נטרין חדש-1-פפטיד משפר את ההגנה מפני מוות עצבי ומקל על דימום תוך מוחי בעכברים חלק 1

תַקצִיר:

דווח שנטרין-1 מעורב בהגנה עצבית בעקבות פגיעה במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, התחום הפונקציונלי המינימלי של Netrin-1 שיכול לשמר את ההגנה הנוירובית אך למנוע את תופעות הלוואי העיקריות של Netrin נותר חמקמק.

מערכת העצבים המרכזית היא אחת ממערכות העצבים החשובות ביותר בגוף האדם, השולטת על החשיבה, הרגשות והפעולות של אנשים. כאשר מערכת העצבים המרכזית נפגעת, גם הזיכרון של אנשים ייפגע. אבל אל דאגה, אנחנו יכולים לנקוט בכמה דרכים חיוביות כדי לעזור לשחזר את הזיכרון.

ראשית, עליך להבין את ההשפעה של נזק לזיכרון. פגיעה במערכת העצבים המרכזית יכולה להשפיע על היכולות הקוגניטיביות של אנשים, תהליכי החשיבה ותשומת הלב, כל אלו משפיעים ישירות על הזיכרון של אנשים. בנוסף, פגיעה במערכת העצבים המרכזית יכולה לגרום גם לאי יציבות רגשית, מה שגורם לאנשים להיות נוטים יותר לפאניקה, חרדה ודיכאון, ובכך להשפיע על התאוששות הזיכרון.

עם זאת, למרות שנזק למערכת העצבים המרכזית יכול להביא כמה השפעות שליליות, אנחנו יכולים לנקוט כמה צעדים חיוביים כדי לקדם התאוששות זיכרון. ראשית, נוכל לנסות אימון קוגניטיבי, כגון קריאה, כתיבה ופתרון חידות. פעילויות אלו יכולות לעורר את המוח לייצר נוירונים חדשים ולעזור למוח לבנות זיכרונות ודרכי חשיבה חדשים.

שנית, אנו יכולים גם לקדם התאוששות זיכרון באמצעות פעילות גופנית כלשהי. מחקרים הראו שפעילות גופנית נכונה יכולה לעורר את המוח לייצר נוירונים וקשרים נוירונים חדשים ולקדם את עיבוד המידע החדש במוח. זו הסיבה שחלק מהאנשים מעלים לפתע רעיון טוב או פותרים בעיה קשה בזמן ריצה או הליכה.

לבסוף, עלינו לשים לב לתפקיד של צריכה תזונתית נכונה על הזיכרון. תפקוד תקין של המוח דורש כמה חומרים מזינים הכרחיים, כגון חלבון, ויטמינים ויסודות קורט. אם למזון שלנו חסרים חומרים מזינים אלו, זה ישפיע על הזיכרון ועל יכולת החשיבה שלנו. לכן, עלינו לבחור כמה מזונות העשירים בחומרים מזינים אלו בתזונה שלנו, כגון דגים, בשר רזה, ירקות ופירות.

בקיצור, לפגיעה במערכת העצבים המרכזית תהיה השפעה מסוימת על הזיכרון של אנשים, אבל אנחנו יכולים לקדם את התאוששות הזיכרון באמצעות אימון קוגניטיבי נכון, פעילות גופנית ושליטה בתזונה. אני מקווה שכולם יוכלו להתמודד עם האתגרים בחיים בצורה חיובית, לשמור על גישה אופטימית, ולשאוף לשקם מערכת עצבים מרכזית בריאה וזיכרון טוב. ניתן לראות שאנו צריכים לשפר את הזיכרון, וסיסטאנצ'ה יכולה לשפר משמעותית את הזיכרון מכיוון ש-Cistanche היא רפואה סינית מסורתית עם השפעות ייחודיות רבות, אחת מהן היא שיפור הזיכרון. היעילות של Cistanche מגיעה מהמרכיבים הפעילים השונים שהוא מכיל, לרבות חומצה טאנית, פוליסכרידים, גליקוזידים פלבנואידים ועוד, שיכולים לקדם את בריאות המוח בדרכים רבות.

לחץ על Know כדי לשפר את הזיכרון לטווח קצר

כאן, חקרנו את ההשפעה הנוירו-הגנתית של פפטיד E1 שמקורו בדומיין EGF3 של Netrin (שאריות 407-422). מצאנו שהוא מקיים אינטראקציה עם קרצינומה של המעי הגס שנמחק (DCC) כדי להפעיל זרחון קינאז הידבקות מוקדית המציג נוירו-הגנה.

