-1 מאבד את יכולתו להתנגד לאפופטוזיס לאחר ביקוע על ידי קספאזות מופעלות.65 זה מצביע על כך שלקלין-1 ממלא תפקיד חשוב בתור ''מתג מולקולרי'' ברגולציה של אוטופגיה ואפופטוזיס.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

V. harveyi הוא חיידק גרם-שלילי ימי המהווה איום רציני על הבריאות של דיג חקלאות ימית. זיהום V. harveyi גורם לדלקת קרום המוח ודלקת המוח בדגים,66 וזיהום V. harveyi גורם לגודש מוחי בגרופר.67 בתגובה לזיהום חיידקי, התגובות החיסוניות והדלקתיות המולדות הן מערכות ההגנה העיקריות של דגים. עם זאת, חיידקים פיתחו גם את היכולת להתחמק מחסינות בסימביוזה עם המארחים שלהם. לסיכום, התוצאות שלנו חושפות מנגנון של התחמקות חיסונית של V. harveyi בדגים. ACKR4a משרה אוטופגיה לעיכוב איתות NF-kB ולחסום אפופטוזיס, אשר בתורו מקל על זיהום V. harveyi בדגי טלאוסט. זו גם הפעם הראשונה שבה נמצאו חיידקים גרם שליליים חומקים מחסינות על ידי ויסות בו זמנית של חסינות מולדת ואפופטוזיס באמצעות אוטופגיה. מחקר זה מספק תובנות להבנת ההשפעות של אוטופגיה על אינטראקציה מארח-חיידק בדגי טלאוסט ומספק פרספקטיבה על עמידות יונקים לזיהום חיידקי.

הפניות

1. דינרלו, קליפורניה (2018). סקירה כללית של משפחת IL-1 בדלקת מולדת ובחסינות נרכשת. אימונול. רפ' 281, 8–27.

2. Gaidt, MM, Ebert, TS, Chauhan, D., Ramshorn, K., Pinci, F., Zuber, S., O'Duill, F., Schmid-Burgk, JL, Hoss, F., Buhmann, ר., ועוד. (2017). ה-DNA inflammasome בתאי מיאלואיד אנושי מופעל על ידי תוכנית מוות של תאי STING במעלה הזרם של NLRP3. תא 171, 1110–1124.e18.

3. Xiao, TS (2017). חסינות מולדת ודלקת. תָא. מול. אימונול. 14, 1–3.

4. Koropatnick, TA, Engle, JT, Apicella, MA, Stabb, EV, Goldman, WE, and McFallNgai, MJ (2004). התפתחות מתווכת גורמים מיקרוביאליים בהדדיות מארח-חיידקית. מדע 306, 1186–1188.

5. Janeway, CA (1989). מתקרבים לאסימפטוטה? אבולוציה ומהפכה באימונולוגיה. קר אביב הארב. סימן. Quant. ביול. 54, 1–13.

6. Vallabhapurapu, S., and Karin, M. (2009). ויסות ותפקוד של גורמי שעתוק NF-kB במערכת החיסון. אננו. כומר אימונול. 27, 693–733.

7. Krakauer, T. (2019). דלקות, אוטופגיה ומוות תאים: השילוש של ההגנה המולדת של המארח מפני חיידקים תוך תאיים. מתווכים Inflamm. 2019, 2471215.

8. הארלי, JH, ויאנג, LN (2017). מנגנונים של התחלת אוטופגיה. אננו. כומר ביוכים. 86, 225–244.

9. He, X., Zhu, Y., Zhang, Y., Geng, Y., Gong, J., Geng, J., Zhang, P., Zhang, X., Liu, N., Peng, Y. ., ועוד. (2019). RNF34 מתפקד בחסינות ובמיטופאגיה סלקטיבית על ידי מיקוד MAVS לפירוק אוטופגי. EMBO J. 38, 1009788–e101018.

10. Yin, L., Lv, M., Qiu, X., Wang, X., Zhang, A., Yang, K., and Zhou, H. (2021). IFN-G מפעיל אינטראקציה מתווכת NOD של autophagy ו-Edwardsiella piscicida כדי להגביר את הפינוי התוך תאי בדגים. J. Immunol. 207, 1087–1098.

