ilבחר
הבית / יֶדַע / תוכן

יֶדַע

ננוציטוקין מבוסס-12-IL מחזק בבטחה חסינות אנטי-סרטנית באמצעות שליטה מרחבית-זמנית של דלקת כדי למגר גידולי קור מתקדמים

Dec 08, 2023

טיפול בגידולים קרים מבחינה אימונולוגית הוא אתגר מרכזי עבור מעכבי נקודת ביקורת חיסונית (ICI). Interleukin 12 (IL-12) יכול להמריץ ICIs נגד גידולים קרים על ידי ביסוס חסינות חזקה נגד גידולים. עם זאת, הרעילות והאינדוקציה הסיסטמית של אותות מדכאים חיסוניים מונעים את התרגום. כאן, פעילות IL-12 נשלטת מרחבית-זמנית להגברת היעילות בבטחה ללא גירוי של תגובות חיסוניות מפריעות על ידי יצירת ננו ציטוקין שנשאר לא פעיל ב-pH פיזיולוגי אך משחרר את מלוא פעילותו ב-pH של גידול חומצי. הננו ציטוקין המבוסס על IL-12- (Nano-IL-12) מצטבר ומשחרר IL-12 ברקמות הגידול, מעורר דלקת אנטי-גידולית מקומית, תוך מניעת תגובה חיסונית מערכתית, תגובות חיסוניות נגדיות, ו רעילות שליליות גם לאחר מתן תוך ורידי חוזר. בקרת ה-Nano-IL-12-מתווכת מרחבית-זמנית של דלקת מניעה יעילות אנטי-סרטנית מעולה ומתמזגת עם ICIs כדי לשלהב עמוקות את המיקרו-סביבה של הגידול ולהכחיד לחלוטין גידולים ראשוניים וגרורתיים עמידים ל-ICI. האסטרטגיה יכולה להיות גישה מבטיחה לקראת טיפולים אימונותרפיים בטוחים ויעילים יותר.

effects of cistance-antitumor

היתרונות של cistanche tubulosa-Antitumor

1. הקדמה

מעכבי נקודת ביקורת חיסונית (ICIs), כגון נוגדנים נגד PD-1 (nivolumab) ואנטי-CTLA- 4 (ipilimumab), חוללו מהפכה בטיפול בסרטן.[1,2] עם זאת, מספר רב של מטופלים עדיין אינם נהנים מטיפולים אלו.[3] תגובה לקויה כזו נקשרה עם פנוטיפ של גידול קר שאינו רגיש ל-ICIs.[4,5] גידולים קרים אלו מציגים בדרך כלל מיקרו-סביבה מדכאת חיסון ורמות נמוכות של חדירת תאי T שמחלישים את ההשפעות של ICIs.[5-7] ] לפיכך, יש צורך דחוף בסוכנים להעביר את הגידול מהפנוטיפ הקר לפנוטיפ דלקתי (חם) עם חדירת תאי T גבוהה לקראת שיפור היעילות של ICIs והרחבת הנוף הטיפולי. לאינטרלוקין-12 (IL-12), שהוא בין הציטוקינים הפרו-דלקתיים החזקים ביותר, יש פוטנציאל גבוה לחיזוק חסינות נגד גידולים ולהתגבר על עמידות ל-ICI.[8–10] עם זאת, IL-12 גורם תופעות לוואי חמורות הקשורות למערכת החיסון (irAEs) בעת הזרקה מערכתית.[8,10] לפיכך, מגוון גישות הנדסת חלבון, כולל ציטוקינים חיסוניים,[11-13] חלבוני היתוך,[14] וציטוקינים רגישים לפרוטאזות,[15 ] נמצאים בחקירה אינטנסיבית לשיפור הבטיחות של IL-12 על ידי הפחתת חשיפה מערכתית ושיפור סלקטיביות הגידול. מצד שני, IL-12 עדיין מציג חסרונות קריטיים הקשורים לדינמיקה המרחבית-זמנית של הדלקת שמובילות לתגובות חיסון נגדיות המערערות את יעילותה.[16–19] לדוגמה, הזרקת IL-12 חוזרת קודמת ההתרחבות המערכתית של אינטרלוקין אנטי-דלקתי-10 (IL-10) בחולים, מה שהגביל את היעילות האנטי-גידולית.[20-22] בהקשר זה, פיתוח מערכות המסוגלות לשלוט מרחבית-זמנית על ה-IL{{36 }}דלקת מתווכת יכולה למקסם את תפקודי האפקטור ולעורר חסינות אנטי-גידולית חזקה, תוך הימנעות מתגובות חיסוניות מפריעות. למרבה הצער, הדינמיקה הדלקתית של המערכות המהונדסות חלבון הנ"ל אינה מובנת במלואה, והקשר שלהן עם התנגדות לתגובות משניות נותר להבהיר. כאן, פיתחנו ציטוקינים בקנה מידה ננו (ננו ציטוקינים) המגיבים לגירויים על ידי עטיפה של IL-12 עם פולימרים ביו-תואמים כדי להשיג שליטה מרחבית-זמנית על פעילותו. הננו-ציטוקינים המבוססים על -12-IL (Nano-IL-12) תוכננו לשחרר את ה-IL הפעיל במלואו -12 לאחר חישת ה-pH התוך-גידולי החומצי, שכן חמצת היא סימן היכר של סרטן[23] והוא מקושר לדיכוי חיסוני.[24,25] למעשה, לאחרונה מצאנו כי הפונקציה הניתנת להחלפה של pH יכולה לאפשר הפעלה גבוהה וסלקטיבית בגידולים עמידים ל-ICI.[26] הפרמקוקינטיקה, הבטיחות והיעילות של ה-Nano-IL-12 הוערכו במודלים של עכברים של מלנומה קרה וסרטן שד. התוצאות שלנו הראו כי NanoIL-12 גורם לתגובה דלקתית מתמשכת ברקמות הגידול על ידי הגדלת עוצמת ומשך החשיפה ל-IL-12 תוך הימנעות מאינטראקציה עם תאי החיסון ברקמות בריאות כדי לדכא את ה-off- מטרת תגובה חיסונית. לפיכך, Nano-IL-12 חסם ביעילות תגובות משניות מנוגדות הן מבחינה מערכתית והן תוך גידולית, והראה יעילות במינונים ש10-פיפול נמוכים מ-IL מקורי-12. החסינות המשופרת נגד גידולים של Nano-IL-12 התחברה בבטחה עם ICIs כדי להדלקה אינטנסיבית של המיקרו-סביבה של הגידול (TME), והובילה לתגובות מלאות (CR) במודלים עמידים ל-ICI של מלנומה, וגרורות ראשוניות וריאות של משולש- סרטן שד שלילי (TNBC).

Desert ginseng-Improve immunity (9)

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

2. תוצאות

2.1. Nano-IL-12 חש ב-pH תוך גידולי כדי לשחרר ציטוקין פעיל לחלוטין

כדי לבנות את ה-Nano-IL-12, סנתזנו פולי(אתילן גליקול)-פולי(LLysine) (PEG-pLL(CDM)) עם שינוי ב-CDM (Carboxydimethylmaleic anhydride) באמצעות השיטה המדווחת[27] (Scheme S1, מידע תומך). לפולימר יש מחצית מקבוצות האמינו בבלוק pLL המצומדות עם CDM דרך הצמדת האמיד (איורים S1-S3, מידע תומך). הננו-IL{{10}} נוצרים רק על ידי ערבוב הפולימר עם הציטוקין בתנאים מימיים ללא תוספת של ממיסים אורגניים (איור 1א). קבוצות האמינו בפולימר יוצרות קומפלקסים של יונים עם חלקי הקרבוקסילטים בחלבונים, בעוד שקבוצות ה-CDM מגיבות עם קבוצות האמינו ב-IL-12 וכן בגדילי הפולימר ליצירת קשרים אמידים רגישים ל-pH. יעילות האנקפסולציה של IL-12 בננוציטוקינים נקבעה כ-80%, כפי שנמדדה על ידי HPLC על ידי השוואת אזורי הפסגות של IL חופשי שכותרתו Alexa Fluor 647 (A647)-12 וה- IL-12 נטען בננוציטוקין (איור 1ב). במקרה של ללא פלואורסצנטי שסומן IL-12, יעילות האנקפסולציה אומתה על ידי מדידת ELISA, מכיוון ששיטת ELISA יכולה לזהות רק את ה-IL החופשי הבלתי מכוסה בתערובת המגיבה בגלל ציפוי הפולימר של Nano -IL-12 חוסם את הזיהוי של ה-IL הטעון-12 עם נוגדן הזיהוי. לפיכך, על ידי חישוב היחס בין ה-IL-12 הבלתי מכוסה לעומת הזנת ה-IL-12 הכוללת, נקבעה גם יעילות ה-Encapsulation כ-80% (איור S4a, מידע תומך), בהתאם לתוצאה מ- מדידות HPLC. ה-NanoIL-12 טוהר על ידי סינון צנטריפוגלי כדי להסיר IL-12 חופשי וצימודים קטנים יחסית של פולימר-IL-12 (איור S4b, מידע תומך). הטיהור אושר על ידי HPLC (איור 1b, לוח תחתון). היווצרות המגן הפולימרי על Nano-IL-12 אושרה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים העברה (TEM) ופיזור אור דינמי (DLS). ב-TEM, הליבה העמוסה IL-12- של NanoIL-12 שנוצרה על ידי בלוק pLL של הפולימר ו-IL-12 נצבעה על ידי אורניל אצטט[28] והוצגה כנקודות שחורות אחידות עם קוטר ממוצע של 23.2 ± 4 ננומטר (איור 1c,d). לפי DLS, הקוטר ההידרודינמי של ה-Nano-IL-12 נמדד להיות 42 ± 2 ננומטר (איור 1ה). על ידי השוואת הגודל הנמדד על ידי TEM ו-DLS, אנו יכולים לחשב שעובי מעטפת ה-PEG בחלקיקים אלה הוא כ-10 ננומטר. תוצאה זו מצביעה על PEGylation צפוף, אשר יהיה שימושי לשיפור הפרמקוקינטיקה.[29] יתרה מכך, מחקרי ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנציה (FCS) של ה-A647-מסומן Nano-IL-12 אישרו את היווצרותם של שותפים בעלי משקל מולקולרי גדול יותר מאשר A647-מתויג IL-12 (טבלה S1, מידע תומך). על ידי השוואת הספירות לכל מולקולה במדידת FCS של דגימות A647-מסומן IL-12 ו-A647-מסומן Nano-IL-12, קבענו שכל Nano-IL{ {67}} מכיל כ-1.5 מולקולות IL-12 בממוצע. בנוסף, מטען פני השטח של ה-Nano-IL-12 נמצא קרוב לנייטרלי (טבלה S2, מידע תומך), מה שמרמז שהפולימר מגן על ה-IL בעל המטען השלילי-12. הקשרים האמידים בננו-IL-12 שנוצרו בין חלקי ה-CDM והאמינים הראשוניים מדווחים כרגישים ל-pH.[30] לפיכך, ה-Nano-IL-12 צפוי להתנתק בתנאים חומציים כדי לשחרר את הציטוקין המובלע. סקרנו לראשונה את רגישות ה-pH של ה-Nano-IL-12 בערכי pH שונים הנעים בין pH 4.5 ל-8.5 על ידי מדידת FCS כדי לשקף את מצב הדיסוציאציה של ה-Nano-IL-12 על ידי שינוי מקדם דיפוזיה. ניתן היה לראות את העלייה של מקדם הדיפוזיה, התואמת לירידה במשקל המולקולרי של החלקיקים, בתנאים חומציים מתחת ל-pH 7.0, מה שמרמז על כך שה-Nano-IL-12 יציב ב-pH פיזיולוגי, אך עלול לאבד את שלמות בנגעים תוך-גידוליים עם הסביבה החומצת [23,31] (איור 1ו). לאחר מכן, חקרנו את קינטיקה של הדיסוציאציה של Nano-IL -12 ב-pH פיזיולוגי 7.4 ו-pH תוך גידולי 6.5 על ידי מדידת FCS. מדידת FCS מאפשרת הערכה מדויקת של מקדמי הדיפוזיה של ה-Nano-IL-12 ושל ה-IL המשוחרר-12. התוצאה החדשה הראתה שה-Nano-IL-12 איבד במהירות את השלמות ב-pH 6.5, ומקדם הדיפוזיה של הדגימה הגיע לערך של IL חופשי-12 לאחר 4 שעות דגירה, מה שמרמז על הפעלה מלאה של Nano-IL -12 בתנאים כאלה. יתרה מכך, ב-pH 7.4, ה-Nano-IL-12 היו יציבים (איור 1g), ושמרו על מקדם הדיפוזיה שלהם גם לאחר מספר ימים (איור S4c, מידע תומך). תצפיות אלו תומכות בהפעלה סלקטיבית של Nano-IL-12 בתנאי pH תוך גידולי וביציבות בתנאים פיזיולוגיים. מכיוון ש-IL-12 יכול לעורר את הפרשת IFN-𝛾 מ-splenocytes,[32] ההשפעה של מיגון/ביטול מגן פולימרי על הפעילות הביולוגית של Nano-IL-12 הוערכה במבחנה על ידי בדיקת ספלנוציטים ( איור 1h). ה-Nano-IL-12 גרר רמות נמוכות יותר של ייצור IFN- 𝛾 מספלנוציטים של עכברים, מה שמעיד על חסימה של הפעילות הביולוגית של IL-12 על ידי אנקפסולציית הפולימר. מצד שני, הננו-IL-12 שהופעל על ידי דגירה מוקדמת בחומצה (pH 6.5) הראה פעילות ביולוגית דומה לזו של IL מקורי-12, מה שמרמז על הננו-IL המופעל-12 יכול לאחזר באופן מלא את הפעילות הביולוגית של הציטוקין.

