ניתוח תמליל שלם כדי לחקור את המאפיינים האימונולוגיים הפגועים בחולים קשישים חולים קשים עם אלח דם

תַקצִיר

רקע כללי

אלח דם הוא סיבוך תכוף בחולים קשים, הוא הטרוגני מאוד וקשור לשיעורי תחלואה ותמותה גבוהים, במיוחד באוכלוסיית הקשישים. שימוש ברצף RNA (RNA-Seq) לניתוח מסלולים ביולוגיים נמצא בשימוש נרחב במחקרים גנטיים קליניים ומולקולריים, אך עדיין חסרים מחקרים בחולים קשישים עם אלח דם. לפיכך, חקרנו את המאפיינים הביולוגיים הרלוונטיים לתמותה ואת המאפיינים התעתיקים בחולים קשישים שאושפזו ביחידה לטיפול נמרץ (ICU) עבור אלח דם.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

שיטות

רשמנו 37 מטופלים קשישים עם אלח דם מיחידה לטיפול נמרץ בבית החולים הוותיקים הכלליים בטאיצ'ונג. ביום 1 וביום 8 נאספו נתונים קליניים ומעבדתיים, כמו גם דגימות דם, לצורך ניתוח RNA-Seq. זיהינו את התעתיק הדינמי והמסלולים המועשרים של גנים המובעים בצורה דיפרנציאלית בין יום 8 ליום 1 באמצעות ניתוח העשרה של DVID וניתוח העשרה של ערכת גנים. לאחר מכן, המגוון של רפרטואר תאי T נותח עם MiXCR.

תוצאות

בסך הכל, 37 חולים סבלו מאלח דם, והמגיבים והלא מגיבים קובצו באמצעות ניתוח רכיבים ראשיים. ציוני SOFA גבוהים יותר באופן מובהק ביום 7, ימי הנשמה ארוכים יותר, משכי שהייה נמרץ ותמותה בבית החולים נמצאו בקבוצת הלא מגיבים, מאשר בקבוצת המגיבים. ביום 8 בחולי טיפול נמרץ קשישים עם אלח דם, הוגדרו גנים הקשורים לחסינות מולדת ולדלקת, כגון ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 ו-PCSK9. הגנים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית (DEGs) הועשרו בוויסות של שעתוק, תגובה חיסונית אדפטיבית, ייצור אימונוגלובולינים, ויסות שלילי של שעתוק ותגובה חיסונית. יתרה מכך, היה מגוון גבוה יותר של קולטני תאי T ביום-8 בקבוצת המגיבים, מאשר ביום-1, מה שמצביע על כך שהחלמה מווסתת יותר מאלח דם בהשוואה למטופלים שאינם מגיבים .

סיכום

התמותה והשכיחות של אלח דם היו גבוהים בקרב קשישים. זיהינו מאפיינים ביולוגיים ומאפיינים טרנסקריפטומיים רלוונטיים לתמותה עם ניתוח נתיב תפקודי ו-MiXCR המבוסס על נתוני RNA-Seq; ומצא שקבוצת המגיבים העלתה את החסינות המולדת והגדילה את המגוון של תאי T; בהשוואה לקבוצת הלא מגיבים. ייתכן ש-RNA-Seq יוכל להציע מידע משלים נוסף לחיזוי מדויק ומוקדם של תוצאות הטיפול.

מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche

מילות מפתח

אלח דם, RNA-Seq, חולה נמרץ קשישים, גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי, קולטן לתאי T

מבוא

אלח דם היא תסמונת קלינית שעלולה לסכן חיים. הוא מיוצר על ידי תגובה מארח לא מסודרת לזיהום ומהווה איום בריאותי עולמי הטרוגני וקטלני ביותר, במיוחד באוכלוסייה המבוגרת [1, 2]. מחקרים קודמים מצאו שחולים קשישים נמצאים בסיכון גבוה יותר לאלח דם ובעלי חומרת מחלה גבוהה יותר מאלה באוכלוסייה הכללית [3]. מספר החולים הקשישים המאושפזים ביחידה לטיפול נמרץ (ICU) עקב אלח דם עלה בהתמדה בשני העשורים האחרונים עקב העלייה המתמדת במספר הקשישים [4]. יש לציין שלמרות עוצמת הטיפול הגבוהה, התמותה נותרת גבוהה בחולים קשישים המאושפזים בטיפול נמרץ, אך עדיין חסרים מחקרים העוסקים במסלולים הביולוגיים הרלוונטיים לתגובת הטיפול בחולים קשישים עם אלח דם [5]. מערכת החיסון של קשישים עוברת שינויים ביולוגיים רבים ככל שהם מזדקנים, אשר משפיעים על התגובה החיסונית של קשישים, וכתוצאה מכך סבירות גבוהה יותר למצבים מדוכאי חיסון [6]. חסינות אדפטיבית נפגעת נחשבת למאפיין מכריע של חיסוני חיסוני בקשישים [7, 8], אך מאפיינים טרנסקריפטומיים במהלך אלח דם בקשישים נותרו בלתי נחקרו. שינויים אלו קובעים לא רק את הרגישות לזיהומים חיידקיים אלא גם את התקדמות אלח דם ותוצאות קליניות [6]. לכן, חיוני לחקור את התגובות האימונולוגיות השונות ואת המאפיינים הביולוגיים הרלוונטיים לתמותה בחולים קשישים המאושפזים בטיפול נמרץ [9, 10].

