השפעות חדשות של טיפול משולב באמצעות עיכוב קספאז-1/Gasdermin D-Induced-Pyroptosis בלופוס נפריטיס

למידע נוסף:ali.ma@wecistanche.com

Heng Cao, Junyu Liang, Jing Liu, Ye He, Yini Ke, Yiduo Sun, Song Jiang וג'ין לין

תַקצִיר

מטרות: טיפול משולב עם מיקופנולט מופטיל, טקרולימוס וסטרואידים יעיל בהשגת הפוגה מלאה בזאבת נפריטיס(LN). טיפול משולב הוריד באופן ייחודי את הקספאז-1 בהשוואה לטיפולים מונותרפיים, שיכולים לפצח גסטרמין D (GSDMD) וזוהה לאחרונה כ-פירופטוזיסתליין. לכן, בדקנו האם טיפול משולב אפשר את דיכוי הקספס-1/GSDMD בתיווךפירופטוזיסב-LN (זאבת נפריטיס).

לחץ כדי cistanche deserticola ma עבור דלקת כליה

שיטות: ביטוי והפעלה של GSDMD זוהו בדגימות כליה של אדם ועכבר עם LN (זאבת נפריטיס) באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית ואימונובלוטינג. פודוציטים ראשוניים שבודדו מעכברי MRLlpr הודגרו עם LPS בתוספת ATP וטופלו מראש עם מונותרפיה או טיפול משולב. עיכוב של קספאז-1/GSDMDפירופטוזיסעל ידי טיפול משולב הוערך בעכברי MRLlpr ודגימות אנושיות. נבדקתי באמצעות ערכת FAM caspase-1 וציטומטריית זרימה. המתאם ביןפירופטוזיסבדם היקפי ונותח מדד פעילות מחלת הזאבת האדמית הסיסטמית (SLEDAl).

תוצאות: דגימות רקמת כליה מ-LN (זאבת נפריטיס) חולים ועכברים הראו רמות ביטוי מוגברות מאוד ומחשוף של GSDMD. בפודוציטים בתרבית, טיפול משולב דיכא באופן משמעותי את ההפעלה של NLRP3 ו-caspase-1 והפחית את רמות ה-N-טרמינליות של GSDMD. טיפול משולב דיכא את התקדמות המחלה באמצעות עיכוב של קספאז-1/GSDMDפירופטוזיסגם בבני אדם וגם בעכברי MRL/LPR. מספרי תאים חיוביים מסוג Caspase-1/PI בדם היקפי היו בקורלציה חיובית עם SLE-DAl. LN (זאבת נפריטיס) חולים עם הפוגה מלאה והפוגה חלקית היו מופחתים להפליא במספר תאים חיוביים מסוג Caspase-1/PI בהשוואה לקו הבסיס. Ac-FLTD-CMK, מעכב שמקורו ב-GSDMD, מנע התפתחות של LN (זאבת נפריטיס).

מסקנה: טיפול משולב דיכא קספאז-1/בתיווך GSDMDפירופטוזיסin vitro ו-in vivo וירידה בהתקדמות המחלה.

מילות מפתח:זאבת נפריטיס, פירופטוזיס, caspase-1, gasdermin D, טיפול

טיפול טיפול עבורפירופטוזיס

מבוא

לופוס נפריטיס(LN) היא דלקת בכליות הנובעת כתוצאה מהמחלה האוטואימונית מערכתית לופוס אריתמטוזוס (SLE).LN (זאבת נפריטיס) הוא ביטוי מרכזי בחולים הסובלים מ-SLE. כ-60 אחוז מהחולים מפתחים מצב זה, כאשר כ-20 אחוז מתקדמים למחלת כליות סופנית (ESRD)(1). טיפול משולב עם mycophenolate mofetil (MMF), מעכבי calcineurin (CNI) וסטרואידים מייצר השפעות משלימות וגם ממזער רעילות (2). טיפול זה מומלץ כטיפול ראשוני עבור LN (זאבת נפריטיס) ומייצר יעילות טובה יותר והפוגה מלאה יותר בהשוואה לציקלופוספמיד תוך ורידי (IVCY) וסטרואידים (3-5).

כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים והתאיים של טיפול משולב, נעשה שימוש בניתוח תעתיק מקיף במודל עכברי של LN (זאבת נפריטיס). לעכברי MRL/LPR ניתנו לבד MMF, tacrolimus או פרדניזון כמונותרפיה, או שילובי תרופות משולשות. פרופילים של ביטוי גנים בכליות של עכברים עם LN (זאבת נפריטיס)חשפו מנגנונים פוטנציאליים שעשויים להסביר את ההשפעות התוספות והסינרגטיות של טיפול משולב בהשוואה לטיפולים מונותרפיים. אחד מ-45 גנים מווסתים באופן ייחודי על ידי טיפול משולב הוא קספאז-1 (6). הוא מופעל על ידי inflammasomes, שהם אוליגומרים מולטי-חלבון המורכבים מ-NLRP3, pro-caspase-1 וחלבון דמוי-אפופטוזיס (ASC), עם תחום זיקה משולב של caspase. הדלקת NLRP3/ASC/caspase-1 הוכרה כתורם מרכזי לפתוגנזה של LN (זאבת נפריטיס). ה-NLRP3 inflammasome מניע הפרעות אוטו-דלקתיות על ידי הפעלת קספאז-1, התחלת יצירת ציטוקינים פרו-דלקתיים, למשל IL-1, הידוע כמעורר תפקוד לקוי של פודוציטים ב-LN(7-9).