Figure 1. Nano-IL-12 activates at intratumoral pH to release the fully active cytokine. a) Formation and structure of IL-12-based nanocytokine (Nano-IL- 12). The Nano-IL-12 is self-assembled in aqueous conditions by simply mixing the polymer with IL-12. The assembly is driven by the pH-sensitive amide bonds and electrostatic interactions. b) HPLC results of free IL-12 protein, PEG-pLL(CDM) + IL-12 mixture, and purified Nano-IL-12. The IL-12 proteins are labeled with A647. c) Representative TEM image of purified Nano-IL-12 clearly shows the core structure of the particles. d) Distribution of the particle cores diameter measured from the TEM images. n = 100 particles counted. e) Distribution of the hydrodynamic diameters of Nano-IL-12 measured by DLS. f) pH-dependent Nano-IL-12 disassociation indicated by FCS measurement of Nano-IL-12 incubated under different pH for 24 h. The dotted line at 5.3 × 107 cm2 s−1 refers to the diffusion coefficient of free IL-12. g) IL-12 release profile of Nano-IL-12 measured by the FCS method. The dotted lines at 1.2 × 107 cm2 s−1 and 5.3 × 107 cm2 s−1 refer to the diffusion coefficients of intact Nano-IL-12 and released free IL-12, respectively. h) IFN-𝛾 secretion by murine splenocytes treated with Nano-IL-12, activated Nano-IL-12, and native IL-12. IFN-𝛾 was measured by ELISA. Data are shown as mean ± S.D.; for f and g, n = 3 parallel measurements. For h, n = 5 parallel measurements.


איור 1. Nano-IL-12 מופעל ב-pH תוך גידולי כדי לשחרר את הציטוקין הפעיל במלואו. א) היווצרות ומבנה של ננוציטוקין מבוסס IL-12- (Nano-IL- 12). ה-Nano-IL-12 מורכב מעצמו בתנאים מימיים פשוט על ידי ערבוב הפולימר עם IL-12. ההרכבה מונעת על ידי קשרי האמיד הרגישים ל-pH ואינטראקציות אלקטרוסטטיות. ב) תוצאות HPLC של חלבון IL-12 חופשי, תערובת PEG-pLL(CDM) + IL-12 וננו-IL מטוהר-12. חלבוני IL-12 מסומנים ב-A647. ג) תמונת TEM מייצגת של Nano-IL מטוהרת-12 מציגה בבירור את מבנה הליבה של החלקיקים. ד) התפלגות קוטר ליבות החלקיקים נמדד מתמונות TEM. n=100 חלקיקים נספרו. ה) התפלגות הקטרים ​​ההידרודינמיים של Nano-IL-12 שנמדדו על ידי DLS. ו) ניתוק ננו-IL-12 תלוי-PH המצוין על ידי מדידת FCS של Nano-IL-12 שהודגרה תחת pH שונה במשך 24 שעות. הקו המקווקו בגודל 5.3 × 107 cm2 s−1 מתייחס למקדם הדיפוזיה של IL חופשי -12. ז) פרופיל שחרור IL-12 של Nano-IL-12 נמדד בשיטת FCS. הקווים המקווקוים ב-1.2 × 107 cm2 s−1 ו-5.3 × 107 cm2 s−1 מתייחסים למקדמי הדיפוזיה של Nano-IL שלם-12 ו-IL חופשי משוחרר-12, בהתאמה. ח) הפרשת IFN-𝛾 על ידי splenocytes של עכברים שטופלו בננו-IL-12, ננו-IL משופעל-12 ו-IL מקורי-12. IFN-𝛾 נמדד על ידי ELISA. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD; עבור f ו-g, n=3 מדידות מקבילות. עבור h, n=5 מדידות מקבילות.

השימור והיציבות של הפורמולה חשובים גם לתרגום Nano-IL-12 כתרופה. לכן, פיתחנו גרסה ליופיליזית של Nano-IL-12 תוך שימוש ב-trehalose כחומר מגן קריו.[33] ה-Nano-IL-12 המשוחזר הראה גודל וטעינת פני השטח דומים עם Nano-IL טריים-12, ללא דליפת מטען, וחלקו רגישות pH דומה ויכולת עידוד IFN-𝛾 במבחנה (איור S4d–g ו- טבלה S2, מידע תומך). תוצאות אלו תומכות בניסוח הליופיליסט כמקבילה בר-קיימא של Nano-IL-12.

Figure 2. Nano-IL-12 improves pharmacokinetics and anti-tumor efficacy. a) IVCLSM images of the earlobe skin of mice after i.v. injection of 10 μg A647-labeled IL-12 or Nano-IL-12 (red color). Scale bar = 50 μm. Mean fluorescence intensity in the tissue area (white boxes) at 5 h after injection was quantified and normalized to the maximum intensity in the vasculature immediately after injection (Vmax). b) Blood circulation profiles of free IL-12 and Nano-IL-12 after i.v. injection of 10 μg IL-12 or equivalent Nano-IL-12 determined by ELISA. Also, the concentration of released IL-12 from Nano-IL-12 in the blood is plotted (data are shown as mean ± S.D., n = 5 mice per group). c) IVIS image of B16F10 melanoma tumors excised 24 h post i.v. injection of 10 μg IL-12 or equivalent Nano-IL-12 labeled with A647. d) Quantification of the IL-12 level in 4T1 TNBC tumors at 24- and 48 h post i.v. injection of 10 μg IL-12 or equivalent Nano-IL-12 by ELISA (Data are shown as mean ± S.D.; n = 3 mice per group; p values are calculated by one-way ANOVA). e) Anti-tumor activity of a single i.v. injection (injection days are indicated by the arrow (Day 8 for the B16F10 model and Day 7 for the 4T1 model)) of 10 μg IL-12 or equivalent Nano-IL-12. The results in B16F10 melanoma are shown in the upper panel and the results in the 4T1 TNBC are shown in the lower panel. The individual tumor growth curves are shown in the left panels. The average tumor volume curves are shown in the center panels, and the survival curves are shown in the right panel (Data are shown as mean ± SEM; n = 5 mice per group, p values are calculated via log-rank analysis).


איור 2. Nano-IL-12 משפר את הפרמקוקינטיקה ואת היעילות האנטי-גידולית. א) תמונות IVCLSM של עור תנוך האוזן של עכברים לאחר הזרקה iv של 10 ug A647- שכותרתו IL-12 או Nano-IL-12 (צבע אדום). סרגל קנה מידה=50 מיקרומטר. עוצמת הקרינה הממוצעת באזור הרקמה (קופסאות לבנות) ב-5 שעות לאחר ההזרקה כמתה ונורמלה לעוצמה המקסימלית בכלי הדם מיד לאחר ההזרקה (Vmax). ב) פרופילי מחזור הדם של IL-12 חופשיים וננו-IL-12 לאחר הזרקה iv של 10 ug IL-12 או ננו-IL-12 שווה ערך שנקבע על ידי ELISA. כמו כן, ריכוז ה-IL-12 המשוחרר מננו-IL-12 בדם משרטט (הנתונים מוצגים כממוצע ± SD, n=5 עכברים לקבוצה). ג) תמונת IVIS של גידולי מלנומה B16F10 שנכרתו 24 שעות לאחר הזרקה iv של 10 ug IL-12 או שווה ערך Nano-IL-12 המסומן עם A647. ד) כימות של רמת IL-12 בגידולי 4T1 TNBC ב-24- ו-48 שעות לאחר הזרקה iv של 10 ug IL-12 או שווה ערך של Nano-IL-12 על ידי ELISA ( הנתונים מוצגים כממוצע ± SD; n=3 עכברים לקבוצה; ערכי p מחושבים על ידי ANOVA חד כיווני). ה) פעילות אנטי-גידולית של הזרקת iv בודדת (ימי ההזרקה מסומנים באמצעות החץ (יום 8 עבור דגם B16F10 ויום 7 עבור דגם 4T1)) של 10 ug IL -12 או שווה ערך Nano-IL{ {51}}. התוצאות במלנומה B16F10 מוצגות בלוח העליון והתוצאות ב-4T1 TNBC מוצגות בלוח התחתון. עקומות צמיחת הגידול הבודדות מוצגות בלוחות השמאליים. עקומות נפח הגידול הממוצעות מוצגות בלוחות המרכזיים, ועקומות ההישרדות מוצגות בלוח הימני (הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM; n=5 עכברים לקבוצה, ערכי p מחושבים באמצעות ניתוח לוג-דירוג ).

