ההשפעה המגנה של הרבה ציסטנצ'ס על מיוטוקסיות הנגרמת על ידי סטטין במבחנה
Mar 24, 2022
איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com
איליין וואט a,b,1, Chun Fai Ng a,b,1, Chi Man Koon a,b, Eric Chun Wai Wong a,b, Brian Tomlinson c, Clara Bik San Lau a,b,n
מכון לרפואה סינית, האוניברסיטה הסינית של הונג קונג, שאטין, הטריטוריות החדשות, הונג קונג
b מעבדת מפתח המדינה לפיטוכימיה ומשאבי צמחים במערב סין, האוניברסיטה הסינית של הונג קונג, שאטין, הטריטוריות החדשות, הונג קונג
ג המחלקה לפרמקולוגיה קלינית, המחלקה לרפואה וטיפול, האוניברסיטה הסינית של הונג קונג, שאטין, טריטוריות חדשות, הונג קונג
תַקצִיר:
רלוונטיות אתנו-פרמקולוגית: הרבהCistanches(HC,Cistancheמדברית, אוCistanchetubulosa) הוא עשב סיני המשמש באופן מסורתי לבעיות שרירים. מחקרים קודמים הראו שתמצית HC יכולה להפחית את הנזק לשרירים ולשפר את אחסון ה-ATP בחולדות לאחר אימון. עם זאת, השפעתו על רעילות השרירים הנגרמת על ידי סטטין מעולם לא נחקרה.
מַטָרָה:מטרת מחקר זה הייתה לקבוע אם התמצית המימית של HC (HCE) יכולה למנוע רעילות הנגרמת על ידי סימבסטטין בתאי שריר שלד של חולדה L6 והאם verbascoside הוא המרכיב הביו-אקטיבי העיקרי שתורם להשפעות
חומרים ושיטות:MTT בוצע כדי לקבוע את ההשפעות של HCE ({{0}}-2000 מ"ג/מ"ל) או verbascoside (0-160 מ"מ) על תאי L6 שטופלו בסימבסטטין (10 מ"מ). בדיקת אפופטוזיס של Annexin V-FITC/PI ובדיקת Caspase 3 בוצעו כדי לקבוע את תפקיד ההגנה של HCE על מוות תאי המושרה על ידי סימבסטטין, וכדי להעריך אם HCE הפעיל את השפעתו המגנה דרך מסלול הקספאז. ייצור ATP נמדד כדי לבדוק אם HCE יכול למנוע הפחתה הנגרמת על ידי סימבסטטין בייצור ATP במבחנה.
תוצאות:סימבסטטין הגביר באופן משמעותי מוות של תאים אפופטוטיים בתאי L6. HCE הפעיל באופן משמעותי הפחתה תלוית מינון על תאים אפופטוטיים המושרים על ידי סימבסטטין, אולי דרך מסלול קספאז-3. סימבסטטין הפחית את ייצור ה-ATP בתאי L6, אשר נמנע בהתאם למינון על ידי HCE. הייתה רק מגמה אך לא השפעה משמעותית (למעט במינון גבוה) של verbascoside על ההגנה על רעילות שרירים הנגרמת על ידי סימבסטטין.
מסקנות:לסיכום, הדגמנו לראשונה ש-HCE יכול להפעיל השפעה הגנה תלוית מינון על רעילות הנגרמת על ידי סימבסטטין במבחנה, דבר שלא היה סביר בגלל נוכחות verbascoside. המחקר שלנו הציע שימוש פוטנציאלי ב-HC במצב של רעילות שרירים הנגרמת על ידי סימבסטטין.
