מבחן TUNEL: כלי רב עוצמה להערכת פגיעה בכליות

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

תַקצִיר:בדיקת דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז מסוף dUTP nick-end (TUNEL) היא בדיקה ותיקה המשמשת לזיהוי פרגמנטציה של DNA הקשורה למוות תאי (3'-OH termini DNA) על ידי אנדונוקלאזות. מכיוון שהאנזימים הללו פעילים במיוחד בכליה, נעשה שימוש נרחב ב-TUNEL לזיהוי ולכימת פיצול DNA ומוות תאי בתרביתכִּליָה תאים וכליות בעלי חיים ובני אדם הנובעים מהפגיעה רעילה או היפוקסית. האפיון המוקדם של TUNEL כמבחן אפופטוטי הוביל להרבה פרשנויות מוטעות של המנגנונים שלתא כליה פציעה.עם זאת, TUNEL הופך פופולרי יותר ויותר עבורפגיעה בכליותהערכה כי ניתן להשתמש בו באופן אוניברסלי בתאי תרבית ורקמות ולכל מנגנוני המוות של התאים. יתר על כן, הוא רגיש, מדויק, כמותי, מקושר בקלות לתאים מסוימים או לתאי רקמה, וניתן לשלב אותו עם אימונוהיסטוכימיה כדי לאפשר זיהוי אמין של סוגי תאים או מנגנונים סבירים של מוות תאים. באופן מסורתי, ניתוח TUNEL הוגבל לנוכחות או היעדרו של אות TUNEL. עם זאת, מידע נוסף על מנגנון המוות של תאים ניתן לקבל מניתוח של דפוסי TUNEL.

טיפול בהפרעת כליות עוררות מינית עם אבקת תוסף cistanche

מבוא ה-DNA היא המולקולה היחידה בתא שניתן לתקן, אך לא ניתן לסנתז אותה מחדש לחלוטין לאחר נזק. הרס ה-DNA הוא אחד השלבים האחרונים של תהליך מוות של תאי רב-שלבי, שעלול להיות הפיך עד לנקודה של פיצול DNA סופני. לכן, האחרון הוא תכונה נפוצה וסמן מכניסטי של מוות בלתי הפיך של תאים [1,2]. פיצול DNA הקשור למוות תאי "מומחז" בדרך כלל על ידי מבחן ה-dUTP nick-end תיוג (TUNEL), סולם DNA או בדיקת שביט [3]. אלקטרופורזה בשדה דופק [4] ובדיקת סינתזה אקראית של אוליגונוקלאוטידים (ROPS) [5] הם שני מבחנים משניים אחרים שבהם נעשה שימוש נדיר. השימוש במבחן שביט מוגבל ל-in vitro (תאים מתורבתים) בלבד, והכימות שלו הוא עתיר עבודה [6]. ביצוע מבחני שביט בגרעיני תאים מבודדים אפשרי, אך הוא קשור לגורמים מבלבלים נוספים במהלך בידוד הגרעינים. השני, בדיקת סולם DNA, אינו שיטה כמותית, והתקווה הראשונית שדפוס הסולם לעומת המריחה יבחין בין אפופטוזיס לנמק, בהתאמה, התבטלה מאחר שגישה זו התבררה כלא אמינה [7]. מבין שלוש השיטות העיקריות, TUNEL היא הרגישה ביותר, הפחות גוזלת זמן, והכי ישימה אוניברסלית. זה יכול לשמש בתאים ורקמות מתורבתים ולכל מנגנוני המוות של התא. הוא מדויק, כמותי, מקושר בקלות לתאים מסוימים או לתאי רקמה, וניתן לשלב אותו עם אימונוהיסטוכימיה כדי לאפשר זיהוי אמין של סוגי התאים או מנגנוני הפגיעה בתאים הקשורים לאותות חיוביים של TUNEL [2].

הפסקות DNA הניתנות למדידה על ידי TUNEL מיוצרות בעיקר על ידי אנדונוקלאזות אפופטוטיות. האנדונוקלאזים הפעילים ביותר בכליה הם deoxyribonuclease 1 (DNase I) ו-endonuclease G (EndoG) [8-10]. DNase I הוא האנדונוקלאז האפופטוטי הפעיל והשופע ביותר ביונקים [11]. הכליות, בלוטות הרוק, הלבלב והמעי הם איברים הידועים כמייצרים כמויות גבוהות של DNase I. תאי אפיתל בבלוטות הרוק, הלבלב והמעי מפרישים DNase I כאנזים עיכול במערכת העיכול. חלק מה-DNase I תאי נלחם נגד תאי מארח "זרים" של DNA [12]. DNase I שאינו מופרש מהווה סכנה נסתרת ל-DNA של התא המארח, אך בדרך כלל DNases אינם פועלים על ה-DNA של התא המארח עד לפציעה או למותו של התא. בכליה, DNase I מופרש על ידי תאי אפיתל צינוריים, ככל הנראה כדי להשמיד וירוסים וחיידקים בשתן. פונקציה זו מתרחשת ככל הנראה בשילוב עם פרוטאינזים, בפרט, מפרין, שהוא הפרוטאין העיקרי בשתן [13]. למרות שהוא מגן מפני זיהום, הנוכחות של DNase פעיל מאוד בכליה הופכת את האיבר הזה לפגיע לפציעה, כאשר הפעילות של DNase ידועה כציטוטוקסית לתאי המארח. DNases מקדמים מוות תאים המושרה על ידי גירויים רעילים או היפוקסיים ומשמידים את כל תאי ה-DNA של הכליה המארח המשתחררים כתוצאה ממוות תאי.

