כיצד סידן מטפל בנזק לכליות שנגרם כתוצאה מלואוריד?

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

מילות מפתח: סִידָן, כִּליָה, אפופטוזיס

תַקצִיר

צריכה מופרזת ארוכת טווח של פלואוריד (F) עלולה לגרום לנזק עצם ולא עצם. הכִּליָההוא איבר הפרשת הפלואוריד העיקרי בגוף. מחקר זה נועד לבחון האם תזונתיסִידָןתוספת יכולה להקלכִּליָהנזק שנגרם על ידי פלואורוזיס וכדי לחקור עוד יותר את ההשפעות שלסִידָןעל מנגנון ההפחתה שלכִּליָהתָאאפופטוזיסהופעל על ידי F. הערכנו את המבנה ההיסטופתולוגי,כִּליָהמדדי תפקוד ורמות ביטוי גנים וחלבונים של קולטן מוותאפופטוזיסמסלולים בחולדות Sprague Dawley (SD) שטופלו בנתרן פלואוריד (NaF) ו/אוסִידָןקרבונט (CaCO3) למשך 120 יום. התוצאות הראו ש-100 מ"ג/ליטר של NaF הושרהכִּליָהפגיעה היסטופתולוגית ואפופטוזיס, העלה את הריכוזים של קריאטינין (CRE), חומצת שתן (UA), חנקן אוריאה בדם (BUN), אשלגן (K), זרחן (P) ו-F (p < {0}}}.05)="" ,="" ולהוריד="" את="" רמת="" המגנזיום="" בסרום="" (mg)="" (p="">< 0.05).="" יתרה="" מכך,="" naf="" העלה="" את="" רמות="" ה-mrna="" והחלבון="" של="" קולטן="" מוות="" משטח="" תאי="" fas="" (fas),="" גורם="" נמק="" גידול="" (tnf),="" הקשור="">אפופטוזיסליגנד מעורר (TRAIL), Caspase 8, Caspase 3 ופולי ADP-ribose polymerase (PARP) (p < 0.01),="" שהפעילו="" לבסוף="" את="" מסלול="" קולטן="" המוות.="" בְּיַחַס="">סִידָןתוספת הפכה את הירידה ברמות CRE, BUN, UA, F ו-P שנגרמו על ידי F, הקלה על נזק היסטופתולוגי ואפופטוזיס, והפחית את רמות ביטוי הגנים והחלבון של סמנים הקשורים למסלולי רצפטורים. לסיכום, אחוז אחדסִידָןמקל על נגרמת Fכִּליָהאפופטוזיסדרך מסלולי איתות FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL.

הכִּליָההוא איבר הפרשת הפלואוריד העיקרי בגוף, הcistancheיכול להגן עלכִּליָהולשפרכִּליָהפוּנקצִיָה.

מבוא

פלואור קיים באופן נרחב באדמה, במים ובמזון. עם זאת, כמה גורמים טבעיים (בלייה של מינרלים וסלעים, היווצרות שלסִידָןומלחי מגנזיום, חדירת מי תהום וכו') ופעילויות אנושיות (שפכים תעשייתיים, אגרוכימיקלים, מוצרים ביתיים וכו') גורמים לזיהום פלואור בסביבה (Daiwile et al., 2019). כיום, הגורם הגדול ביותר לחשיפה לפלואוריד (F) הוא מי שתייה, והריכוז המומלץ של F במי השתייה על ידי ארגון הבריאות העולמי הוא פחות מ-1.5 מ"ג/ליטר (הנחיות לאיכות מי השתייה, 2017). עדויות אפידמיולוגיות מצביעות על כך שריכוז גבוה מריכוז זה מעלה את הסיכון לפלואורוזיס דנטלי, והריכוז הגובר יגדיל את הסיכון לפלואורוזיס שלד (הנחיות לאיכות מי שתייה, 2017; המועצה הלאומית למחקר, 2006). חשיפה ארוכת טווח לריכוזים גבוהים של פלואוריד יכולה להגביר את ספיגת הפלואור בגוף דרך דרכי הנשימה

ודרכי העיכול. צריכה מוגזמת של F עלולה לגרום לנזק לאיברים גרמיים ולא גרמיים בגוף. נזק לרקמות רכות מחוץ לעצם מכונה בדרך כלל נזק שאינו גרמי. נכון לעכשיו, נמצא כי הנזק של רקמה שאינה עצם הנגרם על ידי F מערב את מערכת העיכול, הכבד,כִּליָה, מוח וכו' (Jha et al., 2011; Perumal et al., 2013).

הכִּליָה, איבר ההפרשה העיקרי של הגוף, אחראי על חילוף החומרים של חומרים רעילים ורעלים אקסוגניים בגוף. מחקרים דיווחו כי כ-50-80 אחוז מהפלואור הנבלע בגוף מסונן ונספג מחדש על ידיכליות, והפלואור הנותר מצטבר ברקמות ואיברים אחרים (Chen et al., 2013; Dharmaratne, 2019). סוגים רבים של ספרות הוכיחו שחשיפה של 50 ו-100 מ"ג/LF יכולה להוביל להגדלה של חלל כמוסת הכליה, ניוון שלכִּליָהצינוריות, סידור לא סדיר של תאים פפילריים, היצרות של לומן, וכתוצאה מכךאפופטוזיסשֶׁלכִּליָהתאים והידרדרות של פונקציות ביוכימיות כגון קריאטינין (CRE), חומצת שתן (UA),סִידָן(Ca), וזרחן (P) (Song et al., 2014; HW Wang et al., 2020; Wei et al., 2018a).