מתן הפפטיד E1 הצליח לשפר את ההחלמה התפקודית באמצעות אפופטוזיס מופחת במודל ניסיוני של עכברים של דימום תוך מוחי (ICH).

לסיכום, אנו חושפים רצף פונקציונלי של Netrin-1 שמעורב בתהליך הגילוי שלו לאחר ICH ומזהים פפטיד מועמד לטיפול ב-ICH.

מילות מפתח: דימום תוך מוחי; חמין; הגנה עצבית; נטרין-1; פפטיד.

1. הקדמה

דימום תוך מוחי (ICH) הוא תת-סוג שבץ מוחי הרסני עם שיעור תמותה ותחלואה גבוה [1-3] הכרוך בקרע חריג של כלי דם מוחיים בתוך המוח [4,5].

הסרה כירורגית של המטומות מועדפת להשגת דימום והקלת לחץ תוך גולגולתי [6]. עם זאת, שאריות המאטיות ומוצרי פירוק דם עדיין יכולים לקדם פגיעה מוחית משנית בעקבות ICH, לגרום לנזק עצבי ולדחות התאוששות תפקודית [7-9].

לפיכך, פיתוח אסטרטגיות יעילות המכוונות לנזק נוירוני שנגרם כתוצאה מפגיעת מוח משנית תהיה מועילה לטיפול בשבץ מוחי. Netrin-1 הוא אחד מהחלבונים הנחקרים ביותר המווסתים הנחיה אקסונלית וסינפטוגנזה [10-12] באמצעות אינטראקציה עם הקולטנים שלו. נמחק בסרטן המעי הגס (DCC) וב-UNC5H (הומלוג לא מתואם-5) כדי להפעיל הישרדות, התמיינות והתפשטות תאים [13-15].

הקולטנים גורמים לאות מוות לתווך אפופטוזיס כאשר ה-Netrin-1 נעדר [16]. ידוע שהקשירה של Netrin-1 עם DCC גורמת לדימריזציה של DCC ומתחילה טירוזין 861 זרחון של מוקד אדהסיונקינאז (FAK) כדי לגרום להתפתחות נויריטים והדרכה אקסונלית [17,18].

הקישור של Netrin-1 עם DCC כולל את תחום ה-EGF3 של Netrin-1 ואת תחום FN5 של DCC בהפעלת מסלול האיתות של Netrin-1 [19,20]. לאחרונה, הוכח כי Netrin-1 מפעיל השפעות נוירו-הגנה באזורים איסכמיים [21].

רמת הביטוי של Netrin-1 בסרום, המעכבת אפופטוזיס של תאים ומעודדת התחדשות נוירונית, נמצאת בקורלציה חיובית עם התאוששות המטופל משבץ איסכמי [22,23].

מעניין שהשתלה של תאי גזע מזנכימליים של מח עצם המפרישים נטרין-1 לתוך עצב הסיאטי של החולדה הפגוע יוזמת התחדשות אקסונלית [24] ומפחיתה מוות של נוירונים מוטוריים [25]. הזרקה סטריאוטקסית של חלבון Netrin -1 לחדרים מפחיתה מוות של תאי עצב לאחר דימום תת-עכבישי באמצעות הפעלה של איתות DCC/APPL1/AKT [26].

פוליפפטיד שמקורו בדומיין EGF3 של Netrin-1 (חומצות אמינו 423-433) מפעיל באופן ניכר זרחון ERK ומקדם את ייצור NO, שיש לו השפעות הגנה על הלב [27,28]. עם זאת, Netrin-1 זוהה כסמן ביולוגי פוטנציאלי לגידולי גידול [29-31] בגלל ויסות של סטטוס Netrin-1 שנמצא במספר סוגי סרטן שמקורם ברקמה [32].

כאשר Netrin-1 קשור לקולטן שלו DCC או Unc5H, הקולטנים מעבירים אות חיובי המוביל להישרדות, דלקת, אנגיוגנזה ואנטי-אפופטוזיס, שבתורם מסדיר את הגידול [31].