קספאז פעיל-1 מבקע את gasdermin D(GSDMD) בתוך הקישור של דומיינים N-ו-C-טרמינליים שלו. לאחר מכן, התחום ה-N-טרמינלי מקל על יצירת נקבוביות בממברנת התא, מגרה את התאפירופטוזיסוייצור ציטוקינים IL-1 ו-IL-18(10). מחקרים מתפתחים הראו שתווך GSDMDפירופטוזיסמשתתף בהתקדמות של מחלות כולל אנצפלומיאליטיס אוטואימונית (11), טרשת נפוצה (12), דלקת כבד אלכוהולית (13) ומחלות מעי דלקתיות (14). בנוסף, עיכוב גנטי או תרופתי של קספס-1/GSDMD הוכח כמגן על הכליות מפני פציעה במודלים של מחלת כליות סוכרתית של עכברים(15, 16) וגם לאחר פגיעה כלייתית חריפה(17-19). למרות זאת,פירופטוזיסב-LN (זאבת נפריטיס)עדיין מוגדר בצורה גרועה עד היום(20). שיערנו שטיפול משולב מעניק השפעות מועילות ב-LN (זאבת נפריטיס)) על ידי עיכובפירופטוזיסהמושרה על ידי caspase-1/GSDMD.

במחקר הנוכחי, ההפעלה של קספס-1 ו-GSDMD ברקמות הכליה נחקרה, כמו גם ההשפעות של טיפול משולב על תלוי קספס-1/GSDMDפירופטוזיסעיכוב בעכברי MRL/LPR וחולים עם LN (זאבת נפריטיס). מתאמים פוטנציאליים שלפירופטוזיסעם מדד SLE disease activity (SLEDAI) ותגובות הטיפול הוערכו גם כן.

טיפול עבורפירופטוזיס

חומרים ושיטות

אוכלוסיית המחקר

קבוצת המחקר כללה חולים שאובחנו באמצעות ביופסיה עם LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) פחות או שווה ל-6 חודשים לפני ההרשמה. טווח הגילאים של המטופל היה 18-65 שנים וכולם עמדו בקריטריונים לסיווג של ה-American College of Rheumatology for SLE (2l, 22) והחברה הבינלאומית לנפרולוגיה/פתולוגיה של הכליה (2003). חולים גויסו מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג ומבית הספר לרפואה של אוניברסיטת נאנג'ינג, אשר סבלו מפרוטאינוריה (מעל או שווה ל-1.5 גרם/ד') וריכוזי קריאטינין בסרום הנמוכים או שווה ל-265.2 אומול/ליטר. קריטריוני ההחרגה כללו: חולה טופל בעבר במינונים גבוהים של מתילפרדניזולון; תרופות ביולוגיות (מכוונות למולקולות פתוגניות ספציפיות) או טיפול משולב; פלזפרזה נוכחית או טיפול בגלובולין תוך ורידי תוך 12 שבועות מההקרנה; תפקודי כבד לא תקינים; זיהומים פעילים נוכחיים; וגידול ממאיר תוך 4 שבועות מתחילת המחקר. LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) חולים קיבלו טיפול בדופק עם מתילפרדניזולון למשך 3 ימים במינון של 0.5 גרם ליום. לאחר השלמת הטיפול בדופק מתיל-פרדניזולון, הקבוצה המשולבת עם פרדניזון (0.6 מ"ג/ק"ג/ד'), MMF (0.5 גרם, שתי מנות ליום), וטקרולימוס (2 מ"ג, שתי מנות ליום) ניתנו במשך 4 שבועות בסך הכל. אז המינונים של פרדניזון, שעדיין היו משולבים עם MMF (0.5 גרם, שתי מנות/ד) וטקרולימוס (2 מ"ג, שתי מנות/ד), הופחתו ב-5 מ"ג ליום כל שבועיים עד הושג מינון תחזוקה של 10 מ"ג ליום(4). הפוגה מלאה (CR) נלקחה כ-24-שעה ריכוז חלבון בשתן פחות או שווה ל-0.4 גרם, היעדר משקעי שתן פעילים, ריכוז אלבומין בסרום גדול או שווה ל-35 גרם/ליטר וקריאטינין תקין (23). הפוגה חלקית (PR) נלקחה כירידה גדולה מ- או שווה ל-50 אחוז בריכוז החלבון בשתן 24-ל לפחות או שווה ל-3.5 גרם, ריכוז אלבומין בסרום גדול מ- או שווה ל-30 גרם/ L, ועלייה נורמלית או פחות או שווה ל-25 אחוזים בריכוז הקריאטינין בסרום מהבסיס. מועצת הביקורת המוסדית שלנו אישרה את המחקר (מס' IIT20200410A) וכל המטופלים סיפקו הסכמה בכתב לפני ההרשמה.