אפופטוזיס, מעין מוות תאים הנשלט על ידי גנים, המחולק לאנדוגנייםאפופטוזיסואקסוגנייםאפופטוזיס. דיווחים אחרונים הצביעו על כךאפופטוזיסהנגרמת על ידי F גבוה כוללת בעיקר מסלולים בתיווך מיטוכונדריה, הרשת האנדופלזמית מתווכת מתח, ומסלולים בתיווך קולטן מוות (Wei et al., 2018a). ניסויים קודמים בקבוצה שלנו הצביעו על כך ש-NaF משרה עצם וכבדאפופטוזיסדרך המסלול האנדופלזמי התוך תאי (ER) והמסלול המיטוכונדריאלי (Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019). בנוסף, מחקרים הראו גם שהמסלול המיטוכונדריאלי מעורב בהשראת NaFאפופטוזיסשל עכברכליות(Wei et al., 2018b). עם זאת, אין מחקר שיטתי על המסלול המתווך קולטן מוות ב-F-inducedכִּליָהאפופטוזיס. מסלול קולטן המוות שולט בכל שלב של אקסוגניאפופטוזיס, כולל מסלול רצפטור המוות של תאי Fas (FAS), מסלול של גורם נמק של גידול (TNF) וקשור ל-TNFאפופטוזיסמסלול מעורר ליגנד (TRAIL) (Grunert et al., 2012; Lu et al., 2017; Wang and Su, 2018). מסלול FAS הוא מערכת העברת אותות פרימיטיבית שמתווכתאפופטוזיס. ל-FAS יש מאפיינים של קולטן ממברנה ויוצר טרימר לאחר קשירה עם ליגנד FAS (FAS-L). ואז התחום הספציפי של הטרימר נקשר עם תחום המוות (DD) של מולקולת הקונקסין המקבילה FAS-associated death domain protein (FADD) ליצירת קומפלקס אותות המושרה (DISC) (Wang and Su, 2018). בתהליך העברת האות הביולוגי הבא, FADD יכול להפעיל את Caspase 8 ומשפחת Caspase בו-זמנית, ובסופו של דבר להוביל לאפופטוזיסבאמצעות ההשתתפות של Caspase 3 ואפקט פולי ADP-ribose Polymerase (PARP) (Kischkel et al., 2000; Meynier and Rieux-Laucat, 2019). מחקרים אחרונים הראו שמסלול ה-FAS מתווךאפופטוזיסבתאי T ובמהלךכִּליָהכישלון שנגרם על ידי cisplatin (Djiadeu et al., 2017; Linkermann et al., 2011). בנוסף, מחקר דיווח גם כי NaF משרהאפופטוזיסבעכברים דרך מסלול FAS (Sun et al., 2017). TRAIL הוא ציטוקין מוכר במשפחת העל TNF. הוא נקשר לקולטנים האגוניסטים ההומולוגיים שלו, כלומר קולטני מוות (DR4 ו-DR5). יש DD באזור הסלולרי שלו. ה-DD הכרחי לגיוס של FADD חלבון אדפטיבי. FADD בתורו גורם לשחרור קספסות לציטופלזמה, קספאז 3 מופעל מבקע PARP, ומעכב את פוטנציאל תיקון ה-DNA שלו, וכתוצאה מכךאפופטוזיס(Bodmer et al., 2000; Micheau, 2018). משתמע שמסלול ה-TRAIL/DR5 מעורב ב-NaF המושרהאפופטוזיסבעכברים (Song et al., 2021). Osteoprotegerin (OPG) הוא קולטן מסיס חופשי, חסר תחום טרנסממברני. זה יכול לרסן בתיווך TRAILאפופטוזיסעל ידי עיכוב הקישור של TRAIL וקולטני מוות אחרים (Duiker et al., 2006; Kiraz et al., 2016; Micheau, 2018). הקישור של קולטן TNF ו-TNF (TNF-R1) יכול להפעיל את הגיוס של חלבון תחום המוות הקשור ל-TNFR (TRADD) דרך ה-DD שלו. לאחר מכן, TRADD מקיים אינטראקציה עם FADD, מה שמוביל לגיוס של פרו-קספס 8, אשר מבוקע לקספאז 8 פעיל על ידי אנזימים פרוטאוליטיים. לאחר מכן Caspase 8 מפעיל את Caspase 3, האחראי על התאאפופטוזיס(Kiraz et al., 2016; Sedger and McDermott, 2014). דווח כי NaF גורם להפטוציטיםאפופטוזיסבעכברים דרך מסלול האות TNF-R1 (Lu et al., 2017)