2.2. Nano-IL-12 משפר את הפרמקוקינטיקה של IL-12 ומפעיל בגידולים כדי להעצים השפעות אנטי-גידוליות

האנקפסולציה לתוך Nano-IL-12 יכולה לשפר את הפרמקוקינטיקה של IL-12. כדי להמחיש את מחזור הדם של Nano-IL-12 בהזרקה תוך ורידית (iv), נעשה שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקאלית (IVCLSM) כדי לעקוב אחר ה-Nano-IL מבוסס A647-IL-12- -12 בכלי תנוכי אוזניים של עכבר לאחר הזרקה מווריד הזנב. IL חופשי -12 הראה אקסטרה-וואסציה לאחר הזרקה (איור 2a), המסומן על ידי עוצמת הקרינה המוגברת באינטרסטיטיום הרקמה. בהתחשב בכך שמקרומולקולות בעלות גודל דומה ל-IL-12 (75 kDa), כגון 70 kDa דקסטרן ואלבומין (65 kDa), מציגות גישה מוגבלת לעור,[34] דליפה של IL-12 מכלי הדם מרמז על חוסר היציבות של IL-12 במהלך מחזור הדם. למעשה, מחקרים קודמים הצביעו על פרוטאוליזה של IL-12 על ידי אנזימים הנמצאים בסרום.[35,36] כדי לתמוך עוד יותר בפירוק של IL-12 בניסויים שלנו, היציבות של A{{22 }} שכותרתו IL-12 בפלזמה של עכבר נחקרה על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC). לאחר דגירה עם פלזמה של עכבר, מצאנו ש-IL-12 התפרק למקטעים בעלי משקל מולקולרי קטן יותר (איור S5, מידע תומך), מה שמאשר את חוסר היציבות של IL-12 בדם. מצד שני, ה-Nano-IL-12 הראה דליפה מינימלית לתוך העור, מה שמעיד על יציבותם במחזור הדם. פרופיל מחזור הדם המכומת שנמדד ממבחן ה-ELISA אישר של-Nano-IL-12 הכוללת יש מחזור ארוך יותר מאשר IL חופשי-12 (איור 2ב). בינתיים, רמת הננו-IL-12 המופעל, שנקבעה על ידי ה-IL-12 ששוחרר, הייתה מוגבלת מאוד בדם, מה שמצביע על יציבות in vivo של Nano-IL-12 במהלך מערכתית מחזור הדם, המסייע להפחית את תופעות הלוואי המערכתיות. הצטברות של Nano-IL-12 בלב, בטחול, בריאות ובכליות הייתה דומה לזו של IL חופשי-12 הן 24 והן 48 שעות לאחר מתן, בעוד שבכבד, הצטברות של Nano-IL-12 היה גבוה יותר מזה של IL חופשי-12 ב-24 שעות, אך ניתן להשוואה ב-48 שעות (איור S6, מידע תומך). Nano-IL-12 הראה הצטברות גידול גבוהה משמעותית מאשר IL חופשי-12 (איור 2c) ב-24 שעות לאחר ההזרקה. יתרה מכך, בעוד ש-IL חופשי -12 נוקה מהגידולים ב-48 שעות לאחר ההזרקה, הריכוז של Nano-IL-12 נשאר גבוה (בערך פי 4- גבוה מ-IL חופשי{{59} }) (איור 2d), המצביע על כך שננו-IL-12 הגדיל את השטח מתחת לעקומת הריכוז (AUC) של IL-12 בתוך הגידולים. בהתאם להצטברות המוגברת ולהפעלה בת קיימא בגידולים, Nano-IL-12 הראה יעילות אנטי-גידולית משופרת בהשוואה ל-IL חופשי-12 במודלים של מלנומה B16F10 תת-עורית וסרטן שד משולש-שלילי 4T1 (TNBC) (איור 2ה). בשני הדגמים, רק הזרקה iv בודדת של Nano-IL-12 ב-10 ug IL-12 שווה ערך הובילה לעיכוב משופר משמעותית של צמיחת הגידול מאשר IL-12, מה שהוביל לזמן הישרדות ארוך יותר . יש לציין כי במודל 4T1 TNBC, הידוע לשמצה בדיכוי החיסוני החזק שלו ובהתנגדות לטיפול ב-ICI,[37] הטיפול עם Nano-IL-12 הביא להשפעה טיפולית משמעותית בבירור, בעוד ש-IL חופשי{{83} } היה חסר תועלת נגד גידול גידול.

2.3. Nano-IL-12 שלט באופן מרחבי-זמני בתגובה הדלקתית

כדי לחקור עוד יותר את ההבדל בין ההשפעות הביולוגיות של Nano-IL-12 ו-IL-12 חופשי, רמת התגובה לדלקת שהועלתה מהטיפול הוערכה על ידי תגובת הציטוקינים הן באתרים מחוץ למטרה, כלומר , דם ואיברים בריאים, ובגידולים (מודל אורתוטופי 4T1). ארבעה ציטוקינים במורד הזרם של IL-12, כלומר, IFN-𝛾, גורם נמק גידולי-𝛼 (TNF-𝛼), אינטרלוקין{{10}} (IL-6), ואינטרלוקין -10 (IL-10) נבחרו כאינדיקטורים לתגובת דלקת. ביניהם, IFN-𝛾, TNF- 𝛼 ו-IL-6 הם ציטוקינים פרו-דלקתיים חשובים הקשורים להשפעה האנטי-גידולית של IL-12,[20,38] בעוד IL{{20 }} הוא ציטוקין אנטי דלקתי, שהוא משוב שלילי הנוגד גירוי IL-12.[20,39] ננו-IL-12 ו-IL חופשי-12 הוזרקו פעמיים בימים 0 ו 3, ותגובת הדלקת עוקבה מדי יום במשך שבוע. מסגרת ניסויית זו אפשרה לנו לקבוע את ההשפעות של הזרקה בודדת וגם של מינון חוזר על התגובה הדלקתית המרחבית-זמנית. ההזרקה הראשונה של IL חופשי-12 ביום 0 הובילה להפרשת ארבעת הציטוקינים בדם ובאיברים, כאשר שיא ריכוז הפלזמה נצפה ביום 2 (איור 3a–e,g), מה שמצביע על החזק. -דלקת מטרה הקשורה לתופעות הלוואי הקשורות למערכת החיסון (irAEs) של IL-12.[8,10] מצד שני, ההזרקה הראשונה של Nano-IL- 12 הראתה רמות ציטוקינים נמוכות משמעותית מאשר IL חופשי-12 בדם ובאיברים בריאים, המעיד על ויסות התגובה לדלקת מחוץ למטרה. ההזרקה השנייה של IL חופשי-12 ביום 3 עוררה שוב את הפרשת IFN-𝛾, TNF-𝛼 ו-IL-6. עם זאת, רמות השיא של IFN-𝛾 ו-TNF-𝛼 שנצפו ביום 5 היו נמוכות בבירור מאלה שנצפו ביום 2 לאחר הזרקת IL-12 הראשונה. יתרה מכך, ההזרקה השנייה של IL חופשי-12 העלתה מאוד את רמת ה-IL אנטי דלקתי-10 בפלזמה, איברים וגידולים, אשר נקשרה להתרחבות יתר מערכתית של תאי Th1 כדי לגרום שלב רגולטורי.[40] תגובה מובחנת כזו הנגרמת מטיפול חוזר ב-IL-12 אושרה בניסויים קליניים בבני אדם, והיא תורמת להפחתת ההשפעות הביולוגיות של IL-12, כולל העוצמה האנטי-גידולית.[20] בניגוד ל-IL-12, ההזרקה השנייה של Nano-IL-12 לא החמירה את הפרשת IL-10 בדם ובאיברים. כמו כן, ריכוז הציטוקינים הדלקתיים בדם וברקמות בריאות היה נמוך משמעותית מזה של IL חופשי -12. תוצאות אלו מצביעות על כך שננו-IL-12 יכול לא רק להפחית את התגובה הדלקתית המערכתית אלא גם להתגבר על המגבלות של מתן חוזר ונשנה של IL-12, אשר גרמה לתגובה אנטי-דלקתית נגדית. בגידולים, זריקה iv בודדת של Nano-IL-12 הגבירה את הייצור של IFN-𝛾, TNF-𝛼 ו-IL-6 דלקתיות, והשיגה ריכוזים תוך-גידוליים גבוהים משמעותית מ-IL חופשי{{77} } טיפול (איור 3f,g). בינתיים, הטיפול ב-Nano-IL-12 גרם ל-IL אנטי דלקתי-10 נמוך יותר בגידולים מאשר ב-IL חופשי-12, תוך הימנעות מהתחלה של תגובה אנטי-דלקתית נגדית. יתרה מכך, בהזרקה השנייה של Nano-IL-12, הרמה הגבוהה של ציטוקינים דלקתיים נשמרה בגידולים, בעוד שריכוז ה-IL-10 התוך גידולי נשמר נמוך. וויסות עלייה זה של IFN-𝛾, TNF-𝛼 ו-IL-6 והורדת ויסות IL-10 בגידולים מתאם לרמות התוך-גידוליות הגבוהות והממושכות של Nano-IL-12, ותמיכה תגובה דלקתית מוגברת עבור Nano-IL-12, שהיא קריטית לשיפור היעילות האנטי-גידולית.[41]

כדי לבדוק אם Nano-IL-12 יכול לשפר את היעילות באמצעות השליטה המרחבית-זמנית שלו בדלקת, חזרנו על הניסוי של איור 2e, אבל הפעם טיפלנו בעכברים במינון 10- נמוך פי כמה, כלומר, 1 ug של IL-12 שווה ערך, תוך שימוש בלוח זמנים של מינון חוזר שמפעיל את התגובה החיסונית המנוגדת ל-IL בחינם- 12. במסגרת טיפול חוזר זה במינון נמוך, Nano-IL-12 שיפר בבירור את היעילות האנטי-גידולית על פני IL-12 בגידולי 4T1 TNBC (איור 3h), מה שהוביל לצמיחת גידול איטית יותר ולהארכת הישרדות. מצד שני, הטיפול החופשי ב-IL-12 הראה יעילות זניחה גם לאחר שהוזרק באינטנסיביות במשך שש פעמים, מה שניתן לייחס להרחבת ציטוקינים אנטי-דלקתיים כמו IL-10. תוצאות אלו תומכות ביכולת של Nano-IL- 12 להעצים את היעילות האנטי-גידולית על ידי שליטה מרחבית-זמנית של דלקת. השליטה בתגובה הדלקתית הובילה גם לבטיחות משופרת. ערכנו הערכה היסטולוגית וניתוח דם כדי לקבוע את הרעילות של IL{{20}} וננו-IL-12 לאחר שתי הזרקות בימים 0 ו-3 (איור S7a,c, מידע תומך) . התוצאות הראו רעילות נמוכה משמעותית לכבד, לכליה וללבלב בטיפול ב-Nano-IL-12 בהשוואה ל-IL חופשי-12. כמו כן, עקבו אחר השינויים במשקל הגוף במהלך הטיפולים כפרמטר של רעילות. בעלי חיים שטופלו ב-Nano-IL-12 עלו מעט במשקל במהלך הטיפול, בעוד שהעכברים שקיבלו IL חופשי-12 סבלו מירידה במשקל (איור S7b, מידע תומך). לפיכך, תצפיות אלו מצביעות על כך שננו-IL- 12 יכול לקדם את תגובת הדלקת בגידולים כדי לשפר את היעילות האנטי-גידולית תוך הגבלת השפעות מחוץ למטרה ברקמות בריאות כדי להפחית רעילות ולהפחית את התגובה האנטי-דלקתית הנגדית.