11. Mansilla-Pareja, ME, Bongiovanni, A., Lafont, F., and Colombo, MI (2017). שינויים בשלמות ממברנת ה- Vacuole המשכפלת Coxiella burnetii ומשחק גומלין עם מסלול האוטופגיה. חֲזִית. תָא. לְהַדבִּיק. מיקרוביול. 7, 112.

12. Bravo-Santano, N., Ellis, JK, Mateos, LM, Calle, Y., Keun, HC, Behrends, V., and Letek, M. (2018). Staphylococcus aureus תוך תאי מווסת את חילוף החומרים של פחמן מרכזי במארח כדי להפעיל אוטופגיה. mSphere 3, 003744– 003818.

13. Winchell, CG, Dragan, AL, Brann, KR, Onyilagha, FI, Kurten, RC, and Voth, DE (2018). Coxiella burnetii מערער את p62/ סקוסטוזום 1 ומפעיל איתות Nrf2 במקרופאגים אנושיים. לְהַדבִּיק. חיסון. 86, e00608–e00617.

14. Lee, HK, Lund, JM, Ramanathan, B., Mizushima, N., and Iwasaki, A. (2007). זיהוי ויראלי תלוי אוטופגיה על ידי תאים דנדריטים פלזמציטואידים. מדע 315, 1398–1401.

15. Jounai, N., Takeshita, F., Kobiyama, K., Sawano, A., Miyawaki, A., Xin, KQ, Ishii, KJ, Kawai, T., Akira, S., Suzuki, K., ו Okuda, K. (2007). הצמוד Atg5 Atg12 קשור לתגובות חיסוניות אנטי-ויראליות מולדות. פרוק. נאטל. אקד. Sci. ארה"ב. 104, 14050–14055.

16. Schaaf, MBE, Keulers, TG, Vooijs, MA, and Rouschop, KMA (2016). חלבונים ממשפחת LC3/GABARAP: פונקציות אוטופגיה (לא) קשורות. FASEB J 30, 3961–3978.

17. Chen, Z., Wang, T., Liu, Z., Zhang, G., Wang, J., Feng, S., and Liang, J. (2015). עיכוב אוטופגיה על ידי MiR-30A המושרה על ידי Mycobacteria tuberculosis כמנגנון אפשרי של בריחה חיסונית במקרופאגים אנושיים. Jpn. J. Infect. Dis. 68, 420–424.

18. Kubori, T., Bui, XT, Hubber, A., and Nagai, H. (2017). Legionella RavZ ממלאת תפקיד במניעת גיוס Ubiquitin ל-Vacuoles המכילים חיידקים. חֲזִית. תָא. לְהַדבִּיק. מיקרוביול. 7, 384.

19. Danial, NN, and Korsmeyer, SJ (2004). מוות תאי: נקודות בקרה קריטיות. תא 116, 205–219.

20. Salvesen, GS, and Ashkenazi, A. (2011). תמונת מצב: קספסות. תא 147, 476–476.ה1.

21. Zhou, ZJ, and Sun, L. (2016). עיכוב האפופטוזיס המושרה על ידי Edwardsiella tarda: אסטרטגיה להישרדות תוך תאית. חֲזִית. תָא. לְהַדבִּיק. מיקרוביול. 6, 76.

22. Gu¨ nther, SD, Fritsch, M., Seeger, JM, Schiffmann, LM, Snipas, SJ, Coutelle, M., Kufer, TA, Higgins, PG, Hornung, V., Bernardini, ML, et al. (2020). חיידקים גראם-שליליים ציטוסוליים מונעים אפופטוזיס על ידי עיכוב של קספסות אפקטור דרך ליפופוליסכריד. נאט. מיקרוביול. 5, 354–367.

23. Wierzbicki, IH, Campeau, A., Dehaini, D., Holay, M., Wei, X., Greene, T., Ying, M., Sands, JS, Lamsa, A., Zuniga, E., et al. (2019). חלבון S סטרפטוקוקלי מקבוצה A מנצל תאי דם אדומים כהסוואה חיסונית ומהווה גורם מכריע עבור התחמקות חיסונית. נציג תא 29, 2979–2989.e15.