אלח דם הוא הטרוגני ביותר ומאופיין בתגובות אימונולוגיות מורכבות ודינמיות, הכוללות תגובה דלקתית מוגזמת ראשונית ואחריה חסינות אדפטיבית לא מווסתת/מותשת [11]. מספר מחקרים הראו שינוי בחסינות הסתגלותית לאחר אלח דם; נראה כי מה שנקרא אימונו-שיתוק הוא אחד המאפיינים האימונולוגיים המרכזיים המובילים לחסינות מתמשכת בפגיעה בחולים עם אלח דם [12]. RNA-Seq שימש במחקרים קודמים כדי למצוא את החתימה הטרנסקריפטומית, או ה"סאבאנדוטיפ", בחולים עם אלח דם. התת-גנוטיפים הקשורים לאלח דם הם שיפור מוקדם של תפקוד לקוי של איברים לאחר אלח דם, חסינות אדפטיבית מופחתת בקרב חולים עם דכאות חיסונית והיענות לסטרואידים בחולי הלם ספטי [13, 14]. תוך שימוש בנתוני RNA-Seq, פותחו לאחרונה כלים אנליטיים, כגון MiXCR, כדי לכמת את המגוון של קולטני תאי T (TCRs) [15, 16]. במחקר זה, חקרנו את התעתיק הדינמי של חולי ספיגה על ידי בחינת דגימות זוגיות מיום 1 ויום 8 ומצאנו כי חולי ספיגה בעלי תקלות חיסונית הפחיתו את מגוון תאי ה-T ופגעו בתפקוד תאי ה-T. מחקר זה נועד לחקור מאפיינים ביולוגיים ומאפיינים טרנסקריפטומיים רלוונטיים לתמותה, כדי להשיג הבנה טובה יותר של האיתות הקשור לחסינות אדפטיבית בחולים קשישים שאושפזו ליחידה לטיפול נמרץ בגלל אלח דם.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

חומרים ושיטות לימוד עיצוב ואיסוף נתונים

המחקר אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של TCVGH (IRB מס' CE20069B), והתקבלה הסכמה מדעת מכל המשתתפים. 37 חולי טיפול נמרץ קשישים גויסו מבית החולים הכללי ותיקים בטאיצ'ונג (TCVGH) מדצמבר 2018 עד ינואר 2022. בזמן ההרשמה נאסף מידע דמוגרפי, ודגימות דם בסיסיות נלקחו ביום 1 וביום 8. כדי לשמר את transcriptome, שני מנות דם של 4 מ"ל נאספו במכונים סטריליים של EDTA והועברו מיד לבקבוקונים נטולי RNAse המכילים 10.5 מ"ל RNAlater® (TermoFisher, Waltham, MA, ארה"ב).

מיצוי RNA ורצף

במחקר זה, הפקנו RNA עם PAXgene Blood RNA Kit, ומספר שלמות ה-RNA הממוצע (RIN) היה 8.31±0.58. הוראות היצרן בוצעו בעת בניית הספרייה, ו-1,{5}} ng של RNA מקוטע שימש בניסויים הבאים. 150-ב-p paired end reads שימשו עבור RNA-Seq בפלטפורמת NovaSeq (Illumina, Inc., San Diego, CA, United States), ולכל דגימה היו לפחות 50-60 מיליון קריאות. מערך הנתונים של RNA-seq הופקד במרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (NCBI) Omnibus לביטוי גנים (GEO) תחת מספר ההצטרפות GSE216902. מערך הנתונים שימש עבור פרופורציות תאים וניתוח נתיב.

ציון הערכה של אי ספיקת איברים עוקבים (SOFA).

ציון אי-ספיקת איברים עוקבים (SOFA) הוא ערך מספרי של אי-ספיקת איברים הקשורים לאלח דם, כלומר, הוא מכמת את המספר והחומרה של איברים שנכשלו. כל ציון נע בין 0 ל-4, כאשר ציון גבוה יותר מצביע על החמרת תפקוד איברים [17]. השתמשנו בשינוי הדינמי בציוני SOFA כדי להגדיר מגיבים (R) ולא מגיבים (NR), ומשתתף סווג כ-NR אם הירידה בציון SOFA מיום 1 ליום 7 הייתה פחות מ-2 [13, 18, 19] .

