תַקצִיר:קוורצטין נחקר בהרחבה בשל השפעותיו נגד מחלת אלצהיימר (AD) ואנטי אייג'ינג. מחקרים קודמים שלנו מצאו שקוורצטין ובצורת הגליקוזיד שלו, רוטין, יכולים לווסת את תפקוד הפרוטאזום בתאי נוירובלסטומה. מטרתנו הייתה לחקור את ההשפעות של quercetin ורוטין על הומאוסטזיס חיזור תוך תאי של המוח (גלוטתיון מופחת/גלוטתיון מחומצן, GSH/GSSG), המתאם שלו עם פעילות של אנזים 1 (BACE1) המנתח APP, וחלבון קדם עמילואיד (APP) ביטוי בעכברי TgAPP מהונדסים (הנושאים מוטציה שוודית אנושית APP transgene, APPswe). בהתבסס על כך שעיבוד חלבון BACE1 ו-APP מווסתים על ידי מסלול יוביקוויטין-פרוטאזום ושתוספת עם GSH מגינה על נוירונים מעיכוב פרוטאזום, בדקנו אם דיאטה המכילה קוורצטין או רוטין (30 מ"ג/ק"ג/יום, 4 שבועות) פוחתת בכמה סימנים מוקדמים של AD. ניתוחי גנוטיפ של בעלי חיים בוצעו על ידי PCR. כדי לקבוע הומאוסטזיס חיזור תוך תאי, אומצו שיטות ספקטרופלואומטריות לכימות רמות GSH ו-GSSG באמצעות o-phthalaldehyde, והיחס GSH/GSSG הוברר. רמות TBARS נקבעו כסמן של חמצון שומנים. פעילויות האנזים של SOD, CAT, GR ו-GPx נקבעו בקורטקס ובהיפוקמפוס. פעילות BACE1 נמדדה על ידי מצע ספציפי ל-Secretase המצומד לשתי מולקולות מדווחות (EDANS ו-DABCYL). ביטוי גנים של אנזימים נוגדי החמצון העיקריים: APP, BACE1, חלבון המכיל תחום Disintegrin ו-metalloproteinase 10 (ADAM10), קספאז-3, קספס-6 וציטוקינים דלקתיים נקבעו על ידי RT-PCR. ראשית, ביטוי יתר של APPswe בעכברי TgAPP הוריד את יחס ה-GSH/GSSG, העלה את רמות המלונאלדהיד (MDA), ובסך הכל, הפחית את פעילות האנזים נוגדי החמצון העיקריים בהשוואה לעכברים מסוג פרא (WT). טיפול בעכברי TgAPP עם quercetin או rutin העלה את GSH/GSSG, הפחית את רמות ה-MDA והעדיף את יכולת האנזים נוגד חמצון, במיוחד עם רוטין. שנית, גם ביטוי APP וגם פעילות BACE1 פחתו עם קוורצטין או רוטין בעכברי TgAPP. לגבי ADAM10, זה נוטה לעלות בעכברי TgAPP עם טיפול ברוטין. לגבי ביטוי caspase-3, TgAPP הציג עלייה שהייתה הפוכה לרוטין. לבסוף, העלייה בביטוי של הסמנים הדלקתיים IL-1 ו-IFN- בעכברי TgAPP הופחתה על ידי קוורצטין וגם רוטין. יחד, ממצאים אלה מצביעים על כך שבין שני הפלבנואידים, רוטין עשוי להיכלל בתזונה היומיומית כסוג של טיפול משלים בAD.

לחץ על מחסן כימאי נוגדי חמצון Cistanche

【למידע נוסף:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

מילות מפתח:קוורצטין; רוטין; גלוטתיון; APPswe; BACE1; מחלת אלצהיימר

1. הקדמה

הירידה בתפקוד הקוגניטיבי היא סימפטום של ניוון עצבי קליני, הקשור אך ורק לגיל [1]. השפעת התזונה על ירידה קוגניטיבית הקשורה לגיל היא נושא שהולך וגדל, מכיוון שהיא גורם חיוני שניתן לשנות בקלות. שינויים פתולוגיים במוח הנצפים במהלך ירידה קוגניטיבית מתרחשים הרבה לפני כל ביטוי קליני, המתרחש בעיקר בגיל מבוגר. זה מספק תקופה ארוכה יותר לבסס אסטרטגיות מניעה הנוגעות לירידה קוגניטיבית הקשורה לגיל ודמנציה, שהיא דאגה מרכזית לבריאות הציבור [2]. במשך שנים רבות, בוצע מחקר אינטנסיבי על תרכובות ממקור טבעי, המצויות בתזונה יומיומית, על טיפול קוגניטיבי משפר [3].