כליותהם איברים מסננים המסירים תרכובות רעילות מהגוף. פעילות DNase I גבוהה בכליות הופכת את תאי הכליה לרגישים מאוד לפציעה של תרכובות רעילות ותוצרים מטבוליים שלהן. זה הופך את TUNEL לשיטה המתאימה והישימה ביותר למדידת פגיעה בכליה. בסקירה זו, נתמקד ב-TUNEL כמבחן נרחב, אינפורמטיבי ומדויק למדידת מוות תאי ופציעה ברקמות בכליה. נדון בהיבטים של TUNEL כפי שהוא חל על מחלות כליות ופציעות ונזהה איכויות, טכניקות ותכונות שאינן בשימוש של TUNEL כדי לקדם את השימוש היצרני והמתאים במבחן רב עוצמה זה במחקר, אבחון וטיפול במחלות כליה. נדון גם בתבניות תמונה שונות של TUNEL שניתן לקשר למנגנוני מוות של תאים. הנקודות שהועלו בסקירה זו ישימות באופן נרחב לשימוש ב-TUNEL באיברים אחרים מלבד הכליה.

מילות מפתח:TUNEL; מוות של תאים; כִּליָה; DNases; אנדונוקליזות; פגיעה ברקמות

עקרונות TUNELמבחן TUNEL פותח בשנת 1992 על ידי Gorczyca et al. [14] וגבריאלי ואח'. [15], באמצעות תיוג פלואורכרום ואבידין-פרוקסידאז, בהתאמה. באותה תקופה, היה צורך נואש בשיטות חדשות להערכת אפופטוזיס, ו-TUNEL מילאה את הפער הזה בהצלחה. בתחילה שווק כבדיקה לשבירות גדילי DNA במהלך או קשור לאפופטוזיס [14,16], בהיעדר מבחני טוב יותר, TUNEL הפך במהירות למבחן הסטנדרטי לאפופטוזיס [17,18]. עם זאת, החוקרים זיהו כמעט מיד ש-TUNEL מדדה ללא הבחנה כל פיצול DNA, לא רק זה הקשור לאפופטוזיס [19-21]. עם זאת, הצורך במבחנים אפופטוזיים היה כה גדול עד כי בדרך כלל התעלמו מהדיווחים הנדירים על היותו של TUNEL לא ספציפי לאפופטוזיס. זה הוביל לכמות עצומה של דיווחים חיוביים כוזבים על אפופטוזיס בכליות ובאיברים אחרים, עד לרמה שבה עד 20 אחוזים מכלל התאים דווחו אפופטוטיים גם ללא פגיעה [22-25] כאשר שינויים כמו קטן כמו 0.01 אחוז יכול להיות עדות מובהקת סטטיסטית לפגיעה ברקמות.

בדיקת TUNEL חווה מחודשת בשנים האחרונות מאז תום הפריחה במחקרי האפופטוזיס לפני מספר שנים. החיפוש שלנו ב-PubMed של מאמרי כתב עת הכוללים מונחים "כליות" ו-"TUNEL" הניב למעלה מ-1500 תוצאות משנת 1992 עד 2020. בשנת 2019 פורסמו 170 מאמרים, המספר הגבוה ביותר בשנה אחת ב-28 השנים האחרונות (איור S1) ואשר מהווים את רוב המאמרים שנסקרו עבור סקירה זו. מחקרים רבים השתמשו בחיוביות של TUNEL כמדד אוניברסלי למוות תאים הקשור לפיצול DNA בסוגים אחרים של מוות תאים מלבד אפופטוזיס. לדוגמה, פרופטוזיס, צורה שהתגלתה לאחרונה של מוות תאי מתוכנת, לא אפופטוטי, המופעל על ידי נזק חמצוני המתרחש במהלך איסכמיה-רפרפוזיה של הכליה (IR) בעכברים, יכול להיות מזוהה על ידי TUNEL [26]. Pyroptosis, שהיא צורה דלקתית של מוות תאי מתוכנת המובדל מאפופטוזיס ונמק, נמצא קשור לאותות חיוביים ל-TUNEL [27,28]. חיוביות של TUNEL נצפתה במהלך נקרופטוזיס שתרמה לדלדול מתקדם של תאי צינורית הכליה בחולדות שעברו כריתת כליה תת-טואלית [29]. בכליות וברקמות אחרות נמצאו אותות TUNEL חיוביים בנמק [30,31], אוטופגיה לא מווסתת [32-35], אנויקיס [36,37], קטסטרופה מיטוטית [35,38], אוטוליזה [39], Pautolysis [39], פרופטוזיס [40], ואפונורוזיס [30], המדגימים כי TUNEL הוא בדיקה אוניברסלית באמת למוות בלתי הפיך של תאים.

מבחן TUNEL מבוסס על סימון של קצוות 3'OH על ידי אנזים DNA ספציפי לקצה 3'OH, טרמינל deoxynucleotidyl transferase (TdT) (איור). השימוש ב-DNA פולימראז או ב-Klenow fragment DNA פולימראז במקום TdT עשוי לסייע בקביעת סוג קצוות 3'OH (חריצים, רווחים או אוליגוים תלויים מעל) מכיוון שפולימראזות DNA זקוקות לתבנית (גדיל ה-DNA ההפוך) ולכן לא יתויגו קצוות DNA תלויים או בולטים. חשוב לזכור שייצור קצוות 3ZOH DNA אינו ייחודי לאנדונוקליזות אפופטוטיות (הפורקות DNA). קצוות 3'OH DNA הם אות "מתקשר" עיקרי, מכנה משותף של רוב אנזימי ה-DNA. הם מיוצרים ומשמשים כמעט על ידי כל אנזימי ה-DNA באוקריוטים, כולל אנדונוקלאזים לתיקון DNA (אפוריני/אפירימידיני, AP), אקסונוקלאזות, פולימראזות DNA, ליגזות DNA, טרנספראזות DNA וטופואיזומראזות. בנוסף, ניתן להמיר 3'Id 3z-sugar, או 3z-protein conjugates ל-3'OH termini על ידי phosphatases, glycosylases ו-proteinases, בהתאמה. זו הסיבה שהבנה מדויקת של מה נמדד נחוצה ליישום מוצלח של TUNEL ולפרשנות של תוצאותיה.

