הרגולטור האפיגנטי BRD4 מעורב בתגובה דלקתית המופעלת על ידי קדמיום בכליית חולדה

למידע נוסף:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong et al

Cistanche tubulosa מונע מחלת כליות, לחץ כאן כדי לקבל אתמוצרים ו- Cistanche DHT

תַקצִיר

קדמיום (Cd) תואר כגורם דלקתי פוטנציאלי, בעוד שהראיות הולכות וגדלות מראות שדלקת לא מתאימה היא גורם תורם לפגיעה בכליות. לפיכך, למחקר על תגובה דלקתית הנגרמת על ידי Cd יש משמעות רבה להבהרת המנגנון של רעילות נפרוטוקס הנגרמת על ידי Cd. המכיל ברום דומיין 4(BRD4) הוא מווסת אפיגנטי חשוב המעורב בהתפתחות של מחלות דלקתיות רבות, אך תפקידיו הרגולטוריים ב-Cd.דַלַקתִייש להבהיר את התגובה. כאן, מצאנו שטיפול ב-Cd בחולדות Sprague-Dawley (2 מ"ג/ק"ג BW, ip, 5 ימים רצופים) ובחולדותתא כליהקו (NRK{{0}}E, 0–10 מיקרומטר, 12 שעות) גרמה לשעתוק של ציטוקינים דלקתיים, שניתן להפחית על ידי JQ1 (מעכב BRD4, 25 מ"ג/ק"ג BW, ip , 3 ימים רצופים in vivo; 0.5 מיקרומטר, 12 שעות במבחנה) או RNA מפריע קטן של BRD4 (siRNA, in vitro), מה שמצביע על כך ש-BRD4 משתתף בתגובה דלקתית המופעלת על ידי Cd. לאחר מכן, המחקר שלנו הבהיר את התפקידים של BRD4 בתגובה דלקתית המופעלת על ידי Cd. העיכוב של BRD4 הפחית את הטרנסלוקציה וההפעלה הגרעינית של NF-KB המקודם על ידי Cd in vivo ו-in vitro. Cd העלה את רמת האצטילציה של RelA K310 והגביר את קשירת BRD4 ל-NF-κB RelA באצטיל ב-vivo וב-in vitro, אשר בוטלו על ידי עיכוב BRD4. לסיכום, המחקר שלנו מצביע על כך ש-BRD4 מעורב בשעתוק מופעל על ידי Cd של ציטוקינים דלקתיים על ידי תיווך ההפעלה של מסלול איתות NF-κB והגברת הקישור עצמו ל-NF-κB RelA עם אצטילציה בחולדה.כִּליָה,לפיכך, BRD4 יכול להיות יעד טיפולי פוטנציאלי למחלות כליות הנגרמות על ידי Cd.

מילות מפתח: BRD4קדמיוםכליות דלקתיותציטוקינים NF-κB JQ1

1. הקדמה

קדמיום (Cd) הוא מזהם מתכת כבדה עם רעילות גבוהה ותקופת מחצית חיים ארוכה. עם התפתחות הייצור התעשייתי, האיום המוגבר של זיהום Cd על הביטחון הסביבתי ועל בריאות האדם עורר דאגה (Wang et al., 2020; Horiguchi and Oguma, 2016). לאחר שהוא נספג בגוף, Cd גורם לנזק רב-איבריםכִּליָההוא איבר המטרה העיקרי (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). בעבר, אימתנו באופן שיטתי שעיכוב אוטופגיה, עקה חמצונית ואפופטוזיס תורמים באופן סינרגיסטי לרעילות נפרו-טקסי הנגרמת על ידי Cd בחולדות (Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). דלקת היא תגובה פיזיולוגית הפועלת כתגובת הגנה מפני זיהום או פציעה, אך תגובות דלקתיות בלתי מבוקרות ובלתי מתאימות עשויות לגרום לנזק כגון פגיעה ברקמה נורמלית של עובר אורח וקידום מחלות אוטואימוניות (Hossein-Khannazer et al., 2020; Zhang et al. אל., 2020). תגובה דלקתית המופעלת על ידי Cd החמירה מחלות לב וכלי דם, ונזק לכבד, מה שמצביע על כך שדלקת עשויה למלא תפקידים חשובים בתיווך Cdכִּליָהתהליכים פתולוגיים (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