24. Chen, J., Lu, Y., Ye, X., Emam, M., Zhang, H., and Wang, H. (2000). ההתקדמות הנוכחית בחישת קוורום Vibrio harveyi כמטרות לגילוי תרופות. יורו J. Med. Chem. 207, 112741.

25. Kimura, T., Jain, A., Choi, SW, Mandell, MA, Schroder, K., Johansen, T., and Deretic, V. (2015). אוטופגיה מדויקת בתיווך TRIM מתמקדת בווסתים ציטופלזמיים של חסינות מולדת. J. Cell Biol. 210, 973–989.

26. זלוטניק, א', ויושי, או' (2012). משפחת העל הכימוקינים ביקרה מחדש. חסינות 36, 705–716.

27. Ulvmar, MH, Hub, E., and Rot, A. (2011). קולטני כימוקין לא טיפוסיים. Exp. Cell Res. 317, 556–568.

28. Bonecchi, R., Savino, B., Borroni, EM, Mantovani, A., and Locati, M. (2010). קולטני פתיית כימוקין: תפקוד מבנה ותכונות ביולוגיות. Curr. חלק עליון. מיקרוביול. אימונול. 341, 15–36.

29. Comerford, I., Litchfield, W., Harata-Lee, Y., Nibbs, RJB, and McColl, SR (2007). ויסות רשתות כימוקטיות על ידי קולטנים 'לא טיפוסיים'. ביו-מסות 29, 237–247.

30. Horuk, R., Chitnis, CE, Darbonne, WC, Colby, TJ, Rybicki, A., Hadley, TJ, and Miller, LH (1993). קולטן לטפיל המלריה Plasmodium vivax: קולטן הכימוקין אריתרוציטים. מדע 261, 1182–1184.

31. Bonini, JA, Martin, SK, Dralyuk, F., Roe, MW, Philipson, LH, and Steiner, DF (1997). שיבוט, ביטוי ומיפוי כרומוזומלי של קולטן CC-chemokine אנושי חדש (CCR10) המציג קישור בעל זיקה גבוהה ל-MCP-1 ו-MCP-3. DNA Cell Biol. 16, 1249–1256.

32. Nibbs, RJ, Wylie, SM, Yang, J., Landau, NR, and Graham, GJ (1997). שיבוט ואפיון של קולטן אנושי מופקר בטא-כימוקין D6. ג'יי ביול. Chem. 272, 32078–32083.

33. Burns, JM, Summers, BC, Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, MET, Sunshine, MJ, Littman, DR, Kuo, CJ, et al. (2006). קולטן כימוקין חדש ל-SDF-1 ו-I-TAC מעורב בהישרדות תאים, היצמדות תאים והתפתחות גידולים. J. Exp. Med. 203, 2201–2213.

34. Gosling, J., Dairaghi, DJ, Wang, Y., Hanley, M., Talbot, D., Miao, Z., and Schall, TJ (2000). חוד החנית: זיהוי קולטן כימוקין חדש הקושר תאים דנדריטים וכימוקינים פעילים בתאי T כולל ELC, SLC ו-TECK. J. Immunol. 164, 2851–2856.

35. Hall, RA, Premont, RT, ולפקוביץ, RJ (1999). איתות קולטן הפטאהלילי: מעבר לפרדיגמת חלבון G. J. Cell Biol. 145, 927–932.

36. Brzostowski, JA, and Kimmel, AR (2001). איתות באפס G: פונקציות בלתי תלויות בחלבון G עבור קולטני 7-TM. טרנדים ביוכימיה. Sci. 26, 291–297.

37. Sun, Y., Huang, J., Xiang, Y., Bastepe, M., Ju¨ppner, H., Kobilka, BK, Zhang, JJ, and Huang, XY (2007). מעבר תלוי מינון מאיתות בלתי תלוי בחלבון G לאיתות בלתי תלוי בחלבון G על ידי GPCR. EMBO J. 26, 53–64.