אחת המחלות הנוירו-דגנרטיביות הנפוצות ביותר הקשורות לגיל היא מחלת אלצהיימר (AD), המאופיינת בשני סימני היכר נוירופתולוגיים: רובד עמילואיד (A) וסבכים נוירו-פיברילריים. במונחים של מחקר על בעלי חיים, מודלים של בעלי חיים יכולים לדמות את השלב האסימפטומטי של AD על ידי שינוי חלבון A precursor (APP), למשל [4,5].

באופן מדהים, כמה פיטוכימיקלים ביו-אקטיביים שמקורם בצמחים הקשורים ליתרונות בריאותיים שונים ולירידה בסיכון למחלות רבות, נבדקו ליצירת קומפלקסים לא קוולנטיים עם הפפטיד עמילואיד (A) [3].

למרות שמספר רב של תרופות מסורתיות ומוצרי תזונה טבעיים הראו התקדמות רבה לקראת הפחתת פתולוגיה של AD, אנו מודעים לחלוטין למגבלות של מודלים של בעלי חיים AD, שכן ההשפעות המבטיחות של חומרים אלה אינן תמיד ניתנות לשכפול במחקרים אנושיים [6]. עם זאת, בשל הקושי לנתח רקמת מוח בבני אדם, במיוחד בשלבים מוקדמים מאוד של התקדמות, יש צורך במחקרים במודלים של מכרסמים. כתוצאה מכך, מודלים ניסיוניים אלה עשויים לתמוך בפיתוח של סוכני משתמש מתרופות מסורתיות ותרכובות טבעיות בטוחות כדי לעכב את התקדמות מחלות ניווניות. לפיכך, בדיקת תרכובות טבעיות, המצויות בתזונה יומיומית, למניעת מחלות והגנה מפני הסיכון ל-AD, צריכה להיות בראש סדר העדיפויות.

בין הגורמים הטבעיים התזונתיים החשובים הללו הוא קוורצטין, שהוא הפלבנואיד הפוליפנולי העיקרי במספר פירות וירקות [7]. קוורצטין קיים בעיקר בצורת הגליקוזיד שלו, כלומר רוטין. מצדו, רוטין (קוורצטין-3-O-rutinoside) הראה השפעות עמוקות על התפקודים הסלולריים השונים העומדים בבסיס מספר מצבים פתולוגיים, כלומר אנטי-מיקרוביאליים, אנטי קרצינוגניים, אנטי-תרומבוטיים, מגנים על הלב ונוירו-פרוקטיבים. השפעות תרופתיות אלו קשורות בעיקר לפעילות אנטי דלקתית ונוגדת חמצון של רוטין. בשל יכולתו לחצות את מחסום הדם-מוח ו/או המטבוליטים שלו, הוכח כי רוטין יכול לשנות תסמינים קוגניטיביים והתנהגותיים של מחלות נוירודגנרטיביות [8].

מחקרים קודמים שלנו מצאו שגם פלבנואידים, קוורצטין וגם רוטין, משפיעים על מסלולי איתות שונים ורשתות מולקולריות הקשורות לאיפונון של תפקודי פרוטאזום בתאי נוירובלסטומה [9]. בנוסף, הוכח שביטוי BACE1 ועיבוד APP מוסדרים על ידי מסלול Ubiquitin-Proteasome [10] וכי תוספת עם גלוטתיון מופחת (GSH) הגן על נוירונים מעיכוב פרוטאזום [11]. דלדול GSH במוח הוא ממצא שכיח בחולים עם מחלות נוירודגנרטיביות, כגון AD, ויכול לגרום לניוון עצבי לפני הופעת המחלה [12]. Ubiquitination של BACE1 וחסימת מסלול Ubiquitin-Proteasome מעכבים את פירוק BACE1, וכתוצאה מכך, מוביל לייצור מוגבר של פעילות אנזימטית BACE1 [10].

בהתבסס על ממצאים אלו, וכי הרגלי תזונה ותוספי מזון יכולים להשפיע על מצב החיזור הסלולרי, מטרתנו לחקור את ההשפעות של דיאטה המכילה קוורצטין או רוטין על הומאוסטזיס חיזור תוך תאי של המוח (GSH/GSSG), המתאם שלו עם פעילות BACE1, וביטוי APP במודלים של עכברים של AD (הנושאים מוטציה שוודית אנושית Amyloid Precursor Protein APP transgene, APPswe).

לבסוף, מכיוון שיש עדויות משכנעות להשפעה של תוספי פלבנואידים בשיפור תחומים קוגניטיביים ספציפיים ו/או ממצאי MRI [13], ניסינו לחקות, בבעלי חיים, התערבות על ידי מתן תזונה בריאה המכילה כמויות מתונות של פעיל פוטנציאלי מסוים. מרכיב (קוורצטין או רוטין) כאסטרטגיה יעילה למניעת ביטוי של סמני AD.