אפיגנטיקה מתייחסת לשינויים תורשתיים בביטוי גנים המבוססים על שינויים ברצף שאינם DNA, וההפיכות של שינויים אלו מאפשרת גילוי של מטרות טיפוליות חדשות (Vendetti and Rudin, 2013). משפחת ה-bromodomain ו-extra-terminal domain (BET) כוללת 2 (BRD2), BRD3, BRD4, ו-bromodomain testis specific (BRDT), המכילים ברום-דומיין (BRD2), המתאפיינים בשני תחומים ברום וקשרים לליזינים אצטילטים של היסטונים ולא היסטונים ( Lochrin et al., 2014; Chatterjee and Bohmann, 2018). חלבוני BET פועלים כמפעילי תעתיק של גנים רבים, ובכך מווסתים את מחזור התא, תגובה דלקתית, עקה חמצונית ותהליכים פיזיולוגיים אחרים במודלים פתולוגיים שונים (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 הוא חבר נחקר במיוחד במשפחת חלבוני BET, וחקירות מצטברות דיווחו עליו כיעד אפיגנטי חדש בוויסות מגווןמחלות כליות, כולל דלקת כליות כרונית, נפרופתיה סוכרתית ונזק כלייתי ניסיוני (Zeng and Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). אושר כי BRD4 משתתף בתהליך שעתוק תלוי בגורם גרעיני-κB (NF-κB) כדי לווסת תגובות דלקתיות במחלות רבות (Xu ו-Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). ניתן לגייס את BRD4 על ידי אצטילציה RelA (יחידת משנה NF-κB, גן מקודד חלבון) בליזין 310 (RelA-K310ac) דרך הברומודומיינים שלו, ובכך להפעיל קינאז 9 תלוי ציקלין (CDK9) ולזרחן את ה-RNA פולימראז II כדי לקדם את שעתוק של גנים מטרה NF-κB (Hajmirza et al., 2018). לאחרונה מחקרים מצביעים על כך שמעכבי BRD4 יכולים להיות אפשרות טיפולית פוטנציאלית למחלות דלקתיות. במודלים של פגיעה בחוט השדרה של חולדה, עיכוב של BRD4 החליש את התגובה הדלקתית וקידם את ההתאוששות התפקודית של מיקרוגליה (Dey et al., 2019). כמו כן, עיכוב של BRD4 ביטלה דלקת כלייתית ניסיונית במודלים של חסימת שופכה חד צדדית, GN אנטי ממברנה ועירוי של אנגיוטנסין II (Suarez-Alvarez et al., 2017).

לאור ההשפעות הפרו-דלקתיות הפוטנציאליות של Cd וההשפעות הרגולטוריות של BRD4 על דלקת, שיערנו כי BRD4 מעורב בתגובה דלקתית המופעלת על ידי Cd. כצפוי, BRD4 מתווך את תהליך השעתוק של ציטוקינים דלקתיים במודלים של כליות חולדה חשופות ל-CD. המחקר שלנו חושף מנגנון פוטנציאלי בתגובה הדלקתית המופעלת על ידי Cd ומספק תובנות חדשות לגבי הטיפול ברוקסיות הנפרוטואלית הנגרמת על ידי Cd.

2. חומרים ושיטות

2.1. כימיקלים ונוגדנים

קדמיום כלוריד (CdCl2, נטול מים, 439800) נרכש מסיגמא-אלדריץ' (קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב). ( פלוס )-JQ1 (HY-13030) התקבל מ-MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, ארה"ב). ערכת מיצוי חלבון גרעיני נרכשה ממכון ביו-טיים לביוטכנולוגיה (שנחאי, סין, P0027). ערכת כימילומינסנציה יעילה (ECL, 32209) ומגיב לבדיקת חלבון של חומצה bicinchoninic (BCA, 23225) התקבלו מ-Thermo Fisher Scientific (מדיסון, WI, ארה"ב). נעשה שימוש בנוגדנים ראשוניים נגד החלבונים הבאים: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) נרכשו מ קבוצת פרוטינטק (ווהאן, סין); -אקטין (3700 שניות), היסטון H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), IgG של ארנב רגיל (IgG, 4394) נרכשו מ- Cell Signaling Technology (Danvers, MA, ארה"ב); BRD4 (ab128874), K (ליזין) אצטילטרנספראז 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (אצטיל K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488–מצומד דונקי 3 אנטי-ר 1500bit 7ab anti-r. מ-Abcam (קיימברידג', בריטניה). נוגדנים שניים: Goat Anti-Mouse IgG (H ועוד L) (115-035-003) ו-Goat Anti-Rabbit IgG (H פלוס L) (111-035-003) נרכשו מג'קסון ImmunoResearch (West Grove, PA, ארה"ב ).