38. Nibbs, RJB, and Graham, GJ (2013). ויסות חיסוני על ידי קולטני כימוקין לא טיפוסיים. נאט. כומר אימונול. 13, 815–829.

39. Lewis, BP, Burge, CB, and Bartel, DP (2005). זיווג זרעים משומר, שלעיתים מוקף באדנוזינים, מצביע על כך שאלפי גנים אנושיים הם מטרות מיקרו-RNA. תא 120, 15–20.

40. Friedman, RC, Farh, KKH, Burge, CB, and Bartel, DP (2009). רוב ה-mRNA של היונקים הם מטרות משומרות של microRNA. Genome Res. 19, 92–105.

41. Denli, AM, Tops, BBJ, Plasterk, RHA, Ketting, RF, and Hannon, GJ (2004). עיבוד של microRNAs ראשוני על ידי קומפלקס המיקרו-מעבד. טבע 432, 231–235.

42. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y., and Xu, T. (2022). eIF3k מעכב איתות NF-kB על ידי מיקוד ל-MyD88 לפירוק אוטופגי מתווך ATG בדגי טלאוסט. ג'יי ביול. Chem. 298, 101730.

43. Chu, Q., Sun, Y., Cui, J., and Xu, T. (2017). מיקרו-RNA המושרה-214 תורם לדיכוי של תגובה דלקתית מתווכת NF-kB באמצעות מיקוד לגן myd88 בדגים. ג'יי ביול. Chem. 292, 5282–5290.

44. Gay, NJ, Symmons, MF, Gangloff, M., and Bryant, CE (2014). הרכבה ולוקליזציה של מתחמי איתות קולטן דמויי Toll. נאט. כומר אימונול. 14, 546–558.

45. McKnight, NC, and Zhenyu, Y. (2013). Beclin 1, הוא מרכיב חיוני ומווסת ראשי של PI3K-III בבריאות ומחלות. Curr. פתוביול. רפ' 1, 231–238.

46. ​​Mutwiri, G., Gerdts, V., Lopez, M., and Babiuk, LA (2007). חסינות מולדת ותוספים חדשים. Rev. Sci. טק. 26, 147–156.

47. בוכמן, ק' (2014). אבולוציה של חסינות מולדת: רמזים מחסרי חוליות דרך דגים ליונקים. חֲזִית. אימונול. 5, 459.

48. Chu, Q., Sun, Y., Cui, J., and Xu, T. (2017b). MicroRNA-3570 מווסת את מסלול ה-NF-kB בדגי טלאוסט על ידי מיקוד ל-MyD88. J. Immunol. 198, 3274–3282.

49. Yan, X., Zhao, X., Huo, R., and Xu, T. (2020). IRF3 ו-IRF8 מווסתים איתות NF-kB על ידי מיקוד ל-MyD88 בדגי טלאוסט. חֲזִית. אימונול. 11, 606.

50. Takeuchi, O., Hoshino, K., and Akira, S. (2000). חדשני: עכברים חסרי TLR2- ועכברים חסרי MyD88- רגישים מאוד לזיהום Staphylococcus aureus. J. Immunol. 165, 5392–5396.

51. Keszei, AFA, Tang, X., McCormick, C., Zeqiraj, E., Rohde, JR, Tyers, M., and Sicheri, F. (2014). המבנה של קומפלקס SspH1-PKN1 חושף את הבסיס לזיהוי מצע מארח ואת מנגנון ההפעלה של ליגאז E3 יוביקוויטין חיידקי. מול. Cell Biol. 34, 362–373.

52. Gu¨ nster, RA, Matthews, SA, Holden, DW, and Thurston, TLM (2017). אפקטי מערכת ההפרשה מסוג SseK1 ו-SseK3 מעכבים איתות NFkB ומוות של תאים נקרופטוטיים במקרופאגים נגועים בסלמונלה. לְהַדבִּיק. חיסון. 85, e00010–e00017.

53. Mazurkiewicz, P., Thomas, J., Thompson, JA, Liu, M., Arbibe, L., Sansonetti, P., and Holden, DW (2008). SpvC הוא אפקטור סלמונלה עם פעילות phosphothreonine lyase על קינאזות חלבון המופעלות על ידי מיטוגן מארח. מול. מיקרוביול. 67, 1371–1383.