בהשוואה לשתי שיטות ראשוניות אחרות למדידת פיצול דנ"א, סולם DNA ובדיקת שביט, ל-TUNEL יש את היתרון שהיא מבוססת על זיהוי של קצה DNA ולא על שברים (איור 2). תיאורטית, TUNEL צריך להיות יותר רגיש וליניארי לזיהוי של פיצול DNA ראשוני (נמוך) מאשר סולם DNA או כוכב שביט, שלשניהם יש תקופת פיגור של הצטברות של שברים קטנים בעלי ניידות גבוהה. בכל מקרה, למחקרים המשלבים את TUNEL עם כוכב השביט )41,42] או סולם ה-DNA [43,44] יש יתרון מסוים בתפיסת פיצול DNA מוקדם עם רגישות מקסימלית.

יישומי TUNELTUNEL משמש לזיהוי ולכימת פגיעה בכליות במחקרים קליניים ובסיסיים רעלניים במגוון יישומים, כולל טיפולים רפואיים [45], סביבתיים [46], חשיפה לחקלאות [41] ותעשייתיות [47] ובעלי חיים [48] ] ומדעי המזון [49]. TUNEL ישים לכל סוגי התאים, האיברים והמינים שיש להם DNA ו-DNases, שכולל כמעט את כל המינים. נעשה שימוש ב-TUNEL לזיהוי ולכימת פגיעה בכליות במגוון רחב של בעלי חיים, כולל דג זברה [50], דגי אורז יפני [51], תרנגולות [48], גרבילים [52], עכברים [41], חולדות [45], רב שלה [53], מיני חזירים [54], ובני אדם [55]. יתרון חשוב של TUNEL הוא שניתן להשתמש בו בתאים מתורבתים קבועים כמו גם ברקמות קבועות. זה מספק עקביות מתודולוגית להשוואה בין תוצאות in vitro ו-in vivo במחקרים שבהם ניתן לחקור מנגנונים בתאי כליה מתורבתים, בעוד ההשלכות in vivo מוערכות בכליות החיות. ניתן להשתמש בכל דבר שנמצא בין תאים ורקמות שלמים גם כן, כולל כדוריות תאים מתורבתות [56] ופרוסות כליה ex vivo [57,58].

עוצמת ה-TUNEL מבחינת עוצמת האות או מספר התאים החיוביים של TUNEL עשויה להשתנות בין המינים בהתאם לפעילות של DNases. מניסיוננו, לכליית חולדה יש ​​יותר DNase I פעיל מאשר כליית עכבר, ועוצמת האות החיובית של TUNEL מתאמת לכך. כאשר הכליה מושווה לאיברים אחרים, האות החיובי שלה ל-TUNEL הוא חזק מאוד ודומה לאיברים אחרים בעלי פעילות DNase I גבוהה, כגון המעי ובלוטת הרוק. בקצה השני של הספקטרום, עוצמת האות החיובית הנמוכה ביותר של TUNEL נצפית בתאי מוח ותאי גידול/סרטן, כאשר ביטוי DNase I מושבת ככל הנראה על ידי שחבור חלופי באזור המקודד [59]. אות חיובי ל-TUNEL נצפה בכל סוגי התאים בכליה. בממוצע, האפיתל הצינורי ניזוק לעתים קרובות יותר מאשר גלומרולי, במיוחד בפציעות חריפות (איור 3A). זה מתאם היטב עם פעילות DNase I השוררת בסוגי תאים אלה. אם לשפוט לפי הבדלי מין וגיל שנצפו בניסויים שלנו, DNase I נמצא בשפע ופעיל יותר אצל זכרים מאשר נקבות ובעלי חיים בגיל העמידה בהשוואה לבעלי חיים מבוגרים או יילודים. עם זאת, לא ניכר הבדל ברור בחיוביות של TUNEL ביחס למין או לגיל, כנראה בגלל שהבולט או נשלט על ידי גורמים אחרים. במודלים מסוימים של כליות (כגון איסכמיה-פרפוזיה), DNase I מושרה [9]; בעוד שבאחרים, היא אינה מדוכאת ואף עשויה להיות מדוכאת (לדוגמה, ברעילות של ציספלטין) [10]. הפעלה של אנדונוקלאזים, אם קיימים, הוכחה כמתרחשת ב-24 השעות הראשונות לאחר פגיעה בכליות [9,60,61]. לכן, זה לא היה מפתיע שלפחות מחצית מהיישומים של TUNEL במחקר הכליות בסקירה זו שימשו לפגיעה בכליות חריפה (AKI) מכיוון שההערכה של AKI נעשית לרוב תוך 24 עד 72 שעות לאחר הפציעה כאשר האנדונוקלאזים הפעילים ביותר . רשימת מחקרי AKI ארוכה וכוללת פציעות רעילות, ספטי, השתלות ופציעות היפוקסיות. בעבודה זו, סקרנו את המודלים, סוגי החשיפה, הטיפולים, לוחות הזמנים של ההערכה וסוגי התאים שהושפעו במחקרים אלה. המחקרים שנסקרו כיסו מצבים חריפים ומעורבים של פגיעה בכליות ומחלת כליות כרונית.

