רשת MirNA–mRNA רגולטורית קשורה לתגובת השתלות בפגיעה חריפה בכליות
Mar 21, 2022
דואן גואו1,2†, יו פאן3†, ג'י-רונג יו4*וטאו לין3*
איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com
תַקצִיר
רקע כללי:חַדכִּליָהפציעה(AKI) הוא סיבוך מסכן חיים המאופיין בירידה מהירה בתפקוד הכליות, המופיע לעתים קרובות לאחר ניתוח השתלה. עם זאת, המנגנון המולקולרי העומד בבסיס הפיתוח של AKI לאחר ההשתלה (פוסט-Tx) עדיין לא ידוע. מספר הולך וגדל של מחקרים הוכיחו שמיקרו-RNA (miRNA) מסוימים ממלאים תפקידים חיוניים ב-AKI. המחקר הנוכחי ביקש להבהיר את המנגנונים המולקולריים בפוסט-Tx AKI על ידי בניית רשת miRNA-mRNA רגולטורית.
תוצאות:בהתבסס על שני מערכי נתונים (GSE53771 ו-GSE53769), זוהו שלושה מודולי מפתח, שהכילו 55 mRNA, 76 mRNA ו-151 miRNA, על ידי ביצוע ניתוח רשתות ביטוי משותף של גנים (WGCNA). ה-mind IP v4.1 יושם כדי לחזות את האינטראקציות של mRNA ו-miRNA של מודול מפתח, וצמדי miRNA–mRNA עם ביטחון של יותר מ-0.2 נבחרו לבניית רשת miRNA–mRNA מווסתת על ידי Cytoscape . רשת miRNA–mRNA כללה 82 צמתים (48 mRNA ו-34 miRNA) ו-125 קצוות. שני miRNAs (miR-203a-3p ו-miR-205-5p) ו-ERBB4 עם דרגות צומת גבוהות יותר בהשוואה לצמתים אחרים עשויים למלא תפקיד מרכזי ב-AKI שלאחר Tx. בנוסף, ניתוח מסלולי Gene Ontology (GO) ואנציקלופדיה של קיוטו של גנים וגנומים (KEGG) הצביעו על כך שרשת זו הייתה מעורבת בעיקר בכִּליָה-/פונקציות הקשורות לכליות ומסלולי איתות PI3K–Akt/HIF-1/Ras/MAPK.
סיכום:בנינו רשת miRNA–mRNA רגולטורית כדי לספק תובנות חדשות לגבי פיתוח AKI לאחר Tx, שעשויות לסייע בגילוי סמנים ביולוגיים חדשים או תרופות טיפוליות לשיפור היכולת לחיזוי והתערבות מוקדמים ולהפחתת שיעור התמותה של AKI לאחר ההשתלה.
מילות מפתח: חַדכִּליָהפציעה, השתלת כליה, WGCNA, רשת miRNA–mRNA
cistanche propiedadesלכִּליָה
רקע כללי
כסוג של מחלה קריטית קלינית עם אובדן מהיר של תפקוד כליות ותמותה גבוהה,חַדכִּליָהפציעה(AKI) מתרחשת בדרך כלל אצל מושתלים, מה שעלול לגרום לכישלון ההשתלה ולמוות [1]. אבחון וטיפול בזמן הם חיוניים בשיפור הפרוגנוזה של חולים עם AKI, אך הם מעכבים כיום על ידי היעדר אינדיקטורים ספציפיים לחיזוי מוקדם, הערכה מדורגת וניטור ההשפעה המרפאת. מאחר AKI היא המחלה הקריטית השכיחה ביותר בתחומים רב-תחומיים, מספר הולך וגדל של מחקרים על AKI דווחו בעשורים האחרונים [2-4]. עם זאת, הפתוגנזה של AKI עדיין לא ברורה.
מיקרו-RNA (miRNA) הוא סוג של RNA קטן שאינו מקודד המכיל כ-22 נוקלאוטידים, אשר יכול להיקשר ל-3'-UTR של ה-mRNAs של המטרה ברמה שלאחר התעתוק כדי להפעיל פונקציות פיזיולוגיות ופתופיזיולוגיות חשובות שונות בתאים [5 ]. דווח כי miRNAs מסוגלים לווסת מגוון של mRNA של יונקים [6], בעוד ש-mRNA בודד יכול להיות ממוקד על ידי קבוצה גדולה של miRNAs, המדגים את התפקידים של miRNA בוויסות גנים צריך להתפרש על ידי רשתות מורכבות [7]. בשנים האחרונות, מחקרים על רשת mRNA–miRNA עלו באופן אקספוננציאלי, שכן מאמינים שהם עוזרים לחשוף את המנגנון המולקולרי של מחלות שונות, שכללו נוירובלסטומה [8], סוכרת מסוג 2 [9], ודימום תוך מוחי ספונטני [10]. מחקרים אחרונים מצאו כי השינויים בביטוי של mRNA ו-miRNA ישפיעו על התפשטות ואפופטוזיס של תאי כליה, הקשורים להתרחשות ולהתפתחות של AKI [11, 12]. עם זאת, יש מעט נתונים שפורסמו על הרשת הפוטנציאלית של mRNA ו-miRNA ב-AKI לאחר ההשתלה.