2.2. בעלי חיים וניסויים

24 חולדות Sprague-Dawley (זכר, בן 6 שבועות, 110-120 גרם) נרכשו מחברת Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (ג'ינאן, שאנדונג, סין). החולדות הורשו גישה חופשית למזון ומים בחדר מבוקר סביבתי (24 ± 5 ​​מעלות, מחזור אור/חושך של 12 שעות). נהלי הניסוי היו חלים על הוראת מועצת הקהילות האירופיות 2010/63/EU עבור ניסויים בבעלי חיים, וכל ההליכים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת יאנגג'ואו. לאחר שבוע של התאקלמות, חולקו החולדות באופן אקראי לארבע קבוצות: (1) קבוצת ביקורת: הוזרק תוך צפק עם הממס המתאים (תמיסת מלח פיזיולוגית או תמיסת 2-הידרוקסיפרופיל- -ציקלודקסטרין). (2) קבוצת Cd: CdCl2 (2 מ"ג/ק"ג משקל גוף, מומס במי מלח פיזיולוגי) מוזרק תוך צפק במשך 5 ימים רצופים כדי לבסס את מודל שיכרון ה-Cd. (3) קבוצת Cd פלוס JQ1: CdCl2 (2 מ"ג/ק"ג משקל גוף) הוזרק תוך צפק במשך 5 ימים רצופים כדי לבסס את מודל השיכרון Cd, ו-JQ1 (25 מ"ג/ק"ג משקל גוף, מומס ב2-הידרוקסיפרופיל{{ 25}}תמיסת cyclodextrin) הוזרק תוך צפק ביום 6-8. (4) קבוצת JQ1: JQ1 (25 מ"ג/ק"ג משקל גוף) הוזרק תוך צפק בימים 6-8. נתונים סטטיסטיים של תכולת Cd בסרום וברקמות הכליה של חולדות נרשמו בטבלה S1, המשקפת את ההקמה המוצלחת של מודלים של חולדות חשופות ל-Cd.

לאחר 8 ימי טיפול, החולדות נהרגו על ידי נקע בצוואר הרחם בהרדמה עמוקה לאחר 12 שעות של צום. רקמות הכליה נותחו ורקמה של 1 גרם מכל כליה אוחסנה במהירות ב-80 ◦C למעקב אחר ניתוח Western blot ו-PCR כמותי (qPCR). כמות הרקמה הנותרת תוקנה במהירות ב-4 אחוז פרפורמלדהיד (PFA) לצביעה אימונוהיסטוכימית (IHC).

2.3. תרבית תאים וטיפול

קו תאי הכליה של חולדה (NRK{{0}}E) התקבל מהאקדמיה למדעים של Shanghai Cell Bank of China. תאי NRK-52E תורבו עם מדיום איגל שונה של Dulbecco (DMEM, Gibco, 12800-017) המכיל 5% סרום בקר עוברי (FBS, Gibco, 10437-028), פניצילין וסטרפטומיצין (1 00 U/mL) במצב לח של 5 אחוז CO2 ו-95 אחוז אוויר ב-37 מעלות . CdCl2 (מומס במים אולטרה-טהורים) ו-JQ1 (דימתיל סולפטוקסיד-מומס) אוחסנו בנפרד ב-4 מעלות ו-20 מעלות, ודוללו לתמיסות עבודה לפני השימוש. התכנון הניסוי היה כדלקמן: (1) תאים טופלו ב-0, 2.5, 5, 10 מיקרומטר Cd למשך 12 שעות, או 5 מיקרומטר Cd למשך 0, 6, 12, 24 שעות כדי לבצע את המבחנים הבאים. (2) תאים טופלו עם 5 מיקרומטר Cd ו/או 0.5 מיקרומטר JQ1 במשך 12 שעות כדי לבצע את המבחנים הבאים. (3) תאים הועברו transfected עם siBRD4 ו / או טופלו עם 5 μM Cd במשך 12 שעות נוספות כדי לבצע את המבחנים הבאים.

2.4. טרנספקציה קטנה של RNA מפריעה

העברנו 20 nM BRD4 RNA מפריע קטן (siBRD4, Invitrogen, CA, ארה"ב) לתוך תאי NRK-52E על ידי ריאגנט לטרנספקציה Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Cat# 13778150) למשך 24 שעות לפי מדריכי המוצר. נעשה שימוש ב-siRNA של החושים הבאים:

siBRD4, עם רצף יעד של 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′;

siCt (בקרת siRNA שלילית), עם רצף יעד של 5'- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'.

2.5. סופג מערבי

דגימות רקמת כליה ותאי NRK-52E עברו lysed במאגר RIPA המכיל מעכבי פרוטאז כדי לחלץ חלבון מלא. החלבון הגרעיני הוכן מרקמות ותאים טריים מראש ואוחסן ב-80 מעלות. דגימות חלבון (20-30 אג' לדגימה) הופרדו על ידי אלקטרופורזה של SDS-PAGE, ולאחר מכן הועברו לממברנות פוליווינילידן פלואוריד (Millipore, ISEQ00010). הממברנות נחסמו עם 5 אחוז חלב רזה למשך 90 דקות, והודגרו 12 שעות ב-4 מעלות עם הנוגדנים העיקריים הבאים: -אקטין (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). לאחר מכן נשטפו הממברנות עם TBST והודגרו עם נוגדנים משניים מתאימים (1:10000) למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הממברנות הודגרו עם electrochemiluminescence (ECL, ThermoFisher Scientific) ונקבעו על Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, צרפת), והצפיפות האופטית נותחה באמצעות ImageJ (NIH, Bethesda, MD, ארה"ב).