מילות מפתח:הרבהCistanches, סטטין כולסטרול, היפרליפידמיה, רעילות שרירים, ורבסקוסיד, קספאז-3
1. הקדמה
מעכבי HMG-CoA רדוקטאז (סטטינים), בהיותם קבוצת תרופות המרשם הנמכרת ביותר בעולם בהיסטוריה, מתועדים היטב כמועילים לחולים משני המינים בגילאים שונים עם סיכון בינוני וגבוה למחלות לב וכלי דם (CVD) (גולומב ו אוונס, 2008). לאחר מכן פותחו ואושרו סטטינים שונים, כולל פרבסטטין, אטורבסטטין, פלובסטטין, לווסטטין, פיטאוסטטין, רוסווסטטין וסימבסטטין. באופן כללי, כל הסטטינים פועלים באמצעות עיכוב הפחתת HMG-CoA לחומצה מבלונית במהלך השלב המוקדם של מסלול ה-mevalonate כדי להפחית את ייצור הכולסטרול (Kromer and Moosmann, 2009; Thompson et al., 2003). למרות שסטטינים בדרך כלל נסבלים היטב, אחת ההשפעות השליליות הקליניות החשובות והידועות ביותר היא רעילות שרירי השלד (רבדומיוליזה) (Kobayashi et al., 2008). הפרעות בשרירי השלד יכולות לנוע בין מיאלגיה שפירה למיופתיה חמורה. בעוד שמגוון של מנגנונים מוצע ויכול להיות אחראי להשפעות השליליות של השרירים של סטטין, מנגנונים מיטוכונדריאליים ממלאים תפקיד חשוב (Golomb and Evans, 2008). Mevalonate הוא לא רק מבשר של כולסטרול, אלא גם עבור תרכובות אחרות כולל סלנופרוטאינים, dolichol ו- ubiquinone (Kaufmann et al., 2006; Vaklavas et al., 2009). יכולתם של סטטינים לעכב את מוולונט תעכב אפוא גם את ייצור סלנופרוטאינים כגון גלוטתיון פרוקסידאז (GPx), שהם אנזימים חשובים בשמירה על מנגנון ההגנה האנטי-אוקסידטיבי (Kromer and Moosmann, 2009). סטטינים יכולים גם להוביל לדלדול יוביקינון, ולגרום להפחתה בצריכת החמצן וסינתזת ATP (Beltowski et al., 2009). יתר על כן, הגדלת מחקרים in vitro ו-in vivo הוכיחו שסטטין יכול גם לפעול ישירות על המיטוכונדריה של הרקמה כדי לגרום למעבר ממברנה תלוי Ca2þ (MPT) באופן תלוי מינון (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006 ). זה קשור גם לגידול במיני חמצן תגובתיים (ROS) וללחץ חמצוני מיטוכונדריאלי, המוביל למוות של תאים ולכן תורם לפציעה בכבד ובשרירים (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006).
הרבהCistanches, כל הצמח היבש של Cistanche deserticola YC Ma, או Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight (משפחת Orobanchaceae), הם צמחים טפילים הגדלים בעיקר באזורים המדבריים של צפון וצפון מזרח סין (Siu and Ko, 2010).הרבהCistanchesהוא צמח טוניק סיני ממריץ יאנג המשמש בעיקר לטיפול במחסור בכליות עם תסמינים כמו אימפוטנציה, אי פוריות, שפיכה מוקדמת. האופי הכבד והמגושם של העשב גם מרטיב את המעיים ועוזר להקל על עצירות. זהו גם צמח מרפא סיני שנרשם באופן מסורתי למטופלים נגד כאבים באזור החלציים והברכיים והוא צמח נפוץ בשימוש בניסוחים סיניים לטיפול בבעיות שרירים (Siu and Ko, 2010; Xiong et al., 1998). מעניין לציין שזה גם תואם את המחקרים המדעיים המודרניים שהדגימו את הפעילות נגד עייפות של תמצית עשירה בפוליסכרידים ופנילתנואידים שלהרבהCistanchesבחולדות לאחר אימון על ידי הפחתת הנזק לשרירים ושיפור אחסון ATP (Cai et al., 2010). עבודה אחרונה הוכיחה שתמצית מתנול של Herba Cistanches יכולה לשפר את יצירת ATP המיטוכונדריאלי (Leung and Ko, 2008). Siu and Ko (2010) הדגימו זאתהרבהCistanchesיכול גם לשפר את מצב הגלוטתיון המיטוכונדריאלי על ידי תיווך רמות של סינתזת גלוטתיון ו-GPx, ובכך להגן על רקמות מלחץ חמצוני בלבבות של חולדות. גם Siu and Ko (2010) הראו זאתהרבהCistanchesיכול להפחית את תוכן Ca2þ המיטוכונדריאלי, ובכך להפחית את ה-MPT תלוי Ca2þ. יתר על כן,הרבהCistanchesהוכח גם כנוגד חמצון חזק וחולל רדיקלים חופשיים באיברים שונים, מה שמפחית את הלחץ החמצוני ופעילויות ROS in vivo (Lu et al., 1995; Sui et al., 2011). מעניין יותר, בניסיון לקבוע את השבר הפעיל שתורם לפעילות נגד עייפות שלהרבהCistanches, נמצא כי verbascoside היה המרכיב העיקרי בשבר הפעיל (Cai et al., 2010). כמו כן, הוכח ש-Verbascoside מפחית את עייפות השרירים בקרפדות, אולי בשל פעילותו נוגדת החמצון (Liao et al., 1999), מה שמרמז ש-verbascoside יכול להיות המרכיב הביו-אקטיבי התורם להשפעות המועילות של Herba Cistanches.
מטרת מחקר זה הייתה לקבוע האם השימוש בתמצית מים Cistanches צמחים (HCE) יכול להפחית את רעילות השרירים המושרה על ידי סימבסטטין במבחנה. ההשערה הייתה שהשימוש ב-HCE יכול לתקן את תופעות הלוואי של רעילות שרירים הנגרמת על ידי סימבסטטין. כמו כן נעשה ניסיון לקבוע אם ההשפעות המיטיבות שלהרבהCistanchesמיוחסים לנוכחות של verbascoside.