בעידן הרפואה המדויקת, נתוני רצף בתפוקה גבוהה בשילוב עם ניתוח ביואינפורמטיקה יעיל יכולים לזהות גנים ומנגנוני מטרה פוטנציאליים התורמים להתקדמות של AKI. ניתוח רשתות ביטוי משותף של גנים (WGCNA) הוא שיטה בשימוש נרחב למציאת מווסת הליבה של מחלות, מכיוון שיש לה את היכולת לאסוף גנים עם דפוסי ביטוי דומים למודולים (שבהם נמצאים בדרך כלל מווסת הליבה) ולנתח את הקשר בין מודולים ותכונות או פנוטיפים ספציפיים [13]. במחקר שפורסם לאחרונה על ניאופלסיה תוך-אפיתלית צווארית (CIN), WGCNA בוצע כדי לזהות שישה מודולים הקשורים למחלה, שמהם נבדקו 31 גנים מועמדים למרכז לטיפול ב-CIN [14]. ניתוח ביואינפורמטיקה לא רק משפר את היעילות של מחקר על פונקציות ביולוגיות אלא גם מספק מידע אמין לחקר מנגנונים מולקולריים [15, 16]. בהתבסס על מערכי הנתונים הגדולים של פרופילי ביטוי mRNA ו-miRNA באותו חולה, חקירת רשת ה-miRNA-mRNA הרגולטורית יכולה לסייע בבירור המנגנונים המולקולריים של המחלות [17, 18].
במחקר זה, מערכי הנתונים של הביטוי GSE53769 (mRNA) ו-GSE53771 (miRNA) הועברו, בהתאמה, ל-WGCNA כדי לזהות מודולי מפתח הקשורים ל-post-Tx AKI. לאחר מכן, נבנתה רשת miRNA-mRNA רגולטורית כדי להבהיר את המנגנונים האפיגנטיים העומדים בבסיס ההתקדמות של post-Tx AKI, ובכך לספק כיוון אפשרי למחקר קליני עתידי.
תוצאות
זיהוי מודולי מפתח הקשורים ל-post-Tx AKI על בסיס מערך נתונים GSE53769
על פי אלגוריתמי המתאם והקישור הממוצע של פירסון, 36 דגימות נאספו ומפת ה-Dendrogram המדגם ומפת החום של התכונה מתוארים באיור 1a; מצאנו ש-GSM1300317 (ששייך לקבוצת PBX post-Tx) היה מקובץ לבדו ויכול להיות חריג פוטנציאלי. לכן, נעשה שימוש בחלקת at-SNE (הטבעת שכן סטוכסטית מבוזרת) כדי לוודא שדגימה זו לא תשפיע על הניתוחים הבאים. כפי שמוצג בקובץ נוסף 2: איור S2, לא היה חריג ברור לאחר הפחתת הממדים, ולכן המשכנו עם ה-WGCNA. כפי שמוצג באיור 1b, כוח הסף הרך של 9 נבחר כדי להבטיח את האופי נטול הקנה מידה של רשת הביטוי המשותף של הגנים (איור 1b). ההיסטוגרמה של קישוריות הרשת וחלקת היומן התואמת מוצגת בקובץ נוסף 3: איור S3A-B; ה-R2 היה 0.89, מה שמעיד על עמידה בטופולוגיה משוערת ללא קנה מידה. מידע מפורט על מדדי ft רך הכוללים k, R2 ו-R2 מותאם מסופק בקובץ נוסף 10: טבלה S1. עשר, באמצעות צבירת היררכית הקישור הממוצעת, גנים עם דפוסי ביטוי דומים חולקו למודולים (איור 1c). כדי להבחין טוב יותר בין מודולים עם דפוסי הבעה שונים, לכל מודול הוקצו צבעים שונים. כפי שמוצג באיור 1ד, נבנתה דנדרוגרמה של צבירת מודולים שיצרה בסך הכל 18 מודולים. המודול האפור הכיל את הגנים שלא ניתן להקצות ל-17 המודולים האחרים. מפת חום המתארת את המתאם בין תכונות קליניות למודולים מוצגת באיור 1ה. מבין המודולים הללו, המודול השחור הציג את המתאם החיובי הגבוה ביותר עם AKI שלאחר Tx (P=0.002, R=0.5), בעוד שהמודול השחור הציג את המתאם השלילי החזק ביותר עם post-Tx AKI (P=4e−05, R= -0.63). לפיכך, שני המודולים הללו נבחרו כמודולים מרכזיים. הקצאות של mRNAs במודולים שחור ושזוף מסופקות בקובץ נוסף 11: טבלה S2.
רשת גנים-גנים וניתוח העשרה תפקודית במודול השחור והשזוף
כפי שמוצג באיור 2a, מקדם המתאם של חברות מודול (MM) לעומת מובהקות גנים (GS) במודול השחור היה 0.57 עם P=5.5e-38. בסך הכל זוהו 14 גנים רכזים במודול השחור, שכלל CLIC5, PCOLCE2, NDNF, ESRP1, ENPEP, RASAL2, SLIT2, PSAT1, NOX4, GDA, CNTN3, CFAPP221, CA2 ו-ZNF311 (איור 2b). עשר, ניתוח העשרה של מסלולי GO ו-KEGG בוצע על הגנים במודול השחור. כפי שמוצג באיור 2c, מצאנו שמונחי ה-GO המועשרים ביותר בקטגוריית התהליך הביולוגי (GO-BP) היוכִּליָהפיתוח, פיתוח מערכת הכליות וויסות של מפל ERK1/2. מונחי ה-GO המועשרים ביותר בקטגוריות האחרות (GO-CC ו-GO-MF) היו החלק האפיקי של הקישור למולקולת הידבקות התא והתא (איור 2ד, ה). עבור ניתוח מסלולי KEGG, גנים אלה הועשרו בעיקר באיתות MAPK ובנתיבי איתות Raq1 (איור 2f).