דוגמניות חיות

נקבות עכברי MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) סופקו על ידי SLAC Laboratory Animal Co.Ltd (שנגחאי, סין), כל העכברים חולקו אקראית בעזרת מחולל מספרים אקראיים, 5 עכברים בכל קבוצה ובכל כלוב . הם טופלו בגיל 8 שבועות דרך הפה, בשילוב של 0.5 מ"ג/ק"ג טקרולימוס (MCE HY-13756), 50 מ"ג/ק"ג MMF (MCE HY-B0199) ו-1 מ"ג/ ק"ג פרדניזון (MCE HY-B0214) או רכב מדי יום במשך 8 שבועות בסך הכל, כפי שתואר קודם(6). Ac-FLTD-CMK סונתז על ידי MCE ו-10 מ"ג/ק"ג הוזרק ip יומי. כל הטיפולים היו עיוורים למשתתפים האחראים לגילוי הבא. יחס אלבומין-קריאטינין בשתן (UACR) נקבע באמצעות Albuwell M ו-Creatinine Companion (Excell, Phil, ארה"ב). דגימות כליה נקבעו ב-4 אחוז פרפורמלדהיד לפני צביעה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימית וקורטקס הכליה חולץ לניתוח אימונובלוטינג. השימוש בעכברים אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (מס'2019-883).

בידוד גלומרולי עכברים ותרבות פודוציטים

גלומרולי טוהרו מהכליות של 12-עכברי נקבות C57 ו-MRL/LPR בנות שבוע, כפי שתואר קודם(24). עכברים מורדמים חולפו בחרוזים מגנטיים שחוממו מראש ב-37 מעלות צלזיוס. הכליות הוסרו וקוצצו על קרח לגודל 1 מ"מ. לאחר מכן, רקמות הכליה עוכלו ב-37 מעלות עם 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז ו-100 U/ml DNase I במשך 30 דקות, ואז סוננו פעמיים עם 100-μm מסננות תאי Falcon (431752, BD). לאחר מספר שטיפות עם תמיסת HBSS של 4 מעלות (H1025, Solarbio) וצנטריפוגה עדינה ב-200 גרם למשך 5 דקות, נאספו חרוזים המכילים גלומרולי באמצעות המעמד המגנטי (HY-K0200, MCE) ונשטפו בתמיסת HBSS שלוש פעמים. גלומרולי מבודדים תורבו על צלחות תרבותיות מצופה מסוג I (C3867, Sigma-Aldrich) ב-5 אחוז CO, ב-37 מעלות לפי השיטה שתוארה על ידי ג'פרי (25). בניסוי במבחנה נעשה שימוש במעבר 2 פודוציטים.פירופטוזיסאינדוקציה, ציטוטוקסיות וזיהוי הפרשות IL-1

פודוציטים מעכברי MRL/LPR הועברו ל-1 mg/ml LPS (tell-pb5lps, InvivoGen) שנפתרו ב-Opti-MEM למשך 4 שעות, ולאחר מכן גירוי 5mM ATP(tlrlatpl, In Vivo gene). פודוציטים מעכברי C57 נותקו כביקורת רגילה. מונותרפיות tacrolimus（10μM）, MMF（luM）, ופרדניזון （10μM）, או טיפול משולב הודגרה מראש עם התאים למשך שעה אחת לפני התחלת ה-LPS. הציטוטוקסיות לאחר גירוי נקבעה באמצעות ערכת זיהוי ציטוטוקסיות (11644793001, Roche) לפי הוראות היצרן. הסופרנטנט לאחר הגירוי נאסף ונמדד באמצעות ערכת העכבר IL-1 ELISA Kit (BMS6002, Invitrogen) לפי הוראות היצרן.

נוגדנים וריאגנטים

רמות Caspase-1(sc-398715, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1 (sc-81868, Santa Cruz Biotech) הוערכו בהתאם להוראות היצרן.פירופטוזיסבדם היקפי נמדד באמצעות FAM FLICAMCaspase-1 Kit (Bio-Rad, ארה"ב) על ידי ציטומטריית זרימה.