2. חומרים ושיטות
2.1. אימות והכנה של חומרים צמחיים
חומר צמחי גלם שלהרבהCistanchesנרכש מספק בעל שם בגואנגג'ואו, סין.הרבהCistanchesאושרה כימית באמצעות כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) בהתאם לפרמקופיה הסינית (CP), 2010, עם verbascoside ו- echinacoside כסמנים כימיים (נתונים לא מוצגים). לאחר אימות כימי, דגימת שובר עשבוני שלהרבהCistanchesהופקד במוזיאון של המכון לרפואה סינית באוניברסיטה הסינית של הונג קונג (CUHK), עם דגימת שובר מספר 2014–3434.
בקצרה, 1 ק"ג מהעשב הגולמי הושרו למשך שעה אחת, ולאחר מכן מיצוי פעמיים על ידי חימום למשך שעה אחת תחת ריפלוקס ב-100 מעלות תוך שימוש ב-10 מים מזוקקים לכל מיצוי. התמציות המימיות (HCE) שולבו וסוננו. התסנין רוכז בלחץ מופחת ב-60 מעלות. התמצית המרוכזת עברה ליאופיל עד ליובש. אחוז התשואה היה 50.1 אחוזי משקל. כמות קטנה שימשה לקביעת הכמות של verbascoside ו- echinacoside באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה-ביצועית (UPLC). כל האבקה שחולצה נארזה בוואקום ואוחסנה עד לשימוש.
2.2. ניתוח UPLC של התמצית המימית
ניתוחי UPLC בוצעו באמצעות מערכת Waters Acquity Ultra Performance LC (Waters, ארה"ב). כל הממיסים הדרושים לניתוחי UPLC נרכשו מהמחלקה לכימיה באוניברסיטה הסינית של הונג קונג. Verbascoside ו- echinacoside נרכשו מהמכון הלאומי לבקרת מוצרים פרמצבטיים וביולוגיים, סין. תמיסה המדגם הוזרקה לעמודה Waters Acquity UPLC BEH C18 (10{{20}} 2.1 מ"מ id, גודל חלקיקים 1.7 מ"מ) עם Waters ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard Pre-Column ( 5-2.1 מ"מ מזהה, גודל חלקיקים 1.7 מ"מ). כל הממיסים סוננו מראש עם 0.45 מ"מ דיסק מסנן Millipore (Millipore) והוציאו גז. פליטת גרדיאנט בוצעה באמצעות מערכות הממס הבאות: שלב A נייד - אצטוטריל; שלב נייד ב' - מים מזוקקים כפולים/חומצת פורמית (99.9/ 0.1; v/v). האלוציה בוצעה בהליך גרדיאנט כדלקמן: 0-5 דקות, 88 אחוז B; 5-10 דקות, מ-88 אחוז B ל-83 אחוז B. קצב הזרימה בשימוש היה 0.4 מ"ל לדקה והזיהוי בוצע ב-331 ננומטר בהתאם ל-CP (2010). כל דגימה (5 ul) הוזרקה לעמוד לאחר סינון דרך דיסקית סינון 0.2 מ"מ. זיהוי הסמנים הכימיים בוצע על ידי השוואת זמני ההחזקה וספיגת ה-UV של הפסגות הלא ידועות לאלו של הסטנדרטים. עקומת כיול שורטטה על ידי סדרה של ריכוזים של verbascoside ואכינאקוסיד (40, 20, 10, 5, 2.5 ו-1.25 מ"ג/מ"ל) לצורך כימות. כימות של verbascoside ו- echinacoside בתוך תמצית הצמחים בוצע בשלושה עותקים. המערכת נוטרה על ידי מחשב המצויד בתוכנת Waters MassLynx לאיסוף נתונים, אינטגרציה וניתוח.
2.3. תרבית תאים
קו תאי שריר השלד של החולדות L6 נרכש מ-American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, ארה"ב). התאים נשמרו בצפיפות תת-קונפלוונטית ב-Dulbecco'sModifified Eagle's Medium (DMEM, ATCC, Manassas, VA, ארה"ב) בתוספת של 10% v/v סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S), וכן דגירה ב-37 מעלות באווירה לחה המכילה 5 אחוז CO2 ו-95 אחוז אוויר.