The genes of the tan module underwent the same analysis. Te scatter plots of MM versus GS in the tan module (cor=0.6, P=4.2e−18) are shown in Fig. 3a. The gene-gene network centered on hub genes in this module is depicted in Fig. 3b. As we can see, the tan module contained 12 hub genes including DMXL1, MAF, GPHN, MYOF, CDK14, and QDPR. The functional annotation of genes in the tan module is depicted in Fig. 3c–f, indicating that the black module genes were primarily enriched in functions of the coenzyme metabolic process, the extrinsic component of the plasma membrane, and coenzyme binding, as well as pathways of folate (FA) biosynthesis. Detailed information of differentially expressed genes (defined by log2 fold change>0.1 ו-p-value<0.05 when="" comparing="" their="" expression="" in="" post-tx="" aki="" group="" to="" that="" in="" zero-hour="" aki="" group)="" in="" black="" module="" and="" the="" tan="" module="" is="" provided="" in="" additional="" file="" 4:="" figure="" s4="" and="" additional="" file="" 5:="" figure="" s5,="">
זיהוי מודולי מפתח הקשורים ל-post-Tx AKI על בסיס מערך הנתונים GSE53771
על מנת לחקור את התפקידים של miRNA ב- Post-Tx AKI, ערכנו גם WGCNA עבור miRNA על בסיס מערך הנתונים GSE53771. שלבי הבנייה של רשת הביטוי המשותף עבור miRNAs היו דומים לאלה של mRNAs. דנדרוגרמה מדגם ומפת חום תכונה מוצגים באיור 4א. כדי להבטיח רשת נטולת אבנית, הספק הסף הרך נקבע כ-6 (איור 4ב). ההיסטוגרמה של קישוריות הרשת וחלקת היומן התואמת מוצגת בקובץ נוסף 3: איור S3C-D; ה-R2 היה 0.98, מה שמצביע על עמידה בטופולוגיה משוערת ללא קנה מידה. מידע מפורט של מדדי ft-threshold, כולל k, R2 ו-Ffitted R2, מסופק בקובץ נוסף 10: טבלה S1. בסך הכל זוהו שלושה מודולי miRNA, שהיו בלתי תלויים זה בזה (איור 4 ג, ד). עשרה, המתאם של מודולי miRNA עם תכונות קליניות נותח, והתוצאה הראתה שמודול ה-miRNA הכחול היה המודול היחיד בקורלציה מובהקת עם post-Tx AKI (P=0.003, R= − 0.36) (איור 4ה). לכן, מודול ה-miRNA הכחול שהורכב מ-76 מירנאים נבחר כמודול ה-miRNA המפתח לניתוח שלאחר מכן. מידע מפורט על miRNAs אלה מסופק בקובץ נוסף 11: טבלה S2.
רשת MiRNA–miRNA וניתוח העשרה תפקודית במודול ה-miRNA הכחול
כפי שמוצג באיור 5a, מקדם המתאם של MM לעומת GS במודול ה-miRNA הכחול היה 0.32 עם P=5.8e−5. רשת האינטראקציה של miRNAs מודול הראתה כי 17 miRNAs רכזת זוהו במודול ה-miRNA הכחול (איור 5b). כדי להמשיך ולחקור את התפקידים הביולוגיים של miRNAs במודול זה, גני המטרה של miRNAs אלה שימשו לביצוע ניתוח העשרה תפקודית. תוצאות של ביאור פונקציות מוצגות באיור 5c-e, מה שמצביע על כך שה-miRNAs של מודול ה-miRNA הכחול היו קשורים באופן משמעותי למונחי GO של התמרה קטנה בתיווך GTPase, פיתוח בלוטות, פעילות קו-ווסת שעתוק וצומת adherens, כמו גם פריטי KEGG של מסלול איתות MAPK וזיהום בנגיף 1 של לוקמיה בתאי T.