2.6. צביעה אימונופלואורסנטית (IF).

NRK{{0}}תאי E שנזרעו בצלחת 24-בארות גדלו לכ-60 אחוזי מפגש. התאים טופלו עם 5 מיקרומטר Cd ו/או 0.5 מיקרומטר JQ1 למשך 12 שעות, ולאחר מכן קבוע עם PFA (4 אחוזים, 10 דקות), חלחול עם Triton X- 100 (0.1 אחוז, 15 דקות), חסום עם BSA (2 אחוזים, 90 דקות) ב-RT, והודגר עם נוגדן ראשוני (NF-κB p65, דילול 1:50) למשך הלילה ב-4 מעלות. לאחר שטיפה עם PBS שלוש פעמים, התאים הודגרו עם נוגדן משני (דילול 1:500) למשך 90 דקות, ועם DAPI למשך 5 דקות ב-RT, ואז התאים נצפו תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי. טרנסלוקציה גרעינית של NF-κB נותחה בשלושה מחקרים בלתי תלויים.

2.7. qPCR

ה-RNA הכולל של רקמות הכליה ותאי NRK-52E חולצו עם ערכת RNAiso Plus (Takara Bio, Shiga, יפן). 1 ug של RNA כולל שימש לסנתז cDNA בשרשרת 1 על פי המדריך של היצרן (Roche, Basel, שוויץ). 2 μL DNA משלים (cDNA) לבאר נלקחו כדי לזהות את רמות ה-mRNA היחסיות באמצעות LightCycler® 96 Real-Time PCR System (Roche). חשב את רמות ה-mRNA היחסיות לפי משוואה 2-△△CT. הפריימרים נרשמו בטבלה S2. -אקטין היה גן התייחסות לחולדות.

2.8. Co-immunoprecipitation (Co-IP)

רקמות הכליה ותאי ה-NRK-52E עברו ליטוש במאגר תמוגה טרי שהוכן (20 mM HEPES–KOH pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1% Triton X{{8} }) המכיל PMSF. חרוזי חלבון G (100 μL לדגימה, Bio-Rad, Hercules, CA, ארה"ב) עורבבו עם 2 אג"ג BRD4, RelA-K310ac או נוגדן IgG לכל דגימה, והסתובבו במשך 10 דקות ב-RT. לאחר מכן, כל הליסאטים של החלבון הודגרו עם קומפלקס חרוזים-נוגדנים למשך הלילה ב-4 מעלות. לאחר שטיפה עם חיץ תמוגה של תאים שלוש פעמים, המשקעים החיסוניים הושעו מחדש עם חיץ מדגם 1 × SDS PAGE כדי להגדיר את הדגימות. חלבוני המטרה זוהו באמצעות Western blotting עם נוגדנים ראשוניים נגד BRD4 ואנטי-RelA K310ac.

2.9. ניתוח סטטיסטי

כל הנתונים התקבלו משלושה ניסויים עצמאיים לפחות והובאו כממוצע ± SEM אלא אם צוין אחרת. קבוצות הניסוי הושוו על ידי מבחן t של סטודנט או ניתוח חד כיווני (ANOVA) באמצעות SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). המשמעות נקבעה ל-p <>

3. תוצאות

3.1. Cd משרה ביטוי של ציטוקינים דלקתיים in vivo ו-in vitro

כמזהם סביבתי, Cd הוכח כגורם לנזק לכליות על ידי ויסות סדרה של תהליכים ביולוגיים (Wang et al., 2019c). במחקר זה, השינויים ברמות השעתוק של ציטוקינים דלקתיים נבדקו לאחר חשיפה ל-Cd כדי לחקור האם דלקת מעורבת ב-Cd הנפרוטוקסיות. נתונים הראו שחשיפה ל-Cd העלתה משמעותית את רמות האינטרלוקין (IL)-1 ואת רמות החלבון של גידול נמק (TNF) בתאי NRK-52E (איור 1A-B) וברקמות כליה של חולדה (איור 1C -ד). בינתיים, כפי שמוצג באיור 1E-F, חשיפה ל-Cd הגבירה את רמות התעתיק של ציטוקינים דלקתיים (IL-1, IL-6, TNF- ו- (Monocyte chemoattractant protein-1) MCP -1) in vivo ו-in vitro. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-Cd גורם לביטוי של ציטוקינים דלקתיים בכליות חולדה.