ניתוח ביואינפורמטיקה של נתוני RNA-Seq 

הרצף היה באיכות גבוהה, נעשה שימוש בציוני Phred של 30, ו-HISAT2 מיפה את קריאות הרצף לגנום הייחוס (GRCh38/hg38) [20]. חבילת R DEseq2 [21] שימשה לזיהוי הגנים המובעים בצורה דיפרנציאלית (DEGs), וספירות הקריאה חושבו באמצעות featureCounts [22]. קצב המיפוי הממוצע וספירת הקריאה היו 87.6±4.8% ו-65.5±17.6 מיליון קריאה, בהתאמה. חבילת הפרופילים [23] R נוצלה לביצוע העשרה תפקודית וניתוח מסלולים על בסיס הגנומים (KEGG, https://www.genome.jp/kegg/) ו- Gene Ontology (GO, http://geneontology.org /) מסדי נתונים. ערך p מתוקן של פחות מ-0.05 נחשב כמועשר משמעותית. כל הגנים המובעים באופן דיפרנציאלי סומנו באופן פונקציונלי באמצעות Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [24], ונוצרה מפת העשרה מדומה Cytoscape 3.9.0 [25]. דמיינו תוצאות GSEA על ידי שימוש במפת העשרה, המארגנת מערכי גנים לרשת דמיון. הצומת, הקישור וצבע הצומת מייצגים את מערך הגנים, את החפיפה של הגנים האיברים וציון ההעשרה [24], בהתאמה.

מגוון ניתוחי TCR

נתוני RNA-Seq שימשו ב-MiXCR v3.0.13 [15, 16] כדי לכמת את הקלונוטיפים של חולי אלח דם בהתבסס על פרוטוקול שדווח בעבר [14]. תוכנת VDJTools v 1.2.1 [26] שימשה כדי לחשב את הספירות של אזור הקובע המשלימות-3 (CDR3) וגיוון הדגימות בעקבות רכישת הקלונוטיפים הכמותיים.

ניתוח סטטיסטי

השתמשנו במבחן קולמוגורוב-סמירנוב כדי לבדוק את התקינות ומצאנו שהתפלגות של מספר משתנים, כולל יום הנשמה, משך השהייה בטיפול נמרץ ומשך השהייה בבית החולים, הייתה מוטה שמאלה. כדי להציג את הנתונים בפורמט המאוחד, הצגנו משתנים קטגוריים תדירויות (אחוזים) עבור משתנים קטגוריים ומשתנים רציפים כחציון (טווח בין-רבעוני, IQR). ההבדלים בין שתי הקבוצות נותחו באמצעות מבחן Mann–Witney U עבור משתנים רציפים והמבחן המדויק של פישר עבור משתנים קטגוריים. רמת המובהקות נקבעה ל-0.05, וניתוחים סטטיסטיים היו דו-צדדיים. גרסה R 4.1.0 שימשה לביצוע כל ניתוח הנתונים.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

תוצאות מאפייני המטופל וציוני SOFA

במחקר זה, רשמנו 37 חולים קשישים עם אלח דם [גיל חציוני 83 שנים (IQR: 79-87 שנים)] (טבלה 1). עם ניתוח הרכיבים העיקריים, ראינו שהפער בין היום-1 ליום-8 היה טוב יותר בחולים המגיבים (קבוצת המגיבים, R) מאשר בחולים שאינם מגיבים (קבוצת שאינם מגיבים, NR), המצביע על התאוששות מווסתת מאלח דם בקבוצה החיסונית (קובץ נוסף 1: איור S1). בסך הכל, בין 37 החולים, היו 23 חולים מגיבים (קבוצת מגיבים, R) עם גיל חציוני 82 שנים (IQR: 79.5–86.5 שנים) ו-14 חולים שאינם מגיבים (קבוצת שאינם מגיבים, NR) עם גיל חציוני 84 שנים (IQR: 79–88 שנים). טבלה 1 מציגה את המאפיינים הבסיסיים של קבוצת המחקר. אלבומין גבוה יותר (חציון 3.3 מ"ג/ד"ל, IQR: 3-3.7 מ"ג/ד"ל) וחלבון C-reactive נמוך יותר (חציון 9.16 מ"ג/ד"ל, IQR: 3.9-17.5 מ"ג/ד"ל) נצפו בטיפול מאשר בעמיתיהם. בהשוואה לקבוצת המגיבים, לקבוצה הלא מגיבה היו ציוני SOFA גבוהים יותר באופן מובהק ביום 7, ימי הנשמה ארוכים יותר, משכי שהייה נמרץ ארוכים יותר ותמותה גבוהה יותר בבית החולים.

תעתיק דינמי מובהק בחולי טיפול נמרץ קשישים עם אלח דם

כפי שמודגם באיור 1A, באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים על 500 הגנים המשתנים המובילים מכל הדגימות, גילינו שלחולי אלח דם קשישים ביחידה לטיפול נמרץ היו תעתיקים שונים באופן משמעותי ביום 1 וביום 8. הגנים לביטוי דיפרנציאלי ( DEGs) זוהו לאחר מכן על ידי השוואת פרופילי ביטוי גנים בין יום 8 ליום 1 בחולי טיפול נמרץ קשישים תוך שימוש בקריטריונים של p<0.01 and log fold change>0.25 או<− 0.25. Tree DEGs (two upregulated and one downregulated gene) were found in the R group, while the NR group only had 11 DEGs (five upregulated and six downregulated genes). We found that in elderly sepsis patients in the ICU, the top upregulated genes were innate immunity- and inflammation-relevant genes, namely, ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33, and PCSK9, which bind to low-density lipoprotein receptors (LDLRs), leading to LDLR degradation and increasing LDL cholesterol levels (Fig. 1B). 