Detailed information of differentially expressed miRNAs (defined by log2 fold change>0.1 ו-p-value<0.05 when="" comparing="" their="" expression="" in="" post-tx="" aki="" group="" to="" that="" in="" zero-hour="" aki="" group)="" in="" the="" blue="" module="" is="" provided="" in="" additional="" file="" 6:="" figure="">
קוןמבנה שֶׁל רגולטורים miRNA–mRNA רֶשֶׁת in poרחוב-Tx AKI
הגנים וה-miRNA שיצרו, בהתאמה, את מודולי המפתח ואת מודול ה-miRNA המפתח שימשו ליצירת רשת ה-miRNA–mRNA הרגולטורית. סך של 1048 צמדי miRNA–mRNA חזויים בדרגת ביטחון גבוהה התקבלו מ-miRDIP v4.1 ושימשו לבניית רשת על ידי Cytoscape (קובץ נוסף 7: איור S7). ההערה הפונקציונלית של mRNAs ברשת זו מתוארת בקובץ נוסף 8: איור S8, המצביע על כך ש-mRNA אלו היו מעורבים בעיקר בהדבקה של מצעי תאים, פיתוח מערכת אורוגנית, קשירת הפרין, קישור קולגן, מסלול איתות AGE-RAGE בחולי סוכרת סיבוכים, כמו גם מסלול איתות PI3K-Akt. לאחר מכן, כדי להשיג את הרשת שעשויה למלא תפקידי מפתח בפתוגנזה של post-Tx AKI, בחרנו את צמדי ה-miRNA–mRNA בביטחון של יותר מ-0.2 כדי ליצור רשת miRNA–mRNA מווסתת (איור .6). רשת miRNA–mRNA הרגולטורית הורכבה מ-82 צמתים (48 mRNA ו-34 miRNA) ו-125 קצוות. לאחר ניתוח הרשת, מצאנו את miR-203a-3p, miR-205-5p ו-ERBB4 עם דרגות צומת גבוהות יותר בהשוואה לצמתים אחרים, ופרטי הכימות מסופקים בקובץ נוסף 12 : טבלה S3. עשר, ניתוחים פונקציונליים גילו כי סך 48 ה-mRNA הועשר בעיקר במונחי GO של מורפוגנזה של צינור אפיתל, התפתחות נפרון, התפתחות מערכת אורוגנית וקינאז חלבון לקולטן טרנסממברני (איור 7a-c). לא היו מסלולי KEGG מועשרים באופן משמעותי מכיוון שערכי ה-p שלהם היו גדולים מ-0.05 (איור 7ד). לצורך אימות צולב, השווינו את התוצאות הנוכחיות שלנו שאוחזרו ממסד הנתונים של miRDIP לתוצאות ממסד הנתונים של miRNet. בסך הכל, זוהו 75,699 זוגות miRNA–mRNA לפי דקה, והייתה מפגש של 117 זוגות miRNA–mRNA בין התוצאות של מסד הנתונים miRNet ומסד הנתונים miRDIP; הרשת הרגולטורית המתאימה מוצגת בקובץ נוסף 9: איור S9B. ניתוחי ההעשרה של 117 זוגות ה-miRNA–mRNA הראו שהם היו מעורבים בעיקר בוויסות שלילי של ארגון הרכיבים התאיים, תגובה לחומר אורגני בקטגוריית GO-BP; קומפלקס של גורם ייזום תרגום אוקריוטי 4F, וגוף גרעיני בקטגוריית GO-CC; פעילות קולטן SNAP, קשירת קומפלקס חלבון, פעילות חלבון טירוזין פוספטאז תחת קטגוריית GO-MF, וכן מסלולי KEGG הקשורים לאיתות קרצינומה של תאי כליה, איתות פרולקטין ותגובת עקה חמצונית בתיווך NFR2-. מכיוון שתוצאות ההעשרה התפקודיות לעיל התבססו על צמדי miRNA–mRNA שנחזו על ידי מסדי נתונים של miRNet ו-miRDIP, הם עשויים להיות מייצגים יותר את המנגנונים האפיגנטיים שבבסיס ה-post-Tx AKI.
דִיוּן
Post-Tx AKI הוא סיבוך שכיח לאחר ניתוח השתלה, המאופיין בירידה מהירה בתפקוד הכליות ובתמותה גבוהה [19]. תפיסת הזמן הטוב ביותר לאבחון מוקדם והתערבות של AKI לאחר Tx היא מאתגרת בשל היעדר אינדיקטורים ספציפיים לחיזוי מוקדם, הערכת דירוג וניטור היעילות. כדי להתגבר על בעיות כאלה, בחינת הפתומנגניזם והסמנים הביולוגיים הפוטנציאליים של post-Tx AKI היא חיונית. בשנת 2014, Wilfingseder et al. ביצע ניתוח מיקרו-מערך של miRNA ו-mRNA המבוסס על דגימת ביופסיה של השתלת כליה עם AKI וזיהה עוד חתימה מולקולרית ספציפית ל-AKI באמצעות ניתוחי ביטוי גנים דיפרנציאליים (DEA) [20]. עם זאת, DEA יכול בקלות להוציא כמה גנים חשובים שרמת הביטוי שלהם משתנה מעט, אך ממלאים תפקיד מכריע במחלות. חוץ מזה, קשה לאשר אם ה-mRNAs וה-miRNA המובעים באופן דיפרנציאלי בביופסיה שלאחר Tx בין הבקרה ל-AKI היו קשורים ל-post-Tx AKI, בשל העובדה ש-Tx יכול להוביל גם לביטוי לא תקין של גנים מסוימים. מחקרים הולכים וגדלים הראו שלא ניתן לווסת את ההתחלה וההתקדמות של כל המחלות על ידי מספר גנים, אלא רשת של מספר רב של RNAs [21, 22]. לפיכך, בניית רשת רגולטורית RNA עשויה להיות אסטרטגיה מבטיחה להבנת התפתחות המחלה ולביסוס טיפול חדש [23]. כגישה ביואינפורמטיקה חזקה, ל-WGCNA יש את היכולת לשפר רשתות מתאם פשוטות על ידי כימות המתאמים בין זוגות בודדים של גנים, כמו גם את המידה שבה גנים אלה חולקים את אותם שכנים [24]. WGCNA כולל לא רק גנים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית, אלא גם גנים שאינם מתבטאים באופן דיפרנציאלי אך עדיין מהווים מתווך מפתח של תכונות קליניות מסוימות. בשנים האחרונות, WGCNA יושמה במגוון רחב של אנשים
חוקרי מחלות כדי לסנן סמנים ביולוגיים ולהבהיר מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס התפתחות המחלה [25, 26].