כדי לקבוע את ההשפעות של HCE על רעילות שרירים הנגרמת על ידי סטטין, תאי L6 טופלו עם סימבסטטין ב-1 0 מיקרומטר במשך 48 שעות כדי לגרום לרעילות. HCE (בריכוזים 0, 250, 500, 1000 ו-2000 ug/ml) או verbascoside (בריכוזים 0, 20, 40, 80 ו-160 מיקרומטר) נוספו כטיפול משותף עם סטטין כדי לקבוע אם תמצית צמחים יכולה למנוע את הרעילות של סטטין המושרה בתאי שריר השלד וכי אם verbascoside יכול להפעיל השפעות הגנה דומות כמו התמצית המימית הצמחית.
אפקט מגן של תמצית Herba Cistanche על רעילות הנגרמת על ידי סימבסטטין במבחנה
2.4. ציטוטוקסיות במבחנה
תאי L6 (1x105/well) נזרעו ב{{0}}צלחות תרבית בעלות תחתית שטוחה היטב (איוואקי, יפן) למשך הלילה, ולאחר מכן טיפול ב-10 מיקרומטר סימבסטטין, יחד עם או בלי מינונים שונים של HCE ( 0-2000 ug/ml) או verbascoside (0-160 מיקרומטר), למשך 48 שעות. בינוני רגיל (DMEM) נוסף לבארות הבקרה. תמצית הצמחים והתרכובת הומסו ב-DMEM.
לאחר הטיפול של 48 שעות, המדיום מכל התאים הושלך ו-30 ul של 5 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{{ 8}}דיפניל-טטרזוליום ברומיד (MTT; Sigma, ארה"ב) במי מלח מבוצר פוספט (PBS) נוספו לכל באר והצלחות הודגרו במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות. לאחר מכן הוסר הסופרנטנט ולכל באר נוספו 100 ul של DMSO כדי להמיס את גבישי הפורמזן הסגולים (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA). הספיגה של כל דגימה נקראה ב-540 ננומטר באמצעות קורא microplate (Biotek μ-Quant, ארה"ב). התוצאות הובעו כאחוז ספיגת MTT ביחס לתאי בקרה.
2.5. מבחן צביעה של Annexin-V FITC/PI
תאי L6 (3 x105/well) טופלו עם סימבסטטין, יחד עם או בלי מינונים שונים של HCE או verbascoside. לאחר מכן נאספו התאים, נשטפו והוצבעו בערכת annexin-V FITC בהתאם לפרוטוקול היצרן (Trevigen, MD, ארה"ב). בקצרה, התאים נשטפו פעמיים עם 1 x חיץ מחייב והוכנסו לקובייה בתמיסת תיוג של 100 ul המכילה 1 ul annexin-V FITCconjugate ו-10 ul PI בחושך למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הקרינה של הדגימות זוהתה באמצעות ציטומטריית זרימה (Becton Dickinson FACSCanto II, ארה"ב).
2.6. בדיקת פעילות Caspase 3
פעילות Caspase 3 נקבעה באמצעות בדיקת אנזימים פלואומטרית, אימונוסורבנטית (Sigma) לפי הוראת היצרן. בקצרה, תאי L6 (3 105/באר) שטופלו בסימבסטטין, יחד עם או בלי מינונים שונים של HCE verbascoside, עברו ליטוש באמצעות חיץ התמוגה. 7-אמינו-4-מתילקומרין (AMC) חופשי שנוצר דרך הביקוע הפרוטאוליטי של המצע על ידי Caspase 3 נמדד וכומת פלואורומטרי עם אורך גל עירור ב-360 ננומטר, ואורך גל פליטה ב-460 ננומטר עם Optim BMG FLUOstarmicroplate קורא (BMG LABTECH GmbH, גרמניה).
2.7. בדיקת ATP סלולרית
תאי L6 (3x105/well) טופלו עם סימבסטטין, יחד עם או בלי מינונים שונים של HCE או verbascoside. לאחר הטיפול נאספו תאים ותכולת ה-ATP נמדדה באמצעות הערכה הקולורימטרית הזמינה מסחרית (Abcam, בריטניה) על ידי מדידה של תכולת הגליצרול הפוספט של התאים המוליזים וקריאה ב-570 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות (Biotek μ-Quant, ארה"ב ). מדידת ייצור ATP התבטאה כאחוז ביחס לקבוצת הביקורת.
2.8. ניתוח סטטיסטי
הנתונים הוצגו כאמצעי7SD, Prism 5 עבור Window (גרסה 5.0c, GraphPad Software, Inc., ארה"ב) שימשו לניתוח סטטיסטי. הבדלים משמעותיים בין כל הקבוצות הוערכו על ידי ANOVA חד כיווני, ואחריו מבחן MultipleComparison של Bonferroni. הסתברות של po0.05 נחשבה מובהקת סטטיסטית.