לכן, חשוב מאוד לזהות את התחום הפונקציונלי המינימלי של Netrin-1 שיכול לשמר את ההגנה העצבית ולהימנע מתופעות הלוואי העיקריות של Netrin-1. כאן, מצאנו שפפטיד E1 (שאריות 407–422), שמקורו ב-EGF3domain של Netrin-1, מקיים אינטראקציה עם DCC כדי להגן על נוירונים מפני רעילות הנגרמת על ידי המיין.

במודל ניסיוני של עכברי ICH, היישום של פפטיד E1 שיפר את ההתאוששות התפקודית, כפי שנקבע על ידי מבחני התנהגות. יתר על כן, פפטיד E1 יכול למנוע מהנוורונים של נוירונים לאחר ICH.

בהתבסס על תוצאות אלו, זיהינו רצף תפקודי של Netrin-1 המעורב בהחלמה לאחר ICH וקבענו שניתן להשתמש בפפטיד זה לטיפול ב-ICH.

2. תוצאות

2.1. תחום EGF3 הוא קריטי לאינטראקציה של Netrin-DCC

Netrin-1 מורכב מתחום VI, שלוש חזרות של EGF ותחום C-terminal [33]. המבנה הגבישי של קומפלקס Netrin-1/DCC האנושי מגלה שדומיין Netrin-1 EGF3 הוא קריטי לאינטראקציה של Netrin-1/DCC, אך לא לתחומים EGF1 ו-EGF2 [34].

מוטגנזה של שיירי חומצות אמינו מפתח (His407, Gln442 או Gln443) בדומיין EGF3 שיבשה לחלוטין את הקישור של Netrin-1/DCC [19]. תחומים EGF1/2 נדרשים להעברת איתות מושך לאיתות דוחה כאשר Unc5 מתקיים במקביל עם DCC [20].

לפיכך, יצרנו תחילה מבנים באורך מלא ו-EGF3-מחקנו (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1 (איור 1A) וביטאנו באופן חולף מבנים אלה בתאי HEK293T מתורבתים עבור GSTpulldown .

נצפתה כריכה עבור המבנים שביטאו את Netrin-1 אך לא את Netrin-1(∆407–443) (איור 1C). תוצאות אלו מצביעות על כך שהתחום של EGF3 המכיל חומצות אמינו 407–443 אחראי לאינטראקציה של Netrin-1 עם DCC. כדי לחקור את תפקידו של תחום EGF3 ב-Netrin-DCC, טהרנו תחילה את myc-taggedNetrin{{12 }} או Netrin קטוע-1 (∆407–443) (איור 1B).

לאחר מכן, תאי HEK293T הועברו עם פלסמיד הנושא DCC cDNA והודגרו עם חלבון Netrin-1, ולאחר מכן הקישור Netrin-1 הוערך על ידי צביעה חיסונית.

מצאנו שנטרין -1 באורך מלא, אך לא נטרין קטוע -1, הצליח להיקשר ל-DCC בממברנת הפלזמה (איור 1D). כדי לקבוע אם תחום ה-EGF3 יכול לקיים אינטראקציה עם DCC, יצרנו GST-EGF3construct כדי למשוך מטה תאים מוארים המבטאים DCC יתר על המידה. ראינו קישור ספציפי של DCC עם GST-EGF3 (איור 1E).

יתר על כן, סיננתזנו את הפפטידEGF3 המסומן ב-FITC ואישרנו שכמו Netrin באורך מלא -1, הוא היה מסוגל להיקשר ל-DCC בממברנת הפלזמה (איור 1F). ביחד, הנתונים שלנו מצביעים על כך שדומיין EGF3 אחראי לאינטראקציה של Netrin-1 עם DCC.

2.2. תחום ה-EGF3 מעורר זרחון של נתיבים במורד הזרם של נטרין-1

האינטראקציה של Netrin-1 ו-DCC מפעילה מסלולי איתות מרובים, כוללFAK, SFK ו-ERK [16,35]. Focal adhesion kinase (FAK) היא אחת הפעילויות העיקריות של טירוזין-פוספורילציה המקושרות לאיתות Netrin-1/DCC.

Netrin-1 מפעיל זרחון FAK-phosphorylation ומשפחת Src tyrosine kinases (SFKs) חלבון זרחון [17]. מסלולי האיתות של ה-FAK וה-SFK ממלאים תפקיד מרכזי בשלב ההתפתחותי של מערכת העצבים ותיקון פציעה [36,37]. יתרה מכך, Netrin-1 יכול להפעיל את הקינאז החוץ-תאי מווסת אות-1/2 (ERK1/2), המתווך את פעולתו של מסלול ה-Proteinkinase המופעל על ידי Mitogen (MAPK) [38-40].