במחקר הנוכחי, בהתבסס על מערכי ה-mRNA ו-miRNA microarray, זוהו שלושה מודולים שהיו בקורלציה מובהקת עם AKI לאחר ההשתלה באמצעות WGCNA. מודול Te tan המכיל 55 mRNA הראה מתאם שלילי מובהק עם AKI שלאחר Tx. מחקרים מרובים דיווחו שריכוז גבוה של FA עלול לייצר נמק צינורי חריף כיצירת גבישי FA באבובות הכליות, מה שמוביל לאי ספיקת כליות [27, 28]. ה-mRNAs במודול השיזוף היו מעורבים בעיקר במסלול של ביוסינתזה של FA, מה שמרמז על כך שמסלול זה אחראי להתפתחות של post-Tx AKI. לאחר מכן, בתור המודול הקשור בצורה החיובית ביותר ל-post-Tx AKI, המודול השחור היה מורכב מ-80 mRNAs. יש לציין שהפריטים המועשרים ביותר של ה-mRNA של המודול השחור בניתוח GO היו קשורים בעיקר לתפקודי הכליות כגוןכִּליָהפיתוח ופיתוח נפרון, המאשרים את המתאם הגבוה של מודול זה עם AKI שלאחר Tx. מחקר קודם הצביע על כך שמפל הקינאזות החוץ-תאי (ERK) ממלא תפקיד מהותי בהפעלת מנגנוני תיקון מפצים במהלךכִּליָהפציעה[29]. המחקר שלנו הראה שגם ה-mRNA של המודול השחור הועשר באופן משמעותי בתפקודים של מפל ERK1/2. חוץ מזה, תוצאות של ניתוח מסלול KEGG הצביעו על כך ש-mRNA אלו היו קשורים קשר הדוק למסלול האיתות MAPK ולמסלול האיתות Ras. תועד במידה רבה כי מסלול MAPK מפעיל תפקיד מפתח ב-AKI על ידי ויסות דלקת כליות, פגיעה בצינורית ומוות תאי [30-32]. מקובל בכל העולם שמסלול MAPK/ERK הוא מולקולת אות במורד הזרם במסלול האיתות Ras [33]. התוצאות שלעיל גילו שביטוי לא תקין של גנים מסוימים מביא ל-AKI על ידי ויסות ביוסינתזה של FA, מסלול איתות MAPK ומסלול איתות Ras כדי להשפיע על התפתחות הכליות לאחרכִּליָההַשׁתָלָה.
ראיות ניסיוניות הולכות וגדלות אישרו כי ל-miRNAs מסוימים יש תפקידים קריטיים בזיהוי, התקדמות והתערבות של AKI [34]. Amrouche et al. הוכיח כי ל-miR-146a יש תפקיד חשוב בתגובה הצינורית הכלייתית, אשר וויסות עלייה שלה יכול להגביל את התפתחות AKI [35]. מחקר קודם הוכיח ש-miR בשתן -21 יכול לשמש כסמן ביולוגי לניבוי התפתחות AKI לאחר ניתוח לב [36]. כמודול ה-miRNA היחיד הקשור באופן מובהק ל-post-Tx AKI במחקר זה, מודול ה-miRNA הכחול המכיל 151 miRNAs היה בקורלציה שלילית ל-post-Tx AKI. יש הכרה רחבה ש-miRNAs יכולים לווסת את הביטוי של גני המטרה שלהם במורד הזרם כדי להפעיל פונקציות ביולוגיות. בהתאם לכך, חזינו את המטרות של miRNAs אלה באמצעות "miRNAtap" ו- "multiMiR" לביצוע ביאור פונקציונלי. יש לציין שהמטרות של miRNAs של מודול מפתח גם הועשרו בעיקר במסלול האיתות MAPK, מה שאישר עוד יותר את התפקיד המכריע של מסלול MAPK בתהליך של AKI לאחר Tx.