3. תוצאות
3.1. ניתוח UPLC של תמצית מימית של Herba Cistanches
איור S1A הראה את פרופיל ה-UPLC של תערובת סטנדרטית המכילה echinacoside ו-verbascoside. נקודות זמן השמירה של כל אחד מהסמנים הללו הושוו לפרופיל ה-UPLC שלהרבהCistanchesתמצית מימית (איור S1B). כמות האכינאקוסיד והוורבסקוסיד בפניםהרבהCistanchesנמצא כי תמצית מימית היא {{0}}.45 אחוז משקל ו-0.085 אחוז משקל משקל, בהתאמה.
3.2. השפעת HCE ו-verbascoside על הציטוטוקסיות במבחנה של סימבסטטין בתאי שריר שלד L6
כפי שמוצג באיור 1A, סימבסטטין גרם לציטוטוקסיות משמעותית לתאי L6 כפי שבא לידי ביטוי בהפחתה משמעותית בכדאיות תאי L6 ב-10 מ"מ סימבסטטין. טיפול ב-HCE מנע באופן תלוי מינון ומובהק את הציטוטוקסיות הנגרמת על ידי סימבסטטין ב-500, 1000 ו-2000 מ"ג/מ"ל. Verbascoside הפעיל מגמה לשפר את הכדאיות של תאי L6 שטופלו יחד עם סימבסטטין. עם זאת, אף אחד מהריכוזים לא הגיע למובהקות סטטיסטית (איור 1B).
איור 1. אפקט מגן של (א) HCE; ו-(ב) verbascoside על ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי סימבסטטין בתאי L6. ערכים מייצגים אמצעים7SD (n¼3). הבדל משמעותי בין טיפול בסימבסטטין בלבד לבין קבוצת הביקורת המשתמשת במבחן t של הסטודנט: ### po0.{{10}}01. הבדל משמעותי בין כל הקבוצות שטופלו בסימבסטטין עם או בלי טיפול משותף ב-HCE verbascoside באמצעות ANOVA חד כיווני: ** po0.01,*** po0.001.
3.3. השפעת HCE ו-verbascoside על מוות תאי המושרה על ידי סימבסטטין בתאי שריר שלד L6
כדי לבחון את אופן המוות של תאים המושרה על ידי סימבסטטין ולקבוע את התפקיד המגן של HCE או verbascoside על מוות תאי המושרה על ידי סימבסטטין, חלקם של תאים אפופטוטיים זוהה על ידי צביעה של propidium iodide (PI). התוצאות הראו שסימבסטטין גרם לעלייה משמעותית בשיעור התאים האפופטוטיים המוקדמים (Annexin V-FITC חיובי ו-PI שלילי, Q4-2), ותאים אפופטוטיים/מתים מאוחרים (Annexin V-FITC חיובי ו-PI חיובי, Q2- 2) בהשוואה לקבוצת הביקורת. טיפול משותף עם HCE הפחית את השיעור של תאים אפופטוטיים מוקדמים, ותאים אפופטוטיים/מתים מאוחרים באופן תלוי מינון עד 1000 מ"ג/מ"ל (איור 2A). אפקט מגן זה נצפתה גם בקבוצות טיפול משותף עם verbascoside. עם זאת, אף אחד מהריכוזים שנבדקו לא הגיע למובהקות סטטיסטית (איור 2B).
איור 2. השפעת סימבסטטין עם או בלי טיפול HCE או verbascoside על החצנה של פוספטידילסרין בתאי L6. תאים נצבעו ב-Annexin-V FITC ואני וזוהו על ידי ציטומטריית זרימה
3.4. השפעת HCE ו-verbascoside על פעילות קספאז 3 בתאי שריר שלד L6 שטופלו בסימבסטטין
כפי שמוצג באיור 3A, 10 מ"מ סימבסטטין גרמה משמעותית לפעילות קספאז 3 בתאי L6, דבר המצביע על כך שסימבסטטין גרם לאפופטוזיס לתאי L6 דרך מפל הקספאז. עם זאת, בתאי L6 שטופלו בשיתוף עם סימבסטטין ו-HCE, הפחית HCE באופן תלוי מינון ובאופן משמעותי את פעילות ה-Caspase 3, דבר המצביע על יכולתו של HCE למנוע אפופטוזיס הנגרמת על-ידי סימבסטטין דרך מפל הקספאז. מצד שני, למרות ש-verbascoside הפעיל גם מגמה להפחית את העלייה הנגרמת על ידי סימבסטטין בפעילות האנזים Caspase 3, רק הריכוז ב-160 mM הגיע למובהקות סטטיסטית (איור 3B).
איור 3. אפקט מגן של (א) HCE; ו-(ב) verbascoside על פעילות אנזימטית של caspase 3 המושרה על ידי סימבסטטין בתאי L6. הערכים מייצגים אמצעים7SD (n¼3–5). הבדל משמעותי בין טיפול בסימבסטטין בלבד לבין קבוצות ביקורת המשתמשות במבחן ה-t של הסטודנט: ###po0.001. הבדל משמעותי בין כל הקבוצות שטופלו בסימבסטטין עם או בלי HCE או טיפול משותף עם verbascoside באמצעות ANOVA חד כיווני: *po0.05, **p o0.01, ***po0.001.