ניתוח העשרה של DAVID של התעתיק הדינמי

כדי להדגים את השינוי של מסלולים ביולוגיים בחולי טיפול נמרץ קשישים בין יום 8 ליום 1, הדגמנו את המסלול המועשר על ידי שימוש בשרת DAVID v6.8 המקוון. כפי שמוצג באיור 2, חלקות בועות של Gene Ontology (GO) נבנו עבור התהליכים הביולוגיים של 20 הדרגות העליונות ממערך הנתונים. מצאנו כי ה-DEGs מחולי טיפול נמרץ קשישים עם אלח דם הועשרו בוויסות של שעתוק, תגובה חיסונית אדפטיבית, ייצור אימונוגלובולינים, ויסות שלילי של שעתוק ותגובה חיסונית. ניתוח GO פונקציונלי של DAVID מוצג באיור 3. בהשוואה לבקרות, הערות פונקציונליות של חלבונים המקודדים על ידי גנים ב-DEG הראו באופן משמעותי (P<0.05) increased or decreased enrichment. These annotations were categorized according to biological processes, cellular components, and molecular functions. There were significant differences between DEG-encoded proteins involved in the regulation of transcription, the immune response, protein phosphorylation, and Ras protein signal transduction at the level of biological processes (Fig. 3), whereas cellular component analysis revealed significant differences between the T-cell receptor complex, cytosol nucleoplasm, and nucleus (Fig. 3). Significant differences were found in the enrichment of encoded proteins associated with protein binding, metal ion binding, translation factor activity, or transcriptional activator activity according to molecular function analysis (Fig. 3). Ten, we used the Cytoscape ClueGO plugin to investigate the functional enrichment of the DEGs in the dataset to further refine the biological process from the analysis of DAVID-GO terms [27]. Additionally, the REACTOME pathway analysis from ClueGO revealed that cytokine signaling in the immune system, adaptive immune system, sensory perception, innate immune system, and immunoregulatory interactions between lymphoid and non-lymphoid cells were significantly enriched in many DEGs.

טבלה 1 מאפיינים של חולי טיפול נמרץ קשישים עם אלח דם

איור 1 ניתוח רכיבים עיקריים A וחלקת הר געש B של התעתיק בין יום-1 ליום-8

איור 2 ניתוחי העשרה פונקציונליים ומסלולים של גנים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית עם DAVID על ידי עלילת בועות

איור 3 ניתוח גני אונטולוגיה תפקודית של DAVID (GO) של תהליך ביולוגי (BP), רכיב תאי (CC) ותפקוד מולקולרי (MF)

ניתוח TCR עם MiXCR בחולי טיפול נמרץ קשישים עם אלח דם

בהתחשב בכך שקבוצות R ו-NR התאוששו מאלח דם דרך מסלול איתות ספציפי של קולטן תאי T, תוך שימוש במספר ה-CDR3, D50 והאינדקס ההפוך של סימפסון, השתמשנו ב-MiXCR כדי לקבוע את המגוון של קולטן תאי T (TCR) ) (איור 5A–C). ביום 8, מדד ה-CDR3, D50 וה-Simpson ההפוך של קבוצת R היו גבוהים משמעותית מאשר ביום 1. יתרה מכך, מדד D50 היה גבוה משמעותית בקבוצת R מאשר בקבוצת NR ביום 8 (איור 5B). לבסוף, הערכנו את הגיוון של CDR3 הייחודי באמצעות אינדקס סימפסון הפוך, המשקף קלונוטיפים בשפע. ראינו דפוס דומה, עם גיוון מוגבר משמעותית של TCR בקבוצת R, במיוחד ביום 8 (איור 5C).

דִיוּן

מחקר זה מדגים שמאפיינים ביולוגיים רלוונטיים לתמותה ואיתות הקשורים לחסינות אדפטיבית תוך שימוש ב-transcriptomics, בהשוואת הבדלים בין יום 1 ליום 8 (קובץ נוסף 1: איור S1), יכולים לזהות באופן מהימן חולי טיפול נמרץ קשישים עם אלח דם ולהבדיל שאינם מגיבים לחולים מגיבים. . מחקרים קודמים שחקרו סמנים ביולוגיים של אלח דם היו תלויים בבחירה של תפקודים ומסלולים ביולוגיים ידועים באמצעות שיטות מבוססות ידע [28], ורק מספר קטן של מחקרים התמקדו ישירות בגנים שתפקודיהם לא תוארו במלואם [29]. במחקר זה, אימצנו RNA-Seq כדי לזהות מאפיינים ביולוגיים ואימונולוגיים בחולי טיפול נמרץ קשישים עם אלח דם באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים, ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי ו-MiXCR. חסינות מולדת ודלקת, כגון ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 ו-PCSK9, הווסרו בחולי טיפול נמרץ קשישים עם אלח דם. ZDHHC19 הוא פלמיטוילטרנספראז ומתווך פלמיטוילציה של RRAS, מה שמוביל לעלייה בכדאיות התא [30]. ניתוח ביטוי גנים רחב הגנום נקשר לביטוי מוגבר בחולי טיפול נמרץ עם אלח דם שנגרם על ידי דלקת הצפק הצואה [31]. HDC (Histidine decarboxylase, HDC) הוא חבר במשפחת דקרבוקסילאז מקבוצה II ויוצר הומודימר שמשתמש בפוספט פירידוקסלי כדי להמיר L-histidine להיסטמין. מחקר בבעלי חיים שנערך על ידי Hattori et al. [32] השתמשו בעכברי HDC גנים נוק-אאוט (HDC-/-). לאחר השראת אלח דם על ידי קשירת cecal וניקור (CLP), עכברי HDC נוק-אאוט הפגינו רמות מופחתות של היסטמין בפלזמה, והעלייה ברמות TNF, IL-1b, IL-6 ו-MCP1 באלח דם נחלשה כאשר היה חוסר בפלזמה. היסטמין [32]. ייצור ציטוקינים לא תקין שנגרם על ידי אלח דם ופגיעה באיברים מרובים (ריאות, כבד וכליות) הופחתו באופן משמעותי בעכברי HDC-knockout בהשוואה לעכברי WT C57BL/6 J. עיכוב של ביטוי HDC מנע פגיעה ברקמות דלקתיות ושיפר את ההישרדות בעכברים עם אלח דם המושרה על ידי CLP [32]. בנוסף, היסטמין יכול לקדם את הייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים, המווסתים על ידי גורם השעתוק NF-KB. תחת אלח דם המושרה על ידי CLP, לעכברי HDC נוק-אאוט הייתה ירידה משמעותית בפעילות של NF-KB בגרעין בהשוואה לעכברי WT [32]. תוצאה זו מצביעה על כך שהיסטמין גורם לסינתזה של ציטוקינים פרו-דלקתיים וכימוקינים על ידי הגברת פעילות NF-kB.