יתר על כן, יש צורך לזהות רשת miRNA–mRNA רגולטורית העשויה להיות מעורבת בפתוגנזה של AKI שלאחר Tx, שכן לא גנים או miRNA יכולים לווסת באופן עצמאי את התפתחות AKI שלאחר Tx. רוב המחקרים הקודמים התמקדו אך ורק ב-miRNAs או בגנים כדי להבהיר את המנגנון של AKI. על ידי שימוש בכלים ביואינפורמטיקה, הקמנו לבסוף רשת miRNA–mRNA רגולטורית של AKI לאחר Tx, שהורכבה מ-48 mRNA ו-34 miR NA. בין 82 הצמתים הללו, miR-203a-3p, miR-205-5p ו-ERBB4 הראו דרגות גבוהות ועשויים להיות צמתים מרכזיים ברשת. ההשפעות של miR-205-5p במחלות כליה נחקרו בעבר. Schena et al. דיווח כי רמת הביטוי של miR-205-5p הייתה בקורלציה מובהקת וחיובית עם חומרת סרטן הכליה ו-Hypertensive Nephrosclerosis [37]. מחקר ניסיוני שנערך על ידי Sessa ועמיתיו הציע כי miR-205-5p יכול להיות סמן ביולוגי מולקולרי של נזק לכליות [38]. מחקרים מעטים חקרו את התפקידים של miR-203a-3p ו-ERBB4 בפיתוח AKI. מתועד כי ERBB4 יכול להקל על עלבונות חמצוניים של תאי גזע מזנכימליים מבוגרים על ידי הפחתת רמות מיני חמצן תגובתיים (ROS) [39]. ידוע היטב שכל האיברים המושתלים יעברו מידה מסוימת של פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה המתווכת על ידי רמה גבוהה של ROS לאחר ההשתלה ועלולים להתפתח ל-AKI. שיערנו ש-ERBB4 מפעיל גם את הפונקציה של ויסות רמות ROS בפיתוח של AKI לאחר Tx. ניתוח העשרה GO של ה-mRNAs ברשת זו הראה כי ה-mRNA הללו הועשרו במספר פונקציות הרלוונטיות להתפתחות הכלייתית. יתר על כן, ניתוח העשרה של KEGG הצביע על כך שרשת זו הייתה מעורבת בעיקר במגוון מסלולים שנחקרו היטב, כגון מסלול איתות PI3K–Akt, מסלול איתות HIF-1, מסלול איתות Ras ומסלול איתות MAPK. רוב המסלולים הללו הוכחו כבעלי תפקידים מכריעים ב-AKI [30, 40, 41]. תוצאות אלו הוכיחו שהניתוח שלנו בוצע כהלכה.
יחד, המחקר שלנו, בפעם הראשונה, השתמש ב-WGCNA בשילוב עם ניתוח miRDIP v4.1 כדי לזהות באופן מקיף את האינטראקציות הסבירות ביותר ולבנות רשת miRNA-mRNA רגולטורית הקשורה לתגובת השתלה ב-AKI, אשר סיפקה מסגרת ראשונית וכמה חדשניים. תובנה להבהרת המנגנון המולקולרי של התפתחות של post-Tx AKI. עם זאת, יש להזכיר כמה מגבלות של מחקר זה. ראשית, רק שמונה דגימות ביופסיה לאחר Tx AKI נרשמו למחקר הנוכחי, מה שלא הספיק כדי להסיק מסקנות אמינות לחלוטין. שנית, רשת miRNA–mRNA הרגולטורית דורשת מחקרים נוספים בניסויים בביולוגיה קלינית ומולקולרית לצורך אימות. מכיוון שקשה למצוא נתונים מתאימים, סוגים אחרים של RNAs, כגון RNAs לא מקודדים ארוכים (lncRNAs) ו- RNAs מעגליים (circRNAs), לא נכללו, מה שעשוי להוות חיסרון בבירור המקיף של המנגנון העומד בבסיס post-Tx AKI התפתחות.
יתרונות גזע cistanche על תפקוד הכליות
מסקנות
תחילה בנינו בהצלחה רשת miRNA–mRNA רגולטורית הקשורה לפוסט-Tx AKI על ידי שימוש בניתוח ביואינפורמטיקה. התוצאות הצביעו על כך ששני miRNAs (miR-203a-3p ו-miR-205-5p) ו-ERBB4 עשויים למלא תפקיד מרכזי בפוסט-Tx AKI, ובתפקודים הביולוגיים של ה-miRNA הרגולטורית רשת -mRNA הועשרה בתפקודים הקשורים לכליות/כליות ובנתיבי איתות PI3K–Akt/HIF-1/Ras/MAPK. מחקר זה מספק פרספקטיבה מקיפה של רשתות רגולטוריות כדי להגביר את ההבנה של המנגנון המולקולרי ב-post-Tx AKI. אנו מקווים שהמחקר הנוכחי יועיל לגילוי סמנים ביולוגיים חדשים או תרופות טיפוליות לשיפור היכולת לניבוי מוקדם והתערבות ולהפחתת שיעור התמותה של AKI לאחר השתלה.
שיטות
עיצוב לימודי ואיסוף נתונים
העיצוב הכולל של מחקר זה מוצג בקובץ נוסף 1: איור S1. כל נתוני המיקרו-מערך הכשירים הורדו ממסד הנתונים Gene Expression Omnibus (GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). מערך נתונים GSE53769 הוא מערך נתונים של ביטוי mRNA אשר בוצע באמצעות Affymetrix GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array; מערך הנתונים של GSE53771 הוא מערך ביטוי של miRNA אשר נותח על ידי Affymetrix GeneChip® miRNA 3.0 מערך. שני מערכי הנתונים הללו כללו שניהם 18 דגימות ביופסיה של שעות אפס ו-18 דגימות ביופסיה לאחר השתלה (Tx) מ-18 מקבלי שתל כליה (שמונה עם נמק צינורי חריף ללא דחייה המוגדרים כ-AKI ועשר ביופסיות פרוטוקול ללא פתולוגיה (PBX) המוגדרות כביקורות) וכן הוגשו על ידי Wilfingseder ועמיתיו לעבודה [20]. דגימות אלו חולקו לארבע קבוצות, כלומר AKI שעת אפס, PBX של שעות אפס, AKI שלאחר Tx ו-PBX שלאחר Tx. שני מערכי הנתונים שימשו, בהתאמה, לבניית רשת הביטוי המשותף, לפיה ניתן היה לזהות מודולי mRNA/miRNA מפתח הקשורים לפוסט-Tx AKI, מה שמאפשר בניית רשת רגולטורית miRNA-mRNA המניעה את ההתקדמות של post-Tx AKI .