סִידָןממלא תפקידים שונים בהרכב העצמות והשיניים, והוא גם יכול לשלוט בהעברת העצבים ובשחרור החומר (Cao et al., 2016), להשתתף במערכתסִידָןהומאוסטזיס (Carmeliet et al., 2003; Yang et al., 2016), שינוי חדירות ממברנה (Lappe et al., 2017), מפעילים הפרשת מגוון אנזימים והורמונים (Kim et al., 2012) וכו'. מחקרים קודמים רבים מצאו כי ל-F ול-Ca יש השפעה אנטגוניסטית בביולוגיה (Dure-Smith et al., 1996; Nobrega et al., 2019). ברגע ש-F נספג בגוף, הוא ייכנס לדם ויוצר משקעי CaF2 בלתי מסיסים. אם האספקה ​​התזונתית של Ca אינה מספקת וה-Ca בדם לא מגיע לרמה הראויה, יחולו שינויים פתולוגיים כמו היפוקלצמיה ואוסטאוליזה, ולכן לתוסף תזונה של Ca יש תפקיד חשוב במניעה ושיפור פלואורוזיס (Dure-Smith et. al., 1996; Li et al., 2021; Yang et al., 2021). הקבוצה שלנו אישרה את התזונה הזוסִידָןיכול להקל עלאפופטוזיסשל עצם וכבד דרך מסלול האות PI3K-AKT, מסלול ER ומסלול מיטוכונדריאלי (Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019; Yang et al., 2021). על מנת להוכיח עוד יותר האםסִידָןמחליש את הרעילות הנפרוטית של F באמצעות קולטן המוות המתווךאפופטוזיסבמסלול, הקמנו מודל של עכברושים של דיאטה עתירת פלואורידסִידָןוהעריך אתכִּליָהמדד הפציעה, מידתאפופטוזיס, והשינויים של ביטוי גן סמן וחלבון בקולטן המוות המתווךאפופטוזיסנָתִיב.

חומרים ושיטות

כימיקלים ומכשור

מים מזוקקים הוכנו על ידי מערכת לטיהור המים Heal Force (שנחאי, סין). חוצץ תמוגה של רדיו אימונציפציטציה (RIPA) ונתרן פלואוריד (NaF) סופקו על ידי Sigma-Aldrich (שנחאי, סין). 10 אחוז פורמלין, גליצין, סודיום דודציל סולפט (SDS), TRIS, Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), CaCO3, קרום ניטרוצלולוזה (NC), ערכת Bicinchoninic Acid (BCA) וערכת צביעה המטוקסילין-אאוזין (H&E) התקבלו מ-Solarbio Technology Co. ., Ltd. (בייג'ינג, סין). ריאגנט Trizol נרכש מחברת Takara Biological Engineering (Dalian, סין). ערכות CRE, UA, חנקן אוריאה בדם (BUN), מגנזיום (Mg), P ואשלגן (K) נרכשו מהמכון הביו-הנדסי של נאנג'ינג Jiancheng (נאנג'ינג, סין). באתרואפופטוזיסערכת זיהוי, נוגדן פוליקלונאלי של ארנב FAS (BA0484), ונוגדן פוליקלונאלי של ארנב FAS-L (PB0042) נרכשו מ- Boster Biotechnology (Wuhan, סין). -actin Rabbit Polyclonal antibody (20536-1-AP), FADD Rabbit Polyclonal antibody (14906-1-AP), Caspase 8 Rabbit Polyclonal antibody (13423-1-AP), Caspase 3 Rabbit Polyclonal antibody ({{9 }}AP), ו-HRPconjugated Affinipure Goat Anti-rabbit IgG(H plus L) (SA00001-2) נרכשו מקבוצת Proteintech (Wuhan, סין). TRAL Rabbit Polyclonal Antibody (bs-1214R), TNF alpha Rabbit Polyclonal Antibody (bs2081R), PARP Rabbit Polyclonal Antibody (bs-55164R) נרכשו מ-Bioss (בייג'ינג, סין). זוהר אלקטרוכימי (ECL) ו-3,3'-diaminobenzidine (DAB) נרכשו מ-KeyGen Biotech (ג'יאנגסו, סין). PrimeScript® RT Master Mix ו-SYBR® Premix Ex Taq™ II Kit סופקו על ידי Promega Biotechnology (בייג'ינג, סין).

בעלי חיים וטיפולים

ארבעים חולדות זכר ספראג-דאולי (SD) בריאות {{0}} בנות שבוע (120 ± 20 גרם) הושגו מהמרכז לניסויים לבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של Shanxi (Shanxi, סין). החולדות עברו התאקלמות למשך שבוע אחד, מחולקות אקראית לארבע קבוצות (10 חולדות לקבוצה): קבוצת ביקורת (C), קבוצת NaF (F), קבוצת NaF בתוספת 0.5 אחוז CaCO3 (F ועוד 0.5 אחוז Ca), NaF ועוד 1 אחוז. קבוצת CaCO3 (F בתוספת 1 אחוזסִידָן) וטופלו כמו טבלה 1. כל החולדות שוכנו בכלובי פלסטיק בטמפרטורה של 22-25 מעלות צלזיוס (55 ± 5 אחוזי לחות, מחזור אור/חושך של 12 שעות), דיאטה ומי שתייה נגישים באופן חופשי.