3.2. BRD4 משתתף בתהליך השעתוק המושרה על ידי Cd של ציטוקינים דלקתיים

BRD4 הוא מווסת אפיגנטי שתואר לאחרונה הנקשר להיסטונים עם אצטילציה או לא-היסטון כדי לווסת תהליכי דלקת במחלות רבות. כאן נעשה שימוש במעכבי BRD4 JQ1 ו-BRD4-siRNA כדי לבחון את התפקיד של BRD4 על תגובה דלקתית המופעלת על ידי Cd. נתונים הראו כי רמות חלבון IL-1 ו-TNF-עלייה ב-Cd היו מווסתות למטה על ידי טיפול JQ1 in vivo ומבחנה (איור 2A-D) ועל ידי נוק-דאון של BRD4 במבחנה (איור S1A-B). בינתיים, טיפול JQ1 עיכב באופן משמעותי את רמות השעתוק המוגברות ב-Cd של IL-1, IL-6, TNF- ו-MCP-1 בתאי NRK-52E (איור 2E) ורקמות כליה של חולדה (איור 2F). כמו כן, נוק-דאון של BRD4 הפחית באופן משמעותי את רמות התעתוק המוגברות של Cd של ציטוקינים דלקתיים בתאי NRK-52E (איור S1C). ביחד, ממצאים אלה מצביעים על כך ש-BRD4 הוא מווסת קריטי של תגובה דלקתית המופעלת על ידי Cd בכליות חולדה.

3.3. רמות ביטוי BRD4 נשארות ללא שינוי לאחר חשיפת Cd

לאחר מכן, שינויים ברמות הביטוי של BRD4 זוהו לאחר חשיפת Cd. תאי NRK-52E טופלו ב-Cd בדרגת ריכוז, וחולדות הוזרקו תוך-צפקית עם Cd למשך 5 ימים כדי להבהיר את ההשפעה של Cd על ביטוי BRD4 בכליה in vivo ו-in vitro. התוצאות הראו שרמות החלבון BRD4 לא השתנו הן בתאי NRK -52E שנחשפו ל-Cd (איור 3A-B) והן ברקמות כליה של חולדה (איור 3C-D). כמו כן, רמות ה-mRNA של BRD4 לא השתנו לאחר חשיפת Cd (איור 3E-F). תוצאות אלו מצביעות על כך ש-BRD4 מתווך תגובה דלקתית המופעלת על ידי Cd אינה תלויה בשינויים ברמת הביטוי.

3.4. BRD4 מסדיר את הטרנסלוקציה הגרעינית של NF-KB מקודם Cd

התפקידים של BRD4 בתגובה דלקתית המופעלת על ידי Cd נחקרו במחקר שלנו. שינוי מסלול איתות NF-κB קשור קשר הדוק לתעתוק של ציטוקינים דלקתיים (Chi et al., 2021). המחקר שלנו מצא כי BRD4 מעורב בטרנסלוקציה גרעינית מווסתת Cd והפעלה של NF-KB. ראשית, הלוקליזציה התת-תאית של NF-KB נקבעה על ידי צביעת IF וצביעת IHC. הנתונים באיור 4A ו-D הראו ש-JQ1 מעכב את הטרנסלוקציה הגרעינית של NF-κB מקודם Cd בתאי NRK-52E וברקמות כליה של חולדה. בינתיים, תוצאות הכתם המערבי הראו ש-JQ1 הפחית באופן משמעותי את רמות החלבון הגרעיני המוגברות ב-Cd של NF-KB in vivo (איור 4B-C) ובמבחנה (איור 4E-F). באופן דומה, נוק-דאון של BRD4 גם עיכב משמעותית טרנסלוקציה גרעינית של NF-κB מקודם Cd (איור S2A) והפחית את רמות החלבון הגרעיני של NF-KB (איור S2B-C) המוגברות ב-Cd בתאי NRK-52E. יחד, עיכוב של BRD4 יכול להפחית את הטרנסלוקציה הגרעינית של NF-κB המקודם על ידי Cd, דבר המצביע על כך ש-BRD4 מתווך את ההפעלה של מסלול האיתות NF-κB בכליה לאחר חשיפה ל-Cd.

3.5. Cd מגביר את רמות האצטילציה RelA K310

מחקרים אישרו כי BRD4 נקשר ל-RelA K310 עם אצטילציה דרך תחומי הברום שלו כדי לווסת שעתוק תלוי NF-κB (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). לפיכך, זוהו רמת האצטילציה של RelA K310 והביטוי של שני אנזימים. נתונים הראו כי רמות החלבון RelA-K310ac ו-Acetylase Ep300 ירדו ללא הרף עם הריכוז המוגבר של Cd, בעוד שרמת החלבון deacetylase Sirt1 עלתה בהדרגה בתאי NRK-52E (איור 5A-B) וברקמות כליה של חולדה (איור 5C-D). כמו כן, רמות mRNA Ep300 ו-Sirt1 הראו את אותן מגמות (איור 5E-F). תוצאות אלו מצביעות על כך ש-Cd מקדם את רמת האצטילציה של RelA K310, ולכן BRD4 עשוי להיות מעורב בתעתוק ציטוקינים דלקתיים המופעלים על-ידי Cd בכליה.