Desert ginseng-Improve immunity (21)

יתרונות cistanche לגברים - מחזקים את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. טיפול ננו-IL-12 גורם לחדירת תאי חיסון נגד גידולים ב-TME

IL-12 ידוע גם כגורם מגרה תאי T, מכיוון שהוא יכול לעורר את הצמיחה והתפקוד של תאי T כדי ליזום תגובות חיסוניות אנטי-גידוליות משופרות. לפיכך, הערכנו את החדירה של תאי CD8+ בגידולים לאחר טיפול חוזר ונשנה של Nano-IL-12. ניתוח ציטומטריית זרימה של מלנומה B16F10 שטופלה על ידי שתי הזרקות iv של IL-12 חופשי או Nano-IL-12 ב-1 ug IL-12 שוויון/הזרקה הראה כי Nano-IL{{13} } הגביר משמעותית את החדירה של תאי CD8+ T בגידול בהשוואה ל-IL חופשי-12 (איור 4א). על ידי ביצוע ניסוי של דלדול תאי חיסון בעכבר הנושא גידולי 4T1 TNBC, חקרנו את התרומה של אוכלוסיות תאי חיסון שונות לתגובה מטיפול Nano-IL-12. ננו-IL-12 הוזרקו חמש פעמים ביום 7, 9, 11, 13 ו-15 (1 ug IL-12 שקילות/זריקה). יתר על כן, העכברים הוזרקו תוך צפקית (ip) עם נוגדנים אנטי-CD4, אנטי-CD8 או אנטי-אסיאגו GM1 בימים 6, 8 ו-10 כדי לרוקן CD4+, CD8+, או תאי NK בהתאמה. התוצאות הראו שהדלדול של תאי T ציטוטוקסיים CD8+, תאי T4+ CD ותאי NK הפחיתו באופן משמעותי את היעילות הטיפולית של Nano-IL-12, כפי שצוין על ידי צמיחת הגידול המהירה יותר והירידה בהישרדות בקבוצות המדולדלות בהשוואה לעכברים שקיבלו רק את הטיפול Nano-IL-12 (איור 4ב). תוצאה זו תואמת את התפקוד הביולוגי של IL-12, כולל הגברת הפעילות הציטוטוקסית של תאי CD8 T[42] ותאי NK,[43] ותיווך ההתמיינות של תאי T נאיביים לתאי T עוזר (Th) .[44]

יתרה מכך, יעילות ההפחתה השונה של הפעילות האנטי-גידולית הנובעת מניסוי הדלדול מעידה על הרלוונטיות של כל אוכלוסיית תאים על היעילות של Nano-IL-12, כאשר תאי T ציטוטוקסיים CD8+ הם החלק החשוב ביותר . ניתוח אימונוהיסטוכימיה של קטעי גידול 4T1 TNBC חשף את ההפצה המרחבית של תאי אפקטור חודרים לגידול (איור 4c). בעוד ש-IL-12 חופשי לא שיפר את הנוכחות של תאי T ציטוטוקסיים CD8+ ותאי Tbet+ (Th1) בגידולים, ה-Nano-IL-12 קידם חדירות גבוהה של שני התאים לעומק אזורי גידול. כמו כן, וויסות העל של Granzyme B בתאי CD8+ הציע רמת הפעלה גבוהה יותר של תאי T ציטוטוקסיים לאחר טיפול NanoIL-12 (איור 4ד). יתרה מכך, ראינו שטיפול ב-Nano-IL-12 העלה את ביטוי ה-PD-L1 בגידולים בהשוואה לגידולים שטופלו ב-PBS ו-IL חופשי {{20}}. רמה מוגברת זו של PD-L1 יכולה לנבוע מהגידול הגבוה יותר IFN-𝛾 המושרה על ידי Nano-IL-12, אשר דווח כממריץ ביטוי PD-L1 ברקמת הגידול, [45] המשמש כמנגנון של דיכוי חיסוני להתנגד לחדירת לימפוציטים. הרגולציה התוך-גידולית הזו של PD-L1 מציעה את הפוטנציאל ליצור סינרגיה של היעילות האנטי-גידולית של Nano-IL-12 על ידי שילובו עם ICIs anti-PD-1 או anti-PD-L1. בהתבסס על התצפית לעיל, חקרנו את ההשפעה של Nano-IL-12 כמונותרפיה ובשילוב עם נוגדנים נגד PD-1 על ה-TME (איור 4ה). הניסוי נעשה בגידולי TNBC אורתוטופיים שהוכנו מתאי 4T1 המבטאים המגלוטינין (4T1-HA) מאחר שהמגלוטינין הוא אימונוגן מוגדר היטב, שיכול לגרום לתגובת ציטוטוקסית T-לימפוציטים ספציפית לאנטיגן במודל של עכבר.[46 ,47] העכברים טופלו פעמיים ב-10 ug IL-12 או שווה ערך של Nano-IL-12 בימים 0 ו-3, ולטיפול משולב, העכברים קיבלו בו-זמנית פעמיים זריקות של 100 ug anti-PD -1 נוגדן. ביום 7, דגימות הגידול נקצרו לציטומטריית זרימה.

התוצאות אישרו שטיפול Nano-IL-12 גרם לחדירה גבוהה יותר של לויקוציטים (CD45+) בגידול מאשר IL-12. השילוב של Nano-IL-12 עם הנוגדנים נגד PD-1 הציג גם תאי CD45+ גבוהים יותר בגידולים. בין לויקוציטים, תאים לימפואידים ותאי T הווסרו על ידי Nano-IL-12 ועל ידי שילוב הנוגדנים Nano-IL- 12/anti-PD-1. הטיפול ב-Nano-IL-12 הביא לשינוי מתון באוכלוסיית תאי NK אך הוביל לשינויים משמעותיים בתת-קבוצת תאי T בהשוואה ל-IL חופשי-12. יש לציין שחדירת תאי CD8+ T בגידולי 4T1-HA הועלתה בבירור על ידי Nano-IL-12 מאשר IL חופשי-12. יתרה מכך, תאי HA-tetramer+ T, התואמים לתאי T הספציפיים לאנטיגן, הוגדלו באופן משמעותי בשילוב נוגדנים Nano-IL-12 בתוספת anti-PD- 1, דבר המצביע על קידום של חיסון אדפטיבי תגובה על ידי הסינרגיה של Nano-IL-12 ו-ICIs. תאי ה-CD4+ הכלליים הראו וויסות עלייה בקבוצות שטופלו ב-NanoIL-12. כדי לציין עוד יותר את תת האוכלוסייה של תאי CD4+ T בגידולים, צבענו את התאים באנטי-Foxp3 כדי לחקור את תאי ה-T הרגולטוריים (Tregs). בעוד מונותרפיה אנטי-PD-1 לא הראתה כל דיכוי על Tregs במודל הגידול 4T1- HA, השילוב של Nano-IL-12 פלוס אנטי-PD-1 באופן דרמטי דללו את הטרגיות. יתרה מכך, גידולים שטופלו ב-Nano-IL-12 הציגו תאי Th גבוהים יותר מאשר IL חופשי-12. תוצאות אלו מצביעות על כך שטיפול Nano-IL-12 שיפר את תאי החיסון האנטי-גידוליים בסינון ושילב סינרגיה עם נוגדנים נגד PD-1 כדי להתגבר על ה-TME המדכא את החיסון.

Figure 3. Nano-IL-12 spatiotemporally controlled the inflammatory response. a) Proinflammatory (IFN-𝛾, TNF-𝛼, IL-6) and anti-inflammatory (IL-10) cytokine levels in blood in 4T1-bearing mice injected with 10 μg IL-12 or equivalent Nano-IL-12 twice on Days 0 and 3. The cytokine levels were measured by ELISA. The peak values after the two injections (on Days 2 and 5 for IFN-𝛾, TNF-𝛼, and IL-10; on Days 2 and 6 for IL-6) are visualized as bar graphs on the right panel. b–f) Cytokine levels in the organs and tumors of 4T1-bearing mice injected with 10 μg IL-12 or equivalent Nano-IL-12 twice on Days 0 and 3. The mice were sacrificed on Days 2 and 5 to collect the tissues. (Data are shown as mean ± S.D.; n = 6 mice per group; p values are calculated via unpaired t-test.) g) Heatmaps of the cytokine levels in blood, organs, and tumors from the average values in a-f converted to Z-score. h) Anti-tumor activity of repeated i.v. injection (injected on Days 7, 9, 11, 13, 15, and 25, indicated by arrows) of 1 μg IL-12 or equivalent Nano-IL-12 against murine TNBC. The individual tumor growth curves are shown in the left panel. The average tumor volume curves are shown in the central panel, and the survival curves are shown in the right panel (Data are shown as mean ± SEM; n = 6 mice per group, p values are calculated via log-rank analysis).

איור 3. Nano-IL-12 שלט באופן מרחבי-זמני בתגובה הדלקתית. א) רמות ציטוקינים פרו-דלקתיות (IFN-𝛾, TNF-𝛼, IL-6) ואנטי דלקתיות (IL-10) בדם בעכברים נושאי 4T1- שהוזרקו עם 1{{14 }} ug IL-12 או Nano-IL-12 שווה ערך פעמיים בימים 0 ו-3. רמות הציטוקינים נמדדו באמצעות ELISA. ערכי השיא לאחר שתי ההזרקות (בימים 2 ו-5 עבור IFN-𝛾, TNF-𝛼 ו-IL-10; בימים 2 ו-6 עבור IL-6) מוצגים כגרפי עמודות ב- לוח ימין. ב–ו) רמות ציטוקינים באיברים ובגידולים של עכברים נושאי 4T1- שהוזרקו עם 10 ug IL-12 או Nano-IL שווה ערך-12 פעמיים בימים 0 ו-3. העכברים היו הקריבו בימים 2 ו-5 כדי לאסוף את הרקמות. (הנתונים מוצגים כממוצע ± SD; n=6 עכברים לקבוצה; ערכי p מחושבים באמצעות בדיקת t לא מזווגת.) ז) מפות חום של רמות הציטוקינים בדם, באיברים ובגידולים מהערכים הממוצעים ב-af הומר לציון Z. ח) פעילות אנטי-גידולית של הזרקה חוזרת ונשנית של הזרקה (מוזרקת בימים 7, 9, 11, 13, 15 ו-25, מסומנת בחצים) של 1 ug IL-12 או Nano-IL שווה ערך-12 נגד TNBC עכברי. עקומות צמיחת הגידול הבודדות מוצגות בלוח השמאלי. עקומות נפח הגידול הממוצעות מוצגות בפאנל המרכזי, ועקומות ההישרדות מוצגות בלוח הימני (הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM; n=6 עכברים לקבוצה, ערכי p מחושבים באמצעות ניתוח לוג-דירוג ).