מחקרים אחרונים הוכיחו כי ALOX15 ו-FCER1A הם חיוניים לפתוגנזה של אלח דם חיידקי [33, 34]. ALOX15, אנזים פרוקסידלי שומנים, הוא גן פונקציונלי ליפוקסיגנאז (LOX) [35], המחמצן חומצות שומן רב בלתי רוויות ונקשר למגוון תהליכים פיזיולוגיים כמו גם לפתוגנזה של מחלות ניווניות, דלקתיות והיפר פרוליפרטיביות [35, 36]. ALOX15 והמטבוליטים שלו מעורבים בפתופיזיולוגיה של מחלות דלקתיות מרובות, כגון אלח דם, דלקת פרקים, אסטמה, סיסטיק פיברוזיס וטרשת עורקים [36]. FCER1A (שבר Fc של קולטן IgE Ia, FCER1A), חלבון הקשור למערכת החיסון, הוא הגורם ההתחלתי של תגובות אלרגיות וממלא תפקיד בדלקת אלרגית [37, 38]. FCER1A היה מעורב בוויסות תהליכים מטבוליים וויסות חיסוני במחקרים קודמים. [38, 39]. בנוסף, יש סיכוי גבוה יותר להתרחש אסתמה כאשר FCER1B וגנים דלקתיים אחרים הקשורים לאימונוגלובולינים מקיימים אינטראקציה [39]. יתר על כן, PCSK9 (סוג פרופרוטאין convertase subtilisin/kexin- 9, PCSK9) זוהה כמווסת מרכזי של רמות LDL-C בפלזמה על ידי יכולתו להיקשר לקולטן LDL (LDLR) ולעורר אותו לפירוק ליזוזומלי בתאים , המוביל לפירוק LDLR ולהעלאת רמות הכולסטרול LDL [40].

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

במחקר הנוכחי, השתמשנו בהעשרה ב-KEGG וב-GO כדי לקבוע את ההערה הפונקציונלית של גנים אלה על מנת לחקור את המעורבות של DEGs לידי ביטוי מחולי טיפול נמרץ קשישים עם אלח דם ב-BP, MF ומסלולים מולקולריים של FH. DEGs אלה הועשרו בעיקר בוויסות של שעתוק, תגובה חיסונית אדפטיבית, ייצור אימונוגלובולינים, ויסות שלילי של שעתוק ותגובה חיסונית (איור 2). בנינו רשת מסודרת פונקציונלית של מונחי GO/מסלול באמצעות תוסף Cytoscape ClueGO/CluePedia, פרשנות משופרת למונחים ביולוגיים. תוסף זה גם עזר לנו לדמיין את הרשתות המקובצות באופן פונקציונלי מצבירי גנים גדולים יותר [41]. השתמשנו בתוסף ClueGO כדי לזהות את המסלולים המולקולריים המווסתים באופן דיפרנציאלי ואת אינטראקציות הגנים המשמעותיות שלהם בהתבסס על ערכי p וסטטיסטיקות קאפה כדי לקבל תמונה מקיפה של DEGs המעורבים באלח דם. יתר על כן, ה-DEGs הועשרו באופן משמעותי בפעילות שעתוק וקשירת חלבון כאשר MF מ-GO נותח (איור 3). תוצאות אלו מצביעות על כך שניתוחי העשרה תפקודית מתייחסים במיוחד למסלולי איתות של תאי חסינות הקשורים לתגובה תאית למוטיבים פתוגניים או ציטוקינים. סביר להניח שאלו תוצאות צפויות עבור חולי ספיגה וזקוקים לחקירה נוספת כדי להבהיר את המסלולים בספסיס. בהתבסס על סטטיסטיקות קאפה וערכי p, מצאנו שבין התהליכים הביולוגיים והמסלולים המולקולריים המועשרים, איתות ציטוקינים במערכת החיסון, מערכת החיסון האדפטיבית, תפיסה חושית, מערכת החיסון המולדת ואינטראקציות אימונו-רגולטוריות בין לימפואיד ללא לימפואיד. תאים לא היו בוויסות והיו קשורים באופן משמעותי להתקדמות של אלח דם בחולי טיפול נמרץ קשישים עם אלח דם (איור 4).