בניית רשתות הביטוי המשותף
WGCNA is a widely used method to construct co-expression networks that allow the discovery of gene modules, where coordinated expression patterns of the intra-module genes could be identified and related to external clinical phenotypes. In this way, the search for core disease regulators could be narrowed down and confined to the clinically significant modules [13]. Given the foregoing, WGCNA has greatly improved the efficacy of data mining; therefore, in this study, the R package "WGCNA" was utilized to construct co-expression networks based on the expression profiles of mRNAs and miRNAs, respectively. An optimal soft threshold power β, the minimum power parameter that satisfied the scale-free topology (as manifested by scale-free topology ft index>0.85), נקבע לראשונה. לאחר מכן, נבנתה רשת ביטוי משותף ללא קנה מידה על בסיס מטריצת הסמיכות. מטריצת הסמיכות התקבלה באמצעות הנוסחה: Adjacencyk,j=cork, j- , כאשר k ו-j תואמים לשני גנים שרירותיים וה- משמש להדגשת הדמיון החזק בין k ל-j, מה שהבטיח כי זוגות גנים עם דמיון נמוך יושמט במהלך הקצאת המודול. עשר, מטריצת הסמיכות הומרה למטריצת חפיפה טופולוגית (TOM). על ידי שימוש במדד אי-דמיון מבוסס TOM, דנדרוגרמת עץ הגנים נוצרה על ידי צבירת היררכית ממוצעת של קישור, וגנים עם דפוסי ביטוי דומים התקבצו במודולים שונים (גודל המודול המינימלי נקבע ל-30).
cistanche herbaיכול לטפלכִּליָהמַחֲלָהלְשַׁפֵּרתפקוד כליות
זיהוי מודולי המתאם המשמעותיים
גנים עצמיים של מודול (MEs), המסכמים דפוסי ביטוי גנים כפרופיל ביטוי אופייני יחיד בתוך מודול נתון, שימשו להערכת המתאם הפוטנציאלי של גנים עם תכונות שונות לקביעת המשמעות של כל מודול. מובהקות גנים (GS) ייצגה את המתאם בין גנים ותכונות קליניות שונות, וה-GS הממוצע של כל הגנים במודול הוגדר כמשמעות מודול (MS), המבוטאת כ-MS {{0}}}n- ni{ {2}}GSi (n=מספר גנים בתוך מודול). לאחר חישוב המתאם של Pearson בין MEs ותכונות קליניות, המודולים עם ה-R החיובי או השלילי הנמוך ביותר (מקדם מתאם) עם post-Tx AKI עם חיתוך ערכי מתאם של 0.05 הוגדרו כמודולים מפתח. עקבנו אחר זרימת העבודה הסטנדרטית שהומלצה על ידי מחברי WGCNA [13], ותיקון ערך p עבור בדיקות מרובות לא בוצע מכיוון שמקדם פירסון R וערך p המתאם מספיקים לבחירת מודול משמעותית [13]. עוצמת הצבע במפת החום הצביעה על עוצמת המתאם. כדי ללמוד טוב יותר מודול מפתח, נותח המתאם של גנים של מודול ורשת האינטראקציה בין גנים לגנים הוצגה על ידי מנתח הרשת Cytoscape v3.7.2 [42]. ברשת זו, הגנים בעלי דרגה גבוהה, שהכילו צמתים מחוברים מאוד במודול, נחשבו לגנים רכזת. גנים אלו של hub זוהו על ידי ביצוע הניתוח עם תוסף MCODE ב-Cytoscape.
מִחָדָשׁgulatory miRNA–mRNA לאtwork cעַלstructiעַל
על ידי שימוש בכלי המקוון miRDIP v4.1 הושגו האינטראקציות בין גנים המודולים ל-miRNAs. עשרה, זוגות ה-miRNA–mRNA עם ביטחון גבוה של חיזוי נבחרו לבניית רשת רגולטורית miRNA–mRNA באמצעות Cytoscape v3.7.2. כדי להצליב, התוצאות שלנו, האינטראקציות miRNA-mRNA אוחזרו גם ממסד הנתונים של miRNet.
Fבִּלתִיctiעלl herichmhet אנהlysis
כדי להבין יותר את הפונקציות הפוטנציאליות של הגנים המזוהים, בוצעו ניתוח העשרה של Gene Ontology (GO) וניתוח מסלולים של Kyoto Encyclopedia of Genes and Genmes (KEGG) באמצעות שימוש בחבילת R "רולר אשכולות" [44]; במקרים מסוימים (קובץ נוסף 4: S4A, קובץ נוסף 5: S5A, קובץ נוסף 6: S6A וקובץ נוסף 9: S9C), הופעלה הפונקציה TCGAanalyze_ EAcomplete בספריית TCGAbiolinks. במחקר זה, התוצאות של מונחי GO ומסלולי KEGG עם ה-Benjamini–Hochberg (BH) מותאמיםP-ערכים של<0.05 were="" considered="" to="" be="" significantly="">
Cistanche tubulosa מונע מחלת כליות, לחץ כאן כדי לקבל את הדגימה
עייןננסי
1. Abu Jawdeh BG, Govil A. פגיעה חריפה בכליות בהשתלה: אבחנה מבדלת והשפעה על בריאות ובריאות. עו"ד Chronic Kidney Dis. 2017;24(4):228–32.