ניתוח סטטיסטי

ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות GraphPad Prism (גרסה 8.0) והנתונים ניתנים כממוצע ± SD. שתי השוואות קבוצות נערכו באמצעות מבחן t של Student וניתוחי מתאם באמצעות המתאם של פירסון. דו זנב ע<0.05 was="" considered="" statistically="">

טיפול עבורפירפטוזיס בלופוס נפריטיס (LN)

תוצאות

בתיווך GSDMDפירופטוזיסמופעל בכליות המושפעות מ-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת)

כדי לחקור אם GSDMD תרם לפתוגנזה של LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת), בדקנו לראשונה את רמת ביטוי החלבון של GSDMD בדגימות כליה שנלקחו מ-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) חולים. ניתוח אימונוהיסטוכימי גילה רמות ביטוי מוגברות להפליא של GSDMD בדגימות ביופסיה של כליה שנלקחו מ-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) חולים עם סוג IV, V, I פלוס Vand IV פלוס V, ובהשוואה לנבדקים בריאים. GSDMD התבטא באופן אוניברסלי בפודוציטים גלומרולריים, תאים צינוריים ותאי אינטרסטיציאליים שהסתננו ב-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) חולים. האזור עם צביעה חיובית (חצים אדומים) ושליליים (חצים שחורים) הוגדל (איור 1A). לאחר מכן הוערך אחוז האזור החיובי ל-GSDMD בכליה (איור 1B). תוצאות דומות נמצאו בכליות של עכברי MRL/LPR ובקרות מסוג בר. ניתוח אימונובלוטינג אישר ביטוי מוגבר מאוד של GSDMD בדגימות כליה של עכברי MRL/LPR (איור 1C). ה-GSDMD בפודוציטים גלומרולריים, תאים צינוריים ותאי ביניים חודרים היה מוגבר בעכברי MRL/LPR בהשוואה לעכברי ביקורת (איור 1D). נתונים אלה העלו כי בתיווך GSDMD הופעל ברקמת כליה המושפעת מ-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת).

איור 1|GSDMD מוגבר מאוד ומתפצל בכליות של חולים ועכברים שנפגעו מ-LN (זאבת נפריטיס).

(א) צביעה אימונוכימית של GSDMD בדגימות כליות שנלקחו מנבדקים בריאים ו-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) חולים, חיובי (חצים אדומים) וצביעה שלילית (חצים שחורים) הוגדלו.

(ב) כימות של אזורים חיוביים של GSDMD מוצג בסוג III פלוס V, IV, IV פלוס V, V LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) חולים ונבדקים בריאים.

(ג) ניתוח אימונובלוט של תחום N-טרמינלי מפוצל באורך מלא ותחום C-טרמינלי GSDMD בקליפת הכליה משלושה זוגות של עכברי בקרה ו-MRL/LPR.

(ד) צביעה אימונוכימית של GSDMD בדגימות כליות שנלקחו מבקרות ועכברי MRL/LPR.

*p < {{0}}.05,="" **p="">< 0.01.="" ln="">זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת), זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת; FL, באורך מלא; NT, תחום N-טרמינלי; CT, תחום C-terminal.

טיפול משולב מדכא GSDMD-Mediatedפירופטוזיסהפעלה בפודוציטים ראשוניים במבחנה

לחקור את ההשפעות המעכבות של טיפול משולב עלפירופטוזיס, יישמנו את שיטת הגירוי LPS פלוס ATP כדי לגרוםפירופטוזיסבפודוציטים מעכברי MRL/LPR, נטילת פודוציטים מעכברי C57 פראי כביקורת רגילה. פודוציטים מעכברי MRLlpr טופלו במשך 4 שעות עם LPS ולאחר מכן טופלו במשך 4 שעות עם ATP, גירוי נפוץ עבור GSDMD.פירופטוזיסהפעלה (26). בהשוואה לבקרה רגילה, פודוציטים לאחר מכן הציגו מאפיינים מורפולוגיים פירופטוטיים כגון נפיחות ובעבוע של תאים. טיפול מקדים בטיפול משולב שיפר משמעותית את התכונות המורפולוגיות הפירופטוטיות ואת הציטוטוקסיות (איור 2A). ציטוטוקסיות של פודוציטים המושרה על ידי LPS פלוס ATP. להשוואה, טיפול משולב הפחית באופן משמעותי את הציטוטוקסיות והפרשת IL-1 בסופרנטנט המושרה על ידי גירוי LPS בתוספת ATP (איורים 2B, C). כדי לאמת עוד יותר את ההפעלה של GSDMD בתיווךפירופטוזיס, ניתחנו דלקות קנוניות והפעלת GSDMD באמצעות אימונובלוטינג. בהתאם לשינויים מורפולוגיים פירופטוטיים וציטוטוקסיות, LPS בתוספת ATP הפעילו באופן משמעותי NLRP3, קספאז-1 ו-GSDMD מפורקת בפודוציטים (איור 2D). טיפול משולב דיכא במידה ניכרת את ההפעלה של NLRP3 ו-caspase-1 והפחית את רמת ה-GSDMD N-terminal. יש לציין כי טיפולים מונותרפיים עם טקרולימוס, MMF או פרדניזון דיכאו את ה-LPS בתוספת ATP גירוי ציטוטוקסיות של התא והפרשת L-1, אך טיפול משולב הראה השפעה מעכבת משמעותית יותר על Caspase-1 ו-GSDMD. תוצאות אלו סיפקו ראיות שתמכו בדעה שטיפול משולב משפר את תיווך GSDMDפירופטוזיסעל ידי דיכוי ההפעלה של NLRP3 ו-caspase-1.

