כיום הזדקנות סלולרית נחשבת לתגובה נפוצה של כמעט כל סוגי התאים המתרבים

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

תַקצִירחיסול ממוקד של תאים מזדקנים, ניתוח, הוא אחד ממגמות הליבה בטיפול אנטי אייג'ינג. לאחרונה הוכח כי גליקוזידים לבביים הם סנוליטים רחבי טווח. כאן בדקנו תכונות סנוליטיות של גליקוזידים לבביים כלפי תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs). לגליקוזידים לבביים לא הייתה יכולת סנוליטית כלפי hMSCs מזדקנים ממקורות שונים. באמצעות גישות ביולוגיות וביואינפורמטיות אנו משווים התפתחות הזדקנות ב-A549 'רגישים לגליקוזידים לבביים' ו-'-insensitive'hMSCs. היעדר ניתוח נמצא מתווך על ידי ייבוא ​​אשלגן יעיל ועמידות מוגברת לאפופטוזיס ב-hMSCs בגיל מבוגר. היחלשות ה"הגנה האנטי-אפופטוטית" מעמידה את hMSCs לניתוח. גילינו שעמידות לאפופטוזיס, שהוכרה בעבר כמאפיין נפוץ של הזדקנות, למעשה אינה מאפיין כללי של תאים מזדקנים. יתר על כן, רק תאים מזדקנים אפופטוזיס-פרולין רגישים לניתוח הנגרמת על ידי גליקוזיד לבבי. לפיכך, אנו יכולים לשער כי יעילות הניתוח עשויה להיות תלויה בשאלה האם תאים מזדקנים אכן הופכים עמידים לאפופטוזיס בהשוואה לעמיתיהם המתרבים.

מילות מפתחתאי גזע. סנוליזה · הזדקנות · אפופטוזיס · עמידות ללחץ

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

מבוא

כיום הזדקנות תאית נחשבת לתגובה נפוצה של כמעט כל סוגי התאים המתרבים, כולל סרטן וגזע, כמו גם כמה תאים פוסט-מיטוטיים למגוון גירויים מלחיצים [1-3]. ניתן להבחין בין הסוגים הבאים של הזדקנות תאית בהתאם למקור הגורם המושרה: רפליקטיבי (עקב נזקי ה-DNA בקצוות הטלומרים המקוצרים), מושרה אונקוגני (בתגובה להפעלה חריגה של איתות אונקוגני), המושרה בלחץ ( המתווך על ידי נזקי ה-DNA הנגרמים על ידי עקה חמצונית, הלם חום, קרינת UV ו-y וכו') ובהשראת כימותרפיה (מופעלת בתאים סרטניים בתגובה לתרופות כימותרפיות)[4-7]. קיימת הטרוגניות בסמנים המובעים על ידי תאים מזדקנים בהתאם לסוג התא וגם לעלבון המשמש להשראת הזדקנות. עם זאת, ישנן מספר תכונות נפוצות האופייניות לרוב סוגי התאים המזדקנים. המאפיין המהותי של הזדקנות עבור כל סוג של תא מתחלק הוא אובדן התפשטות בלתי הפיך [8].תמצית cistanche tubulosaהבלתי הפיך של עצירת מחזור התא נשלטת על ידי מעכבי קינאז תלויי ציקלין (CDK) pl6 ו-p21 ולעתים קרובות מווסתת על ידי חלבון מדכא הגידול p53 [8,9]. המאפיינים החשובים האחרים של תאים מזדקנים הם הפעלה של תגובת נזק מתמשכת ל-DNA; היפרטרופיה של תאים, אשר מתעוררת לעתים קרובות כתוצאה מפגיעה בביוגנזה ריבוזומלית וסינתזת חלבון; הפרעה של השפלה ליזוזומלית וחוסר תפקוד של מערכות השפלה המנוחה; פעילות מוגברת של האנזים הליזוזומלי הספציפי הקשור להזדקנות- -גלקטוזידאז; שינויים שונים במיטוכונדריה; רכישת הפנוטיפ הפרשה הקשור להזדקנות (SASP), המורכב מגורמים מעודדי דלקת, אנזימים מפרקי מטריצה, מיני חמצן תגובתיים וכו'; שינויים בנוף אפיגנטי וכרומטין, כולל היווצרות של מוקדים הטרוכרומטיים הקשורים לגיל ההתבגרות והתרחבות של לוויינים [8-10]. במילים אחרות, תאים מזדקנים משמרים פעילות מטבולית וחיוניות, אך תפקודם משתנה באופן משמעותי בהשוואה ל- תאי המוצא.