Figure 4. The anti-tumor effect of Nano-IL-12 is generated from the enhanced infiltration of effector cells in the TME. a) Flow cytometry analysis of CTLs infiltration in melanoma after Nano-IL-12 treatment. Mice were inoculated with B16F10 cells on Day 0. IL-12 (1 μg) or equivalent Nano-IL-12 were i.v. injected twice on Days 8 and 11. Tumor samples were collected and analyzed on Day 15 (Data shown as mean ± S.D.; n = 5 mice per group; p-values were calculated via one-way ANOVA). b) Antitumor activity of Nano-IL-12 upon depletion of CD4+, CD8+ and NK cells. Mice bearing 4T1 tumors were i.v. injected with Nano-IL-12 (1 μg IL-12 equivalent) on Days 7, 9, 11, 13, and 15. Moreover, the mice were injected with anti-CD4, anti-CD8, and anti-asiago GM1 antibodies on Days 6, 8, and 10. Tumor growth curves (Data are shown as mean ± SEM) and survival curves were recorded (n = 6 mice per group, p values are calculated via log-rank analysis). c) IHC images of 4T1 tumor sections. Mice bearing 4T1 TNBC tumors (average tumor volume: 200 mm3) were twice i.v. injected with PBS, 10 μg IL-12, or equivalent Nano-IL-12 on Days 0 and 3. On Day 7, the mice were sacrificed to collect the tumors. The CD8+, Tbet, or PD-L1+ cells in the tumors are visualized in yellow. The cell nuclei were stained with Hoechst (blue). Scale bar = 1 mm. d) Immunostaining of Granzyme B (green) and CD8 (red) in 4T1 tumor sections. The cell nuclei were stained with Hoechst (blue). Yellow pixels indicate activated CD8+ T cells. Scale bar = 100 μm. e) Analysis of lymphoid cells infiltration in 4T1-HA tumors treated with PBS, anti-PD1 antibodies, IL-12, Nano-IL-12, IL-12 plus anti-PD1 antibodies and Nano-IL-12 plus anti-PD1 antibodies. IL-12 and Nano-IL-12 were i.v. injected at 10 μg on Days 7 and 9 postinoculation. Anti-PD-1 was i.p. injected at 100 μg on Days 8 and 10 postinoculation. On Day 17, mice were sacrificed, and the tumors were homogenized for flow cytometry measurement (Data are shown as mean ± S.D., n = 5 samples per group, p values are calculated via one-way ANOVA).


איור 4. ההשפעה האנטי-גידולית של Nano-IL-12 נוצרת מהחדרה מוגברת של תאי אפקטור ב-TME. א) ניתוח ציטומטריית זרימה של חדירת CTL במלנומה לאחר טיפול ב-Nano-IL-12. עכברים חוסנו בתאי B16F10 ביום 0. IL-12 (1 ug) או ננו-IL-12 שווה ערך הוזרקו פעמיים ביום 8 ו-11. דגימות גידולים נאספו ונותחו ביום 15 (הנתונים מוצגים כממוצע ± SD; n {{ 16}} עכברים לקבוצה; ערכי p חושבו באמצעות ANOVA חד כיווני). ב) פעילות אנטי-גידולית של Nano-IL-12 עם דלדול תאי CD4+, CD8+ ו-NK. עכברים הנושאים גידולי 4T1 הוזרקו ל-IV עם Nano-IL-12 (1 ug IL-12 שווה ערך) בימים 7, 9, 11, 13 ו-15. יתר על כן, העכברים הוזרקו עם אנטי-CD4 , נוגדנים נגד CD8 ואנטי-אסיאגו GM1 בימים 6, 8 ו-10. נרשמו עקומות צמיחת גידול (הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM) ועקומות הישרדות (n=6 עכברים לקבוצה, ערכי p מחושבים באמצעות ניתוח דירוג יומן). ג) תמונות IHC של קטעי גידול 4T1. לעכברים שנשאו גידולי 4T1 TNBC (נפח גידול ממוצע: 200 מ"מ) הוזרק פעמיים iv עם PBS, 10 ug IL -12 או Nano-IL שווה ערך-12 בימים 0 ו-3. ביום 7, עכברים הוקרבו כדי לאסוף את הגידולים. תאי ה-CD8+, Tbet או PD-L1+ בגידולים מוצגים בצהוב. גרעיני התא נצבעו בהוכסט (כחול). סרגל קנה מידה=1 מ"מ. ד) צביעה חיסונית של גראנזים B (ירוק) ו-CD8 (אדום) בקטעי גידול 4T1. גרעיני התא נצבעו בהוכסט (כחול). פיקסלים צהובים מציינים תאי T פעילים של CD8+. סרגל קנה מידה=100 מיקרומטר. ה) ניתוח חדירת תאי לימפה בגידולי 4T1-HA שטופלו ב-PBS, נוגדנים נגד PD1, IL-12, Nano-IL-12, IL-12 פלוס אנטי- נוגדני PD1 וננו-IL-12 בתוספת נוגדנים נגד PD1. IL-12 ו-Nano-IL-12 הוזרקו iv ב-10 ug בימים 7 ו-9 לאחר החיסון. Anti-PD-1 הוזרק ל-IP ב-100 ug בימים 8 ו-10 לאחר החיסון. ביום 17, עכברים הוקרבו, והגידולים הומוגגו למדידת ציטומטריית זרימה (הנתונים מוצגים כממוצע ± SD, n=5 דגימות לקבוצה, ערכי p מחושבים באמצעות ANOVA חד כיווני).

2.5. טיפול ננו-IL-12 מפעיל את ה-TME מרמת התמלול לתגובת ICI מוגברת

לאחר מכן חקרנו את ההפעלה של ה-TME של גידולי 4T1-HA לאחר הטיפולים מרמת ביטוי הגנים על ידי ניתוח תעתיקים. ריצוף של דגימות ה-RNA הכוללות שהופקו מרקמות הגידול נערך לאחר טיפול בנוגדנים PBS, anti-PD-1, IL-12, Nano-IL-12 והשילובים של הציטוקינים עם ICIs. מפת החום של ביטוי גנים גלובלי הצביעה בבירור על פרופילי הגנים המובחנים בגידולים המקבלים Nano-IL-12 ואת השילוב של Nano-IL-12 עם אנטי-PD- 1 (איור S11, מידע תומך ). כדי לציין את התהליכים הביולוגיים המושפעים על ידי טיפול ב-Nano-IL-12, ניתחנו את הגנים המובעים בצורה דיפרנציאלית בכל קבוצה וערכנו ניתוח העשרה של הגנים המווסתים ומורדים (איור 5a,b). שני ניתוחי GOBP ו-KEGG גילו שבהשוואה ל-IL-12 ו-PBS, הטיפול ב-Nano-IL-12 הגביר באופן מובהק את הגירוי של התפשטות, התמיינות והפעלה פונקציונלית של תאי חיסון שונים, כגון תאי T. התפשטות, התמיינות של תאי T לתאי Th, והפעלת תאי T ומסלול איתות של קולטן תאי T. יתרה מכך, גנים הקשורים לביטוי PD-L1 ולמסלול בדיקת PD-1 נמצאו גם הם מווסתים עם טיפול ב-Nano-IL-12. תוצאות אלו תומכות בגירוי החזק של NanoIL-12 לתאי T שנצפה במחקרי ציטומטריית זרימה ואימונוהיסטולוגיה. במקביל, גנים הקשורים לתאי חיסון אחרים, כמו מונוציטים ותאי NK, הושפעו באופן חיובי מהטיפול ב-Nano-IL-12. כמו כן, תגובת ציטוקינים ותהליכים חיסוניים אחרים, כמו הצגת אנטיגן, הווסרו מטיפול Nano-IL-12. מצד שני, Nano-IL-12 הוריד מסלולים הקשורים לחלוקת תאים, דבר המצביע על כך שהטיפול יכול לדכא את התפשטות תאי הגידול (איור S11, מידע תומך). תוצאות אלו מצביעות על היתרונות של Nano-IL-12 בהפעלת הזרוע המולדת והסתגלנית של חסינות תוך-גידולית.

חקירה נוספת על הטיפולים המשולבים העלתה שהטיפול המשולב של נוגדני Nano-IL-12 בתוספת נוגדנים נגד PD-1 הגביר את החסינות התוך-גידולית בהשוואה ל-IL-12 פלוס אנטי-PD{{6} } נוגדנים או מונותרפיה נגד PD-1 על ידי גירוי מסלולים חיסוניים מולדים וסתגלניים כאחד (איור 5b ואיור S11c, מידע תומך). באופן מרשים, השילוב של נוגדני NanoIL-12 בתוספת anti-PD-1 הביא לעיכוב חזק יותר על המסלולים הקשורים למיטוזה, מה שמסיק ששילוב זה יכול לתווך פעילות הרג חזקה יותר של תאי המשפיעים שחדרו כנגד תאי הגידול. בהתבסס על תוצאות ה-RNA-seq, ניתחנו גם את האוכלוסיות של תאי חיסון חודרים לגידול (איור 5c,d). כמו התוצאה מציטומטריית זרימה, קבוצות שטופלו ב-Nano-IL-12 הראו חדירות מוגברת של תאי CD8+ T. יתר על כן, התוצאות חשפו גם את הוויסות המונוציטים והגרנולוציטים, המאשר את הדלקת המוגברת בגידולים מהמסלולים החיסונים המולדים המוחזקים. תוצאות אלו אישרו כי Nano-IL-12 מגדיר תגובה חיסונית חזקה נגד גידולים והשילוב עם אנטי-PD-1 יכול לחזק תהליך זה.

Figure 5. Nano-IL-12 treatment enhances immune activation in TME to potentiate anti-PD1 antibodies. a) Volcano plots of the differentially expressed genes in comparison between Nano-IL-12 versus IL-12 and Nano-IL-12 + anti-PD-1 versus IL-12 + anti-PD-1. The plots were obtained from RNA-seq analysis of 4T1-HA tumors treated by different treatments: 10 μg IL-12 and equivalent Nano-IL-12 were i.v. injected on Days 7 and 9 postinoculation. Anti-PD-1 was i.p. injected at 100 μg on Days 8 and 10 postinoculation. On Day 17, mice were sacrificed to collect the tumor samples. b) Enrichment analysis showing the upregulated pathways in the two comparison pairs in a. c) Heatmap of cell populations in the TME determined by RNA-seq. The populations were converted to Z-scores for plotting the figure. d) Histograms of the cell populations showing significant differences in multiple comparisons (Data are shown as mean ± S.D.; for PBS group, n = 5 samples; for other groups, n = 4 samples per group; p values are calculated via one-way ANOVA).


איור 5. טיפול Nano-IL-12 משפר את ההפעלה החיסונית ב-TME כדי להעצים נוגדנים נגד PD1. א) חלקות הר געש של הגנים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית בהשוואה בין Nano-IL-12 לעומת IL-12 ו-Nano-IL-12 + anti-PD-1 לעומת IL{{12} } אנטי-PD-1. החלקות התקבלו מניתוח RNA-seq של גידולי 4T1-HA שטופלו בטיפולים שונים: 10 ug IL-12 ו-Nano-IL שווה ערך-12 הוזרקו iv בימים 7 ו-9 לאחר החיסון . Anti-PD-1 הוזרק ל-IP ב-100 ug בימים 8 ו-10 לאחר החיסון. ביום 17, עכברים הוקרבו כדי לאסוף את דגימות הגידול. ב) ניתוח העשרה המראה את המסלולים המווסתים בשני צמדי ההשוואה ב-a. ג) מפת חום של אוכלוסיות תאים ב-TME שנקבע על ידי RNA-seq. האוכלוסיות הומרו לציוני Z עבור התוויית הדמות. ד) היסטוגרמות של אוכלוסיות התאים המראות הבדלים משמעותיים בהשוואות מרובות (הנתונים מוצגים כממוצע ± SD; עבור קבוצת PBS, n=5 דגימות; עבור קבוצות אחרות, n=4 דגימות לקבוצה; ערכי p מחושבים באמצעות ANOVA חד כיווני).