האם נצפית פגיעה בכליות עם אות חיובי ל-TUNEL באבוביות או בגלומרולוס תלוי בסוג הגורם המזיק או המחלה. לדוגמה, זאבת נפריטיס בבני אדם ונזקי ננו-חלקיקי ניקל תוארו כבעלי אותות חיוביים ל-TUNEL לחלוטין [62,63]. מצד שני, איסכמיה-פרפוזיה ונפרופתיה סוכרתית הנגרמת על ידי סטרפטוזוטוצין בחולדות יצרו תאים חיוביים ל-TUNEL רק בצינוריות [64,65]. צינוריות פרוקסימליות, הלולאה של Henle, צינוריות דיסטליות וצינורות קולקטיביים הם לרוב חיוביים ל-TUNEL במודלים של איסכמיה-פרפוזיה חוזרת. תאים חיוביים ל-TUNEL הן בגלומרולי והן בצינוריות תוארו בחולדות שנחשפו לתרופות כמו ציקלוספורין A [66] ודוקסורוביצין [67] או חומרים למוצרי צריכה כגון ננו-חלקיקי תחמוצת אבץ [68] ובמודל חולדה של סוכרת [68] 69]. AKI המושרה בהלם ספטי בבני אדם היה קשור גם לתאים גלומרולריים וגם לתאים חיוביים ל-TUNEL [70]. חסימת המעי הדק בלולאה סגורה חנוקה גרמה לחיוביות TUNEL בכליה תוך 3 שעות [87].

AKI יכול להתרחש לאחר השתלה ופציעות היפוקסיות. דחיית אלולוגנט בבני אדם קשורה בדרך כלל לעלייה של תאים חיוביים ל-TUNEL [88,89]. לאחר איסכמיה קרה, תאים חיוביים ל-TUNEL נצפו בדרך כלל תוך 2-24 שעות במהלך רפרפוזיה [90], או באופן צר יותר, בין 14 ל-17 שעות לאחר איסכמיה [91], ולפעמים אנו עדיין נצפים עד 7 ימים ב דחיית השתלה [92]. באופן דומה, במודלים של איסכמיה-רפרפוזיה, תאים חיוביים ל-TUNEL נצפו לרוב 24 שעות לאחר פרפוזיה חוזרת [44,93,94], או בטווח שבין 4 [95,96] ל-72 שעות [97]. הן במחקרי השתלה והן במחקרי AKI איסכמי, תאים חיוביים ל-TUNEL הותרו לתאי אפיתל צינוריים דיסטליים ופרוקסימליים [44,93]. בעכברכליותלאחר פגיעה באיסכמיה-פרפוזיה, תאים חיוביים ל-TUNEL תוארו כמרוכזים בצומת הקורטיקומדולרי, היעד הרגיל של פגיעה איסכמית [98].

פציעה אקוטית וכרונית מעורבת, שבה חשיפות רעילות, מצבי מחלה ו/או הערכות היו חריפות (כלומר שעות, ימים) וכרוניות (כלומר, שבועות, חודשים, שנים) באותו מחקר, נצפו בהשתלה אנושית דחייה (ביופסיה שבוע עד 3 שנים לאחר ההשתלה) [88], זיהום בנגיף הפטיטיס E בחזירים (7 ו-14 ימים לאחר החיסון) [52], מתח הנגרם כתוצאה מ-CO2 pneumoperitoneum בהידרונפרוטיקהכליות(2 שבועות הידרונפרוזיס, יומיים לאחר פנאומפריטוניום) [53], גלומרולונפריטיס שגשוג מנזגיאלי הנגרמת על ידי ארס נחשים (1 עד 14 ימים לאחר ההזרקה) [99], חסימה חד צדדית של השופכה (1 עד 14 ימים של חסימה) [100], חשיפה לאוראניל אצטט (1 עד 28 ימים של חשיפה) [101], נפרופתיה חומצה אריסטוכולית (חשיפה יומית של 5 ו30-ימים) [102], והיפרוקסיה של יילודים (נבדקה 1 עד 60 ימים לאחר הלידה, חשופה להיפרוקסיה לראשונה 14 ימים) [103]. 14 ימים לאחר ההשפעה היא נקודת זמן נפוצה מאוד להערכה עבור סוגים אלהפציעות כליות[52,53,99,101,103]. ברוב המקרים, תאים חיוביים ל-TUNEL היו מקומיים בצינוריות ובצינורות קולקטיביים. היוצא מן הכלל היחיד היה רעילות ארס נחשים, שפגעה בעיקר בגלומרולי [99].