כדי לחקור אם תחום ה-EGF3 הוא קריטי להפעלה של מסלולי איתות במורד הזרם באמצעות הקישור של Netrin-1 ל-DCC, בדקנו תחילה את ההשפעה של תחום EGF3 על הזרחון של טירוזין 861 של FAK (איור 2A) . מצאנו שמחיקה של EGF3 עיכבה זרחון FAK בנוירונים קורטיקליים מתורבתים (איור 2B, C), ובכך מאשרת תפקיד חיוני ל-EGF3 במסלול האיתות של Netrin-1.

לאחר מכן, נוירונים קליפת המוח בתרבית עוררו עם חלבון GST-EGF3fusion למשך 20 דקות, ו-Western blotting אישר עוד יותר שטיפול בחלבון היתוך GST-EGF3 גרם לזירחון FAK, ERK ו- SFK (איור 2D-G).

תוצאות אלו מצביעות על כך שתחום ה-EGF3 של Netrin-1 מתפקד כממריץ רב עוצמה להפעלת מסלולי איתות במורד הזרם.

איור 1. תחום ה-EGF3 של Netrin-1 הוא האזור הקריטי לאינטראקציה של Netrin-1/DCC. (א) איורים של מבני נטרין-1. מבני Netrin-1 הם Netrin-1 באורך מלא, Netrin-1-(∆407–443) ו-GST-EGF3. (ב) נטרין מטוהר-1-(∆407–443)-Myc/His כמתו באמצעות השוואה עם עקומת התקן BSA. (ג) אימונובליטציה של חלק המשיכה על ידי חלבון היתוך של תחום GST-DCC FN5 ו-GST בלבד. (ד) תמונות אימונופלואורסצנציה של Flag-DCC המבטאות תאי 293T שהודגרו עם מדיום בקרה, Netrin-1-myc/his ו-Netrin-1-(∆407–443) -Myc/his למשך 30 דקות, בהתאמה, והכמותית אָנָלִיזָה. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. (ה) אימונובלוטינג של החלק הנמשך על ידי חלבון היתוך GST-EGF3 ו-GST יחד. (ו) תמונות אימונופלואורסצנציה של Flag-DCC המבטאים תאי 293T שהודגרו עם מדיום בקרה ו-FITC שכותרתו Pep EGF3 למשך 30 דקות, בהתאמה, והניתוח הכמותי. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר.

איור 2. תחום EGF3 מפעיל מסלולים במורד הזרם של Netrin-1. (א) הליך ניסיוני. (ב) נוירונים בקליפת המוח (E17ו-DIV3) עוררו עם Netrin-1, Netrin-1-(∆407-443) או מדיום בקרה למשך 20 דקות. ליזטים של תאים הודגרו עם נוגדן אנטי-p-FAK-861 כדי לאשר פעילות Netrin-1. (ג) ניתוח כמותי של תוצאות הכתם המערבי מוצג ב-(ב). n=3. (ד) נוירונים בקליפת המוח (DIV3) טופלו ב-1.5 µM GST (+), 1.5 µM GST-EGF3 חלבון היתוך (+), או 1.5 µMNetrin -1 (+) מדיום במשך 20 דקות. ליזטים של תאים הודגרו עם anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 ו-anti-p-ERK-202/204.(E–G) ניתוח כמותי של המערבון תוצאות כתם מוצגות ב-(D). n=3. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. ANOVA חד כיווני שימש עבור כל הניתוחים הסטטיסטיים המוצגים באיור זה (* p < 0.05, ** p < 0.01; ns, לא מובהק). פרטים של ניתוח נתונים מופיעים בטבלה משלימה S1.

2.3peptide E1 ו-E2 מקיימים אינטראקציה עם DCC כדי להפעיל את נתיב האותות במורד הזרם של Netrin-1

כפי שתואר קודם לכן, פפטיד קטן שמקורו בדומיין EGF3 של Netrin-1(חומצות אמינו 423-433) גרם ל-ERK זרחון [27]. סנתזנו פפטידים E1 (שאריות 407-422) ו-E2 (שאריות 423-433) שנגזרו מתחום EGF3 של Netrin-1 (איור 3A).