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

כעת ברור שתאים מזדקנים יכולים לשנות את המיקרו-סביבה שמסביב ומשפיעה הן על תאים שכנים והן על נישות תאיות, מה שעלול להוביל לתפקוד לקוי של רקמות ולכן עשוי להיות קשור להתקדמות של הזדקנות ומחלות הקשורות לגיל [11,12]. בהתחשב בכך, כיום תשומת לב רבה יותר מתמקדת באסטרטגיות ל"הרג" ממוקד של תאים מזדקנים[13-15]. לשם כך, מתפתחת באופן פעיל סוג חדש של תרופות הנקראות סנוליטיקה. סנוליטים מכוונים למסלולי איתות התורמים לעמידות של תאים מזדקנים לאפופטוזיס, ובכך מעוררים אפופטוזיס עדיפה בתאים מזדקנים [16]. רשימת הסנוליטים מתחדשת כל הזמן בסוכנים חדשים. התרכובות הידועות ביותר בעלות הפעילות הסנוליטית המוצהרת הן navitoclax (מעכב ממשפחת Bcl-2), שילוב של dasatinib (מעכב של ריבוי טירוזין קינאזות) וקוורצטין (פלבונול טבעי), מעכבי Hsp90, מעכבי MDM2, FOXO{ {8}}פפטיד מפריע ל-p53, מפרק חלבון ממשפחת BET, CAR-T ספציפי ל-uPAR, navitoclax מצומד גלקטו ותרכובות טבעיות סנוליטיות שונות[16-24]. לאחרונה, באמצעות בדיקת תרופות בתפוקה גבוהה, שתי קבוצות מחקר עצמאיות זיהו גליקוזידים לבביים, במיוחד אובאין, דיגוקסין ובופלין, כסנוליטים רחבי טווח [25,26].ביקורות על cistanche tubulosaראוי להזכיר כי כמעט לכל הסנוליטים המוצהרים יש מגבלות, כגון תופעות לוואי לא רצויות או חוסר יעילות כלפי חלק מסוגי תאים. תאי גזע מזנכימליים (MSCs), הנמצאים כמעט בכל האיברים/רקמות שלאחר הלידה, מאופיינים ביכולת להתחדש (חלוקות סימטריות) ולהתמיין, ובכך תורמים לתחזוקה והתחדשות של הרקמה השוכנת [27]. בשל התכונות הייחודיות הללו, יחד עם התפקודים האנטי-דלקתיים והמדכאים החיסוניים החזקים, MSCs מיושמים באופן נרחב בטיפול תחליפי תאים לטיפול במחלות שונות, כולל סוכרת, טרשת נפוצה, אוטם שריר הלב, וכן הלאה [28]. עם זאת, בדומה לצאצאים המובחנים שלהם ולתאים בלתי-פוטנטיים אחרים, MSCs מסוגלים להזדקק לשכפול או בטרם עת בתגובה להפעלה של אונקוגנים ולגירויים מלחיצים [29, 30]. להזדקנות של MSCs יש הרבה תוצאות לא רצויות, ביניהן התשישות של מאגר תאי הגזע, תחזוקה והתחדשות רקמות מופחתות, פגיעה ביכולת ההתמיינות, התפשטות הזדקנות בתיווך SASP, תכונות אנגיוגניות מופחתות, שינוי בנישת תאי הגזע [29,31-33]. בהתחשב במשמעות הביולוגית של תפקוד ה-MSCs התקין, MSCs מזדקנים עשויים להיחשב ליעד המכריע לניתוח. בהתאם להצעה זו, פורסמו במהלך השנה האחרונה מספר סקירות המדגישות תוצאות מועילות אפשריות של הסרת MSCs בגיל מבוגר [29, 31,34,35]. עם זאת, ישנם רק נתונים ניסיוניים מעטים לגבי בעיה זו [36-40].

במסגרת המחקר הנוכחי, אנו מדגימים לראשונה שגליקוזידים לבביים, כלומר אואבאין ובופלין, אינם מצליחים להציג פעילות המוליטית כלפי MSCs אנושיים (hMSCs) שמקורם באנדומטריום (END-MSCs), רקמת שומן (AD-MSCs), עיסת שיניים (DP-MSCs) וג'לי Warton (WJ-MSCs). בנוסף, אנו מאשרים ששני הגליקוזידים הלבביים מסוגלים לגרום לאפופטוזיס באופן מועדף בסנס-סנט A549 ו-SK-HEP-1, כפי שתואר קודם לכן במחקרי הפיילוט [25,26]. על ידי הערכת שינויים בהומאוסטזיס יוני הנגרם על ידי רמות החסימה והביטוי של Nat/K plus -ATPase של הגנים הקשורים, אנו חושפים שהעדר אנליזה המושרה על ידי ouabain עשוי להיות מתווך על ידי היעילות המוגברת של היבוא המפצה K plus ב-END- MSCs בהשוואה ל-A549 המזדקן. יתר על כן, באמצעות ביואינפורמטיקה מתקדמת אנו מדגימים שהזדקנות של END-MSCs, עמידים לניתוח המושרה על ידי ouabain, מלווה ברכישת פנוטיפ עמיד לאפופטוזיס, בעוד שהזדקנות של A549 רגיש לאואבאין. חשוב לציין, חסימת הפעילות של חלבון אנטי-אפופטוטי MCL-1 לפני טיפול בגליקוזיד לבבי הובילה לניתוח של END-MSCs עמידים לאפופטוזיס. לכן, אנו מספקים ראיות ברורות לכך שהתנגדות לאפופטוזיס אינה תכונה כללית של תאים מזדקנים. בהתבסס על הנתונים שהתקבלו, אנו מסיקים כי היעילות של גישות אנליטיות עשויה להיות תלויה בשאלה האם תאים אכן הפכו עמידים לאפופטוזיס במהלך התפתחות הזדקנות.