לאחר 17 שבועות של גידול, חולדות צמו במשך 24 שעות, והמים היו חופשיים לשתות. לאחר מכן החולדות הורדמו עם נתרן פנטוברביטל והוקרבו על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר שנאסף הדם מגלגלי העיניים. מעט דם נאסף על ידי הצינורות המכילים נתרן הפרין נוגד קרישה לבדיקת BUN. חלק מהדם הוכנס למבחנות נפוצות, הונח בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, ולאחר מכן עבר צנטריפוגה במהירות של 3000 סל"ד לדקה למשך 10 דקות להפרדת הסרום. הסרום הופרד לבדיקות CRE, UA, Mg, P, K ו-F. שמונה דוגמאות שלכליותמכל קבוצה נבחרו באקראי והוקפאו במהירות בחנקן נוזלי, ולאחר מכן אוחסנו ב-80 ◦C עבור ניסויי qRT-PCR ו-Western blotting. הדוגמאות האחרות שלכליותנקבעו ב-10% פורמלין לבדיקה היסטופתולוגית וניסויים סופיים בתיווך deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL). כל פעולות הניסוי הקשורות לבעלי חיים יושמו בקפדנות על פי התקנות של המוסד לטיפול בבעלי חיים וועדת השימוש של האוניברסיטה החקלאית של שאנשי, שאנשי, סין.

כִּליָהמְקַדֵם

החולדות נשקלו תחילה; אז הכִּליָההרקמה הוסרה ונשקללה. הכִּליָהמקדם התקבל על ידי הנוסחה הבאה.

כִּליָהמקדם=[כִּליָהמשקל רטוב (g) / משקל גוף (g)] ×100 אחוז.

בדיקה היסטופתולוגית

כִּליָהדגימות הוטבעו בפרפין. קטע (5 מיקרומטר עובי) שלכִּליָההוכתם על ידי H&E. לאחר מכן, השקופיות נצפו באמצעות מיקרוסקופ אור (אולימפוס, טוקיו, יפן). חומרת הכִּליָההפציעה נשפטה לפי ציון היסטופתולוגי.כִּליָהפגיעה בצינורית מוגדרת ככִּליָההגופות מתנוונות ומעוותות, הכִּליָהחלל הקפסולה התרחב, הכִּליָהצינוריות היוצרות גבס, ותאי אפיתל נושרים. בהגדלה של פי 200, נעשה שימוש בקריטריונים הבאים כדי להעריך את מידת הפגיעה בכבד. 1: 0–25 אחוז נזק; 2: 25–50 אחוז נזק; 3: 50–75 אחוז נזק; 4: 75-100 אחוז נזק (Baranova et al., 2016).

קביעה שלכִּליָה-אינדיקטורים הקשורים

רמת F נמדדה על ידי אלקטרודה ספציפית ליון F (Quadri et al., 2018). הרמות של CRE, UA, BUN, Mg, P ו-K נמדדו באמצעות ערכות זמינות מסחרית. כל ההליכים הקשורים בוצעו בהתאם להוראות היצרן.

זיהוי שלאפופטוזיסרמה על ידי TUNEL

על מנת לכמת אתאפופטוזיסבכִּליָהתאים, ניתוח ניסיוני בוצע באמצעות שימוש באתראפופטוזיסערכת איתור. הכִּליָהחלקים עברו דה-פראפין ולאחר מכן הועברו לעיכול באמצעות Proteinase K. Terminal Deoxynucleotidyl Transferase יכול לסמן dUTP (DIG-dUTP) המסומן בדיגוקסין לקצה 3'-OH, ו-DIG-dUTP נקשר לנקודת הפריצה של ה-DNA לאחר תגובה עם האנטי סמן ביולוגי -חופר-ביוטין. בשילוב עם DAB נוסף לתצוגה. להדמיה

כל הגרעינים, החתכים נצבעו נגדי בהמטוקסילין. אותות חומים כהים מציינים תאים חיוביים וכחול מציין תאים שאינם מגיבים. האפופטוזיסהמדד חושב על פי הנוסחה הבאה.

שיעור התאים האפופטוטיים=(מספר התאים האפופטוטיים לצומת / מספר התאים הכולל לצומת) ×100 אחוז .

PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)

סך RNA מהכִּליָהחולץ באמצעות ריאגנט Trizol. השתמשנו בספקטרופוטומטר ND{{0}} (ננו-דרופ, ארה"ב) ובאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כדי לבדוק את האיכות והכמות של ה-RNA. שעתוק הפוך (RT) בוצע על 500 ננוגרם כולל של RNA באמצעות PrimeScript® RT Master Mix. פריימרים ספציפיים ל-actin ו-FAS, TRAIL, TNF וגנים אחרים תוכננו על ידי תוכנת Primer Premier 7.0 (טבלה 2) וסונתזו על ידי Sangon Biotech (שנחאי, סין). מערכת PCR בזמן אמת Quantstudio 7 flex (תרמו-פישר, ארה"ב) ו-SYBR® Premix Ex Taq™ II Kit שימשו עבור RT-PCR. נפח התגובה של PCR היה 20 μL, ותנאי ה-RT-PCR היו: 95 ◦C 10

דקות, 40 מחזורים של 95 ◦C 15 שניות, 55 ◦C 30 שניות, 72 ◦C 30 שניות, ולבסוף מחזור אחד של 95 ◦C 15 שניות, 60 ◦C 15 ש', 95 ◦C 15 שניות. כל התגובות חזרו על עצמן שלוש פעמים. שיטת 2-ΔΔCt היחסית שימשה לחישוב רמות הביטוי היחסיות של mRNA, ו-actin שימש ככייל. בתהליך, הפרש היעילות הוא פחות מ-5 אחוזים.