3.6. Cd מגביר את קשירת BRD4 ל-RelA-K310ac כדי לשפר את תפקוד התעתיק שלו

קישור לאתרי אצטילציה הוא הבסיס לוויסות התעתיק של BRD4 (Huang et al., 2009). כדי לוודא אם Cd מווסת את תפקוד BRD4 על ידי הגדלת קישור BRD4 ל-RelA-K310ac, האינטראקציה בין RelA-K310ac ל-BRD4 זוהתה באמצעות Co-IP. הנתונים באיור 6A הראו ש-Cd הגביר באופן משמעותי את האינטראקציה בין RelA-K310ac ו-BRD4 בתאי NRK-52E, אשר הוקל על ידי טיפול JQ1 או נוק-דאון BRD4. כמו כן, אותה מגמה נצפתה ברקמות כליה של חולדה (איור 6B). תוצאות אלו מראות ש-Cd משפר את הקישור של BRD4 ל-RelA-K310ac, מה שמקדם שעתוק תלוי NF-κB ותורם לאחר מכן לתגובה הדלקתית המופעלת על ידי Cd.

4. דיון

Cd דווח כגורם פוטנציאלי לדלקת בגלל הרעילות הגבוהה שלו, בעוד המנגנון המדויק עדיין לא מובן במלואו (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). המחקר שלנו אישר ש-Cd גורם לביטוי ציטוקינים דלקתיים בתאי כליה של חולדה, ומצא ש-BRD4, יעד אפיגנטי בעל תפקידים קריטיים בסדרה של תהליכים תאיים כולל דלקת, תורם לתגובה דלקתית המופעלת על-ידי Cd. ניסויים נוספים הצביעו על כך ש-BRD4 מעורב בהפעלת מסלול איתות של NF-κB מקודם Cd. כמו כן, Cd העלה את רמת האצטילציה של RelA K310, ובכך הגבירה את הקישור של BRD4 ל-NF-KB RelA אצטיל כדי לקדם שעתוק ציטוקינים דלקתיים תלויי NF-KB.

דלקת היא אחד ממנגנוני ההגנה הטבעיים מפני כימיקלים אקסוגניים, בעוד שהתגובה הדלקתית הבלתי מבוקרת והבלתי הולמת עלולה לפגוע ברקמות תקינות ולגרום למחלות אוטואימוניות (Jian et al., 2018). סמנים ביולוגיים מוגברים של דלקת היו קשורים לעתים קרובות למחלות שונות. מחקרים הראו כי דלקת הנגרמת על ידי Cd מעורבת באטרוגנזה (Tinkov et al., 2018). יתרה מכך, Cd קידם את הביטוי של ציטוקינים דלקתיים, אשר תרמו לנזק לריאות ולרקמת האשכים וגורמים לרעילות כבד (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). ההשפעות המזיקות הללו עולות בקנה אחד עם התוצאות שלנו, שהתגובה הדלקתית מעורבת בפגיעה בכליות הנגרמת על ידי Cd. מחקרים הולכים וגדלים התמקדו במנגנוני התרחשות של דלקת הנגרמת על ידי Cd. כבן משפחה של חלבון BET שנחקר היטב, BRD4 ממלא תפקיד קריטי בתהליכים ביולוגיים רבים כולל דלקת. כאן, נעשה שימוש ב-JQ1 (מעכב של BRD4) וב-siRNA כדי לבטל את הוויסות של הפעילות התפקודית של BRD4 ומצא שהעיכוב של BRD4 הפחית את התעתוק המושרה על ידי Cd של ציטוקינים דלקתיים בכליות החולדות, מה שמצביע על כך ש-BRD4 משתתף בתגובה הדלקתית המופעלת על ידי Cd . מקובל להאמין שחוסר הוויסות של ביטוי BRD4 הוא אירוע מכריע בהתרחשות של תגובה דלקתית. בפציעת חוט שדרה, היפרטרופיה לבבית פתולוגית ומחלות אחרות הקשורות לדלקת, הביטוי המופרע של BRD4 תרם לביטוי של ציטוקינים דלקתיים (Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren et al., 2019). עם זאת, ל-Cd לא הייתה השפעה על רמות הביטוי של BRD4 בתנאי הניסוי הנוכחיים, מה שהוביל אותנו לשקול האם BRD4 מתווך את התגובה הדלקתית המופעלת על ידי Cd דרך מסלולים אחרים.