2.6. ננו-IL-12 מתמזגת עם ICIs כדי למגר ביעילות גידולים ראשוניים וגרורות

כדי לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של Nano-IL-12 לסינרגיות עם ICIs, גידולי TNBC ראשוניים אורתוטופיים הוקמו בעכברים על ידי חיסון תאי 4T1 לכרית השומן בשד. העכברים טופלו עם Nano-IL-12 על פי לוחות זמנים שונים של מינון ודפוסי שילוב עם ICIs כדי לבדוק את היעילות האנטי-גידולית של הטיפולים המקבילים. מצאנו שגם במינון נמוך (1 ug IL-12 שקילות/זריקה), הטיפול החוזר עם Nano-IL-12 הפעיל פעילות אנטי-גידולית ברורה נגד גידולי TNBC ראשוניים כמונותרפיה, שכן מוצג על ידי דיכוי קצב צמיחת הגידול וההישרדות הממושכת (איור S12, מידע תומך). עם זאת, טיפול IL-12 חינם במינון זה לא הראה יעילות כלשהי, גם בשילוב עם טיפול נגד PD-1. השילוב של Nano-IL- 12 עם anti-PD-1 הגביר עוד יותר את היעילות, והושג CR. לאחר מכן בדקנו מינון גבוה יותר של Nano-IL-12 (10 ug IL-12 שקילות/הזרקה) ושילבנו אותו עם קוקטיילי ICI (antiPD-1 ונוגדנים נגד CTLA4) כדי למלא את הטיפול התרופתי פוטנציאל. יש לציין שבמינון זה, הטיפול המשולב של Nano-IL-12 עם ICIs עצר את צמיחת הגידול והכחיד גידולים לחלוטין (איור 6א), כאשר כל העכברים הראו CR בקבוצת טיפול זו. יתרה מכך, העכברים שנרפאו הראו עמידות בפני אתגר חוזר של הגידול עם תאי 4T1, ותומכים בקיומו של זיכרון חיסוני חזק מהטיפול עם טיפול משולב Nano-IL-12 ו-ICIs.

Desert ginseng-Improve immunity (15)

מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche

TNBC ידוע כגידול אגרסיבי עם שיעור גבוה של גרורות מרוחקות.[48,49] לפיכך, בהמשך חקרנו את הביצועים של Nano-IL-12 במודל TNBC גרורתי. מודל TNBC גרורתי ספונטני הוקם על ידי כריתה של הגידולים האורתוטופיים 4T1 הראשוניים, אשר יוביל להתפתחות של גרורות במספר איברים, בעיקר הריאות.[50] במודל זה, הטיפול המשולב של Nano-IL-12 עם ICIs חשף גם תוצאות משביעות רצון, שעצרו את התקדמות גרורות הריאות (איור 6b) והובילו ל-CR בכל העכברים שטופלו. יתרה מכך, לאחר אתגר חוזר בהזרקה iv של תאי 4T1, רוב העכברים שנרפאו הראו עמידות חזקה, מה שמצביע על זיכרון חיסוני יעיל מהשילוב של Nano-IL-12 ו-ICIs. מלבד TNBC, בדקנו גם Nano-IL-12 בשילוב עם ICI במודל מלנומה B16F10 ראשוני (איור S13, מידע תומך). התוצאות הראו שהשילוב של Nano-IL-12 (10 ug IL-12 שקילות/הזרקה) עם נוגדן anti-PD-1 הוביל ל-CR ב-4 עכברים מתוך 6 בקבוצה , והעכברים שנרפאו הראו עמידות בפני אתגר חוזר עם תאי B16F10, מה שמרמז על זיכרון אימונולוגי חזק.

3. דיון

פיתחנו אסטרטגיית IL-12 הניתנת להפעלת גידול באמצעות ננוציטוקינים רגישים (Nano-IL-12) שיכולים להשתיק את הפעילות הביולוגית של IL-12 ב-pH 7.4, אך לאחזר את הציטוקין הפעיל במלואו ב- pH תוך גידולי. בהזרקה מערכתית, ה-Nano-IL-12 הסתובב ביציבות בזרם הדם, והפחית את התגובה החיסונית באתרים לא פתולוגיים ואת השכיחות של irAEs, גם לאחר מתן חוזר. מצד שני, הצטברות והפעלה גבוהים של Nano-IL-12 בגידולים מובילים לשיפור משמעותי של היעילות והסינרגיה עם ICIs, השגת CR במודלים של גידולים קרים עמידים בפני ICIs, והענקת מוצק זיכרון חיסוני לאחר הטיפול.

Nano-IL-12 הפעיל עמוקות את ה-TME על ידי שחרור הפרשה חזקה של ציטוקינים דלקתיים, חדירות מוגברת של תאי אפקטור וירידה בנוכחות של תאים מדכאים חיסוניים. יתרה מכך, Nano-IL-12 הגביר את רמות ה-PD-L1 בתאי הגידול, מה שיכול לקדם את הפעילות של נוגדנים נגד PD-1. השינויים ב-TME שנגרמו על ידי Nano-IL-12 שיתפו פעולה עם נוגדני antiPD-1 כדי לעורר חסינות סרטנית באמצעות שיפור הצגת האנטיגן, הנוכחות המוגברת של תאי אפקטור וחיזוק הפעילות שלהם, וכן קידום אינטראקציות של תאי מערכת החיסון. מחקרים קליניים הראו שלמחסום אנטי-PD1/anti-PD-L1 יש שיעור תגובה גבוה יותר בחולי PD-L1-חיוביים TNBC עם מספר גבוה של לימפוציטים חודרים לגידול.[51,52] עם זאת, הביצועים הכוללים של חסימת נקודת ביקורת חיסונית כמונותרפיה נגד TNBC לא היו משביעי רצון[53,54] עקב הביטוי הנמוך בדרך כלל וה-TME ההטרוגני המשמעותי של TNBC[55,56] למעשה, רק חסימת PD-L1 בשילוב עם כימותרפיה (Nab-Paclitaxel) אושרה בחולי TNBC גרורתיים, מה שנותן תועלת הישרדות כללית צנועה בחלק קטן מחולי TNBC.[57] לפיכך, הפוטנציאל של Nano-IL-12 לעקוף את ה-TME המדכא את החיסון ולהגביר את ביטוי PD-L1 של TNBC עשוי לספק חלופה חזקה להגברת שיעורי התגובה של חסימת מחסומים. הבטיחות המשופרת של Nano-IL-12 היא גם יתרון משמעותי ליישום טיפולי. מחקרים קליניים קודמים הראו ש-IL-12 מוזרק סיסטמית גורם לרעילות המטולוגית וכבדית חזקה.[58,59] תופעות לוואי כאלה קשורות בעיקר לייצור של IFN-𝛾 ו-TNF-𝛼 המושרה על ידי IL{{40} } טיפול.[42,60] במחקר שלנו, Nano-IL-12 הראה רמות ציטוקינים נמוכות משמעותית מ-IL חופשי-12 בדם ובאיברים, מה שהגביל את הנזק לאיברים. לפיכך, הצלחנו להזריק את ה-Nano-IL- 12 מספר פעמים ב-10 ug IL-12 לעכבר, כלומר בסביבות 500 ug kg-1, שזה בערך {{52} פי } יותר מהמינון המקסימלי הנסבל (MTD) של IL-12 בבני אדם, כלומר, 500 ng kg-1. [61] תופעת לוואי חשובה נוספת של טיפול סיסטמי ב-IL-12 שנצפתה במחקרים קליניים היא תחילתה של תגובה אנטי-דלקתית אדפטיבית לאחר מתן שני של IL-12, מה שמוביל להפחתת היעילות. [20,21] תופעה כזו נקשרה למנגנוני משוב שלילי הקשורים לייצור יתר של IL אנטי דלקתי-10, ולירידה של ציטוקינים פרו-דלקתיים כמו IFN-𝛾, TNF-𝛼 ו-IL{{ 67}}.[20,22] ננו-IL-12 נמנע מעלייה של IL-10 בדם ובאיברים לאחר המתן השני, מה שיכול להיות נוח להשגת לוחות זמנים של מתן חוזר ללא ירידה של השפעות נגד גידולים. יש לציין שהטיפול עם Nano-IL-12 לא העלה את ריכוז ה-IL-10 בגידולים, תוך שמירה על רמות תוך-גידוליות גבוהות של IFN-𝛾, TNF-𝛼 ו-IL-6.

Figure 6. Nano-IL-12 synergizes with immune checkpoint inhibitors to eradicate breast tumors. In both orthotropic and metastatic TNBC models, mice were grouped to receive PBS, IL-12 + ICIs (anti-CTLA4 and anti-PD-1), and Nano-IL-12 + ICIs therapies (dose and treatment schedule were shown in the scheme at the upper panels respectively). a) Combination therapy of Nano-IL-12 and ICIs led to the complete eradication of orthotopic tumors in all mice treated. The individual tumor growth curves are shown in the left panel. The average tumor volume and survival curves are shown in the upper-right panel. The cured mice showed robust defense against rechallenge injection with 4T1 cells to the mammary, with no tumor growth on the treated mice (lower-right panel). b) Combination therapy of Nano-IL-12 and ICIs showed strong inhibition against metastatic tumor progression. After treatment (Day 23), the lungs of mice treated with Nano-IL-12 + ICIs combination therapy showed clearly fewer metastasis, shown by the representative photos (green arrows: macroscopic metastasis) and histological evaluation (Scale bar = 100 μm) presented in the left panel. Nano-IL-12 + ICIs combination therapy finally led to a complete response in all mice treated, as indicated by the survival curves (upper-right panel). Also, the cure mice showed robust defense against tumor rechallenge by injection of 4T1 cells (lower-right panel). (Data are shown as mean ± SEM.; n = 6 mice per group; p values are calculated via log-rank analysis).