מיצוי חלבון כולל וניתוח סופג מערבי

הכִּליָההרקמה נשטפה עם PBS, מיובשה עם נייר סינון ופורקה בתמוגה RIPA (המכילה PMSF), ב-12,000 סל"ד/דקה, 4^◦C למשך 10 דקות. ריכוז החלבון נקבע באמצעות ערכת חומצה Bicinchoninic Acid (BCA) (Solarbio Science & Technology, בייג'ינג, סין). דגימת חלבון של 35 ננוגרם חולצה בהצלחה והופרדה על 8 אחוזים של ג'ל SDS-polyacrylamide על ידי אלקטרופורזה. חלבון המטרה הועבר לממברנת NC, ​​וממברנת ה-NC נחסמה עם 5 אחוז חלב ללא שומן בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן, קרום ה-NC הודגרה עם נוגדנים ראשוניים של -אקטין (1:1000), TRAIL (1:500), FAS (1:500), FAS-L (1:100), TNF (1:500), FADD (1:500), Caspase 8 (1:500), Caspase 3 (1:500) ו-PARP (1:1000) ב-4 מעלות למשך הלילה. לאחר כביסה 3 פעמים עם PBST, קרום ה-NC הודגרה עם נוגדני IgG משניים של עיזים מצומדות HRP נגד ארנב (1:2000) בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. נעשה שימוש ב-ECL כדי להמחיש את להקות חלבון היעד. צפיפות אופטית חושבה על ידי תוכנת AlphaView (גרסה: 3.2.2.0) על מערכת FluorChem Q (Alpha Innotech, CA, ארה"ב).

ניתוח סטטיסטי

תוכנת GraphPadPrism{{0}} שימשה כדי לארגן ולנתח את נתוני הניסוי, וכל נתון מיוצג על ידי ממוצע ± SEM. המשמעות של ההבדל בין הממוצעים נקבעה על ידי ניתוח השונות (ANOVA) ולאחר מכן הבדיקה של Tukey כאשר P < 0.05="" נחשב="">

תוצאות

שינויים בכִּליָהמדדי מקדם ותפקוד ביוכימי

הכִּליָהמקדם ורמות F, CRE, BUN, UA, Mg, P, K הוצגו באיור 1. בהשוואה לקבוצת C,כִּליָהמקדם ירד באופן משמעותי בקבוצת F (p < 0.05).="" עם="" זאת,="" מקדם="" הכליות="" ב-f="" פלוס="" 1="">סִידָןהקבוצה הראתה עלייה משמעותית בהשוואה לקבוצת F (p < {{0}}.05).="" רמת="" f="" בקבוצת="" f="" הייתה="" גבוהה="" באופן="" ניכר="" מאשר="" בקבוצת="" c="" (p="">< 0.001).="" מעניין,="" בהשוואה="" לקבוצת="" f,="" רמת="" ה-f="" בקבוצת="" f="" בתוספת="" 1="" אחוז="" ca="" ירדה="" באופן="" משמעותי="" (p=""><>

CRE, BUN ו-UA הוערכו כדי לשקף את מידתכִּליָהנזק ושינוי תפקודי. הרמות של CRE, BUN ו-UA עלו באופן מובהק בקבוצת F בהשוואה לאלו בקבוצת C (p < 0.05),="" עם="" זאת,="" ביחס="" לקבוצת="" f,="" שלושת="" האינדיקטורים="" שלעיל="" היו="" במיוחד="" ירד="" ב-f="" פלוס="" 1="">סִידָןקבוצה (p < 0.05).="" mg,="" p="" ו-k="" היו="" אינדיקטורים="" אלקטרוליטים="" הקשורים="" קשר="" הדוק="">כִּליָהפוּנקצִיָה. בהשוואה לקבוצת C, רמת Mg בסרום ירדה באופן משמעותי, רמות P ו-K עלו באופן דרמטי בקבוצת F (p < 0.05).="" עם="" זאת,="" הוספת="" 1="">סִידָןהדיאטה העלתה באופן ניכר את רמות ה-Mg בסרום ב-15.3 אחוזים (p <{2}}.05) והפחיתה="" באופן="" ניכר="" את="" רמות="" ה-p="" בסרום="" ב-16.9="" אחוזים=""><0.05). תכולת="" הסרום="" k="" הראתה="" מגמת="" ירידה="" ללא="" כל="" משמעות="" לאחר="" טיפול="" בתוספת="" 1="" אחוז="">