בנוסף, הראינו את המגוון של תאי T בחולים קשישים עם אלח דם והשתמשנו ב-MiXCR כדי לנתח את הרצף הגולמי של RNA-Seq כדי לקבוע קלונוטיפים של TCR, מה שאיפשר לנו לבחון בו זמנית את המגוון של TCRs ואת כל התעתיק [ 15]. RNA-Seq ו-MiXCR שימשו במחקר זה כדי לזהות איתות של תאי T והתוצאות גילו שמגוון ה-TCR של קבוצת R ביום-8 היה גדול מזה ביום-1 (איור 5) . בהשוואה לקבוצת NR, לקבוצת R היו ערכי אינדקס CDR3, D50 והפוך סימפסון ביום-8 גבוהים משמעותית מאשר ביום-1. המשמעות של המגוון המושרה של TCRs בחולי טיפול נמרץ קשישים עם אלח דם מודגשת גם על ידי ראיות אלה, המדגימות את הכדאיות של ניצול נתוני RNA-Seq ו-MiXCR כדי לתת מענה למגוון של TCRs בחולים עם אלח דם. למחקר שלנו יש כמה מגבלות שצריך לשים לב אליהן. ראשית, קבוצת החולים שנחקרה במחקר זה הייתה קטנה. לפיכך, חקירות של אוכלוסיות מגוונות עם גודל מדגם גדול יותר יסייעו באישור הנתונים שלנו. שנית, השתמשנו ב-RNA-Seq בתפזורת במחקר זה, וניסויים עתידיים של sc-RNA-Seq וניסויים תפקודיים מוצדקים לאימות ברמה התאית. יתר על כן, ניתן להשתמש בגישת ההגברה המהירה 5' של קצוות cDNA (5'-RACE) כדי לחקור את רפרטואר תאי ה-T, מה שעשוי לאשש עוד יותר את הממצאים שלנו. שלישית, הערכנו את הפונקציות הביולוגיות והמולקולריות של תגובות דלקתיות בחולים עם אלח דם באמצעות נתוני RNA-Seq. נדרשים מחקרים תפקודיים נוספים כדי להבהיר את התפקידים באלח דם.

איור 4 העשרה על ידי אונטולוגיה של גנים (GO) הוצגה באמצעות תוסף ClueGO/CluePedia מ-Cytoscape

איור 5 מגוון הקולטן של תאי T ביום-1 וביום-8. ספירות (A), CDR3 ייחודי (B), D50 ו-(C) של אינדקס סימפסון הפוך. *<0.05, **<0.005

מסקנות

השכיחות והתמותה של אלח דם הן גבוהות בקרב אנשים קשישים. המחקר שלנו רשם קשישים חולים במחלה קשה עם אלח דם וזיהה מאפיינים ביולוגיים ומאפיינים טרנסקריפטומיים רלוונטיים לתמותה עם מסלול תפקודי וניתוח MiXCR המבוססים על נתוני RNA-Seq. בהשוואה ליום 1, מצאנו חסינות מולדת מווסתת וגיוון מוגבר של תאי T בקרב חולים המגיבים ביום 8, מה שמצביע על כך שלחולים המגיבים הייתה החלמה מווסתת יותר מאלח דם בהשוואה לחולים שאינם מגיבים. כדי ליישם חיזוי מדויק ומוקדם, שימוש במבחן של RNA-Seq יכול להציע מידע משלים נוסף לחיזוי מוקדם של תוצאות הטיפול.

הפניות

1. סימור CW, Kennedy JN, Wang S, Chang CH, Elliot CF, Xu Z, et al. חופשת דרעי, אימות והשלכות טיפול אפשריות של פנוטיפים קליניים חדשים לאלח דם. JAMA. 2019;321(20):2003–17.

2. Sweeney TE, Azad TD, Donato M, Haynes WA, Perumal TM, Henao R, et al. ניתוח ללא פיקוח של transcriptomics באלח דם חיידקי על פני מערכי נתונים מרובים חושף שלושה אשכולות חזקים. Crit Care Med. 2018;46(6):915–25.

3. de Lange DW, Brinkman S, Flaatten H, Boumendil A, Morandi A, Andersen FH, et al. ציון פרוגנוסטי מצטבר המנבא תמותה בחולים מעל גיל 80 שאושפזו בטיפול נמרץ. J Am Geriatr Soc. 2019;67(6):1263–7.

4. Flaatten H, de Lange DW, Artigas A, Bin D, Moreno R, Christensen S, et al. מצב המחקר ברפואה טיפול נמרץ ואג'נדה עתידית לחולים מבוגרים מאוד בטיפול נמרץ. טיפול נמרץ מד. 2017;43(9):1319–28.