איור 6. Nano-IL-12 עושה סינרגיה עם מעכבי נקודת ביקורת חיסונית כדי למגר גידולי שד. הן במודלים אורתוטרופיים והן במודלים של TNBC גרורתי, עכברים קובצו כדי לקבל טיפולי PBS, IL-12 + ICIs (אנטי-CTLA4 ואנטי-PD-1), ו-Nano-IL-12 + ICIs (מינון ולוח הזמנים לטיפול הוצגו בסכימה בפאנלים העליונים בהתאמה). א) טיפול משולב של Nano-IL-12 ו-ICIs הוביל לחיסול מוחלט של גידולים אורתוטופיים בכל העכברים שטופלו. עקומות צמיחת הגידול הבודדות מוצגות בלוח השמאלי. נפח הגידול הממוצע ועקומות ההישרדות מוצגים בפאנל הימני העליון. העכברים שנרפאו הראו הגנה חזקה מפני הזרקת אתגר חוזרת עם תאי 4T1 לשד, ללא צמיחת גידול על העכברים המטופלים (פאנל ימני תחתון). ב) טיפול משולב של Nano-IL-12 ו-ICIs הראה עיכוב חזק נגד התקדמות הגידול הגרורתי. לאחר הטיפול (יום 23), הריאות של עכברים שטופלו בטיפול משולב Nano-IL-12 + ICIs הראו בבירור פחות גרורות, כפי שהוצגו על ידי התמונות המייצגות (חצים ירוקים: גרורות מקרוסקופיות) והערכה היסטולוגית (סרגל קנה מידה {{21 }} מיקרומטר) מוצג בחלונית השמאלית. טיפול משולב של ננו-IL-12 + ICIs הוביל לבסוף לתגובה מלאה בכל העכברים שטופלו, כפי שמצוין על ידי עקומות ההישרדות (פאנל ימין למעלה). כמו כן, עכברי המרפא הראו הגנה חזקה מפני אתגר חוזר של הגידול על ידי הזרקה של תאי 4T1 (פאנל ימני תחתון). (הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM.; n=6 עכברים לקבוצה; ערכי p מחושבים באמצעות ניתוח לוג-דירוג).

מכיוון ש-IL-12 נחשב לאחד הציטוקינים האימונוסטימולטוריים החזקים ביותר, מספר גישות נבדקות באינטנסיביות כדי להחליש את הרעילות הנגרמות על-12-IL ולהעצים את יעילותו. אסטרטגיות המשתמשות בהזרקה ישירה תוך גידולית, כגון פורמולציות המבוססות על IL-12 ואדג'ובנטים,[62] ו-DNA פלסמיד[63] או שליח RNA[64] המקודד ל-IL-12 לייצור הציטוקין באתרו, יכולות למקסם את האינדקס הטיפולי.[8] עם זאת, המינהל המקומי עשוי לעמוד בפני מספר מגבלות במרפאה, לרבות טיפול בגידולים הגדלים בתנוחות שאינן ניתנות להזרקה,[65] יעילות תלוית מפעיל,[66] חלוקה לא אחידה של התרופות המוזרקות בגידול,[67] ו מסירה מחוץ למיקוד על רקע דליפה.[68] יתרה מכך, הפעילות האנטי-סרטנית של התכשירים המוזרקים תוך גידולים נגד גרורות מרוחקות מסתמכת במידה רבה על היעילות המשתנה של אפקט אבסקופלי, [69] אשר הראתה שיעורי התרחשות נמוכים במחקרים קליניים [70-72] וייתכן שלא תוכל להתגבר על אותות מדכא חיסון בגרורות.[73] האפשרות לתת בבטחה Nano-IL-12 על ידי הזרקה תוך ורידית מערכתית, שהיא הליך קליני סטנדרטי, יכולה לאפשר פרמקוקינטיקה צפויה ויש לה פוטנציאל לגשת לכל אתרי הגידול דרך אספקת הדם. חלבוני Fc-fusion מבוססי IL-12-[14] ואימונוציטוקין[11-13] חולקים גם הם את היתרונות הללו עם NanoIL-12. עם זאת, רכיב ה-IL-12 בתרכובות אלו פעיל מערכתית, מה שמעלה חששות בטיחותיים. לדוגמה, חלבוני היתוך במחזור ארוך של IL-12 הראו רמות גבוהות של ציטוקינים חיסוניים IFN-𝛾[74,75] ו-IL-12 בסרום הראו הצטברויות לאתרים מחוץ למטרה.[76, 77] היכולת של Nano-IL-12 לשלוט בהפעלה מרחבית-זמנית יכולה לספק אסטרטגיה בטוחה וחזקה עם ספציפיות במיקוד לגידול.

effects of cistance-antitumor (2)

היתרונות של cistanche tubulosa-Antitumor

מגבלה של המחקר הנוכחי שלנו היא שננו-IL-12 מבוסס על עכבר IL-12. בהתחשב בכך שההומולוגיה בין IL-12 של עכבר ל-IL-12 אנושי היא בסביבות 60-70%, יהיה צורך במחקרים נוספים כדי לקבוע את הניסוח של ננוציטוקין אנושי מבוסס IL-12- עם פעילות ו פרופילי בטיחות הדומים למערכת מבוססת עכבר. למרבה המזל, בדיקות ראשוניות הראו שהפולימרים המשמשים במחקר שלנו יכולים גם לכסות IL -12 אנושי, עם רגישות pH דומה. יתרה מכך, מכיוון שניתן להנדס את הפולימרים במדויק, ניתן יהיה לפתח מערכת מבוססת IL-12-אנושית עם פרופילים מרחבי-זמניים מתאימים לשימוש אנושי. לסיכום, ה-Nano-IL-12 כננו ציטוקינים השיג שליטה מרחבית-זמנית יעילה של פעילות IL-12 במתן מערכתי, מה שהבטיח גירוי מדויק של חסינות תוך-גידולית כדי להשיג בטיחות ותוצאות טיפוליות משביעות רצון בגידול קר ראשוני וגרורתי. מודלים, תוך סינרגיה עם חסימת מחסומים. מכיוון שהפולימרים המשמשים להרכבת Nano-IL-12 ניתנים להנדסה ללקיחת מגוון רחב של חלבונים בעלי משקלים מולקולריים שונים ומטען פני השטח, למערכת יש פוטנציאל לאפשרויות יישום רחבות יותר, כגון עטיפה של ציטוקינים טיפוליים אחרים או אפילו קוקטיילים של ציטוקינים. יתרה מכך, בהינתן שהמערכת הפולימרית ניתנת להנדסה נוספת כדי לחוש גירויים אחרים מלבד pH, [78] ניתן לעצב את הננו ציטוקינים למיקוד במיקרו-סביבות גידול שונות. לבסוף, בהתחשב בפוטנציאל התרגום של הפולימרים והננו ציטוקינים המועסקים, אסטרטגיה זו טומנת בחובה הבטחה לעתיד של אימונותרפיה בסרטן.

הפניות

[1] AJ Korman, SC Garrett-Thomson, N. Lonberg, Nat. Rev. Drug Discovery 2021, 21, 509.

[2] A. Ribas, JD Wolchok, Science 2018, 359, 1350.

[3] A. Haslam, V. Prasad, JAMA Network Open 2019, 2, e192535.

[4] P. Sharma, BA Siddiqui, S. Anandhan, SS Yadav, SK Subudhi, J. Gao, S. Goswami, JP Allison, Cancer Discovery 2021, 11, 838.

[5] JD Martin, H. Cabral, T. Stylianopoulos, RK Jain, Nat. כומר קלינ. אונקול. 2020, 17, 251.

[6] CM Fares, EM Van Allen, CG Drake, JP Allison, S. HuLieskovan, Am. Soc. קלינ. אונקול. Educ. סֵפֶר. 2019, 39, 147.

[7] K. Chamoto, R. Hatae, T. Honjo, Int. ג'יי קלין. אונקול. 2020, 25, 790.

[8] KG Nguyen, MR Vrabel, SM Mantooth, JJ Hopkins, ES Wagner, TA Gabaldon, DA Zaharoff, Front. אימונול. 2020, 11, 2510.

[9] EA Chiocca, AB Gelb, CC Chen, G. Rao, DA Reardon, PY Wen, WL Bi, P. Peruzzi, C. Amidei, D. Triggs, L. Seften, G. Park, J. Grant, K. טרומן, JY Buck, N. Hadar, N. Demars, J. Miao, T. Estupinan, J. Loewy, K. Chadha, J. Tringali, L. Cooper, R. V Lukas, Neuro-Oncology 2021, 24, 951.

[10] B. Mirlekar, Y. Pylayeva-Gupta, Cancers 2021, 13, 167.

[11] A. Mansurov, J. Ishihara, P. Hosseinchi, L. Potin, TM Marchell, A. Ishihara, J.-MM Williford, AT Alpar, MM Raczy, LT Grey, MA Swartz, JA Hubbell, Nat. ביומד. Eng. 2020, 4, 531.

[12] N. Pasche, D. Neri, Drug Discovery Today 2012, 17, 583.

[13] J. Strauss, CR Heery, JW Kim, C. Jochems, RN Donahue, AS Montgomery, S. McMahon, E. Lamping, JL Marte, RA Madan, M. Bilusic, MR Silver, E. Bertotti, J. שלום, JL Gulley, Clin. Cancer Res. 2019, 25, 99.

[14] K. Jung, JH Ha, JE Kim, JA Kim, YJ Kim, CH Kim, YS Kim, OncoImmunology 2018, 7, e1438800.

[15] A. Mansurov, P. Hosseinchi, K. Chang, AL Lauterbach, LT Grey, AT Alpar, E. Budina, AJ Slezak, S. Kang, S. Cao, A. Solanki, S. Gomes, J.- M. Williford, MA Swartz, JL Mendoza, J. Ishihara, JA Hubbell, Nat. ביומד. Eng. 2022, 6, 819.

[16] HD Chang, A. Radbruch, Expert Rev. Clin. אימונול. 2014, 3, 709.

[17] H. Chang, A. Radbruch, D. Rheumaforschungszentrum, Ann. NY Acad. Sci. 2007, 1109, 40.

[18] S. Tugues, SH Burkhard, I. Ohs, M. Vrohlings, K. Nussbaum, J. Vom Berg, P. Kulig, B. Becher, Cell Death Differ. 2014, 22, 237.

[19] C. Asselin-Paturel, M. Isabelle Vergnon, B. Hamid Echchakir, M. Guillaume Dorothé, M. Sé vrine Blesson, M. Franç oise Gay, B. Fathia Mami-Chouaib, S. Chouaib, Cancer 2001, 91, 113.

[20] JEA Portielje, CHJ Lamers, WHJ Kruit, A. Sparreboom, RLH Bolhuis, G. Stoter, C. Huber, JW Gratama, Clin. Cancer Res. 2003, 9, 76.

[21] JP Leonard, ML שרמן, GL Fisher, LJ Buchanan, G. Larsen, MB Atkins, JA Sosman, JP Dutcher, NJ Vogelzang, JL Ryan, Blood 1997, 90, 2541.

[22] E. Bajetta, M. Del Vecchio, R. Mortarini, R. Nadeau, A. Rakhit, L. Rimassa, C. Fowst, A. Borri, A. Anichini, G. Parmiani, Clin. Cancer Res. 1998, 4, 75.

[23] C. Corbet, O. Feron, Nat. Rev. Cancer 2017, 17, 577. [24] M. Bellone, A. Calcinotto, P. Filipazzi, A. De Milito, S. Fais, L. Rivoltini, Oncoimmunology 2013, 2, e22058.

[25] S. Damgaci, A. Ibrahim-Hashim, PM Enriquez-Navas, S. PilonThomas, A. Guvenis, RJ Gillies, Immunology 2018, 154, 354.

[26] J. Liu, H. Cabral, B. Song, I. Aoki, Z. Chen, N. Nishiyama, Y. Huang, K. Kataoka, P. Mi, ACS Nano 2021, 15, 13526.