מצאנו שדגירה של פפטיד E1 העלתה את רמות ה-FAK וה-SFK המזורחות (איור 3B, D, E) בתאי התרבות באופן תלוי-מינון, אך לא שינתה את רמות ה-ERK הפוספוריל (איור 3B, F).

שלא כמו peptideE1, פפטיד E2 לא רק גרם לזרחון טירוזין של FAK (איור 3C, G) וזרחון טירוזין של SFK (איור 3C, H), אלא גם גרם לזרחון טירוזין של ERK (איור 3C, I).

לפפטיד הבקרה (Pep Ctrl) לא הייתה השפעה ניתנת לזיהוי על זרחון טירוזין של FAK, SFK ו-ERK (איור S1). יתר על כן, ראינו שהזרחון של רכיבים של מסלול האיתות של FAK המושרה על ידי פפטיד E1 היה תלוי זמן (איור S2). תוצאות אלו מצביעות על כך ש-E1 ו-E2 הם הפפטידים התפקודיים המינימליים של Netrin-1.

איור 3. הרצפים המינימליים של תחום ה-EGF3 מפעילים מסלולים במורד הזרם של Netrin-1. (א) איורים של הפפטידים. (ב) נוירונים בקליפת המוח (DIV3) עוררו עם ריכוזי גרדיאנט של פפטיד E1. ליזטים של תאים הודגרו עם anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 ואנטי-p-ERK-202/204. (ג) נוירונים קליפת המוח מתורבתים טופלו עם ריכוזים מדורגים של פפטיד E2.

ליסאטים נאספו והודגרו עם הנוגדנים המצוינים כדי למדוד את הזרחון של FAK, SFK ו-ERK. (D-F) כימות של מידת הזרחון של FAK, SFK ו-ERK המושרה על ידי פפטיד E1 בנוירונים מוצג ב-(B). n=3. (G-I) כימות של מידת הזרחון של FAK, SFK ו-ERK המושרה על ידי פפטיד E2 מוצג ב-(C). n=3. (י) נוירונים בקליפת המוח שמקורם ב-DCC בר-טיפוס והמו-זיגוט מוטנטמבריון, עוררו עם פפטידים שמקורם ב-Netrin-1 או -1-נטרין ועברו ליטוש.

הליסאטים שהתקבלו עברו אימונובלוטינג. (K) כימות של FAK PY{{0}} ורמות DCC בנוירונים מוטנטיים DCC מוצג ב-(J). n=3. הנתונים מוצגים כאמצעים ± SEMs. ANOVA חד כיווני שימש עבור כל הניתוחים הסטטיסטיים המוצגים באיור זה (*p <0.05;ns, לא מובהק). פרטים של ניתוח נתונים נראים בטבלה משלימה S1.

כדי לקבוע אם ההפעלה של מסלול האיתות של FAK תלויה ב-DCC, מדדנו את מידת הזרחון של טירוזין של FAK המושרה על ידי פפטידים אלה בנוירונים DCC+/+ ו-DCC-/-. מצאנו ששני הפפטידים E1 ו-E2 לא הצליחו לגרום לזרחון של FAK בנוירונים DCC-/- (איור 3J, K).

מצאנו גם שפפטידים E1 ו-E2 (Flag-E1 ו-Flag-E2) מסונתזים באופן מסונתז עם N-Terminally Flag-taggings ישירות לתחום DCCFN5 (איור S3).

2.4. פפטיד E1 מגן על נוירונים מפני מוות תאים כתוצאה מהמין במבחנה

כדי להציג את ההגנה מפני פגיעה עצבית של פפטיד E1, השתמשנו בתגובת רעילות הניתנת ל-aHemin כדי לחקות פגיעה מוחית משנית לאחר דימום תוך מוחי [41,42].

תאים עצביים המבטאים GnRH (NLT) [43-45] הודגרו עם המין בריכוזים ומשכי זמן שונים. דגירה של תאי NLT עם המין במינון הקטלני המדיאלי (60 µM) הביאה לירידה תלוית זמן בשיעור ההישרדות של התא, מה שמרמז שהמין נקלט על ידי נוירונים ועובר חילוף חומרים (איור S4).