NF-κB הוא גורם רגולטורי חשוב בתהליכים דלקתיים ואחראי לשליטה בביטוי של מתווכים דלקתיים רבים (Lawrence, 2009). מחקרים דווחו כי BRD4 מעורב בוויסות מסלול האיתות NF-κB. Huang et al. (2017) הציע כי BRD4 מווסת את הפעלת NF-KB בתיווך IKK דרך המסלולים p38 ו-JNK-MAPK. וואנג וחב'. (2019a) מצא ש-BRD4 נוק-דאון או טיפול ב-JQ1 חסמו מסלול איתות NF-κB המופעל על ידי ליפופוליסכריד (LPS) במיקרוגליה. מנג וחב'. (2014) הוכיחו שטיפול JQ1 חסם את הביטוי של הציטוקינים הדלקתיים על ידי עיכוב ההפעלה של NF-κB בתאי RAW 264.7 שטופלו ב-LPS. דיווחים אלו הצביעו על כך ש-BRD4 מתווך את ההפעלה של NF-kB במודלים רבים של דלקת בעוד שעיכוב BRD4 הוא גישה טיפולית יעילה לאנטי-דלקת. במחקר הנוכחי, העיכוב של BRD4 חסם את הטרנסלוקציה הגרעינית של NF-κB ברקמות כליה של חולדה חשופות ל-Cd ותאי NRK-52E, מה שמרמז ש-BRD4 מתווך את מסלול האיתות NF-KB המופעל על ידי Cd.

בדרך כלל, לאחר ש-NF-κB הופעל על ידי גירויים שונים ועובר לגרעין, BRD4 נקשר ל-NF-κB RelA עם אצטילציה באתר K310, מה שמגביר את היציבות והפעילות התעתיק שלו בגרעין (Hajmirza et al., 2018). לפיכך רמת האצטילציה של RelA K310 משפיעה על התפקוד הרגולטורי של BRD4 על התגובה הדלקתית. בנוירונים בהיפוקמפוס, ה-deacetylase Sirt1 תיווך דה-אצטילציה של RelA K310 כדי לווסת את ביטוי BACE1, שתרם לייצור עמילואיד עצבי (Flores-Leon et al., 2019). בתאי גליובלסטומה, סטרס בטיפול פוטודינמי הוריד את ה-deacetylase Sirt1 והפעיל את ה-acetylase Ep300, אשר העלה את רמות RelA-K310ac והוביל לייצור מוגבר של תחמוצת החנקן הפרו-הישרדותית (Fahey et al., 2019). המחקר שלנו מצא ש-Cd מקדם את רמת האצטילציה של RelA K310 על ידי הגדלת ביטוי Ep300 והפחתת ביטוי Sirt1, מה שמעיד על כך ש-Cd משפיע על הפונקציה הרגולטורית BRD4 על ידי הגדלת רמות האצטילציה של RelA K310.

יש לציין שהתוצאות שלנו הראו שטיפול ב-JQ1 היה יעיל יותר מ-BRD4 בהקלה על תגובה דלקתית המופעלת על ידי Cd. ל-JQ1 יש זיקת קישור גבוהה עם BRD4 והוא יכול לחסום כמעט לחלוטין את קישור BRD4 לכרומוזום, בעוד ש-siBRD4 יכול רק להפריע לביטוי חלבון BRD4 כדי להפחית את הקישור של BRD4 לאתר המטרה, מה שמרמז ש-BRD4 מתווך תגובה דלקתית המופעלת על ידי Cd עשויה להיות תלויה ב מקשר עם NF-κB RelA אצטיל. מחקרים אחרונים הראו מנגנון רגולטורי דומה: לאחר טרנסלוקציה והפעלה גרעינית של NF-κB, BRD4 קיים אינטראקציה עם RelA אצטיל כדי להפעיל במקביל את הפעלת התעתיק של NF-κB (Huang et al., 2009). RelA-BRD4 גויס למקדמי מטרה של NF-κB במצבי גירוי דלקתי שונים, בעוד שטיפול JQ1 פעל על ידי מניעת קישור של BRD4 ל-NF-κB RelA עם אצטיל, ובכך הפחית את פעילות התעתיק של NF-κB (Zou et al., 2014). התוצאות שלנו הראו שהעיכוב של BRD4 חוסם אינטראקציה משופרת ב-Cd בין BRD4 ל-RelA-K310ac בכליות חולדה, ותומכים בתוצאות לעיל שעיכוב BRD4 מדכא את פעילות התעתיק הנגרמת על ידי Cd של NF-κB, מה שמצביע על כך ש-Cd משפר את הקישור של BRD4 לאצטיל. NF-κB RelA להגברת השעתוק של ציטוקינים דלקתיים.

לסיכום, המחקר שלנו חשף את המנגנונים הרגולטוריים של BRD4 בתגובה דלקתית המופעלת על ידי Cd בכליות חולדה: (1) BRD4 מתווך טרנסלוקציה והפעלה גרעינית של NF-KB המושרה על ידי Cd. (2) Cd מגביר את רמות האצטילציה של RelA K310 ומגביר את הקישור של BRD4 ל-NF-KB RelA עם אצטילציה, מה שמקדם שעתוק ציטוקינים דלקתיים תלויי NF-KB. בנוסף, העיכוב של BRD4 הקל באופן משמעותי על רמות ציטוקינים דלקתיות המוגברות ב-Cd, מה שמצביע על כך של-BRD4 ממוקד יש פוטנציאל להתפתח כאמצעי יעיל לטיפול במחלות דלקתיות כולל דלקת נפריטיס הנגרמת על ידי Cd.