54. Saitoh, T., and Akira, S. (2010). ויסות של תגובות חיסוניות מולדות על ידי חלבונים הקשורים לאוטופגיה. J. Cell Biol. 189, 925–935.

55. Orvedahl, A., Alexander, D., Tallo´czy, Z., Sun, Q., Wei, Y., Zhang, W., Burns, D., Leib, DA, and Levine, B. (2007) ). HSV-1 ICP34.5 מעניק נוירו-ווירולנטיות על ידי מיקוד לחלבון האוטופגיה Beclin 1. Cell Host Microbe 1, 23–35.

56. Kyei, GB, Dinkins, C., Davis, AS, Roberts, E., Singh, SB, Dong, C., Wu, L., Kominami, E., Ueno, T., Yamamoto, A., et אל. (2009). מסלול האוטופגיה מצטלב עם הביוסינתזה של HIV-1 ומווסת את התפוקות הוויראליות במקרופאגים. J. Cell Biol. 186, 255–268.

57. Niu, H., Xiong, Q., Yamamoto, A., Hayashi Nishino, M., and Rikihisa, Y. (2012). אוטופגוזומים המושרים על ידי חלבון קושר Beclin 1 חיידקי מקלים על זיהום תוך תאי חובה. פרוק. נאטל. אקד. Sci. ארה"ב. 109, 20800–20807.

58. Hussain, MA, Datta, D., Singh, R., Kumar, M., Kumar, J., and Mazumder, S. (2019). גל ציטוסול-Ca2+ בתיווך TLR-2 מפעיל ER stress-superoxide-NO signalosome מגביר את ייצור TNF-a המוביל לאפופטוזיס של מקרופאגים של דגים נגועים ב-Mycobacterium smegmatis. Sci. רפ' 9, 12330.

59. Lee, J., Hartman, M., and Kornfeld, H. (2009). אפופטוזיס מקרופאג בשחפת. יונסאי מד. י' 50, 1–11.

60. McCormick, AL (2008). שליטה באפופטוזיס על ידי ציטומגלווירוס אנושי. Curr. חלק עליון. מיקרוביול. אימונול. 325, 281–295.

61. Kuma, A., Hatano, M., Matsui, M., Yamamoto, A., Nakaya, H., Yoshimori, T., Ohsumi, Y., Tokuhisa, T., and Mizushima, N. (2004) . תפקידה של אוטופגיה בתקופת הרעב המוקדמת של יילודים. טבע 432, 1032–1036.

62. Marin˜ o, G., Niso-Santano, M., Baehrecke, EH, and Kroemer, G. (2014). צריכה עצמית: יחסי הגומלין בין אוטופגיה ואפופטוזיס. נאט. כומר מול. Cell Biol. 15, 81–94.

63. Furuya, D., Tsuji, N., Yagihashi, A., and Watanabe, N. (2005). Beclin-1 מוגבר cis diaminedichloroplatinum שגרם לאפופטוזיס באמצעות שיפור פעילות קספס 9. Exp. Cell Res. 307, 26–40.

64. Pattingre, S., Tassa, A., Qu, X., Garuti, R., Liang, XH, Mizushima, N., Packer, M., Schneider, MD, and Levine, B. (2005). חלבונים אנטי-אפופטוטיים של Bcl-2 מעכבים אוטופגיה 1-תלויה של Beclin. תא 122, 927–939.

65. Djavaheri-Mergny, M., Maiuri, MC, and Kroemer, G. (2010). דיבור צולב בין אפופטוזיס ואוטופגיה על ידי מחשוף בתיווך קספאז של Beclin 1. Oncogene 29, 1717–1719.

66. Grimes, DJ, Gruber, SH, ומאי, EB (1985). זיהום ניסיוני של כרישי לימון, Negaprion brevirostris (Poey), עם מיני Vibrio. ג'יי פיש. Dis. 8, 173–180.

67. Mohamad, N., Mohd Roseli, FA, Azmai, MNA, Saad, MZ, Md Yasin, IS, Zulkiply, NA, and Nasruddin, NS (2019). זיהום טבעי במקביל של Vibrio harveyi ו-V. alginolyticus בקבוצות היברידיות מתורבתות במלזיה. J. Aquat. אנים. בריאות 31, 88–96.