כדי לבחון אם הביטוי של Netrin-1 ו-DCC הגיבו למוות תאי עצבי המושרה על ידי המין, תאי NLT מתורבתים הודגרו עם המין במשך משכי זמן שונים. תוצאות הכתם המערבי הוכיחו שרמות הביטוי של Netrin-1 ו-DCC עלו באופן משמעותי ב-6 שעות לאחר דגירת ההמין ולאחר מכן ירדו בהדרגה (איור 4A, B).

כדי לחקור אם הפפטידים E1 ו-E2 הצליחו להחליש מוות נוירוני המושרה בהמין, ביצענו בדיקת CCK-8 עם Netrin-1, PepCtrl, פפטיד E1 ופפטיד E2.

מצאנו שלפפטידים אלה לא הייתה השפעה ניתנת לזיהוי על כדאיות התא (איור 4C ואיור S5). בהשוואה לדגירה עם Pep Ctrl ו-peptideE2, פפטיד E1 ו-Netrin -1 שיפרו את המוות הנוירוני המושרה על ידי המין (איור 4D). כמו כן, צבענו עם calcein-AM ו-PI כדי להבחין בין תאים חיים ומתים.

התוצאות הראו שגם Netrin-1 וגם הפפטיד E1 הגנו מפני מוות המושרה על ידי המין במבחנה (איור 4E-G). יתר על כן, 1.5 מיקרומטר פפטיד E1 הקל על מוות המושרה בהמין בנוירונים מתרבות ראשונית (איור 4H, I). בסך הכל, תוצאות אלו הראו כי פפטיד E1 מגן על נוירונים מפני מוות תאי המושרה בהמין.

2.5. Netrin-1-Peptide E1 נגזר מקדם התאוששות תפקודית לאחר ICH

כדי לחקור האם פפטיד E1 שמקורו ב-Netrin-1 ממלא תפקיד חשוב בהתאוששות תפקודית לאחר שבץ דימום, הקמנו מודל ניסיוני של עכברים ICH על ידי הזרקת קולגנאז מעורבב בדיו לתוך הסטריאטום (איור S6A).

לאחר שלושה ימים, הראו תמונות של פרוסת המוח כדי לעקוב אחר מיקום ההזרקה ונפח הקולגנאז עם דיו (איור S6B, C). עכברים עם דימום סטריאטלי הפגינו חולשה בצד הדו-צדדי בגלל פגיעה מוחית (איור S7A-C).

המטומה בסטריאטום בעקבות ICH נראתה בהשוואה להזרקת מי מלח (איור S7D). רמות החלבון היחסיות של Netrin-1 ו-DCC בקליפת המוח הפרי-המטומית עלו בעכברי ICH בהשוואה לעכברי ביקורת ביום 2, וה-Netrin-1 עדיין היה גבוה יותר באופן משמעותי ביום השלישי, מה שמצביע על כך שנטרין-1 חשוב להתאוששות של פגיעה מוחית (איור S7E, F).

לאחר מכן, הוזרק לעכברי ICH (FITC-Pep TE1) שכותרתו FITC (FITC-Pep TE1), שהוסיף רצף TAT של ה-N-terminus של פפטיד E1, והוכח כי ה-FITC-Pep TE1 חוצה את מחסום הדם-מוח ( איור S8).

עכברי ICH וביקורת הוזרקו תוך צפקית עם הפפטיד (12 מ"ג/ק"ג) מדי יום או נפח שווה של תמיסת מלח (איור 5A). מצאנו כי מתן עם פפטיד TE1 שיפר את שיעור ההישרדות והציל פגמים במשקל הגוף לאחר ICH (איור 5B, C).

מצאנו גם שנפח הקולגנאז שנקבע עם יחס שווה של דיו בכל קבוצה היה דומה, מה שמאשר את מודל ה-ICH הסטנדרטי הזה של קולגנאז הביא להמטומות תוך-סטריאטליות שניתנות לשחזור (איור 5D). פפטיד TE1 שיפר את ציוני ההתנהגות של עכברי ICH במבחן הסרת הסרט (איור 5E ) ובדיקת צילינדר (איור 5F).

כצפוי, הפפטיד TE1 הפחית את נפח האוטם לאחר ICH (איור 5G, H). ביחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שפפטיד E1 ניתן להפחתת נפח ההמטומה ולשפר התאוששות תפקודית במודל עכבר של ICH.