איור 2|טיפול משולב משפר את הפירופטוזיס בפודוציטים במבחנה.

(א) תכונות פירופטוטיות הוצגו בפודוציטים ראשוניים מתורבתים לאחר דגירה עם LPS בתוספת ATP וטופלו מראש בטיפול משולב. החצים הצביעו על תאים המציגים תכונות דמויות פירופטוטים.

(ב) סופרנטנטים מתאי אתגר נותחו למות תאי, כפי שנמדד על ידי הפרשת LDH.

(ג) סופרנטנטים מהתאים המאותגרים נותחו לשחרור IL-1b.

(ד) ניתוח אימונובלוטינג של ביטוי NLRP3, caspase-1, GSDMD-NT ו-ASC לאחר טקרולימוס, MMF, פרדניזון או טיפול משולב לאחר הפעלת NLRP3 inflammasome.

*p < {{0}}.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001;="" ****p="">< 0.0001.="" ldh,="" לקטט="">

DSMO, Dimethyl sulfoxide, FK506, tacrolimus; MMF, mycophenolate mofetil; PNS, פרדניזון; COM, טיפול משולב; ASC, חלבון דמוי כתם הקשור לאפופטוזיס.

טיפול משולב מדכא Caspase-1/GSDMD-Inducedפירופטוזיסבעכברי MRL/LPR

עכברי MRL/LPR בני שמונה שבועות קיבלו שילוב של MMF, tacrolimus, ופרדניזון או שליטה על הרכב. בהתאם למחקר קודם (6), לאחר טיפול במשך 8 שבועות, לא נמצא הבדל בתמותה או במשקל הגוף בין קבוצות הטיפול המשולב. בניגוד לקבוצת הרכבים, טיפול משולב היה יעיל מאוד במניעת פרוטאינוריה, גלומרולוסקלרוזיס וחדירת תאי חיסון אינטרסטיציאליים בכליות (איור משלים 1).

לאחר מכן, בדקנו את רמות הביטוי של caspase-1 ו- GSDMD בטיפול משולב וקבוצות ביקורת של כלי רכב. ניתוח אימונוהיסטוכימי גילה שהקספאז הבין-סטיציאלי הגלומרולרי והכליתי-1 וביטוי GSDMD ירדו באופן ניכר בקבוצת הטיפול המשולב (איור 3A). ניתוח האימונובלוטינג מצא גם ירידה בביטוי ובביקוע של caspase-1 ו- GSDMD בקליפת הכליות של קבוצת הטיפול המשולב (איור 3B). יתר על כן, תאים חיוביים כפולים מסוג קספאז-1/פרופידיום יודיד (PI) נספרו באמצעות ציטומטריית זרימה ו-פירופטוזיסערכת FAM Caspase-1. התוצאות חשפו ירידה ניכרת במספר תאי הדם ההיקפיים מסוג caspase-1*/PI' בעכברי MRL/LPR שקיבלו את הטיפול המשולב בהשוואה לעכברי MRL/LPR שטופלו עם כלי רכב. (איורים 3C,D). בנוסף, טיפול משולב גם הפחית משמעותית את ריכוז Ii בסרום (איור 3E). לכן הגענו למסקנה שטיפול משולב דיכא את הנגרמת קספאז-1/GSDMDפירופטוזיסבכליות ובתאי הדם של LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) עכברים.

איור 3|טיפול משולב מוחלש ב-Caspase-1/GSDMD-pyroptosis בעכברי MRL/LPR.

(א) צביעה אימונוכימית של GSDMD ו-caspase-1 בדגימות כליות של עכברי MRL/LPR. בהשוואה לבקרת הרכב, ביטוי קספאז-1 ו- GSDMD עוכבו באופן ניכר בקבוצת הטיפול המשולב.

(ב) ניתוח אימונובלוט של GSDMD ו-caspase באורך מלא ומפוצל -1 בדגימות קליפת הכליה של עכברי MRL/LPR; השוואה בין תוצאות מקבוצות הטיפול ברכב ושילוב.

(ג) FACS של תאים חיוביים כפולים מסוג Caspase-1/PI בדם היקפי מעכברי MRL/LPR שקיבלו או לא ניתן להם טיפול משולב.

(ד) כימות של תאים חיוביים כפולים מסוג Caspase-1/PI בדם היקפי של עכברי MRL/LPR שניתנו או לא קיבלו טיפול משולב.