שינויים בכִּליָהמוֹרפוֹלוֹגִיָה

השינויים המורפולוגיים שלכִּליָהרקמות נבדקו על ידי H&E (איור 2I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ). בקבוצת C,כִּליָהתאים צינוריים היו מסודרים בצורה קומפקטית, המורפולוגיה הייתה סדירה והמורפולוגיה של הגלומרולי הייתה שלמה. עם זאת, הגבולות בין התאים לא היו ברורים, הכִּליָההגופים התנוונו ועווותים, הכִּליָהחלל הקפסולה התרחב, הכִּליָהצינוריות יצרו גבס, ותאי אפיתל התנתקו בקבוצת F. בהשוואה לקבוצת F, עם עלייה שלסִידָןריכוז, הסדר שלכִּליָהתאים הפכו בהדרגה יותר מסודרים, המורפולוגיה שלכִּליָההגופיות התאוששו בהדרגה, ומידת הפציעה הוקלה בהדרגה. בנוסף, הערכנו את הנזק על ידי שימוש ב-כִּליָהציון (איור 2Ⅴ). הציון של קבוצת F היה גבוה משמעותית מזה של קבוצת C (p < 0.01);="" עם="" זאת,="" הציון="" ב-f="" פלוס="" 1="">סִידָןהקבוצה ירדה באופן ניכר בהשוואה לקבוצת F (p < 0.05).

TUNEL מזההכִּליָהתָאאפופטוזיס

ביצענו את מבחן TUNEL כדי לזהות ולנתח האםכִּליָהתאים עברואפופטוזיסבמחקר זה (איור 3I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ).כִּליָההרקמות בקבוצת C היו מסודרות בצורה מסודרת, עם פחות תאים אפופטוטיים (4.67 ± 1.15 אחוז). קבוצת F הראתה מספר גדול של TUNEL חיוביכִּליָהתאי אפיתל צינוריים (48.17 ± 3.94 אחוזים). לעומת זאת, ה-F בתוספת 1 אחוזסִידָןהקבוצה הציגה ירידה דרמטית במספר התאים החיוביים ל-TUNEL (28.83 ± 4.81 אחוזים) (איור 3Ⅴ).

השפעות שלסִידָןעל שינויים הנגרמות על ידי F בגנים הקשורים למסלול של קולטן מוות

רמות הביטוי היחסיות של mRNA של גורמים במעלה הזרם הקשורים לקולטן המוות המתווךאפופטוזיסנתיב (TRAIL, DR5, TNF, TNFR1, TNF-R2, FAS, FAS-L, OPG) התגלו באיור 4a. ביחס לקבוצת C, רמות ביטוי ה-mRNA של TRAIL, DR5, TNF, TNF-R1, TNFR2, FAS ו-FAS-L היו משופרים במיוחד בחולדות שטופלו ב-F (p < 0.01).="" לעומת="" זאת,="" ביטויי="" ה-mrna="" היחסיים="" של="" trail,="" tnf,="" tnf-r2,="" fas="" ו-fas-l="" הופחתו="" באופן="" ניכר="" ב-f="" פלוס="" 1="">סִידָןקבוצה בהשוואה לקבוצת F (p < {{0}}.05).="" בהשוואה="" לקבוצת="" c,="" נצפתה="" ירידה="" ברורה="" ברמות="" ביטוי="" ה-mrna="" של="" opg="" בקבוצת="" f="" (p=""><0.01). עם="" זאת,="" יחסית="" לקבוצת="" f,="" opg="" ב-f="">סִידָןהקבוצות הוגדלו. רמות הביטוי היחסיות של גורמים FADD, TRADD, Caspase 8, Caspase 3 ו-PARP הוצגו באיור 4b. ביטויי החלבון של FADD, TRADD, Caspase 8, Caspase 3 ו-PARP שופרו כמובן בקבוצת F בהשוואה לקבוצת C (p < 0.01),="" אך="" ברור="" שהצטמצמו="" ב-f="">סִידָןקבוצות, בהשוואה לקבוצת F (p < 0.05).

השפעות שלסִידָןעל שינויים הנגרמות על ידי F באפופטוזיס- חלבונים הקשורים

ביטוי החלבון של TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, Caspase 8, Caspase 3 ו-PARP זוהה באמצעות Western blotting (איור 5a, b). בהשוואה לקבוצת C, ביטויי החלבון של TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, Caspase 8, Caspase 3 ו-PARP בקבוצת F היו מוגברים באופן ניכר (p < 0.01).="" ביטויי="" החלבון="" של="" כל="" הגורמים="" לעיל="" ירדו="" באופן="" ניכר="" ב-f="" פלוס="" 1="">סִידָןקבוצה בהשוואה לקבוצת F (p < 0.05).