3.5. השפעת HCE על הפחתה הנגרמת על ידי סימבסטטין בייצור ATP בתאי שריר שלד L6
Simvastatin (10 mM) הפחית באופן משמעותי את ייצור ATP בתאי L6 בכ-60 אחוז בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 4A). טיפול משותף ב-HCE הפחית באופן תלוי מינון את הירידה בייצור ATP בתאים שטופלו בסימבסטטין, שרק הריכוזים של 500, 1000 ו-2000 מ"ג/מ"ל הגיעו למובהקות סטטיסטית. מצד שני, למרות ש-verbascoside הפעיל מגמה לשחזר ייצור ATP ב-50 מ"ג/מ"ל, הוא לא הגיע למובהקות סטטיסטית (איור 4B).
איור 4. אפקט מגן של (א) HCE ו-(ב) verbascoside על הפחתה הנגרמת על ידי סימבסטטין בייצור ATP בתאי L6. הערכים מייצגים אמצעים7SD (n¼3–5). הבדל משמעותי בין טיפול בסימבסטטין בלבד לבין קבוצות ביקורת באמצעות מבחן ה-t של הסטודנט: ###po0.001. הבדל משמעותי בין כל הקבוצות שטופלו בסימבסטטין עם או בלי HCE או טיפול משותף עם verbascoside באמצעות ANOVA חד כיווני: *po0.05, **po0.01.
4. דיון
עם השכיחות הגוברת של מחלות לב וכלי דם (CVD) וחולים שאובחנו עם היפרכולסטרולמיה ברחבי העולם, השימוש בסטטינים הפך נפוץ יותר. למרות שהסטטינים נסבלים באופן כללי היטב, פגיעה בשרירים היא תופעת לוואי המדווחת לעתים קרובות הקשורה לשימוש בסטטינים שיכולה להתרחש בצורה חריפה בשבועות או חודשים לאחר תחילת התרופה (Fine, 2003). תסמיני השרירים עשויים להשתנות מבעיות קלות, למשל, כאב, רגישות או חולשה עם או בלי עליית קריאטין קינאז (CK), ועד למצב החמור ביותר של רבדומיוליזה (Armitage, 2007; Hu et al., 2012). עקב התרחשותן של תופעות לוואי אלו, והעובדה שאין טיפול יעיל לרעילות שרירים הנגרמת על ידי סטטינים, הסטטינים נותרים בשימוש חסר. בסקר רחב על 10,409 נבדקים צרפתים שנערך באמצעות ראיון טלפוני, 10 אחוז מהמטופלים שקיבלו טיפול בסטטינים דיווחו על תסמינים שרירים, מהם 30 אחוז מהחולים התסמינים הללו הביאו להפסקת הטיפול (Rosenbaum et al., 2013).
הוכחנו לראשונה כי תמצית המים שלהרבהCistanches, עשב סיני מסורתי בשימוש נפוץ, יכול להפעיל אפקט מגן מפני רעילות הנגרמת על ידי סימבסטטין במבחנה בתאי שריר שלד L6, מה שמרמז על הפוטנציאל שלהרבהCistanchesתמצית מימית (HCE) על תפקידה המגן על רעילות שרירים הנגרמת על ידי סטטינים, שהיא תופעת לוואי שכיחה מוכרת בחולים הנוטלים סטטינים. היכולת החזקה של HCE להגן מפני רעילות שרירים הנגרמת על ידי סטטין תהיה אפוא בעלת פוטנציאל גדול.