חומרים ושיטות

תאים

END-MSCs, WJ-MSCs, DP-MSCs, AD-MSCs, A549 ו-SK-Help התקבלו מהאוסף הרוסי של תרבויות תאים (המכון לציטולוגיה, סנט פטרסבורג, רוסיה). קווי A549 ו-SK-Help אושרו על ידי קריולוגיה, גידוליות, בדיקות איזואנזים (LDH ו-G6PD) וניתוח STR. התאים תורבו במדיום מלא DMEM F12(Gibco BRL) בתוספת של 10 אחוז FBS (HyClone), 1 אחוז פניצילין-סטרפטומיצין (Gibco BRL) ו-1 אחוז גלוטמי (Gibco BRL). כל התאים נבדקו באופן שגרתי עבור זיהום מיקופלזמה.

מצבים מעוררי הזדקנות ומתח

עבור הזדקנות הנגרמת על ידי מתח חמצוני, END-MSCs/WJ-MSCs טופלו ב-200 uM/100 uM HO(Sigma) למשך שעה. עבור הזדקנות הנגרמת על ידי doxorubicin, DP-MSCs/A549 טופלו ב-1 מיקרומטר של doxorubicin (Veropharm) למשך 3 ימים. בכל אחד מהמקרים, תאים נחשבו לזקנים לא לפני 14 ימים לאחר הטיפול. עבור הזדקנות רפליקטיבית AD-MSCs מוקדם יותר מהמעבר הרביעי זוהו כתאי בקרה ומאוחר מהעשירי כזקנים. עבור הזדקנות הנגרמת על ידי אטופוסיד A549/END-MSCs/SK-Help טופלו ב-2 uM/5 uM/3 uM etoposide (Veropharm) במשך 3 ימים ונותחו לא לפני 7 ימים לאחר השראת ההזדקנות. במקרה זה, תכנון הטיפול עלה בקנה אחד עם אלו שתוארו במחקר שממנו מקורו נתוני RNA-seq (Wang et al.,2017). שני גליקוזידים לבביים שיישנו כתרכובות סנוליטיות--Ouabain (Sigma) ובופלין (Calbiochem).

על מנת להשוות התנגדות למתח בין ביקורת END-MSCs מזדקנים או A549, תאים טופלו ב-400/800 uM H O2(Sigma) למשך שעה אחת או ב-0.3/1 uM staurosporine (Sigma). כדאיות התא נותחה 48 שעות לאחר השראת לחץ.

כדי לחסום פעילות MCL-1 END-MSCs טופלו מראש ב-10 uM של A-1210477(Sigma) למשך 3 ימים.

ניתוח ציטומטריית זרימה

מדידות של כדאיות תאים, שגשוג, גודל תא, פלואורסנציה אוטומטית, שיעורי אפופטוזיס, מחשוף קספאז 3/7, פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית ודפולריזציה של הממברנה בוצעו על ידי ציטומטריית זרימה. ציטומטריית זרימה בוצעה באמצעות CytoFLEX (Beckman Coulter) והנתונים שהתקבלו נותחו באמצעות תוכנת CytExpert גרסה 2.0. תאים דבקים נשטפו פעמיים עם PBS ונקטפו על ידי טריפסיניזציה. תאים מנותקים אספו והושעו מחדש במדיום טרי ולאחר מכן נספרו ועברו ניתוח לצורך אוטופלואורסצנטי. על מנת לגשת לכדאיות התא, 50ug/ml propidium iodide (Life Technologies) נוספו לכל דגימה ממש לפני הניתוח. גודל התא הוערך על ידי פיזור אור ציטומטרי קדימה של תאים PI שליליים. השראת אפופטוזיס אומתה באמצעות צביעה משותפת של Annexin-V-APC (Invitrogen) ו-DAPI (Sigma) בהתאם להוראות היצרן. פעילות Caspase הוערכה באמצעות CellEventTM Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen) לפי פרוטוקול היצרן. אובדן פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי הוערך באמצעות צבע היחס היחסי JC-1 (Invitrogen). הליך הצביעה בוצע בהתאם לפרוטוקול היצרן. עבור דה-פולריזציה של הממברנה, השתמשנו ב-DiBAC4(3) בדיקה ניאון (Invitrogen).

צביעת גלקטוזידאז הקשורה להזדקנות

צביעת -Galactosidase (SA- -Gal) הקשורה להזדקנות בוצעה באמצעות ערכת צביעת גלקטוזידאז (Cell Signaling Technology) לפי הוראות היצרן. ניתוח כמותי של תמונות הופק עם היישום של חבילת MatLab, על פי האלגוריתם שתואר קודם[41]. עבור כל נקודת ניסוי, נותחו לא פחות מ-50 תאים שנבחרו באקראי.