הצהרת תרומת הכותבים של CrediT

Zhongguo Gong: מושגים, מתודולוגיה, ויזואליזציה, ניתוח פורמלי, אימות, חקירה, ניתוח פורמלי, איסוף נתונים, כתיבה - טיוטה מקורית. Gang Liu: מושג, מתודולוגיה, ויזואליזציה, אצור נתונים, כתיבה - טיוטה מקורית, ניהול פרויקטים, רכישת מימון. Wenjing Liu: תוכנה, משאבים, מתודולוגיה, ניתוח פורמלי. Hui Zou: ניהול פרויקטים, פיקוח. שיר Ruilong: תוכנה, ניתוח פורמלי, פיקוח. Hongyan Zhao: תוכנה, ניתוח פורמלי, פיקוח. יאן יואן: פיקוח. Jianhong Gu: פיקוח. Jianchun Bian: רכישת מימון, פיקוח. Jiaqiao Zhu: כתיבה - סקירה ועריכה, פיקוח. Zongping Liu: כתיבה - סקירה ועריכה, פיקוח,

ניהול פרויקטים, רכישת מימון, המשגה.

הצהרת עניין מתחרה

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים או קשרים אישיים ידועים שהיו עשויים להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

הכרה

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 31872533, 31902329, 32072933), תוכנית המפתח הלאומית למחקר ופיתוח של סין (מספר 2016YFD0501208), והפרויקט של התוכנית האקדמית המועדפת לפיתוח ההשכלה הגבוהה של ג'יאנגסו מוסד (PADP). כתב היד נערך עבור שפה אנגלית נאותה, דקדוק, סימני פיסוק, איות וסגנון כללי על ידי אחד או יותר מהעורכים המוסמכים ביותר דוברי אנגלית ב-ELIXIGEN.

הפניות

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. ג'לי מלכותי מחליש רעילות נפרוטית הנגרמת על ידי קדמיום בעכברים זכרים. Sci. רפ' 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. חשיפה משותפת לרמות לא רעילות של קדמיום ופלואוריד גורמת לרעילות כבד אצל חולדות דרך מעורר נזק חמצוני מיטוכונדריאלי, אפופטוזיס ומסלולי NF-kB. סביבה. Sci. לזהם. מילון Int. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. אבקת זרעי חילבה מפחיתה את הנזק האשכים הנגרם על ידי קדמיום ורעילות הכבד בחולדות זכרים. Exp. טוקסיקול. פאתול. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting על Nrf2: כיצד איתות Nrf2 יכול להשפיע על הפעילויות הטיפוליות של מעכבי חלבון BET. מאמרים ביולוגיים 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Roles of Selenoprotein S ביצירת מלכודת חוץ-תאית של נויטרופילים תגובתיים תלויי חמצן, הנגרמת על ידי סלניום- דלקת עורקים חסרה. חיזור ביול. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A., Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J. ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 מכוון את התפתחות תאי הגזע המטופואטיים ומווסת תגובות דלקתיות של מקרופאגים. EMBO J. 38 (7)

פיגרברג, ב', נולד, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. חשיפה לקדמיום קשורה לקולטן מסיס של urokinase plasminogen activator, סמן מחזורי של דלקת ומחלות לב וכלי דם עתידיות. סביבה. מילון 152, 185-191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. אירועי איתות במעלה הזרם מובילים לייצור מוגבר של תחמוצת חנקן פרו-הישרדותית בתאי גליובלסטומה בעלי אתגר פוטודינמי. רדיק חופשי. ביול. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. שונות של מטבוליטים ומתכות כבדות שונות ב- Oryza sativa L., הקשורים למחלת כליות כרונית של אטיולוגיה לא ידועה בסרי לנקה. Chemosphere 247, 125836.

Flores-Leon,M.,Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. דלדול NAD( פלוס) המושרה על ידי חומצה פלמיטית קשור לתפקוד המופחת של SIRT1 ולביטוי מוגבר של BACE1 בנוירונים בהיפוקמפוס. נוירוכם. מילון 44 (7), 1745–1754.

Ghosh, KNI, 2018. טיפול בקדמיום גורם לאכינוקוקוזיס, נזק ל-DNA, דלקת ואפופטוזיס ברקמת הלב של חולדות ויסטאר לבקן. סביבה. טוקסיקול. פרמקול. 59, 43–52. דלקת וסרטן. ביו-רפואה 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. חשיפה חריפה לקדמיום גורמת לנויטרופיליה ממושכת יחד עם אינדוקציה מושהית של גורם מגרה מושבה גרנולוציטים בכבדים של עכברים. קֶשֶׁת. טוקסיקול. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F.,Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. ההשפעות של חשיפה לקדמיום בהשראת דלקת. Immunopharmacol. אימונוטוקסיקול. 42 (1), 1–8.