[27] A. Tao, GLo Huang, K. Igarashi, T. Hong, S. Liao, F. Stellacci, Y. Matsumoto, T. Yamasoba, K. Kataoka, H. Cabral, Macromol. Biosci. 2020, 20, 1900161.

[28] Y. Mochida, H. Cabral, Y. Miura, F. Albertini, S. Fukushima, K. Osada, N. Nishiyama, K. Kataoka, ACS Nano 2014, 8, 6724.

[29] JS Suk, Q. Xu, N. Kim, J. Hanes, LM Ensign, Adv. משלוח תרופות Rev. 2016, 99, 28.

[30] CY Sun, Y. Liu, JZ Du, ZT Cao, CF Xu, J. Wang, Angew. Chem., Int. אד. 2016, 55, 1010.

[31] A. Ibrahim-Hashim, V. Estrella, Cancer Metastasis Rev. 2019, 38, 149.

[32] G. Trinchieri, F. Gerosa, J. Leukocyte Biol. 1996, 59, 505.

[33] T. Starciuc, B. Malfait, F. Danede, L. Paccou, Y. Guinet, NT Correia, A. Hedoux, J. Pharm. Sci. 2020, 109, 496.

[34] G. Egawa, S. Nakamizo, Y. Natsuaki, H. Doi, Y. Miyachi, K. Kabashima, Stem Cells Int. 2013, 3, 1932.

[35] S. Jayanthi, BP Koppolu, KG Nguyen, SG Smith, BK Felber, TKS Kumar, DA Zaharoff, Stem Cells Int. 2017, 7, 5360.

[36] MP Hwuang, RJ Fecek, T. Qin, WJ Storkus, Y. Wang, J. Controlled Release 2019, 318, 270.

[37] Q. Wang, Y. Wang, J. Ding, C. Wang, X. Zhou, W. Gao, H. Huang, F. Shao, Z. Liu, Nature 2020, 579, 421.

[38] G. Trinchieri, Annu. כומר אימונול. 1995, 13, 251.

[39] L. Meyard, E. Hovenkamp, ​​SA Otto, F. Miedema, J. Immunol. 1996, 156, 2776.

[40] A. Cope, GLe Friec, J. Cardone, C. Kemper, Trends Immunol. 2011, 32, 278.

[41] SP Kerkar, RS Goldszmid, P. Muranski, D. Chinnasamy, Z. Yu, RN Reger, AJ Leonardi, RA Morgan, E. Wang, FM Marincola, G. Trinchieri, SA Rosenberg, NP Restifo, J. Clin . להשקיע. 2011, 121, 4746.

[42] W. Lasek, R. Zago˙zd˙zon, M. Jakobisiak, Cancer Immunol. אימונית. 2014, 63, 419.

[43] C. Zhang, J. Zhang, J. Niu, Z. Zhou, J. Zhang, Z. Tian, ​​Hum. אימונול. 2008, 69, 490.

[44] NG Jacobson, SJ Szabo, RM Weber-Nordt, Z. Zhong, RD Schreiber, JE Darnell, KM Murphy, J. Exp. Med. 1995, 181, 1755.

[45] K. Mimura, JL Teh, H. Okayama, K. Shiraishi, LF Kua, V. Koh, DT Smoot, H. Ashktorab, T. Oike, Y. Suzuki, Z. Fazreen, BR Asuncion, A. Shabbir. , WP Yong, J. So, R. Soong, K. Kono, Cancer Sci. 2018, 109, 43.

[46] T. Watanabe, S. Watanabe, G. Neumann, H. Kida, Y. Kawaoka, J. Virol. 2002, 76, 767.

[47] AS Bergot, A. Durgeau, B. Levacher, BM Colombo, JL Cohen, D. Klatzmann, Cancer Gene Ther. 2010, 17, 645.

[48] ​​R. Dent, M. Trudeau, KI Pritchard, WM Hanna, HK Kahn, CA Sawka, LA Lickley, E. Rawlinson, P. Sun, SA Narod, Clin. Cancer Res. 2007, 13, 4429.

[49] BG Haffty, Q. Yang, M. Reiss, T. Kearney, SA Higgins, J. Weidhaas, L. Harris, W. Hait, D. Toppmeyer, J. Clin. אונקול. 2006, 24, 5652.

[50] AV Paschall, K. Liu, J. Visualized Exp. 2016, 2016, 54040.

[51] A. Marra, G. Viale, G. Curigliano, BMC Med. 2019, 17, 90.

[52] ר' תומאס, ג' אלח'דיירי, ג'יי דקוק, פרונט. אונקול. 2021, 10, 3464.

[53] S. Adams, P. Schmid, HS Rugo, EP Winer, D. Loirat, A. Awada, DW Cescon, H. Iwata, M. Campone, R. Nanda, R. Hui, G. Curigliano, D. Toppmeyer, J. O'Shaughnessy, S. Loi, S. Paluch-Shimon, AR Tan, D. Card, J. Zhao, V. Karantza, J. Cortés, Ann. אונקול. 2019, 30, 397.

[54] LY Dirix, I. Takacs, G. Jerusalem, P. Nikolinakos, HT Arkenau, A. Forero-Torres, R. Boccia, ME Lippman, R. Somer, M. Smakal, LA Emens, B. Hrinczenko, W. Edenfield, J. Gurtler, A. von Heydebreck, HJ Grote, K. Chin, EP Hamilton, Breast Cancer Res. טיפול. 2018, 167, 671.

[55] EA Mittendorf, AV Philips, F. Meric-Bernstam, N. Qiao, Y. Wu, S. Harrington, X. Su, Y. Wang, AM Gonzalez-Angulo, A. Akcakanat, A. Chawla, M. Curran, P. Hwu, P. Sharma, JK Litton, JJ Molldrem, G. Alatrash, Cancer Immunol. מילון 2014, 2, 361.

[56] MT Barrett, E. Lenkiewicz, S. Malasi, A. Basu, JH Yearley, L. Annamalai, AE McCullough, HE Kosiorek, P. Narang, MA Wilson Sayres, M. Chen, KS Anderson, BA Pockaj, Breast Cancer Res. 2018, 20,71.

[57] P. Schmid, S. Adams, HS Rugo, A. Schneeweiss, CH Barrios, H. Iwata, V. Diéras, R. Hegg, S.-A. Im, GS Wright, V. Henschel, L. Molinero, SY Chui, R. Funke, A. Husain, EP Winer, S. Loi, LA Emens, N. Engl. J. Med. 2018, 379, 2108.

[58] MK Gately, U. Gubler, MJ Brunda, RR Nadeau, TD Anderson, JM Lipman, U. Sarmiento, Ther. אימונול. 1994, 1, 187.

[59] UM Sarmiento, JH Riley, PA Knaack, JM Lipman, JM Becker, MK Gately, R. Chizzonite, TD Anderson, Lab. להשקיע. 1994, 71, 862.

[60] VM Eng, BD Car, B. Schnyder, M. Lorenz, S. Lugli, M. Aguet, TD Anderson, B. Ryffel, VFJ Quesniaux, J. Exp. Med. 1995, 181, 1893.

[61] JA Gollob, KG Veenstra, RA Parker, JW Mier, DF McDermott, D. Clancy, L. Tutin, H. Koon, MB Atkins, J. Clin. אונקול. 2003, 21, 2564.

[62] Y. Agarwal, LE Milling, JYH Chang, L. Santollani, A. Sheen, EA Lutz, A. Tabet, J. Stinson, K. Ni, KA Rodrigues, TJ Moyer, MB Melo, DJ Irvine, KD Wittrup , נאט. ביומד. Eng. 2022, 6, 129.

[63] ML Lucas, L. Heller, D. Coppola, R. Heller, Mol. ת'ר. 2002, 5, 668.

[64] SL Hewitt, D. Bailey, J. Zielinski, A. Apte, F. Musenge, R. Karp, S. Burke, F. Garcon, A. Mishra, S. Gurumurthy, A. Watkins, K. Arnold, J. Moynihan, E. Clancy-Thompson, K. Mulgrew, G. Adjei, K. Deschler, D. Potz, G. Moody, DA Leinster, S. Novick, M. Sulikowski, C. Bagnall, P. Martin, JM Lapointe, H. Si, C. Morehouse, M. Sedic, RW Wilkinson, R. Herbst, et al., Clin. Cancer Res. 2020, 26, 6284.

[65] RS Riley, CH June, R. Langer, MJ Mitchell, Nat. Rev. Drug Discovery 2019, 18, 175.

[66] I. Melero, E. Castanon, M. Alvarez, S. Champiat, A. Marabelle, Nat. כומר קלינ. אונקול. 2021, 18, 558.

[67] LM Wein, JT Wu, DH Kirn, Cancer Res. 2003, 63, 1317.

[68] J. Hong, C.-O. Yun, BMC Biomed. Eng. 2019, 1, 17.

[69] A. Mukhopadhyay, J. Wright, S. Shirley, DA Canton, C. Burkart, RJ Connolly, JS Campbell, RH Pierce, Gene Ther. 2018, 26, 1.

[70] MA Postow, MK Callahan, CA Barker, Y. Yamada, J. Yuan, S. Kitano, Z. Mu, T. Rasalan, M. Adamow, E. Ritter, C. Sedrak, AA Jungbluth, R. Chua , AS Yang, R.-A. רומן, S. Rosner, B. Benson, JP Allison, AM Lesokhin, S. Gnjatic, JD Wolchok, N. Engl. J. Med. 2012, 366, 925.

[71] EF Stamell, JD Wolchok, S. Gnjatic, NY Lee, I. Brownell, Int. ג'יי רדיאט. Oncol., Biol., Phys. 2013, 85, 293.

[72] EB Golden, S. Demaria, PB Schiff, A. Chachoua, SC Formenti, Cancer Immunol. מילון 2013, 1, 365.

[73] TY Seiwert, AP Kiess, J. Clin. אונקול. 2021, 39, 1.

[74] E. Gutierrez, M. Bigelow, C. LaCroix, P. Kirby, L. Markowitz, M. Naill, S. O'Neil, PA Hull, J. Engelhardt, J.-M. Cuillerott, A. Cheung, A. Grinberg, N. Wagtmann, Cancer Res. 2021, 81, 1714

[75] R. Varma, K. Liu, C. Bonzon, R. Rashid, N. Rodriguez, N. Hassanzadeh-Kiabi, C. Ardila, SY Chu, US Muchhal, JR Desjarlais, MJ Bernett, Cancer Res. 2020, 80, 5549.

[76] J. Sharifi, LA Khawli, P. Hu, S. King, AL Epstein, Hybrid Hybridomics 2001, 20, 305.

[77] C. Halin, S. Rondini, F. Nilsson, A. Berndt, H. Kosmehl, L. Zardi, D. Neri, Nat. ביוטכנולוגיה. 2002, 20, 264.

[78] S. Mura, J. Nicolas, P. Couvreur, Nat. מאטר. 2013, 12, 991.

[79] E. Becht, NA Giraldo, L. Lacroix, B. Buttard, N. Elarouci, F. Petitprez, J. Selves, P. Laurent-Puig, C. Sautès-Fridman, WH Fridman, A. de Reyniès, גנום ביול. 2016, 17, 218

אולי גם תרצה