סופג מערבי

סופג ווסטרן בוצע כמתואר קודם [41]. אלקטרופורזה של SDS-PAGE, העברה לממברנת ניטרוצלולוזה ואימונובלוטינג עם זיהוי ECL (Thermo Scientific) בוצעו לפי פרוטוקולים סטנדרטיים של היצרן (Bio-Rad Laboratories). נעשה שימוש בנוגדנים נגד החלבונים הבאים: גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH)(clone 14C10), phospho-p53(Ser15), p21(clone 12D1), phospho-Rb (Ser807/811) , HMGB1(משובט D3E5), כמו גם חזרת פרוקסידאז מצומדת עז נגד ארנבת IgG. שיעורי הדילול היו 1:1000 עבור כל הנוגדנים הראשוניים ו-1:7000 עבור המשניים. כל הנוגדנים נרכשו מ- Cell Signaling. ה-Scion Image 4.0 (Scion Corporation) שימש לבחירה ולקביעת צפיפות הרקע מופחתת של הלהקות בכל הג'לים והכתמים.

ניתוח טרנסקריפטומי

בניתוח נעשה שימוש בדגימות משלושת מערכי הנתונים הבאים של Gene Expression Omnibus (GEO)RNA-seq: GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 ו-GSM2742121-GSM2742122 לתאי בקרה וזקניםA549, בהתאם); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 ו-GSM3454500-GSM3454502 לתאי בקרה ותאי IMR-90, בהתאם); ומערך הנתונים שלנו GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 ו-GSM{16}}GSM4877910 עבור בקרה ו-END-MSCs מזדקנים, בהתאמה). הנתונים של כל מערכי הנתונים עובדו באותו אופן.

נתוני קריאות גולמיים עברו סינון איכותי וחיתוך מתאם באמצעות סקריפטים FilterByTile ו-BBDuk מחבילת BBtools (גרסה 38.75) תוך שימוש באפשרויות ברירת המחדל. הקריאה הנותרת סוננה ונחתכה בנוסף באמצעות סקריפט טרימסטר מ-FastqPuri-חבילה (גרסה 1.0.7).cistanche בריטניהפעולת החיתוך הוחלה על שני קצוות הקריאה אם ​​הם הכילו N's או שאיכותם הייתה מתחת לסף האיכות שהוגדר ל-27, כל הקריאות הקצרות מ-25 בסיסים נמחקו. בקרת האיכות של הזמירה התקיימה עם תוכנת FastQC (גרסה 0.11.7) וסקריפטים של FastqPuri. הקריאות, לאחר שעברו את כל הפעולות, מהוות לא פחות מ-90 אחוז מהנתונים הראשוניים.

שפע התמלילים נאמד באמצעות מיפוי קל משקל של סלמון (גרסה 1.1.0) הפועל במצב יישור סלקטיבי. רשימת הפתיונות נוצרה על סמך גנום ההתייחסות האנושי של Gencode GRCh38.p13 (גרסה 33) ושימשה עוד לבניית האינדקס על קבצי ייחוס משורשרים של תעתיק וגנום Gencode (גרסה 33) תוך שימוש בגודל קמר של 21. פעולות מיפוי הופעלו עם דגלים נוספים——numBootstraps 30——פאייטים——gcBias——אמת מיפויים. שיעורי המיפוי שהתקבלו היו בסביבות 70 אחוזים.

עיבוד נתונים נוסף בוצע באמצעות R גרסה 3.6.3 עם אוסף חבילות Tidyverse (גרסה 1.3.0). ספירת גנים משוערת, מטא-נתונים וטווחי תמלול הועלו לתוך R וסוכמו לרמת גן באמצעות tximeta (גרסה 1.4.5). מטריצת הספירה שהתקבלה סוננה כך שתכיל שורות עם לפחות 5 ספירות משוערות בכל הדגימות, המטריצה ​​שהתקבלה הכילה 20,400 גנים.