על פי התיאוריה המסורתית ב-TCM, יאנג קשור לחילוף החומרים באנרגיה המיטוכונדריאלית בגוף, ומרשם של צמחי מרפא ממריצים יאנג נמצא כמשפר את יצירת ה-ATP המיטוכונדריאלי (Ko and Leung, 2007). באופן מעניין, ראינו ירידה בייצור ATP בתאי שריר שלד L6 שטופלו בסימבסטטין, והפחתה זו בייצור ATP השתפרה משמעותית עם טיפול משותף ב-HCE. במחקר שלנו, באמצעות תאי שריר שלד של חולדה L6, הדגמנו הפחתה בכדאיות התא הנגרמת על ידי סימבסטטין. הפחתה זו בכדאיות התא השתפרה באופן משמעותי עם הטיפול המשותף שלהרבהCistanchesבאופן תלוי מינון. למרות שהמנגנון המדויק של רעילות שרירים הנגרמת על ידי סטטינים לא הובהר במלואו, אפופטוזיס המושרה על ידי סטטין של מיוציטים בריאים בשלד הוצע להיות גורם תורם הגורם למיופתיה, תופעת הלוואי השכיחה ביותר שחווים משתמשי סטטינים (Dirks and Jones, 2006) . במחקר שלנו, ראינו עלייה משמעותית בתאים אפופטוטיים המושרים על ידי סימבסטטין, אשר הייתה קשורה לפעילות מוגברת משמעותית של קספאז 3. נתונים אלה עולים בקנה אחד גם עם מחקרים קודמים, שהוכיחו שסטטינים שונים יכולים לגרום לאפופטוזיס במיובלסטים שלד, מיוטובים ובתאי שריר שלד אנושיים ראשוניים מובחנים באמצעות הפעלה של פעילויות קספאז-9 וקספאז-3 (Dirks וג'ונס, 2006). ה-HCE שלנו הצליח למנוע את העלייה הנגרמת על ידי סימבסטטין באפופטוזיס המופעלת על ידי קספאז-3 באופן תלוי מינון.
הרבהCistanches
חוץ מזה, ספרות קודמת הציעה כי verbascoside הוא אחד המרכיבים הפעילים העיקריים בתוכוהרבהCistanches. Verbascoside, הידוע גם כאקטאוזיד, שייך לחבר ה-phenylethanoid גליקוזידים, קבוצה טבעית של תרכובות פוליפנוליות המסיסות במים (Liao et al., 1999). בעבר, הוכח ש-verbascoside הוא נוגד חמצון חזק שיכול להפגין פעילות חזקה של ניקוי ROS ונוגדי חמצון (Liao et al., 1999). במחקר שלנו, כדי לקבוע אם verbascoside הוא המרכיב העיקרי ב-HCE שלנו שתורם להשפעות המועילות שנצפו, בדקנו את ההשפעות של verbascoside בריכוזים של 0–160 mM. מכיוון שהוכחנו שה-HCE שלנו פעיל בטווח הריכוזים של 250-2000 mg/ml, בהתבסס על תוצאות HPLC שלנו, שהצביעו על כך שה-HCE שלנו מכיל verbascoside בריכוז של 0.085% wt /wt, הריכוז הפעיל של verbascoside צריך לנוע בין 0.2125-1.7 mg/ml (כלומר 0.34-2.72 mM), האם verbascoside צריך להיות המרכיב הפעיל? עם זאת, לא הצלחנו לצפות בהשפעה מועילה משמעותית של verbascoside עם טווח הריכוז שנבדק, למרות שראינו מגמה תלוית מינון להשפעה מועילה של verbascoside על תאי שריר השלד L6. נתונים אלה הצביעו על כך שההשפעה המיטיבה של ה-HCE שלנו שנצפתה בתאי שלד L6 אינה צפויה להיות מיוחסת להשפעה של verbascoside בלבד, מה שמצביע על כך שרכיבים אחרים מלבד verbascoside עשויים להיות אחראים להשפעות המועילות שנצפו. ייתכן גם ש-verbascoside עשוי לקיים אינטראקציה עם תרכובות ביו-אקטיביות אחרות בתוך התמצית כדי לתרום להשפעות המועילות. ניסויים נוספים המשתמשים בחלוקה מונחה ביולוגית יהיו שימושיים במתן תובנות נוספות על גילוי הרכיבים הביו-אקטיביים האחראים לתרומה להשפעות המגן הנצפות של HCE על רעילות שרירים הנגרמת על ידי סימבסטטין.
לסיכום, המחקר הנוכחי מצביע על כך ש-HCE יכול להפעיל השפעות הגנה חזקות על הפחתה הנגרמת על ידי סימבסטטין בכדאיות תאי השריר במבחנה. תוצאות אלו מספקות את הראיות הראשוניות המצביעות על כך שתמצית מימית HC שלנו עשויה להיות בעלת ערך טיפולי כמזון פונקציונלי או תזונתי לחולי היפרליפידמיים אשר נדרשים להפסיק את הטיפול בסטטינים עקב מיוטוקסיות הנגרמת על ידי סטטין.
הכרה מחקר זה נתמך כלכלית על ידי לשכת המזון והבריאות HKSAR, קרן הבריאות והמחקר הרפואי מס'. 11120831.
הפניות
Armitage, J., 2007. הבטיחות של סטטינים בפרקטיקה הקלינית. Lancet 370, 1781–1790.
Beltowski, J., Wojcicka, G., Jamroz-Wisniewska, A., 2009. השפעות שליליות של סטטינים - מנגנונים והשלכות. Curr. סמים סאפ. 4, 209–228.
Cai, RL, Yang, MH, Shi, Y., Chen, J., Li, YC, Qi, Y., 2010. הפעילות נגד עייפות של תמצית עשירה ב-phenylethanoid מ- Cistanche deserticola. פיטוטר. מילון 24, 313–315.