2. תוצאות

2.1. גנוטיפ של עכברים

מושבת העכברים TgAPP פותחה במעבדה שלנו מזכרים הטרוזיגוטיים Tg2576 ונקבות מסוג פרא. גנוטייפ של עכברים בוצע כדי לזהות פרטים מהונדסים. מבין כל העכברים שנבדקו, כ-40% נמצאו כטרנסגניים (TgAPP).

תוצרי ה-PCR שהתקבלו הופרדו על ידי אלקטרופורזה בג'לי אגרוז של 1.5 אחוז במאגר 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA) ב-70 V (מתח קבוע) ולאחר מכן צולמו על ידי צביעה עם GelRed (Millipore). פרופיל ההגברה עבור עכברים מהונדסים ו-WT מוצג באיור 1.

2.2. גלוטתיון

כדי להעריך הומאוסטזיס חיזור תוך תאי בנוירונים בעכברי TgAPP, רמות GSH ו-GSSG כומתו, ויחס GSH/GSSG נקבע כסמן של כוח מפחית תאי בזכרים ובנקבות כאחד (איור 2).

בהערכת השפעת הטרנסגן על מערכת הגלוטתיון, נצפתה ירידה בכוח ההפחתת התא (GSH/GSSG) בעכברי TgAPP לגבי חיות WT, הן בזכרים והן בנקבות ובשני אזורי המוח (איור 2C3, H3), במיוחד בהיפוקמפוס. הן בעכברי WT והן בעכברי TgAPP, יחס GSH/GSSG היה נמוך משמעותית בזכרים מאשר בנקבות (איור 2C3, H3; p < 0.05). בעוד שבנשות TgAPP הירידה הזו היא תוצאה של רמות GSH נמוכות יותר (איור 2C1, H1), אצל גברים TgAPP היא מיוחסת בעיקר לעלייה ברמות GSSG (איור 2C2, H2).

שינויים ברמות GSH ו-GSSG של עכברי TgAPP, בהתאמה, בטיפול בקוורצטין או רוטין, בולטים יותר בזכרים מאשר בנקבות. נראה שקוורצטין נוטה להגביר את רמות GSH (איור 2C1, H1; p < 0.05) ורוטין להורדת רמות GSSG (איור 2C2, H2; p < 0.05).

טיפולי קוורצטין ורוטין, בזכרים ובנקבות כאחד, הצליחו להפוך את הירידה ביחס GSH/GSSG בהיפוקמפוס (איור 2H3) שבו התאוששות כוח החיזור הייתה משמעותית לעומת עכברי TgAPP שלא טופלו. אצל גברים, מדד זה השיג ערכים דומים לאלה של עכברי WT בהיפוקמפוס (H3). בנקבות, למרות שיחס זה אינו מועלה לזה של עכברי WT, טיפול בקוורצטין ורוטין הגדיל אותו באופן משמעותי בהשוואה לזה של עכברי TgAPP בהיפוקמפי שלהם (H3: quercetin, p < 0.{{ 6}}01; rutin, p < 0.05).

2.3. חומרים תגובתיים בחומצה תיוברביטורית (TBARs)

רמות TBARs נקבעו כסמן של חמצון שומנים. באמצעות עקומות כיול, התוצאות הובעו כריכוז מלונדאלדהיד (MDA) (איור 3).

בעקבות ביטוי יתר של APP, נצפתה עלייה משמעותית ברמות MDA בהשוואה לעכברי WT הן בקליפת המוח (איור 3C) והן בהיפוקמפוס (איור 3H), והן בזכרים ובנקבות (p < 0.001) .

בנקבות TgAPP, טיפולי קוורצטין ורוטין כמעט החזירו את רמות ה-MDA לאלו של עכברי WT (איור 3C, H). בזכרי TgAPP, כמו כן, טיפולי קוורצטין ורוטין מחזירים את רמות ה-MDA לאלו של עכברי WT בקליפת המוח (איור 3C) ויורדות עוד יותר בהיפוקמפוס (איור 3H). הן בעכברי WT והן בעכברי TgAPP, ללא טיפול וטיפול בדיאטת פלבנואידים, רמות MDA היו תלויות מין (איור 3C, H; p < 0.05), למעט עכברי TgAPP שטופלו בקוורצטין בהיפוקמפוס.

2.4. פעילות אנזים וביטוי של אנזימים נוגדי חמצון

כדי להתייחס לשאלה האם ויסות הפעילות האנזימטית או ביטוי הגנים של האנזימים נוגדי החמצון העיקריים, או שניהם, מתרחשת על ידי דיאטת קוורצטין או רוטין, בוצעה קביעה של הפעילות האנזימטית ורמות ה-mRNA.