עבור ייצוג PCA ומפת חום, ספירות הקריאה נורמלו באמצעות טרנספורמציה ביומן מחבילת DESeq2 (גרסה 1.26.0).cistanche wirkungמפות חום נבנו עם שימוש במסנן גנים (גרסה 1.38.0) ומפת חום (גרסה 1.0.12)R חבילות. אימות דגימות חלוקה לפי משתנה הזדקנות נערך באמצעות תת-הגדרת ספירות קריאה מנורמלות לפי גנים הקשורים למונח Gene Ontology "הזדקנות תאית" (GO 0090398). ניתוח ביטוי דיפרנציאלי ואומדן שינויים בקפלים ביומן חושבו באמצעות DESeq2 עבור המשתנה האחרון בנוסחת התכנון השליטה על מצב הזדקנות התאים, תגובת הטיפול ב-ouabain ואינטראקציה של הגורמים המצוינים. כדי לחזק בדיקות ביטוי דיפרנציאלי, הוחל תיקון שינוי קיפול יומן באמצעות שילוב של מעריך הצטמקות אדפטיבית מאריזת כף היד (גרסה 1.8.0) וציון סף שינוי קיפול יומן השווה ל-0.667. ההערכות המכווצות שהתקבלו שימשו עוד לדירוג גנים ולהפעלת ניתוח העשרה של ערכת גנים באמצעות פרופיל אשכול (גרסה 3.14.3) וחבילות Fuse (גרסה 1.12.0)R עם ערכי p מותאמים להשוואות מרובות לפי שיטת Benjamin-Hochberg. דגימות מיקרו-מערך של Affymetrix עבור AD-MSCs בקרה ו-senes-cent התקבלו ממסד הנתונים GEO (GSE66236) ועובדו עם אפליקציית Phantasus עם נורמליזציה של log2 וספירת כמות. ניתוח העשרה של ערכת גנים בוצע עם שימוש בפתיל (גרסה 1.12.0)R חבילת.

מיצוי RNA, שעתוק הפוך ו-PCR בזמן אמת

מיצוי RNA, שעתוק הפוך ו-PCR בזמן אמת בוצעו כמתואר במחקר הקודם שלנו [32]. ריאגנטים למיצוי RNA (Reagent ExtractRNA), שעתוק הפוך (ערכת MMLV RT) ו-PCR בזמן אמת (ערכת HS SYBR) התקבלו מ-Evrogen. רמות ביטוי הגנים הוערכו באמצעות מגבר ה-PCR BioRad CFX-96 בזמן אמת (BioRad) עם תוכנית ההפעלה הבאה עבור כל הגנים שנחקרו: 40 מחזורי התכה למשך 10 שניות ב-95 מעלות, חישול למשך 15 שניות ב-57.5 מעלות וסינתזה למשך 15 שניות ב-72 מעלות. ניתוח עקומות התכה יושם כדי לשלוט בספציפיות של תגובות. הניתוח הבא של הנתונים שהתקבל בוצע באמצעות תוכנת Bio-Rad CFX Manager (BioRad) עם שיטת הכימות הסטנדרטית 2deltaCt עם שימוש בביטוי GAPDH כנקודת ההתייחסות. רצפי פריימר מפורטים בטבלה 1.

ניתוח סטטיסטי

כדי לקבל מובהקות להבדל בין שתי הקבוצות הוחל מבחן t של סטודנט או מבחן t של Welch. לצורך השוואות מרובות בין קבוצות, נעשה שימוש ב-ANOVA עם HSD של Tukey. אלא אם צוין אחרת, כל הנתונים הכמותיים מוצגים כממוצע ± SD והכוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים כדלקמן: ns, לא משמעותי,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

תוצאות

H2O2-מטופלים ב-END-MSC נכנסים להזדקנות מוקדמת

במסגרת המחקר הנוכחי, השתמשנו בתאי גזע מזנכימליים אנושיים מבודדים מאנדומטריום מפורק (END-MSCs), העומדים בקריטריונים המינימליים שהוצעו על ידי ISCT להגדרת hMSCs [41]. בעבר, פיתחנו מודל ניסיוני אמין לחקור היבטים שונים של הזדקנות מוקדמת של END-MSCs [30]. כלומר, הראינו ש-END-MSCs נתונים ללחץ חמצוני תת קטלני רכשו בהדרגה את כל המאפיינים האופייניים של תאים מזדקנים, כולל מוקדי נזק מתמשך של DNA ותגובת נזק פעיל ל-DNA, עצירת מחזור תאים בלתי הפיכה בתיווך ה-p53/p21/Rb הקלאסי. מסלול, אובדן שגשוג, היפרטרופיה של תאים, הופעת SA- -צביעת מרה ופיתוח של פנוטיפ הפרשה הקשור להזדקנות [30, 32, 42]. כאן יישמנו את המודל המעוצב כדי לחקור את ההשפעה הסנוליטית של אואבאין, כמו גם לחשוף את השינויים התוך-תאיים הבסיסיים בהומאוסטזיס יונים. בתחילה, על ידי הערכת הפרמטרים הנפוצים ביותר אישרנו שטיפול במינון בודד (1 שעה, 200 מיקרומטר) HO היה מספיק כדי לגרום להזדקנות ב-END-MSCs. חשוב לציין, END-MSCs לחוצים נחשבו לזקנים שבועיים לאחר הלחץ החמצוני; לכן, כל סמני ההזדקנות הוערכו לא לפני 14 ימים לאחר הטיפול ב-H-Oz. ואכן, טיפול H-Oz ב-END-MSCs הוביל לחסימת שגשוג, היפרטרופיה של תאים כפי שמצוין על ידי גודל התא המוגדל, הצטברות של lipofuscin שזוהתה על ידי עלייה של אוטופלואורסצנטי, הופעת ה-SA- -Gal, הפעלה של מסלול p21/Rb ואובדן HMGB1 יחד תומכים בהקמת הזדקנות בתנאי הניסוי שנבחרו (איור ac,e,f).