איור 4. פפטיד E1 משפר מוות תאים המושרה בהמין במבחנה. (א) כתם מערבי של Netrin-1 ו-DCC בתאי NLT מתורבתים שנחשפו להמין (60 מיקרומטר). (ב) ניתוח כמותי של תוצאות הכתם המערבי מוצג ב-(א). n=3. (ג) מבחני CCK-8 הראו שפפטידים בסדרה לא שינו את יכולת התאים. n=4. (ד) 1.5 מיקרומטר Pep E1 שמר על כדאיות תאי NLT כאשר הוסיפו היטב לאחר חשיפה להמין (60 מיקרומטר). n=4. (ה) בדיקה חיה (ירוק)/מתה (אדום) של תאי NLT שנחשפו להמין (60 µM,6 שעות). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. (ו, ז) ניתוח כמותי של הבדיקה חי/מת ב (E). n=9. (ח) מבחני CCK-8הראו ש-Pep E1 יכול להפחית מוות תאים המושרה בהמין בנוירונים מתרבות ראשונית. n=8.(I) הדמיית ניסוי חי/מת של נוירונים בתרבות ראשונית (50 מיקרומטר, 6 שעות). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הנתונים מוצגים כאמצעי ± SEM. ANOVA חד כיווני או דו כיווני ANOVA שימש עבור כל הניתוחים הסטטיסטיים המוצגים באיור זה (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; ns, לא מובהק). פרטים של ניתוח נתונים מופיעים בטבלה משלימה S1.

איור 5. פפטיד E1 שמקורו ב-Netrin-1-מקדם את תהליך ההתאוששות לאחר ICH. (א) סכימה של הפרדיגמה הניסיונית של הזרקה תוך צפקית (IP) של פפטיד TE1 במודל ICH של עכברים. (ב) יחס ההישרדות לאחר ICH של כל קבוצה נרשם, והופעלה שיטת קפלן-מאייר. n=10. (ג) שינויים במשקל הגוף 5 ימים לאחר ICH. n=6.(ד) תערובת קולאז'/מי מלח עם יחס שווה של דיו (סה"כ 0.6 µL) שהוזרקה בסטריאטום של עכברי C57, תמונות מייצגות המראות ששטח הדיו היה דומה בעכברים שטופלו עם/ ללא פפטיד TE1 5 ימים לאחר ICH. (E, F) הזרקת IP של פפטיד TE1 (12 מ"ג/ק"ג) אך לא בקרת TAT (12 מ"ג/ק"ג), התנהגות משופרת לפי משימת הסרת סרט (E) או משימה פינתית (F).

מלוח,n=10 בעלי חיים בודדים; ICH, n=6 בעלי חיים בודדים; ICH + TAT, n=6 בעלי חיים בודדים; ICH + TE1, n=8 בעלי חיים בודדים. (ז) קטעים מייצגים של המטוקסילין ואאוזין בעכברים שטופלו עם/בלי פפטיד TE 1 5 ימים לאחר ICH. פס קנה מידה, 1 מ"מ. (ח) כמות של נפח דימום בקטעי מוח המוצגים ב-(G).

מלוח, n {{0}} בעלי חיים בודדים; ICH, n=6 בעלי חיים בודדים; ICH + TAT, n=6 בעלי חיים בודדים; ICH + TE1, n=8 בעלי חיים בודדים. הנתונים מוצגים כאמצעי ± SEM. נעשה שימוש ב-ANOVA חד כיווני או דו-כיווני עבור כל הניתוחים הסטטיסטיים המוצגים באיור זה (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; ns, לא משמעותי). פרטים של ניתוח נתונים נראים בטבלה משלימה S1.

2.6. Netrin-1-Peptide E1 מפחית אפופטוזיס עצבי לאחר ICH

לחקור את המנגנונים הבסיסיים של פפטיד E1 בתהליך של התאוששות תפקודית של ICH. זיהינו ניוון עצבי באזור הפריהמטומי על ידי צביעה של פלואור-ירקן C (FJC).

מצאנו כי מתן הפפטיד TE1 הפחית משמעותית את מספר התאים החיוביים ל-FJC באזורי פריהמטומה, דבר המעיד על כך ש-pep TE1 מעכב ניוון עצבי לאחר ICH (איור 6A, B). ביצענו צביעת TUNEL ומצאנו שהפפטיד TE1 הפחית באופן משמעותי את מספר הנוירונים החיוביים ל-TUNEL (איור 6C, D).