איור 4 מציג את פעילויות האנזים של SOD, CAT, GR ו-GPx, שנקבעו בעכברים נקבות וזכרים, בקליפת המוח (איור 4a) ובהיפוקמפוס (איור 4b).

כתוצאה מביטוי יתר של APP, נצפתה רק ירידה משמעותית בפעילות CAT בעכברי TgAPP בהשוואה לעכברי WT הן בקורטקס (איור 4a(C2); p < 0.05) והן ההיפוקמפוס (איור 4b(H2); p <0.05).

טיפול ב-Quercetin לא יצר כל שונות משמעותית בפעילות האנזים בהשוואה לעכברי TgAPP, בזכרים או נקבות, באזורי המוח שנחקרו. לעומת זאת, בעלי חיים שטופלו ברוטין חוו עלייה בפעילות CAT בקליפת המוח (איור 4a(C2)) ובפעילות GR בהיפוקמפוס (איור 4b(H3)) אצל זכרים ונקבות כאחד (p < 0 .05). יתר על כן, רוטין הגביר את פעילות CAT ההיפוקמפוס בזכרי TgAPP (איור 4b(H2)) ופעילות GPx בנקבות (איור 4b(H4)).

איור 5 מציג את ביטוי הגנים של האנזימים נוגדי החמצון העיקריים, SOD, CAT, GR ו-GPx, שנקבע בעכברים נקבות וזכרים, בקליפת המוח (איור 5a) ובהיפוקמפוס (איור 5b).

לא נצפו הבדלים בביטוי הגנים בין עכברי TgAPP ו-WT עבור האנזימים נוגדי החמצון העיקריים (איור 5a,b). גברים TgAPP שטופלו ברוטין הראו עלייה משמעותית בביטוי של CAT בהיפוקמפוס (איור 5b(H2)). באשר ל-GPx ההיפוקמפוס, נצפה דפוס דומה ל-CAT, אם כי העלייה לא הייתה משמעותית (איור 5b(H4)).

2.5. עיבוד אפליקציה: BACE1 ו-ADAM10

התוצאות של פעילות האנזים BACE1 הן בקליפת המוח והן בהיפוקמפוס בזכרים ובנקבות מוצגות באיור 6, מבוטאות כאחוזים של פעילות לגבי עכברי TgAPP לא מטופלים.

באיור 6, נמצא שפעילות האנזים BACE1 בעכברי TgAPP גדלה בכ-10 אחוז בהשוואה לעכברי WT, הן באזורי המוח הנחקרים והן בשני המינים, ונמצאה מובהקת סטטיסטית (p < 0.05).

העלייה בפעילות שנצפתה בעכברים המהונדסים ירדה הן על ידי טיפולי קוורצטין והן על ידי טיפולי רוטין, הן בקורטקס והן בהיפוקמפוס. עם זאת, עדיין ניתן לציין שהשפעת הרוטין הייתה מעט יותר גדולה מזו של קוורצטין אצל גברים.

לאחר שנודעה פעילותו של BACE1, החלטנו לבצע את מחקר ביטוי הגנים של APP, המאפיין העיקרי של מודל החיות הטרנסגני, ואנזימי העיבוד העיקריים שלו: BACE1 ו-ADAM10. איור 7 מציג את התוצאות שהתקבלו בעכברים נקבות וזכרים, הן בקורטקס והן בהיפוקמפוס.

בשני המינים, נצפתה עלייה משמעותית בביטוי APP של יותר מ-85 אחוזים לגבי עכברי WT, מה שמדגים את ביטוי היתר של הגן שניהם בקליפת המוח (איור 7C1; p < 0.05) ובהיפוקמפוס (איור 7H1; p < 0.05). טיפולים בקוורצטין ורוטין הצליחו להפחית את הביטוי הזה ביותר מ-45 אחוז (p < 0.05) עבור עכברים זכרים ונקבות כאחד בשני אזורי המוח הנחקרים (איור 7C1, H1), כאשר ההשפעות בולטות יותר בהיפוקמפוס ( איור 7H1).

באשר לביטוי החלבון BACE1, למרות שפעילות BACE1 השתנתה, לא היו הבדלים משמעותיים בין עכברים מהונדסים ולא מהונדסים ללא קשר למין ולטיפול בפלבנואידים שנבדקו.

לפיכך, הערכנו את הביטוי ADAM10 המעורב בעיבוד הלא-עמילואידגני של APP. למרות שהשינויים בביטוי ADAM10 בעכברי TgAPP בהשוואה לעכברי WT לא היו מובהקים סטטיסטית, נצפתה ירידה קלה. לגבי הטיפולים בפלבנואידים, רוטין הראה מגמת עלייה בביטוי ADAM10, הן בזכרים והן בנשים ובשני אזורי המוח (איור 7C3, H3).

【למידע נוסף:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】