כְּרוֹנִיכִּליָהמחלה (CKD), המוגדרת כנוכחות שלכִּליָהנזק או ירידה בקצב הסינון הגלומרולרי (GFR) בבני אדם למשך יותר מ-3 חודשים, הם גם נושא נפוץ להערכת TUNEL, שיכולה לקבוע אם CKD קשור לפרוגרסיבינזק לכליות.מחלת ה-CKD הנחקרת ביותר בה מיושמת TUNEL היא נפרופתיה סוכרתית. הפציעה שזוהתה על ידי חיוביות TUNEL התרחשה באבוביות ופודוציטים [69] בחולי סוכרת עם הופעת סוכרת לפני בדיקת TUNEL שנעה בין 7 ל-30 שנים [104,105] ו-2 עד 16 שבועות לאחר טיפול בסטרפטוזוטוצין במכרסמים [106,107]. היסטופתולוגיה חיובית ל-TUNEL דומה דווחה בנפרופתיה של אימונוגלובולין A [22]. בזאבת נפריטיס ו- membranoproliferative glomerulonephritis, חיוביות של TUNEL נראתה בעיקר בגלומרולי [62,108,109]. מצד שני, מחקרי בטיחות תרופתיים של cisplatin [110], chloroquine [45], doxorubicin [67], finasteride [23], tacrolimus [111], ו-levetiracetam [24] הבחינו בעיקר בנזק צינורי. כמו כן, הפציעה החריפה המתמשכת שזוהתה על ידי תאים חיוביים ל-TUNEL תוארה במחקרים על נפרופתיה של חומצת שתן [112], מחסור במתיונין [48], חשיפה לרעלים סביבתיים מיקרוציסטין-LR [50], וקדמיום [113] וב. קשר עם סידן-אוקסלט המושרהכִּליָהאבנים [114] וננו-חלקיקים מסויידים [115]. בעוד שזיהוי הנזק המתקדם בכליות במהלך CKD באמצעות מבחן TUNEL הוא כלי אבחוני שימושי, שילוב של מבחן TUNEL עם אימונוהיסטוכימיה (IHC) יהיה אולי אינפורמטיבי עוד יותר בקביעת מנגנון הפציעה.

טכניקות כימות וקולקליזציה של TUNEL

שיטות לכימות TUNEL משתנות. ברוב הדיווחים, תאים/גרעינים חיוביים ל-TUNEL נכמתים כאחוז מסך התאים/גרעינים [83,116,117]. זה נראה הדבר הנכון לעשות, אם כי מספר התאים החיוביים ל-TUNEL כנראה אינו מתאים בדיוק למספר התאים המתים. ייתכן שתאים מסוימים לא הגיעו לרמות ניתנות לזיהוי של פיצול DNA, בעוד שאחרים כבר יכלו להיות מסולקים על ידי מקרופאגים. נעשה שימוש גם בכימות של מספר התאים החיוביים ל-TUNEL ליחידה מרובעת (mm2) [118], אך שיטה זו נראית פחות מדויקת מכיוון שהיא תלויה במיקום ובתכולת סוג התא של האזורים. קטעי קליפת המוח מכילים בעיקר גלומרולי, צינוריות, כלי דם וקרניים מדולריות, בעוד שקטעים מדולריים מכילים בעיקר לולאות של הנלה, צינורות איסוף וכלי דם. כימות "לכל שדה" בהחלט תלוי מהו השדה [72,119], וכימות "למקטע" הוא, אפילו יותר, לא מוגדר [61,120]. נראה כי מדידות מזוהות בצורה גרועה, כגון "ציון היסטולוגי" [121], "אינדקס אפופטוטי" [113], "שיעור אפופטוזיס" [92], "אחוז האפופטוזיס" [122], או אחוז ביקורת לא מטופלת [123,124] להיות אפילו פחות מתאים, ולהקשות על הפרשנות ולא להשוות עם רוב המחקרים.

מוות תאים בתאים שכנים מתחיל בצורה לא אחידה מכיוון שהוא תלוי בכלי הדם, מחזור התא ומשתנים אחרים. זה גורם לעתים קרובות לצביעה לא אחידה של TUNEL של תאים ברקמה [45,96,125]. באופן מפתיע, העוצמה הכללית של האות החיובי של TUNEL אינה משמשת למדידת TUNEL, למרות שהיא תלויה ישירות במידת פיצול ה-DNA. זה אולי בגלל שתאים נחשבים למתים ללא תלות בעוצמת האות TUNEL, שכן תא לא יכול להיות "מת יותר" אם צביעת TUNEL היא אינטנסיבית יותר. למרות שקשה להשוות מחקרים המשתמשים במגוון רחב של שיטות לכימות תוצאות TUNEL, כמות התאים החיוביים ל-TUNEL בחיות ביקורת היא בדרך כלל מתחת ל-2 אחוזים [75,99,100,116,126]. פציעה חריפה קשורה לעלייה של ~5-40× בחיוביות TUNEL [79,126,127]. במהלך פציעה כרונית, העלייה בתאים החיוביים ל-TUNEL נמוכה מעט, פי 2-20-, [29,43,65] בהשוואה לביקורות לא מטופלות.

מבחן TUNEL הראשוני המבוסס על צביעת דיאמינובנזידין (DAB) תוכנן עבור מיקרוסקופ אור [14,15]. שיטה מסורתית זו עדיין הייתה בשימוש בשני שליש מהמחקרים שנסקרו בסקירה זו וברוב המכריע של מחקרי ביופסיה אנושיים. הכימות נעשה על ידי ספירת תאים ידנית, ולמרות שהוא מדויק, הוא גוזל זמן. לעתים קרובות, לא נעשה שימוש בכימות כלל, והתוצאות מוצגות באמצעות תמונות של דגימות מטופלות ומוכתמות כהוכחה פשוטה לכך שהתרחש מוות של תאים. אוטומציה עשויה להאיץ את תהליך הכימות [128,129]. עם זאת, לא ניתן לשלב DAB עם כל צביעה אחרת באותה דגימה, ולפיכך TUNEL מבוסס DAB יכול לספק רק את מספר התאים המתים, ללא כל זיהוי של סוג התא (למעט זיהוי חזותי) או מנגנון מוות תאי.