5. Guidet B, de Lange DW, Boumendil A, Leaver S, Watson X, Boulanger C, et al. התרומה של שבריריות, קוגניציה, פעילות חיי היומיום ומחלות נלוות על תוצאה בחולים מאושפזים חריפים מעל 80 שנה ביחידות נמרץ אירופאיות: מחקר VIP2. טיפול נמרץ מד. 2020;46(1):57–69.

6. Stahl EC, Brown BN. אסטרטגיות טיפול תאי למאבק במדעי האימונוגנים. אורגנוגנזה. 2015;11(4):159–72.

7. Martin S, Perez A, Aldecoa C. אלח דם ואימונוזנסציה בחולה מבוגר: סקירה. פרונט מד (לוזן). 2017. https://doi.org/10. 3389/fmed.2017.00020.

8. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D, et al. חסינות אדפטיבית ספציפית לאנטיגן ל-SARS-CoV-2 ב-COVID-19 חריפה וקשרים עם גיל וחומרת המחלה. תָא. 2020;183(4):996-1012 e1019.

9. Leblanc G, Boumendil A, Guidet B. עשרה דברים שכדאי לדעת על מטופלים קשישים במחלות קשות. טיפול נמרץ מד. 2017;43(2):217–9.

10. Guidet B, Vallet H, Boddaert J, de Lange DW, Morandi A, Leblanc G, et al. טיפול בחולים קשים מעל גיל 80: סקירה נרטיבית. אן טיפול נמרץ. 2018;8(1):114.

11. בריידי J, Horie S, Lafey JG. תפקיד התגובה החיסונית ההסתגלותית באלח דם. טיפול נמרץ מד Exp. 2020;8(1):20.

12. מרטין MD, סמנכ"ל Badovinac, Grifth TS. תגובות תאי T CD4 ומצב אימונו-שיתוק המושרה באלח דם. אימונול קדמי. 2020. https://doi.org/10. 3389/fmmu.2020.01364.

13. Barcella M, Bollen Pinto B, Braga D, D'Avila F, Tagliaferri F, Cazalis MA, et al. זיהוי פרופיל טרנסקריפטום הקשור לשיפור תפקוד האיברים בחולי הלם ספטי לאחר טיפול תומך מוקדם. Crit Care. 2018;22(1):312.

14. Cheng PL, Chen HH, Jiang YH, Hsiao TH, Wang CY, Wu CL, et al. שימוש ב-RNA-Seq כדי לחקור מאפיינים של חילוף חומרים חיסוני בחולים מדוכאי חיסון עם אלח דם. פרונט מד (לוזן). 2021. https://doi. org/10.3389/fmed.2021.747263.

15. Bolotin DA, Poslavsky S, Mitrophanov I, Shugay M, Mamedov IZ, Putint-seva EV, et al. MiXCR: תוכנה ליצירת פרופיל חסינות אדפטיבי מקיף. שיטות נאט. 2015;12(5):380–1.

16. Bolotin DA, Poslavsky S, Davydov AN, Frenkel FE, Fanchi L, Zolotareva OI, et al. פרופיל רפרטואר של קולטן אנטיגן מנתוני RNA-seq. Nat Biotechnol. 2017;35(10):908–11.

17. Vincent JL, de Mendonca A, Cantraine F, Moreno R, Takala J, Suter PM, et al. שימוש בציון SOFA להערכת השכיחות של אי תפקוד/כשל איברים ביחידות לטיפול נמרץ: תוצאות של מחקר פרוספקטיבי רב-מרכזי קבוצת עבודה בנושא "בעיות הקשורות לאלח דם" של האגודה האירופית לרפואה נמרצת. Crit Care Med. 1998;26(11):1793–800.

18. Garcia-Gigorro R, Saez-de la Fuente I, Marin Mateos H, Andres-Esteban EM, Sanchez-Izquierdo JA, Montejo-Gonzalez JC. תועלת של ציוני SOFA ו-Delta-SOFA לניבוי תוצאות בחולים קשים מהמיון. Eur J Emerg Med. 2018;25(6):387–93.

19. ג'ונס AE, Trzeciak S, Kline JA. ציון הערכת אי-ספיקת איברים רציף לניבוי תוצאות בחולים עם אלח דם חמור ועדויות להיפופרפוזיה בזמן הצגת המיון. Crit Care Med. 2009;37(5):1649–54.

20. Kim D, Langmead B, Salzberg SL. HISAT: מיישר חיבור מהיר עם דרישות זיכרון נמוכות. שיטות נאט. 2015;12(4):357–60.

21. Anders S, Huber W. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי לנתוני ספירת רצף. גנום ביול. 2010;11(10):R106.

22. Liao Y, Smyth GK, Shi W. FeatureCounts: תוכנית יעילה לשימוש כללי להקצאת קריאות רצף לתכונות גנומיות. ביואינפורמט ics. 2014;30(7):923–30.

23. Raudvere U, Kolberg L, Kuzmin I, Arak T, Adler P, Peterson H, et al. ז: Profiler: שרת אינטרנט לניתוח העשרה תפקודית והמרות של רשימות גנים (עדכון 2019). Nucleic Acids Res. 2019;47(W1):W191–8.