מספר האסטרוציטים החיוביים ל-TUNEL לא היה ניתן לזיהוי לאחר טיפול בפפטיד TE1 (איור 6E, F). בנוסף, על ידי שימוש בדקסטרן 4 kDa המסומן ב-FITC כאטראסר כדי לציין את החדירות של מחסום הדם-מוח (BBB), מצאנו שהפפטיד TE1 לא השפיע על ההתאוששות של חדירות BBB (איור S9A, B).

רמות יחידות הקרינה הגולמיות בסרום (RFUs) היו דומות, מה שמאשר את נוכחותם של חומר מעקב מוזרק בכל החיות שנותחו (איור S9C). השתמשנו גם בלקטין המסומן עם פלואורססאין כדי לתייג מיקרו-כלים, אך לא הצלחנו לצפות בשיפור כלשהו לאחר טיפול ב-TE1 (איור S9D, E). מעל לכל, ממצאים אלה מצביעים על כך שהפפטיד E1 מקדם התאוששות עצבית לאחר ICH על ידי עיכוב אפופטוזיס עצבי.

איור 6. פפטיד E1 שמקורו ב-Netrin-1- יכול להגן מפני מוות עצבי וניוון, אך לא אסטרוציטים לאחר ICH.(A) קטעים מייצגים צבועים פלואורו-ירקן C בעכברים שטופלו עם/בלי TE1 ב-5 ימים לאחר ICH. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר, בהתאמה. (ב) כמות של תאים חיוביים פלואורו-ירקן C באזור הפריהמטומי (n=4). (ג) צביעת TUNEL המראה השפעות של TE1 על פגיעה מוחית משנית (SBI) 5 ימים לאחר הופעת ICH. תמונות מייצגות מקבוצות Saline, ICH, ICH + TAT ו-ICH + TE1.

כל קבוצה הייתה נתונה ל-ICH מלבד קבוצת המלוחים. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר בהתאמה. (ד) ניתוחים כמותיים עבור אחוז הנוירונים החיוביים ל-TUNEL מוצגים ב- (C). n=4. (ה) מיקום של TUNEL עם GFAP ב-5 ימים לאחר ICH. תמונות מייצגות מקבוצות Saline, ICH, ICH + TAT ו-ICH + TE1. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר, בהתאמה. (ו) ניתוחים כמותיים עבור אחוז האסטרוציטים החיוביים ל-TUNEL מוצגים ב-(E). n=4. הנתונים מוצגים כאמצעי ± SEM.

ANOVA חד כיווני שימש עבור כל הניתוחים הסטטיסטיים המוצגים באיור זה (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001; פרטים על ניתוח נתונים מופיעים בטבלה משלימה S1.

3. דיון

המחקר שלנו זיהה רצף פפטיד ליבה של Netrin-1 שהוא חיוני להתאוששות תפקודית לאחר ICH. על ידי אינטראקציה עם DCC, הפפטיד הזה שמקורו ב-Netrin-1-מגן מפני מוות נוירוני עקב נזק משני לאחר ICH, ולכן הוא טיפול מבטיח ל-ICH.

היישום הטיפולי של Netrin-1, חלבון בעל משקל מולקולרי גבוה, דורש זיהוי של הרצף הפונקציונלי המינימלי של Netrin-1 שמקדם איתות במורד הזרם. במחקר שלנו, נוצרו פפטידים E1 (שאריות 407-422) ו-E2 (שאריות 423-433), שמקורם בדומיין EGF3 של Netrin-1, בהתאמה. מצאנו שהפפטיד E1 (שאריות 407-422) מוגן מפני מוות נוירוני לאחר ICH.

מצאנו שרמות הביטוי של Netrin-1 ו-DCC עלו בתאי NLT בטיפול אפטר-המין. ההמין משתחרר מהמוגלובין לאחר ICH וגורם לפגיעה משנית הן בתאי גליה והן בתאי עצב [46-48].

בנוסף, ראינו גם עלייה ברמות החלבון של Netrin-1 ו-DCC בעקבות ICH ניסיוני. בנוסף, ראינו גם רמות חלבון מוגברות של netrin-1 ו-DCC בעקבות ICH ניסיוני.

תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם תוצאות קודמות המראות שלנטרין-1 תפקיד חשוב בהתאוששות לאחר ICH [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com