בעוד שמחקרים בבני אדם מסתמכים ברובם על TUNEL מבוסס DAB תוך שימוש במיקרוסקופ אור, כמחצית ממחקרי בעלי חיים משתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנטי FL (איור 3). TUNEL פלואורסצנטי מושך מבחינה ויזואלית, ניתן לפירוש בקלות, ויש לו מספר יתרונות מרכזיים. בנוסף לכימות מדויקת על ידי זיהוי של גרעינים חיוביים ל-TUNEL או עוצמת הצבע הממוצעת, אות TUNEL ניאון FL יכול להיות colocalized עם צבעים אחרים להיסטוכימיה (למשל, DAPI) (איור 3A) או IHC (איור 3B). באחרונים, השימוש בסמני חלבון עשוי לעזור לזהות אותות חיוביים ל-TUNEL הקשורים לשוניםכִּליָהתאים או לתת מידע על סוג המוות של התא. לא הצלחנו למצוא דוגמאות ל-TUNEL בשילוב עם צביעה כפולה של נוגדני IHC. בעוד ששילוב כזה יהיה אינפורמטיבי מאוד, למשל, לזיהוי מנגנון מוות של תאים בסוגי תאים מסוימים, הקשיים הטכניים הקשורים לצביעה כזו עשויים לעלות על היתרונות.

זיהוי שלכִּליָהסוג תא הוא בהחלט לא בעיה עבור מנוסהכִּליָהפתולוג [104]. בשל כך, השימוש בסמנים נוספים לזיהוי סוג תא, למשל, באמצעות CD31 לזיהוי תאי אנדותל [130], הוא נדיר. עם זאת, לעתים קרובות נעשה שימוש בסמני חלבון IHC לאפיון של פגיעה ברקמות. רוב המחקרים משתמשים בחיובי TUNEL כעדות היחידה לאפופטוזיס. במחקרים אחרים, ההכרה בכך שחיוביות TUNEL אינה ספציפית לאפופטוזיס הובילה להרבה סמנים מורפולוגיים (למשל, צביעת המטוקסילין ואאוזין או חומצה מחזורית), ביוכימיים וסמנים IHC לשילוב עם צביעת TUNEL כדי לאשר אפופטוזיס. הסמן הנפוץ ביותר לאפופטוזיס תלוי קספאז הוא קספאז מפוצל (פעיל)-3 על ידי שימוש בנוגדן שאינו מזהה את הקספאז בגודל מלא-3 [131,132]. גם מבחני TUNEL וגם מבחני קספאז{12}} הראו צביעה צינורית בלבד, לא גלומרולרית, באיסכמיה-רפרפוזיה של חולדה [64]. מחקרי קספס אחרים השתמשו בקספס-1 [27], -9 [53], -11 [28] ו--12 [75]. סמנים אפופטוטיים אחרים כללו את משפחת B-cell lymphoma 2 (Bcl2) של חלבונים Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] ו-Bad [43]; קולטן אפופטוטי Fas [52] וקולטן-ליגנד אפופטוטי FasL [66]; גורמי שעתוק חלבון (FOX) Fox01 [133] ו-Fox03 [27]; וציטוכרום c [53]. דלקת זוהתה על ידי IHC של tumor necrosis factor-alpha (TNF) [134]; גורמי גדילת הגידול TGF [66] ו-TGF- 1 [135]; serine/threonine kinase 1 (SGK1) [135]; פלבופרוטאין העברת אלקטרונים, תת-יחידה בטא (ETF) [136]; יאנוס קינאז-2 (JAK2) [137]; מתמר אותות ומפעיל של תעתיק 3 (STAT3) [137]; משפר גורם גרעיני קאפה-שרשרת קלה של תאי B משופעלים (NF-κB) [137] וחלבון המעכב שלו IκB [137]. לכִּליָההערכת פציעה, מולקולת פגיעה בכליות-1 (KIM-1) [24], ערוץ אקוופורין-1 (AQP-1) [45], גורם הגורם להיפוקסיה {{7} }אלפא גורם שעתוק (HIF-1) ​​[103], טרנספורטר חומצות אמינו מסוג Asc-1 (Asc-1) [121], יעד יונק של rapamycin (mTOR) [131] קינאז נעשה שימוש ב-transglutaminase II [89]. פגיעה בכליות חמצונית נחקרה באמצעות סמנים כגון 8-הידרוקסיגואנוזין (8OHdG) [102], ליפוקלין הקשור ל- neutrophil gelatinase-associated (NGAL) [102], NAD-dependent deacetylase sirtuin-1 (SIRT1) [138] , ו-heme oxygenase 1 (HO-1) [90]. קינאזות נחקרו באינטנסיביות, כולל מסלול c-Jun N-terminal kinase (JNK) [101], phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/nuclear factor erythroid 2-קשור לגורם שעתוק גורם 2 (PI3K/ מסלול Akt/Nrf2) [46], pannexin-1 (PANX1) חלבון ממברנה מרווח חיבור פלזמה [26], וקינאז חלבון מופעל על ידי מיטוגן/קינאז מווסת אות חוץ-תאי (MAPK/ERK) [26]. מחקרים על אנדונוקלאזים אפופטוטיים כללו DNase (CAD) [139], DNase I [108], ו-EndoG [139], וסמני נזק ל-DNA כללו חלבון גידול p53 (p53) [99] וחלבון הקשור לדינמין 1 (PARP1 ) [66]. כמה מחקרים מצאו גם את ההערכה של אפופטוזיס בתיווך מתח הרשתית האנדופלזמית ופגיעת רקמות מועילה [75].