ההשפעות המזיקות ביותר של תאים מזדקנים ברמות הרקמה והאורגניזמים הן תוצאה של חיוניותם הממושכת. בהתאם לנקודה זו, END-MSCs שטופלו ב-HO? שמרו על כדאיות גבוהה אפילו בשלבים המאוחרים של התפתחות הזדקנות (כדאיותם של END-MSCs מזדקנים הוערכה 17 ימים (14 ימים-3 ימים) לאחר הלחץ החמצוני הראשוני) (איור 1ד) ). לסיכום, טיפול HO2-תת קטלני ב-END-MSCs הוא המודל המתאים של הזדקנות מוקדמת ורלוונטי לחקור את ההשפעות של תרכובות סנוליטיות על END-MSCs.

לגליקוזיד לב אואבאין אין פעילות סנוליטית כלפי END-MSCs מזדקנים בטווח ריכוזים רחב

עדויות אחרונות מצביעות על כך שגליקוזידים לבביים, כולל אובאין, דיגוקסין ובופלין, מייצגים משפחה של תרכובות בעלות פעילות המוליטית [25,26]. למרות שכיום גליקוזידים לבביים נחשבים לסנוליטים רחבי טווח, הנתונים לגבי השפעתם על hMSCs מזדקנים חסרים. לכן, כאן בדקנו האם ל-ouabain יש פוטנציאל לגרום למוות באופן סלקטיבי ב-END-MSCs מזדקנים. לשם כך, הערכנו את הכדאיות של END-MSC של בקרה ושל סנס-סנט לאחר טיפול ב-ouabain בטווח הריכוזים הרחב (מ-10-' ל-10~M). מעניין לציין כי אף אחד מהריכוזים לא הוביל לירידה ניכרת בכדאיות של תאי בקרה ושל תאי מזדקנים ביום הראשון לאחר יישום אואבאין (איור 2 ואיור משלים.S1).

עם זאת, ביום השלישי לאחר הטיפול באואבין, חשפנו ירידה משמעותית תלוית מינון בכדאיות של END-MSCs בקרה (איור 2א ואיור משלים. S1). באופן בלתי צפוי, תאים מזדקנים התבררו כעמידים יותר ל-ouabain בכל ריכוז שנבדק. בהתאם לתוצאה זו,10-מובאין הוביל למוות אפופטוטי נוטה יותר בתאי בקרה (20.75 אחוז An plus /PI-ו-36.47 אחוז An plus /PI פלוס) בהשוואה לתאי מבוגרים (15.01 אחוז An＋/PI -ו-12.15 אחוזים פלוס /PI פלוס )(איור 2ב). התוצאות שהושגו מוכיחות בבירור שבהקשר של END-MSCs מזדקנים לאובאין אין פעילות סנוליטית.

כדי לשלול השפעות אפשריות הקשורות לשונות של גירויים מעוררי הזדקנות על הפעולה הסנוליטית של ouabain, ביצענו קבוצה נוספת של ניסויים. כלומר, טיפלנו ב-END-MSCs עם etoposide במקום מתח חמצוני כדי לגרום להזדקנות מוקדמת.ביופלבנואידים הדריםEND-MSCs שטופלו באטופוסיד הציגו את כל התכונות האופייניות לתאים מזדקנים (איור 3a-e).

חשוב לציין, ל-ouabain לא הייתה פעולה המוליטית כלפי END-MSCs מזדקנים שטופלו באטופוזיד (איור 3f ואיור מנטאלי משלים. S2). נתונים אלה מספקים אישור נוסף לתוצאות לעיל והוכחות לכך שהיעדר ניתוח המושרה על ידי אובאין אינו תוצאה של טריגר ההזדקנות הקונקרטי המשמש להשראת הזדקנות.

איור 1 אימות של מודל הזדקנות מוקדמת של END-MSCs הנגרמת על ידי מתח חמצוני. END-MSCs מזדקנים א שגשוג רופף, b עוברים היפרטרופיה, ג רוכשים אוטופלואורסצנטיות מוגברת, שומרים על כדאיות תאים גבוהה d ו-e מציגים פעילות SA- -Gal בהשוואה לאלו הבקרה. f לרמות זרחון של p53 ו-Rb ורמות ביטוי של חלבוני p21 ו-HMGBI ב-END-Ouabain הבקרה והזדקנות אין פעולה המוליטית כלפי תאי גזע מזנכימליים אנושיים ממקורות שונים כדי להרחיב את התצפיות שלנו לגבי היעדר אנליזה המושרה על ידי ouabain ב-END-MSCs , ניתחנו השפעות ouabain על hMSCs שבודדו ממקורות אחרים כולל רקמת שומן, עיסת שיניים וג'לי של וורטון. כדי לחזק בנוסף את הנתונים שלנו, יישמנו מודלים שונים של הזדקנות - הזדקנות רפליקטיבית עבור AD-MSCs, הזדקנות המושרה על ידי doxorubicin עבור DP-MSCs, והזדקנות הנגרמת על ידי מתח חמצוני עבור WJ-MSCs (איור 4a-f).