24. Merico D, Isserlin R, Stueker O, Emili A, Bader GD. מפת העשרה: שיטה מבוססת רשת להדמיית העשרה של מערכי גנים ואינטרפרציה. PLoS ONE. 2010;5(11):e13984.

25. שאנון P, Markiel A, Ozier O, Baliga NS, Wang JT, Ramage D, et al. Cytoscape: סביבת תוכנה למודלים משולבים של רשתות אינטראקציה ביו-מולקולרית. Genome Res. 2003;13(11):2498–504.

26. אנדרסן א.ס. חיזוי ועיצוב של מבני DNA ו-RNA. N Bio-Technol. 2010;27(3):184–93.

27. Le Gall JR, Lemeshow S, Saulnier F. ציון פיזיולוגיה חריפה מופשטת חדשה (SAPS II) המבוססת על מחקר רב-מרכזי אירופי/צפון אמריקאי. JAMA. 1993;270(24):2957–63.

28. Sutherland A, Thomas M, Brandon RA, Brandon RB, Lipman J, Tang B, et al. פיתוח ואימות של בדיקת אבחון חדשנית לסמן ביולוגי מולקולרי לגילוי מוקדם של אלח דם. Crit Care. 2011;15(3):R149.

29. Lukaszewski RA, Jones HE, Gersuk VH, Russell P, Simpson A, Brealey D, et al. אבחון פרה-סימפטומטי של זיהום לאחר ניתוח ואלח דם באמצעות חתימות ביטוי גנים. טיפול נמרץ מד. 2022. https://doi. org/10.1007/s00134-022-06769-z.

30. Niu J, Sun Y, Chen B, Zheng B, Jarugumilli GK, Walker SR, et al. חומצות שומן ו-ZDHHC19 מוגבר סרטן מקדמים הפעלת STAT3 באמצעות S-palmitoylation. טֶבַע. 2019;573(7772):139–43.

31. Burnham KL, Davenport EE, Radhakrishnan J, Humburg P, Gordon AC, Hutton P, et al. היבטים משותפים ומובחנים של התגובה הטרנסקריפטומית של אלח דם לדלקת צפק צואה ודלקת ריאות. Am J Respir Crit Care Med. 2017;196(3):328–39.

32. Hattori M, Yamazaki M, Ohashi W, Tanaka S, Hattori K, Todoroki K, et al. התפקיד הקריטי של היסטמין אנדוגני בקידום פגיעה ברקמת איבר קצה באלח דם. טיפול נמרץ מד Exp. 2016;4(1):36.

33. Reyes M, Filbin MR, Bhattacharyya RP, Billman K, Eisenhaure T, Hung DT, et al. חתימה של תא חיסון של אלח דם חיידקי. נאט מד. 2020;26(3):333–40.

34. Tang-Huau TL, Gueguen P, Goudot C, Durand M, Bohec M, Baulande S, et al. תאים דנדריטים ומקרופאגים שנוצרו ב-vivo של בני אדם מצליבים אנטיגנים דרך מסלול ואקוולרי. נאט קומון. 2018;9(1):2570.

35. Ivanov I, Kuhn H, Heydeck D. ביולוגיה מבנית ותפקודית של חומצה ארכידונית 15-lipoxygenase-1 (ALOX15). גֵן. 2015;573(1):1–32.

36. Singh NK, Rao GN. תפקיד מתפתח של 12/15-Lipoxygenase (ALOX15) בפתולוגיות אנושיות. Prog Lipid Res. 2019;73:28–45.

37. Baioumy SA, Esawy MM, Shabana MA. הערכה של FCepsilonRIa במחזור בחולי אורטיקריה ספונטנית כרונית והקשר שלה עם משתנים קליניים ואימונולוגיים. אימונוביולוגיה. 2018;223(12):807–11.

38. Liao EC, Chang CY, Hsieh CW, Yu SJ, Yin SC, Tsai JJ. מחקר פיילוט חקרני של סמנים גנטיים למחלות אלרגיות בתיווך IgE עם ביטויים של FcepsilonR1alpha ו-Cepsilon. Int J Mol Sci. 2015;16(5):9504–19.

39. Hua L, Zuo XB, Bao YX, Liu QH, Li JY, Lv J, et al. אינטראקציה של ארבעה מוקדים בין IL13, IL4, FCER1B ו-ADRB2 לאסטמה בילדי האן סינים. רופא ילדים פולמונול. 2016;51(4):364–71.

40. Kosenko T, Golder M, Leblond G, Weng W, Lagace TA. ליפו-חלבון בצפיפות נמוכה נקשר לסוג פרופרוטאין convertase subtilisin/kexin-9 (PCSK9) בפלזמה אנושית ומעכב פירוק קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה של PCSK9-מתווכת. J Biol Chem. 2013;288(12):8279–88.

41. Bindea G, Mlecnik B, Hackl H, Charoentong P, Tosolini M, Kirilovsky A, et al. ClueGO: תוסף Cytoscape לפענוח אונטולוגיה של גנים מקובצים פונקציונלית ורשתות הערות למסלולים. ביואינפורמטיקה. 2009;25(8):1091–3.