בהתחשב במספר רב של מחקרים מכניסטיים שנסקרו והיתרון בשילוב של TUNEL עם סמני IHC לזיהוי מנגנוני מוות של תאים, ניתן היה לצפות למחקרים רבים המשתמשים ב-colocalization בין השניים. האנליזה עשויה להתבצע על ידי קולקליזציה של פיקסל אחר פיקסל בין תאים חיוביים ל-TUNEL וסמני IHC, סמן IHC ממוצע עוצמה באזורים חיוביים ל-TUNEL, או אות חיובי ל-TUNEL פירושו עוצמה באזורים חיוביים לסמן IHC. למרבה הצער, היתרון הזה של TUNEL שימש רק במחקרים בודדים. תאים חיוביים ל-TUNEL עברו קולקאליזציה עם קספאז מפוצל-3 בכִּליָהצינוריות במהלך רעילות פרצטמול בחולדות [74]. שילוב של IHC עם אות חיובי ל-TUNEL אפשרה זיהוי מוות תאי של תאים mesangial במהלך Habu nephritis [99]. במיקרוסקופ אור, קולוקליזציה עם סמנים מכניסטיים של רעילות נעשתה בחתכים סדרתיים, כפי שדווח על ידי Ott et al. [89].

בעיות ומגבלות של TUNEL

מספר בעיות פוטנציאליות יכולות להתרחש ויש לצפות בהן בעת ​​עבודה עם TUNEL. האחת היא שקצה 30OH DNA מתרחש לא רק במהלך מוות תאי כתוצאה מפעולת אנדונוקלאז, אלא גם כמטבוליט ביניים תקין כמעט בכל התגובות האנזימטיות עם DNA. פונקציית תא ראשונית המייצרת טרמיני 30OH היא סינתזת DNA, שבה שברי אוקאזאקי רבים עשויים באופן תיאורטי לייצר אות TUNEL חיובי שגוי, במיוחד בשינויים רגישים מאוד של המבחן. בְּמַהֲלָךפגיעה בכליות,תיקון DNA עשוי גם לתרום לאותות כוזבים חיוביים ל-TUNEL כתוצאה מפעולת אנדונוקלאז של AP. פגיעה כלייתית חמצונית מסיבית הנגרמת על ידי פגיעה כימית (מי חמצן, בלומיצין) או פיזית (הקרנת גמא) עשויה להוסיף למספר קצוות ה-30OH, ולהגדיל את קריאות ה-TUNEL החיוביות השגויות מלבד פיצול DNA בתיווך אנדונוקלאז.

לעתים קרובות יותר ויותר סביר להניח שתנאי ניסוי לא מוגדרים כראוי של תגובת ה-TdT (זמן, טמפרטורה, פעילות אנזימטית או גורמים משותפים) עלולים לגרום לרקע אות חיובי ל-TUNEL מוגבר באופן מלאכותי. למרות שזה עדיין לא מוגדר לגבי מה שנחשב לקו הבסיס הנורמלי עבור דגימות רקמת כליות לא מטופלות, נראה סביר שכ-1 אחוז מסך התאים יהיה מספר סביר. אין ספק, רקע של 10 אחוזים ומעלה הוא עדות ברורה לתנאי בדיקה לא מאופיינים ולא מעודנים או לסטייה מתנאי אחסון דגימה מתאימים.

בעיה נוספת שיש לצפות היא פעילות נמוכה של DNase I בכמה סוגי תאים (למשל, אנדותל),כִּליָהתאים (למשל, גלומרולי), או רקמות פתולוגיות (למשל, גידולים). יש לצפות מתאים אלו להראות חיוביות נמוכה של TUNEL, לא בגלל שהם עמידים לפציעות, אלא בגלל שאין מספיק פעילות אנדונוקלאז כדי לייצר אות מדיד ב-TUNEL. מניסיוננו, אפילו שינויים בין {{0}}.01 אחוז ל-0.1 אחוז מהתאים החיוביים של TUNEL יכולים להיות מובהקים סטטיסטית ולהשתמש בהם כראיה מוצקה לפגיעה בכליות (של רקמה אחרת).

לבסוף, בעיה בכימות של צביעת TUNEL מתעוררת כאשר כמות פיצול ה-DNA גבוהה מדי, למשל, בשלבים מאוחרים של מוות תאי או בפציעות בעצימות גבוהה, שבהם לא ניתן לצבוע כראוי את ה-DNA שנותר עם DAPI עקב פירוק סליל כפול (איור 3D). במקרים אלה, אותות חיוביים ל-TUNEL "תלויים באוויר", ולכאורה אינם קשורים לגרעין. זה הופך לאחריותו של פתולוג לפרש את אלה כתאים חיוביים ל-TUNEL ולא כאל חפץ. עם TUNEL המסומן עם פלואורססאין, קיימת סכנה לזיהוי אוטופלואורסצנטי רקע ברקמה כחיוביות של TUNEL [140]. במקרים אלו, מומלץ לעבור ל-TUNEL ספקטרום אדום [51,54].