כפי שמוצג באיור.4g, סוגים שונים של hMSCs היו שונים בכדאיות בטיפול באובאין, למשל, גם DP-MSC בקרה וגם מזדקן היו עמידים הרבה יותר לפעולת ouabain מאשר WJ-MSCs (איור 4g ואיור משלים. S3b, ג). עם זאת, ouabain לא הצליח לגרום לסנוליזה באף אחד מהסוגים של hMSCs מזדקנים (איור 4g ואיור משלים. S3). יחד, הנתונים שהתקבלו מוכיחים כי היעדר ניתוח המושרה על ידי ouabain הוא מאפיין נפוץ לסוגים שונים של hMSCs. MSCs. הערכים המוצגים הם ממוצע ± SD. עבור השוואות קבוצות מרובות ב-a ו-d, הוחל ANOVA חד כיווני, n=3, ns לא מובהק,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH שימש כבקרת טעינה

בופלין הגליקוזיד הלבבי אינו מצליח להרוג את END-MSCS המזדקן

כדי לאמת את היעדר פעולה סנוליטית של גליקוזידים לבביים כלפי hMSCs, השתמשנו בבופלין, תרכובת נוספת עם הפעילות הסנוליטית המוצהרת השייכת למשפחת הגליקוזידים הלבביים [25]. ל-Bufalin כמעט ולא הייתה השפעה על כדאיות השליטה ו-H2O2-מטופלים ב-END-MSC של סנס-cent בטווח ריכוז רחב (מ-10-7 עד 10-5 M) (איור 5a והשלמה איור S4a).

בדומה למה שצפינו עבור טיפול באובאין, היעדר ניתוח על בופאלין היה בלתי תלוי בגירויים מעוררי הזדקנות, מכיוון שכדאיותם של ESCs שהתבגרו בתגובה ללחץ חמצוני או לאטופוזיד לא הושפעה (איור 5a, ב, איור משלים ס4א, ב). התוצאות שתוארו לעיל מאשרות שגליקוזידים לבביים התבררו כלא יעילים להשראת מוות ממוקדת ב-END-MSCs בגיל מבוגר. MSCs. הערכים המוצגים הם ממוצע ± SD. עבור השוואות קבוצות מרובות ב-a ו-d, הוחל ANOVA חד כיווני, n=3, ns לא מובהק,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

בופלין הגליקוזיד הלבבי אינו מצליח להרוג את END-MSCS המזדקן

כדי לאמת את היעדר פעולה סנוליטית של גליקוזידים לבביים כלפי hMSCs, השתמשנו בבופלין, תרכובת נוספת עם הפעילות הסנוליטית המוצהרת השייכת למשפחת הגליקוזידים הלבביים [25]. ל-Bufalin כמעט ולא הייתה השפעה על כדאיות השליטה ו-H2O2-מטופלים ב-END-MSC של סנס-cent בטווח ריכוז רחב (מ-10-7 עד 10-5 M) (איור 5a והשלמה איור S4a).

בדומה למה שצפינו עבור טיפול באובאין, היעדר ניתוח על בופאלין היה בלתי תלוי בגירויים מעוררי הזדקנות, מכיוון שכדאיותם של ESCs שהתבגרו בתגובה ללחץ חמצוני או לאטופוזיד לא הושפעה (איור 5a, ב, איור משלים ס4א, ב). התוצאות שתוארו לעיל מאשרות שגליקוזידים לבביים התבררו כלא יעילים להשראת מוות ממוקדת ב-END-MSCs בגיל מבוגר.

איור 2 ל- Ouabain אין פעילות המוליטית ל-HO2-מטופלים בסנס-cent END-MSC בטווח ריכוזים רחב. כדאיות תאים יחסית (אחוז) של END-MSCs בקרה וגיל מבוגר ב-3 ימים לאחר הטיפול ב-1077,10~6,10-5 M ouabain. ב אינדוקציה של אפופטוזיס ב-END-MSCs עם 10-6 מוביין הוערכה על ידי צביעה כפולה של Annexin V/DAPI. n=3 ניסויים עצמאיים. כל הנתונים תואמים לממוצע ± SD. מובהקות סטטיסטית הוערכה על ידי מבחן ה-t של Welch:ns לא מובהק,***p<>

שני הגליקוזידים הלבביים אואבאין והבופאלין מסוגלים לגרום למוות של תאים באופן סלקטיבי בתאי A549 ו-SK-Hep1 מזדקנים