2. Cooke WR, Hemmilä UK, Craik AL, Mandula CJ, Mvula P, Msusa A, et al. שכיחות, אטיולוגיה ותוצאות של פגיעה כלייתית חריפה הקשורה למיילדות במלאווי: מחקר תצפית פרוספקטיבי. BMC Nephrol. 2018;19(1):25.
3. Solé C, Pose E, Solà E, Ginès P. Hepatorenal syndrome בעידן של פגיעה חריפה בכליות. Liver Int Of J Int Assoc Study Liver. 2018;38(11):1891–901.
4. Ostermann M, Liu K. Pathophysiology of AKI. Best Practice Res Clin Anaes- הקרקע. 2017;31(3):305–14.
5. Saliminejad K, Khorram Khorshid HR, Soleymani Fard S, Ghafari SH. סקירה כללית של microRNAs: ביולוגיה, תפקודים, טיפולים ושיטות ניתוח. J Cell Physiol. 2019;234(5):5451–65.
6. פרידמן RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP. רוב ה-mRNA של היונקים הם מטרות משומרות של microRNA. Genome Res. 2009;19(1):92–105.
7. Pan X, Wenzel A, Jensen LJ, Gorodkin J. זיהוי כלל הגנום של אשכולות של אתרי קישור למיקרו-RNA חזויים כמועמדים לספוג מיקרו-RNA. PLoS ONE. 2018;13(8):e0202369.
8. Chen B, Hua Z, Qin X, Li Z. מיקרו-מערך משולב לזיהוי ה-MiRNAs של הרכז ובנה רשת miRNA-mRNA בנוירובלסטומה באמצעות ניתוח ביואינפורמטיקה. Neurochem Res. 2020.
9. Liu HM, Huang Y, Li L, Zhang Y, Cong X, Wu LL, et al. פרופילי ביטוי של MicroRNA-mRNA ורשת תפקודית של הבלוטה התת-לסתית בעכברי db/db סוכרתיים מסוג 2. Arch Oral Biol. 2020;120:104947.
10. Iwuchukwu I, Nguyen D, Beavers M, Tran V, Sulaiman W, Fannin E, et al. רשת רגולטורית MicroRNA כסמנים ביולוגיים של התקף מאוחר בחולים עם דימום תוך מוחי ספונטני. מול נוירוביול. 2020;57(5):2346–57.
11. van Zonneveld AJ, Rabelink TJ, Bijkerk R. miRNA-תואמו רשתות כמטרות טיפוליות מבטיחות לפגיעה חריפה בכליות. אם ג'יי פאתול. 2017;187(1):20–4.
12. Wu J, Li DD, Li JY, Yin YC, Li PC, Qiu L, et al. זיהוי של רשתות microRNA-mRNA המעורבות בפגיעה בתאי אפיתל צינורית הכלייתית הנגרמת על ידי ציספלטין. Eur J Pharmacol. 2019;851:1–12.
13. Langfelder P, Horvath S. WGCNA: חבילת R לניתוח רשת מתאם משוקלל. BMC Bioinform. 2008;9:559.
14. Zhang X, Bai J, Yuan C, Long L, Zheng Z, Wang Q, et al. ניתוח ביואינפורמטיקה וזיהוי של גנים פוטנציאליים הקשורים לפתוגנזה של ניאופלזיה תוך-אפיתלית צווארית. J סרטן. 2020;11(8):2150–7.
15. Li J, Lu L, Zhang YH, Xu Y, Liu M, Feng K, et al. זיהוי חתימות ביטוי תאי גזע של לוקמיה באמצעות מונטה קרלו תכונה אסטרטגיית בחירה ומכונת תמיכה וקטורית. סרטן ג'ין ת'ר. 2020;27(1–2):56–69.
16. Pan X, Zeng T, Yuan F, Zhang YH, Chen L, Zhu L, et al. סקר של חתימת מתילציה ותפקודי גנים הקשורים לתת-הסוגים של גליומות מוטציה של איזוציטרט דהידרוגנאז. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:339.
17. Shen M, Song Z, Wang JH. פרופילי microRNA ו-mRNA באמיגדלה קשורים לדיכאון וגמישות הנגרמים על ידי מתח בעכברים צעירים. פסיכופרמקולוגיה. 2019;236(7):2119–42.
18. An T, Song Z, Wang JH. מנגנון מולקולרי של טיפול תגמול המשפר התנהגות דכאונית הנגרמת על ידי מתח כרוני שהוערך על ידי רצף מירנה ו-mRNA בקליפת המוח הפרה-פרונטלית המדיאלית. Biochem Biophys Res Commun. 2020;528(3):520–7.
19. Zuk A, Bonventre JV. פגיעה חריפה בכליות. עננו ר' מד. 2016;67:293–307.
20. Wilfingseder J, Sunzenauer J, Toronyi E, Heinzel A, Kainz A, Mayer B, et al. פתוגנזה מולקולרית של פגיעה חריפה בכליות לאחר ההשתלה: הערכת פרופילי mRNA ו-miRNA של הגנום המלא. PLoS ONE. 2014;9(8):e104164‑e.