דפוסי TUNEL כמקור למידע נוסף

ניתן להבחין בבירור בין מספר דפוסי TUNEL ולהשתמש בהם כדי לקבוע מנגנון פוטנציאלי ודרגת פציעה (טבלה 1, איור 3). בדרך כלל, סוג של גרעינים בלבד של דפוס TUNEL נוצר על ידי פציעה קלה, בעוד פציעה חזקה יותר (כלומר, חשיפה מוגברת) גורמת לצביעה חזקה יותר והתפוררות של גרעינים או תאים. דפוס TUNEL אפופטוטי למהדרין הוא פיצול גרעיני כתוצאה מהיווצרות גופים אפופטוטיים (איור 3E). שברים קטנים של גרעינים חיוביים ל-TUNEL, שהם כנראה גופים אפופטוטיים, נראו באיסכמיה חוזרת של חולדה ב-24-72 שעות [97]. גופים אפופטוטיים נראו גם עם תיוג TUNEL של גרעינים באפיתל הצינורי הכלייתי ובאינטרסטיטיום 14 ימים לאחר פציעת איסכמיה-פרפוזיה חוזרת בחולדות [141]. הגדלת מינונים של שמן לבנדר הפחיתה דפוסי TUNEL של גרעינים בלבד והמירה אותם ל-TUNEL דמוי נמק עם דליפה ציטופלזמית [94]. האחרון היה תוצאה של הרס מעטפת גרעינית עקב פעולתם של פרוטאנזים וליפאזות בנמק. ציטופלזמה TUNEL (איור 3F) שנראתה כציטופלזמה חיובית ל-TUNEL נצפתה במיקרוסקופ אור במודל הרבדומיוליזה באבוביות של חולדה [142] ובפודוקיטים שהורבו בנוכחות של גלוקוז גבוה ובנפרופתיה סוכרתית בעכברים [135]. Cytoplasmic TUNEL תואר גם באיסכמיה-רפרפוזיה כלייתית בעכברים באמצעות FL פלואורסצנטי TUNEL [98] ובאיסכמיה-פרפוזיה חוזרת בחולדות באמצעות מיקרוסקופ אור [143]. מרקורי כלוריד הנגרם נזק עמוק וצינורי בלעדי עם צביעה ציטופלזמית TUNEL חזקה המעידה על נזק לממברנה גרעינית [60]. אם הפציעה נמשכת או המינון של הגורם המזיק גדל, ניתן להמיר TUNEL ציטופלזמי לתמונה "מבולגנת" של TUNEL מפוזר (איור 3G) המיוחס לשלבים מאוחרים של הרס תאים עקב נמק ושפיכה של ציטופלזמה ופסולת סלולרית. לדוגמה, הן ציטופלזמי והן TUNEL מפוזר נצפו בעכברים שטופלו ב-cisplatin [71,72] וחולדות [144], ובפגיעה בפודוציטים בחולדות סוכרתיות הנגרמות על ידי סטרפטוזוטוצין [145]. TUNEL נמק מפוזר נצפתה גם במהלך רעילות נפרוטואלית הנגרמת על ידי אורניל אצטט בעכברים [101]. לבסוף, משתנה אות TUNEL נוסף שיש לשים לב אליו הוא עוצמת האותות החיוביים ל-TUNEL, אשר עשויים לסטות מתא לתא בהתאם למספר ההפסקות (דרגת הפציעה) שכל תא חווה, כפי שתועד על ידי מחקרים מסוימים [45,96,125 ]. עבור מודלים שבהם נצפתה עוצמת אות TUNEL משתנה, מומלץ לכימות הן לפי מספר האובייקטים החיוביים ל-TUNEL והן לפי העוצמה הממוצעת של הצביעה.

מסקנות

בשל הפעילות הגבוהה של אנדונוקלאזים אפופטוטיים בכליה, במיוחד DNase I ו-EndoG, השימוש ב-TUNEL עבורמחקר ואבחון כליותהוא מאוד אינפורמטיבי. זה עשוי להיות שימושי אפילו יותר אם TUNEL מיושם מעבר לשימוש הראשוני שלו כשיטה לזיהוי אפופטוזיס. החלת TUNEL באופן בלעדי למחקרי אפופטוזיס היא דוגמה טובה לאופן שבו המדע יכול להיות מופנה בטעות על ידי שיטה שלא נעשה בה שימוש הולם. למרות השימוש בו כמבחן פציעה חריפה בעיקר, ניתן ליישם את TUNEL בהצלחה להערכת AKI ו-CKD כאחד. עם זאת, ב-CKD, יש לצפות שמידת החיוביות של TUNEL תהיה נמוכה יותר מאשר בפציעה חריפה. מכיוון שפעילות האנדונוקליזות (בעיקר, DNase I) גבוהה בהרבה באפיתל הצינורי מאשר בתאים אחרים של כליה, פגיעה באבוביות בכליות נתפסת בדרך כלל כבולטת יותר. עם זאת, ניתן לחקור פציעות גלומרולריות או כלי דם באמצעות TUNEL אם הפציעה אכן מתרחשת בתאים אלו. ה-colocalization של TUNEL פלואורסצנטי FL עם סמני IHC מאפשר זיהוי וקשר של סוגי תאים ומנגנוני מוות של תאים עם אותות TUNEL. כימות TUNEL יכול לתרום מידע רב ערך על מידת המוות של תאים, ויישום תוכנת ניתוח תמונה יכולה להיות שימושית מאוד בהקשר זה. בהתחשב במגוון הדפוסים של TUNEL, מומלץ מאוד ליצור ולהדגים תמונות מייצגות

אותות TUNEL הנחשבים חיוביים. לבסוף, יש להשתמש בדפוסי TUNEL כמקור למידע נוסף, כגון מנגנון המוות של התא ומידת הרעילות. לדוגמה, הבחנה בין גופים אפופטוטיים חיוביים ל-TUNEL, נוכחות של אותות TUNEL ציטופלזמיים, או דפוסי TUNEL מפוזרים עשויים לסייע בזיהוי תאים אפופטוטיים לעומת תאים חיוביים ל-TUNEL נמקיים עבור פירושים מדויקים יותר של תוצאות המחקר והאבחון.

טיפול בהפרעת כליות בגירוי מיני