דִיוּן

העדויות העדכניות ביותר הוכיחו ש-F יכול לגרום לנגעים ברקמות רכות, ומידת הנזק ל-F תלויה בריכוז ה-F, זמן החשיפה וסוג האיברים (Wei et al., 2019). במחקר זה, נעשה שימוש ב-100 מ"ג/ליטר של NaF במשך 17 שבועות כדי לבסס מודל בעלי חיים לחשיפה תת-חריפה של מי שתייה ל-NaF. המינון של NaF נבחר בהתאם לדרגת הזיהום של F בסביבה ולגורמים הלא וודאיים של מינים שונים. בהתחשב בכך שריכוז ה-F הטבעי שנמדד במי תהום מקומיים הוא כ-4.5 מ"ג/ליטר, המים המזוקקים עם 100 מ"ג/ליטר NaF ששימשו במחקר זה (ריכוז ה-F הוא כ-45 מ"ג/ליטר) חושבו על פי גורם לא ודאי עבור אקסטרפולציה של בעל חיים לאדם ב-10 (הנחיות לאיכות מי שתייה, 2017; Mukherjee and Singh, 2021; Wen et al., 2013; Zhang et al., 2020). מחקרים מוקדמים מצאו כי תזונתייםסִידָןיכול להשפיע על ספיגת הפלואור, לקדם את הפרשת הפלואור בגוף, להפחית את קצב הספיגה של הפלואור, ובכך להפחית את הרעילות של F (Harrison et al., 1984; Larsen et al., 1981). המחקרים הניסיוניים האחרונים שלנו הראו ש-Ca מקל על פגיעות עצם וכבד הנגרמות על ידי F על ידי עיכוב המסלול הפנימי שלאפופטוזיס(Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019). עם זאת, עד כה, המחקר על ההשפעה המגנה של Ca על רעילות נפרוטוקס הנגרמת על ידי F והמנגנון הקשור אליו הוא חסר תקדים. כאן, אנו מדווחים ש-Ca מקל על הנגרמת Fכִּליָהנֵזֶק. בנוסף, מצאנו גם ש-Ca הופך בהשראת Fכִּליָהתָאאפופטוזיסדרך קולטן המוות בתיווךאפופטוזיסמסלול (מסלולי FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL). הצטברות ארוכת הטווח של F ב-כִּליָהיכול להוביל למבנה הרקמה ולנזק תפקודי. במחקר זה, מצאנו שחשיפה ל-NaF גרמהכִּליָהתָאאפופטוזיסבחולדות, בליווי ניוון גלומרולרי ועיוות,כִּליָההרחבת חלל הקפסולה,כִּליָהצינוריות יוצרות גבס, ותאי אפיתל נושרים. למרות זאת,כִּליָההנזק הוקל באופן משמעותי לאחר תוספת של 1 אחוז Ca. תוצאות אלו היו דומות לתוצאות שהתקבלו בדוחות קודמים (Cao et al., 2015; HW Wang et al., 2020).

CRE הוא המטבוליט של השריר, UA הוא התוצר הסופי של חילוף החומרים בפורין, ו-BUN הוא התוצר הסופי העיקרי של חילוף החומרים של החלבון בגוף, המופרש באמצעות סינון גלומרולרי ומשמש בדרך כלל לאיתורכִּליָהפונקציה (Myers et al., 2006; HW Wang et al., 2020). הסקר הביוכימי של אזור F הגבוה הראה ששיעורי הסינון הגלומרולרי הופחתו באופן משמעותי, ו-F, UA ו-BUN השתנו באופן משמעותי (Malin et al., 2019). הניסויים בבעלי חיים הראו שסרום CRE,סִידָן, וריכוזי P הופחתו משמעותית בעכברים שנחשפו ל-100 מ"ג/ליטר NaF, מה שמצביע על כך ש-F הפריעכִּליָהתפקוד כמו גם מטבוליזם Ca ו-P (HW Wang et al., 2020). נפרוטוקסיות הנגרמת על ידי F קשורה לכִּליָהתִפקוּד לָקוּי. מתיכִּליָההתפקוד מתדרדר, הפרשת F בגוף מופחתת, מה שמוביל להצטברות יתר של פלואור בגוף.כִּליָהוהחמרת רעילות F (Kido et al., 2017). כאשרכליותנפגעים קשות, ה

הפרשת F בשתן פוחתת, וריכוז F בסרום עולה עוד יותר (Dharmaratne, 2019). במחקר זה, ראינו שרמות ה-BUN והסרום CRE, UA, P, K בחולדות שטופלו ב-100 מ"ג/ליטר NaF עלו באופן משמעותי, מה שמצביע על כך שחשיפה גבוהה ל-F גרמה לשינויים בכִּליָהאינדיקטורים ביוכימיים בחולדות והובילוכִּליָהאִי סְפִיקָה. יתר על כן, ציינו גם כי האינדיקטורים השונים של הכִּליָהנוטים להיות נורמליים לאחר מכןסִידָןתוספת. זה מראה ש-Ca (במיוחד 1 אחוזסִידָן) יש השפעה מקלה משמעותית על F-inducedכִּליָהנזק בחולדות.

Cistancheיכול לעזור עםכִּליָהנֵזֶק.

אפופטוזיסהוא מוות תאים אוטונומי ומסודר הנשלט על ידי גנים, המתאפיין בהשפלה של DNA ללא תמוגה ברורה של תאים. מחקר זה הבחין כי פלואורוזיס גרמהכִּליָהתָאאפופטוזיסבחולדות. FAS משחק תפקיד מרכזי בהתרחשות שלאפופטוזיסומחלות שונות. ספרות עדכנית גילתה ש-FAS מתווךאפופטוזיסבתוך הכִּליָההמושרה על ידי איסכמיה-פרפוזיה ולוקוציטים אנושייםאפופטוזיסהמושרה על ידי N-nitrosodimethylamine (Iwaniuk et al., 2019; Xu