Dirks, AJ, Jones, KM, 2006. אפופטוזיס המושרה על ידי סטטין ומיופתיה שלד. אמ. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C1208–C1212.
Fine, DM, 2003. רעילות שרירים הקשורה לסטטינים. קלינ. פרמקול. 3, 554.
Golomb, BA, Evans, MA, 2008. השפעות לוואי של סטטין: סקירה של הספרות והוכחות למנגנון מיטוכונדריאלי. אמ. J. Cardiovasc. סמים 8, 373–418.
Hu, M., Cheung, BM, Tomlinson, B., 2012. בטיחות של סטטינים: עדכון. ת'ר. עו"ד סמים סאפ. 3, 133–144.
Kaufmann, P., Torok, M., Zahno, A., Waldhauser, KM, Brecht, K., Krahenbuhl, S., 2006. רעילות של סטטינים על המיטוכונדריה של שרירי השלד של חולדה. תָא. מול. Life Sci. 63, 2415–2425.
Ko, KM, Leung, HY, 2007. שיפור יכולת יצירת ATP, פעילות נוגדת חמצון ופעילויות אימונומודולטוריות על ידי צמחי מרפא סיניים יאנג ויין. סַנְטֵר. Med. 2, 3.
Kobayashi, M., Kagawa, T., Narumi, K., Itagaki, S., Hirano, T., Iseki, K., 2008. תוספת ביקרבונט כדרך מונעת בנזק שריר הנגרמת על ידי סטטינים. ג'יי פארם. פארם. Sci. 11, -8.
Kromer, A., Moosmann, B., 2009. הפגיעה בכבד הנגרמת על ידי סטטין כרוכה בשיחות צולבות בין מסלולים ביוסינתטיים של כולסטרול וסלנופרוטאינים. מול. פארם. 75, 1421–1429.
Leung, HY, Ko, KM, 2008. תמצית Herba Cistanche משפרת את יצירת ה-ATP המיטוכונדריאלי בלבבות חולדה ותאי H9C2. פארם. ביול. 46, 418.
Liao, F., Zheng, RL, Gao, JJ, Jia, ZJ, 1999. פיגור של עייפות שרירי השלד על ידי שני הגליקוזידים של פניל-פרופנואידים: verbascoside ומרטנסיט מ-Pedicularis plicata Maxim. פיטוטר. מילון 13, 621–623.
Lu, KG, Liu, HB, Gu, QQ, 1995. מחקר על מרכיבים כימיים של Cistanche deserticola Ma. וסלסה Cistanche (CA Mey) G. Beck. סַנְטֵר. מסורת. עֵשֶׂב. סמים 26, 143.
ועדת הפרמקופיה, 2010. הפרמקופיה של הרפובליקה העממית של סין. הוצאת התעשייה הכימית, בייג'ינג.
Rosenbaum, D., Dallongeville, J., Sabouret, P., Bruckert, E., 2013. הפסקת טיפול בסטטינים עקב תופעות לוואי שריריות: סקר בחיים האמיתיים. נוטר. Metab. Cardiovasc. Dis. 23, 871-875.
Siu, AH, Ko, KM, 2010. תמצית Herba Cistanche משפרת את מצב הגלוטתיון המיטוכונדריאלי ואת הנשימה בלבבות חולדה, עם אינדוקציה אפשרית של חלבונים לניתוק. פארם. ביול. 48, 512–517.
Sui, ZF, Gua, TM, Liu, B., Peng, SW, Zhao, ZL, Li, L., Shi, DF, Yang, RY, 2011. תרכובת פחמימות מסיסות במים מגופיהרבהCistanches: בידוד והשפעתו השואבת על רדיקלים חופשיים בעור. פחמימות. Polym. 85, 75.
Thompson, PD, Clarkson, P., Karas, RH, 2003. מיופתיה הקשורה לסטטינים. JAMA 289, 1681–1690.
Vaklavas, C., Chatzizisis, YS, Ziakas, A., Zamboulis, C., Giannoglou, GD, 2009. בסיס מולקולרי של מיופתיה הקשורה לסטטינים. טרשת עורקים 202, 18–28.
Velho, JA, Okanobo, H., Degasperi, GR, Matsumoto, MY, Alberici, LC, Cosso, RG, Oliveira, HC, Vercesi, AE, 2006. סטטינים גורמים למעבר חדירות המיטוכונדריאלי תלוי סידן. טוקסיקולוגיה 219, 124–132.
Xiong, Q., Hase, K., Tezuka, Y., Tani, T., Namba, T., Kadota, S., 1998. פעילות מגוננת על הכבד של phenylethanoids מ Cistanche deserticola. פלנטה מד. 64, 120–125.