(ה) כימות של ריכוזי IL{{0}}b בסרום בעכברי MRL/LPR שניתנו או לא קיבל טיפול משולב. ####P < 0.0001.="" facs,="" מיון="" תאים="" מופעל="" על="" ידי="" פלואורסצנציה;="" ct,="" טיפול="">

טיפול משולב מדכא Caspase-1/GSDMD-Inducedפירופטוזיסב-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) חולים

בין ינואר 2020 ליוני 2020, 47 חולים עם LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) נרשמו ו-43 השלימו 24-שבועות של טיפול משולב. המחלה הבסיסית והדמוגרפיה של העוקבה שנרשמה רשומים בטבלה משלימה 1. כימות של caspase-1/propidium iodide (תאים חיוביים כפולים PI בוצעו בחולים עם LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) סוג III, IV, V, III פלוס V, IV פלוס V ובבקרות בריאות באמצעות אפירופטוזיסערכת FAM Caspase-1 וציטומטריית זרימה. בהשוואה לביקורות הבריאות, מספר התאים החיוביים כפולים מסוג Caspase-1/PI בדם היקפי גדל (איורים 4A, B). בדקנו גם תאים חיוביים כפולים מסוג Caspase-1/PI לאחר 24-שבועות של טיפול ובנקודת ההתחלה. לאחר 24-שבועות של טיפול אינדוקציה, השכיחות של CR ו-PR הייתה 39.5 אחוזים (17/43) ו-32.6 אחוזים (14/43), בהתאמה. מספרי התאים החיוביים הכפולים של caspase-1/PI בדם היקפי של חולי CR ו-PR הופחתו בצורה יוצאת דופן בהשוואה לקו הבסיס (איור 4C). זיהינו גם מתאם בין קספאז-1 המושרהפירופטוזיסוה-SLEDA; הנתונים הראו בבירור שהיחס החיובי של caspase-1/PI בדם היקפי נמצא בקורלציה חיובית עם SLEDAI (איור 4D). Ac-FLTD-CMK, מעכב שמקורו ב-GSDMD, מנע התפתחות של LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת).

איור 4|טיפול משולב החליש את הפירופטוזיס-1-מתווכת בקספאז בחולי LN (זאבת נפריטיס).

(א) FACS של תאים חיוביים כפולים קספאז{{0}/PI בדם היקפי של LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) חולים שטופלו עם או בלי טיפול משולב.

(ב) כימות של תאים חיוביים כפולים מסוג Caspase-1/PI בדם היקפי מסוג III, IV, V, III פלוס V ו-IV פלוס V LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) חולים ונבדקים בריאים.

(ג) כימות של תאים חיוביים כפולים קספאז-1/PI בדם היקפי של LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) חולים בקו הבסיס, CR, PR ואי-הפוגה לאחר טיפול משולב.

(ד) ניתוח מתאם של יחסי תאים חיוביים כפולים מסוג Caspase-1/PI עם SLE-DAI.

**p < 0.01.="" facs,="" מיון="" תאים="" מופעל="" על="" ידי="" פלואורסצנציה;="" ln="">זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת), זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת; CR, הפוגה מוחלטת; יחסי ציבור, רמיסיה חלקית; SLE-DAI, אינדקס פעילות של מחלת לופוס אריתמטוזוס מערכתית.

מחקר שנערך לאחרונה מצא ש-GSDMDhmice פיתחה יציבות מוגברת של C3 ו-IgG בכליות, פגיעה כלייתית חמורה יותר ותמותה מוגברת במודל המושרה על ידי imiquimod של SLE.17 כדי להבהיר יותר את התפקיד של GSDMD ב-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת), עכברי MRL/LPR טופלו ב-Ac-FLTD-CMK21 החל מגיל 8- שבועות, עם הרכב לגבי הבקרה. לאחר 8- שבועות של טיפול, לא נמצא הבדל בתמותה או במשקל הגוף בין הקבוצה שטופלה ב-Ac-FLTD-CMK. בהשוואה לעכברי בקרת הרכב, לעכברי MRL/LPR שטופלו ב-Ac-FLTD-CMK היה יחס אלבומין-קריאטינין בשתן נמוך יותר (איור 5A), ריכוז קריאטינין בסרום נמוך יותר (איור 5B), גלומרולוסקלרוזיס מופחת (איור 5C) ו-CD3 , CD4 ו-CD68 חדירת תאים חיוביים (איור 5D). תוצאות אימונוהיסטוכימיה הראו ביטוי מופחת של GSDMD (איור 5D) ודיכוי הפרשת IL-1 בסרום שנקבע על ידי ELISA (איור 5E). ביחד, הנתונים העלו כי Ac-FLTD-CMK מעכבפירופטוזיסבכליות המושפעות מ-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת).

איור 5|Ac-FLTD-CMK, מעכב שמקורו ב-GSDMD, מנע התפתחות של LN (זאבת נפריטיס).

(א) היחס בין אלבומין לקריאטינין בשתן חושב בעכברי MRL/LPR שניתנו או לא קיבלו מעכב GSDMD.

(ב) קריאטינין בסרום בעכברי MRL/LPR שניתנו או לא קיבלו מעכב GSDMD.

(ג) תמונות מייצגות של דגימות כליות מוכתמות בחומצה מחזורית-שיף (PAS) ואחוז גלומרולוסקלרוזיס לכימות.

(ד) צביעה אימונוכימית של CD3, CD4, F4/80 ו- GSDMD. (ה) כימות של ריכוזי IL-1b בסרום בעכברי MRL/LPR שניתנו או לא קיבלו מעכב GSDMD.

הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. #p < {{0}}.05,="" ##p=""><>

דִיוּן

טיפול משולב הוא אסטרטגיה מבטיחה בגלל CR גבוה יותר ושיעורי תגובה כלליים, זמן קצר יותר עד להפוגה ופחות תופעות לוואי. עד כה, המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של טיפול משולב לא היו ידועים. לאחרונה, Fu et al.(6) טיפלו בעכברי MRL/LPR במונותרפיה או בטיפול משולב וביצעו ניתוח טרנסקריפטומי מקיף על כליות שלמות. מעניין, הם מצאו שטיפול משולב אך לא מונותרפיות דיכאו באופן ספציפי וייחודי את ביטוי הקספאז-1.

הדלקת NLRP3/ASC/caspase-1 מוכרת כעת כתורם מרכזי לפתוגנזה של LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת). דלקות NLRP3 בפודוציטים מופעלות בעכברים המועדים לזאבת וגם בחולים עם LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת). כאשר דלקות NLRP3 דוכאו עם מעכב caspase-1, נמצא שפרוטאינוריה, נגעים היסטולוגיים של הכליה והשחתת תהליך כף הרגל של פודוציטים השתפרו בעכברים בעלי נטייה לזאבת(8). Huang et al. (27) דיווח כי NLRP3 בא לידי ביטוי בתאים צינוריים של LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) Class IV וכי הפעלת NLRP3 הייתה בקורלציה חיובית עם ציון מדד הפעילות עבור חולים עם LN. Caspase-1 הוכח כממלא תפקיד חיוני בזאבת ובתפקוד לקוי של כלי הדם, ולכן הוא יעד פוטנציאלי להתערבויות טיפוליות חדשות(28). תרופות ניסיוניות מתפתחות כגון RIP3(29), אנטגוניסטים לקולטן P2X7(30), מעכבי GSK-3 (31) ואגוניסט Nrf2 (32) עיכבו את התפתחות LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) בעכברי MRL/LPR על ידי אפנון הפעילות הדלקתית של NLRP3/ASC/caspase-1, מה שמדגיש את החשיבות והקריטיות של הדלקת NLRP3/ASC/caspase-1 ב-LN. ריכוזים מוגברים של IL-18 בסרום נמצאים בקורלציה עם חומרת המחלה ומידת הפגיעה/מעורבות הכליות בחולי SLE(33). למיטב ידיעתנו, נראה שמשפחת הגסדרמין עשויה להיות חיונית להתפתחות שלפירופטוזיס, אך היו מיעוט ראיות לנוכחות של GSDMD/GSDME בחולי SLE.

בסך הכל, בחנו את ההפעלה והביטוי של GSDMD בדגימות ביופסיה של כליה שנלקחו מ-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) חולים ועכברי MRL/LPR. GSDMD הושרה ונבקע בחוזקה בפודוציטים גלומרולריים ובתאים צינוריים ותאי אינטרסטיציאליים שחדרו. לאחר מכן, לעכברי MRL/LPR קיבלו שילוב של MMF, tacrolimus ופרדניזון או כלי רכב. בהשוואה לקבוצת הביקורת של כלי הרכב, ההפעלה של קספס-1 ו-GSDMD הופחתה בקבוצת הטיפול המשולב. מידת הפירופטוזיסבדם היקפי היה גם נמוך בהרבה ב-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) חולים לאחר מתן טיפול משולב. יתר על כך,פירופטוזיסבדם היקפי היה מתאם חיובי עם SLEDAI, מה שהציע זאתפירופטוזיסבדם היקפי יכול לשמש כסמן משמעותי לפעילות SLE. לפיכך שיערנו שטיפול משולב עשוי להעניק השפעות מועילות ב-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) על ידי עיכובפירופטוזיסהמושרה על ידי caspase-1/GSDMD. מחקרים מבניים גבישים קודמים של קספאז-1 בקומפלקס עם Ac-FLTD-CMK חשפו אינטראקציות רבות של מעכבי אנזים שמנעו זיהוי GSDMD על ידי קספאז-1. עם זאת, מצאנו ש-Ac-FLTD-CMK, הפועל כמעכב שמקורו ב-GSDMD, עיכבפירופטוזיסב-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת), אשר עשוי להיגרם על ידי מנגנון אחר.

לאחרונה, במודל עכברי המושרה על ידי TLR7- של SLE(34), עכברי GSDMD-/-פיתחו מידה רבה יותר של נזק לכליות ותמותה מוגברת, מה שהציע בתחילה שלמחיקת GSDMD תהיה השפעה מגנה ותהיה קשורה דלקת מערכתית וייצור של נוגדנים עצמיים עם תמותה מוגברת. עכברים חסרי GSDMD מפתחים שקיעה בולטת יותר של קומפלקס חיסוני גלומרולרי בדגימות כליות ופרוטאינוריה גבוהה יותר בהשוואה לעכברים מסוג פרא. הפרשה מוגברת של HMGB1 חוץ-תאית נמצאה גם בלימפוציטים GSDMD-/לימפוציטים המצביעים על כך שנמק/פירופטוזיסהתרחש כאשר GSDMD נעדר.