et al., 2019). כאשר FAS ו-FAS-L מתחברים ליצירת טרימר, האות הפרו-אפופטוטי מופעל. מחקר שנערך לאחרונה הראה ש-F גורם לתאאפופטוזיסדרך מסלול FAS/FAS-L (Xu et al., 2011). במחקר זה, F הגדיל באופן משמעותי את ביטוי ה-mRNA והחלבון של FAS ו-FAS-L ב-כִּליָה. הרגולציה העליונה של רמות FAS ו-FAS-L מציעה שמסלולים אפופטוטיים הקשורים ל-FAS/FAS-L עשויים להיות מעורבים בהשראת Fאפופטוזיס. גיוס טרימר FAS/FAS-L של FADD מוביל למחשוף של Pro-Caspase 8 לייצור Caspase 8 פעיל, אשר בתורו מפעיל את Caspase 3 ואז מוביל לאפופטוזיס(Li et al., 2011; Xu et al., 2011). מחקר זה אימת ש-100 מ"ג/ליטר NaF הושרהאפופטוזיסבחולדהכליותדרך מסלול FAS/FAS-L. התוצאה החשובה ביותר היא שתוסף Ca בתזונה מחליש אתאפופטוזיסהשפעה מעוררת של F, המיוחסת לוויסות מטה של ​​הפעלת FAS/FAS-L והפעלה משנית של Caspases.

TNF הוא ציטוקין פליאוטרופי המשתתף במגוון רחב של תגובות תאי, כולל התמיינות, שגשוג, דלקת ומוות תאי. אות TNF מפעיל את שניהםאפופטוזיסומסלולים אנטי-אפופטוטיים. סוגים רבים של ספרות דיווחו כי TNF שולט בהשראת ליפופוליסכרידיםכִּליָהנזק ואקוטי הנגרמת על ידי ציספלטיןכִּליָהפגיעה (Lee et al., 2016; Li et al., 2018). TNF נקשר ל-TNF-R1, ה-DD שלו מגייס את TRADD, ואז TRADD מקיים אינטראקציה עם FADD, מה שמוביל להיווצרות ה- DISC (Kiraz et al., 2016; Sun et al., 2003). מחקרים גילו כי F יכול לגרום לכבד, נוירון וכִּליָהלֵיִקוֹצִיטאפופטוזיסדרך מסלול איתות TNF (Lu et al., 2017; Singh et al., 2017; Yan et al., 2016). בדומה לתוצאות של דיווחים אלה, הביטויים היחסיים של TNF, TNF-R1, TNF-R2 ו-TRADD בקבוצת F עלו משמעותית בניסוי זה. לעומת זאת, הביטוי של גנים אלה ירד באופן משמעותי לאחר האחוזסִידָןתוסף, המציע התערבות שלסִידָןבמסלול TNF.

TRAIL מעורב בהסדרה שלאפופטוזיס, ריבוי, תגובה דלקתית חיסונית וכו'. נכון לעכשיו, מאמינים ש-TRAIL קשור קשר הדוק להתרחשות ולפרוגנוזה שלכִּליָהמחלה (קנדידו, 2014). יותר ויותר ספרות אישרה ש-TRAIL מסדיר אתאפופטוזיסשֶׁלכִּליָהתאי אפיתל צינוריים בגלומרולונפריטיס הקשורים ל-HBV וכִּליָהאפופטוזיסב-Uromodulin הקשוריםכִּליָהמחלה (Johnson et al., 2017; Yang et al., 2018). יתר על כן, מחקר דיווח כי הביטוי של TRAIL השתנה בדרך כלל במהלך ההומאוסטזיס ושונותכִּליָהפציעות (Devarapu et al., 2017). TRAIL נצמד לקולטן המוות DR5 ומגייס את FADD דרך האינטראקציה של ה-DD, ולאחר מכן נקשר ל-pro-Caspase 8 דרך תחום אפקט המוות הקיים ב-FADD ליצירת DISC (Yuan et al., 2018). מחקר זה הראה שהביטוי של TRAIL ו-DR5 גדל באופן משמעותי בקבוצת F. לאחר השלמה עםסִידָן, הביטוי של TRAIL ו-DR5 עוכב. זה מוצעסִידָןמעכב את מסלול ה-TRAIL להפחתת ה-Fאפופטוזיס.

סיכום

חשיפה של 100 מ"ג/ליטר ל-NaF מופעלת בתיווך קולטן מוותאפופטוזיסמסלול (FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL) ולאחר מכן מושרהכִּליָהתָאאפופטוזיסבחולדות, גורםכִּליָההפרעות מטבוליות וכִּליָהאי ספיקה, וכתוצאה מכךכִּליָההגופים התנוונו ועווותים, הכִּליָהחלל הקפסולה התרחב, הכִּליָהצינורות יצרו גבס. עם זאת, תוספת של 1 אחוזסִידָןלתזונה ירד תכולת הפלואוריד בדם, והקל עוד יותר עלכִּליָההפרעה מטבולית וכִּליָהאי ספיקה דרך המסלול המתווך קולטן מוות, והפחיתה משמעותית אתכִּליָהפציעה (רכיב איור 6).

הפניות

המקור הוא על ידי Haojie Li, המכללה לרפואה וטרינרית, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, PR China וכו'.