בהתחשב בעובדה שהתוצאות שלנו אינן תואמות את העדויות שפורסמו לאחרונה לגבי הפעולה הסנוליטית בספקטרום רחב של גליקוזידים לבביים, החלטנו לשחזר את האפקט הזה באמצעות המודל הסלולרי המתואר במחקרים הרלוונטיים [25,26]. לפיכך, ביצענו סדרה של ניסויים תוך שימוש בתאי קרצינומה ריאות A549 הבקרה והזדקנות. הזדקנות בתאי A549 נגרמה על ידי טיפול באטופוזיד. הזדקנות הנגרמת על ידי אטופוסיד של תאי A549 היא מודל בשימוש תכוף ולכן מאופיין היטב של הזדקנות המושרה על ידי טיפול [4]. כמו כן, הוכח כי אואבאין הורג באופן סלקטיבי תאי A549 מזדקנים שטופלו באטופוזיד[25]. כדי להוכיח הזדקנות ב-A549, הערכנו את קצב ההתפשטות, גודל התא, הצטברות של lipo-fine, SA- -צביעת גל, מצב ההפעלה של מסלול p53/p21/Rb, ורמת הביטוי של HMGB1 (איור 6a-e).

כדי לאמת פעילות המוליטית של ouabain כלפי תאים סרטניים מזדקנים, הערכנו תחילה את כדאיות התא תלוי המינון. בהתאם לתוצאות שלנו שתוארו לעיל, לא הצלחנו לזהות שום ירידה משמעותית במספר תאי הבקרה הקיימא או תאי A549 מזדקנים תוך 24 שעות לאחר יישום ouabain (איור משלים. S5a). עם זאת, ב-3 ימים לאחר הטיפול, ouabain הפחית משמעותית את הכדאיות של תאי A549 מזדקנים באופן תלוי מינון, בעוד שמספר תאי הביקורת A549 ירד במידה הרבה פחות (איור 7a ואיור משלים. S5a). כלומר, כ-90 אחוז מתאי הביקורת שמרו על הכדאיות ב-10- M ouabain בהשוואה ל-50 אחוז מתאי A549 מזדקנים שטופלו באותו מינון (איור 7a). יתרה מכך, תאי A549 מזדקנים היו מועדים יותר למוות תאי המושרה על ידי בופאלין מאשר עמיתיהם הביקורתיים (איור 7b) (איור 5b ואיור משלים. S5b).

על פי הנתונים שפורסמו, ouabain עורר אפופטוזיס-3-תלוי בקספאז בתאי A549 מזדקנים [26]. ואכן, חשפנו עלייה משמעותית בשבר החיובי הכפול ו/או ה-PI בתאי סרטן מזדקנים שטופלו ב-10-6M ouabain (איור 7c). יתרה מזאת, באמצעות בדיקת פלורסנט צפינו בהפעלה של קספס-3 בתאי A549 מזדקנים שטופלו באואבאין (איור 7ד). ביחד, תוצאות אלו תואמות לחלוטין את הנתונים שתוארו על ידי מחברים אחרים ומאשרות את הפעילות ההמוליטית של אואבאין כלפי A549.

כמו כן, השתמשנו ב- doxorubicin במקום באטופוזיד כדי לגרום להזדקנות ב-A549 (איור 8a-e). כצפוי, A549 מזדקן שטופל ב-doxorubicin, כמו גם שטופל באטופוזיד, הפגינו רגישות גבוהה יותר הן ל-ouabain והן ל-bufalin בהשוואה לעמיתיהם הביקורתיים (איור 8g ואיור משלים. S6). האחרון מאשר כי ההשפעות הסנוליטיות של גליקוזידים לבביים אינן תלויות בגירויים מעוררי הזדקנות. לפיכך, לגליקוזידים לבביים אכן יש סנוליטים

איור 3 Ouabain אינו מסוגל לגרום לסנוליזה ב-END-MSCs מזדקנים שטופלו באטופוסיד. אימות של מודל ההזדקנות המושרה על ידי אפיזודה עבור END-MSCs: יכולת התפשטות, גודל תא b, רמות autofluorescence c ופעילות d SA- -Gal, רמת זרחון e של Rb ורמות ביטוי של חלבוני p21 ו-HMGBI. f כדאיות תאים יחסית (אחוז) של תאי בקרה ותאי מזדקנים לאחר טיפול ב-10-6 ouabain. הערכים הם ממוצע ± SD. עבור קבוצות מרובות הוחלו השוואות ב-ANOVA חד כיווני,n=3, ns לא מובהק,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

לבסוף, החלטנו לשחזר ניסויי אנליזה על תאי סרטן כבד שטופלו באטופוזיד SK-Help, מודל תא נוסף עם השפעות סנוליטיות מוכחות של גליקוזידים לבביים על פי Guerrero et al. מחקר [25] (איור 9א-ה). SK-Help מזדקן שטופל באטופוזיד הוכיח רגישות גבוהה יותר לשני הגורמים בהשוואה לעמיתיהם הביקורתיים, והוכיח את הפעולה ההמוליטית של גליקוזידים לבביים כלפי סוג תא זה (איור 9f ואיור משלים. S7).

יחד נתונים אלו מעידים כי הסלקטיביות של המוליזה המושרה על ידי גליקוזידים לבביים מסתמכת יותר על טבע התא מאשר על טריגר ההזדקנות הקונקרטי.

מאמר זה מופק מתוך Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x