Caspase-1 מפעיליםפירופטוזיסעל ידי מחשוף GSDMD. לעומת זאת, בתאים חסרי GSDMD או GSDMD נמוך, קספאז-1 מפעיל אפופטוזיס ולאחר מכן נמק משני תלוי-GSDMEפירופטוזיס. כאשר פעילות GSDMD נעדרת לאחר הטיפול, GSDME יכול אולי גם להחליף אפופטוזיס-3-מתווכת בקספאז לאפופטוזיספירופטוזיס(35,36). בנוסף, ההפעלה של caspase-8 הוגברה בהרבה במקרופאגים שהיו חסרים ב-GSDMD. הפעלה משמעותית של caspase-8 נמצאה גם ב-TLR7-ה-GSDMD חסר LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) עכברים(34). לפיכך, בהיעדר GSDMD, סביר להניח ש-caspase-1 משתף פעולה עם caspase-8 כדי לגרום ל-caspase-3-אפופטוזיס בתיווך GSDME לעבור ל-פירופטוזיסב-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת), השערה הדורשת חקירה ניסויית נוספת.

ישנן מספר מגבלות במחקר הנוכחי. ראשית, בהתבסס על הנתונים הנוכחיים, אימתנו שטיפול משולב יכול לדכאפירופטוזיס, אך טיפולים אחרים כגון טיפול כפול בסטרואידים ו-MMF, סטרואידים וטקרולימוס, או נוגדן אנטי-CD20 עשויים גם הם להיות בעלי השפעות דומות. שנית, המנגנון המולקולרי המדויק של השפעת העיכוב של טיפול משולב על קספאז-1 אינו נחקר היטב. אחרון חביב, אנו רואים את הקשר של תאים חיוביים כפולים מסוג Caspase-1/PI בדם היקפי עם SLE-DAI ואת השינוי לפני ואחרי טיפול משולב ב-LN רטרוספקטיבי (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) קבוצת חולים. יש לחקור עוד יותר את הערך הניבוי הקליני של תאים חיוביים כפולים מסוג Caspase{{0}/PI לפעילות מחלות ותגובת הטיפול בקבוצה פרוספקטיבית גדולה יותר.

בסך הכל, זיהינו שטיפול משולב העניק את השפעותיו המועילות על ידי דיכוי קספאז-1/GSDMDפירופטוזיסב-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת), שסיפקה תובנה חדשה לגבי המנגנונים הסלולריים המעורבים. ואכן, טיפול משולב דיכא את ביטוי הקספאז-1 באופן ספציפי וייחודי. עיכוב תרופתי או גנטי של NLRP3 ו-caspase-1 שיפר את תפקוד הכליות ודיכא אוטואימוניות ב-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת). התפקיד הפתופיזיולוגי של קספאז-1 ב-LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) ראוי למחקר נוסף, וטיפולים המכוונים ל-GSDMD בחולים עם LN (זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת) צריך להעריך בזהירות רבה.

שיטת טיפול עבורפירופטוזיס

הפניות

1. Saxena R, Mahajan T, Mohan C.זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת: עדכון נוכחי.Arthritis Res Ther (2011)13:240.doi: 10.1186/ar3378

2. An Y, Zhang H, Liu Z. Individualizing Therapy inזָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת. Kidney Int Rep (2019)4:1366-72.doi: 10.1016/j.ekir.2019.08.005

3. Bao H,Liu ZH, Xie HL, Hu WX,Zhang HT,LiLS.טיפול מוצלח של Class V פלוס IVזָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹתעם טיפול רב-מטרות. J Am Soc Nephrol (2008)19:2001-10.doi: 10.1681/ASN.2007121272

4. Liu Z, Zhang H, Liu Z, Xing C, Fu P, Ni Z, et al. Multitarget Therapy for Induction Treatment ofזָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת: A Randomized Trial, Ann Intern Med (2015)162:18-26. DOI: 10.7326/M14-1030

5. Zhang H, Liu Z, Zhou M, Liu Z, Chen J, Xing C, et al. Multitarget Therapy for Maintenance Treatment ofזָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת. J Am Soc Nephrol(2017)28:3671-8.doi:10.1681/ASN.2017030263

6. Fu J, Wang Z, Lee K, Wei C, Liu Z, Zhang M, et al. Transscriptomic Analysis חושף מנגנונים סינרגטיים חדשים בטיפול משולב עבורזָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת. Kidney Int(2018)93:416-29.doi: 10.1016/j.kint.2017.08.031

7. אוממרינו ד.זָאֶבֶתדַלֶקֶת הַכְּלָיוֹת: NLRP3 Inflammasome מצית תפקוד לקוי של פודוציטים. Nat Rev Rheumatol(2017)13:451.doi: 10.1038/Orpheum. 2017.9